PROGETTO MODO “Model Organism” Variabilità dell’espressione fenotipica in soggetti con Corea di Huntington e con medesima alterazione genica Prof. Francesco Salvatore Prof. Antonella Carsana Prof. Gabriella Esposito Dott. Rossana D’Angelo Patologie da ripetizioni di poliglutammina (poliQ) - Espansione di triplette CAG nella regione codificante di specifici geni - Mutazioni dinamiche - Anticipazione, penetranza incompleta - Correlazione inversa tra il numero di ripetizioni CAG e l’età d’esordio della malattia - Corea di Huntington (HD), prevalenza 3-7:100,000 (gene HTT) HD Triplette ripetute CAG nel gene HTT (esone 1) - CAG ≤ 26 - CAG 27 - 35 - CAG 36 - 39 - CAG ≥ 40 Sani Alleli intermedi (instabili) HD penetranza incompleta HD affetti Patogenesi di HD - Alterazione della bioenergetica mitocondriale Danno ossidativo Alterazioni trascrizionali Modifiche epigenetiche Alterazioni del trasporto vescicolare Coinvolgimento delle cellule gliali Scopo del progetto (I) Approfondire i meccanismi molecolari alla base delle discordanze genotipo – fenotipo in un gruppo di pazienti affetti da HD che presentano lo stesso numero di ripetizioni CAG nell’allele mutato. Studio Diagnosi molecolare di 58 pazienti/soggetti appartenenti a 47 famiglie 58 pazienti/soggetti 47 famiglie −CAG ≥ 40 −CAG 36 – 39 −CAG 27 – 35 −CAG ≤ 26 33 soggetti 2 soggetti 1 soggetto 22 soggetti Per studiare le discordanze genotipo – fenotipo, abbiamo selezionato i pazienti con lo stesso numero di ripetizioni CAG ed età d’esordio e segni clinici diversi Famiglia 11 ? ID #11-1 #11-2 #11-3 Anno di nascita 1976 1979 1980 Età 38 35 34 CAG 19 46 19 46 19 46 Età d’esordio -- -- 32 Segni clinici Borderline Sana Alterazioni motorie Tre sorelle con lo stesso genotipo HTT Solo la più giovane delle sorelle (#11-3) presenta segni clinici di HD Dati clinici: Prof. Giuseppe De Michele, Elena Salvatore Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università di Napoli Federico II Pazienti HD selezionati con lo stesso numero di CAG e quadri clinici ed età d’esordio differenti ID Anno di nascita Età CAG #7 #10 #23 #32 1962 52 1971 43 1972 42 1971 43 17 Età d’esordio Segni clinici 46 17 46 17 46 22 46 47 41 34 40 Disturbi motori, cognitivi e psichiatrici Disturbi motori e cognitivi Disturbi psichiatrici Disturbi motori e psichiatrici E’ necessario reclutare altri pazienti caratterizzati dalla stessa mutazione a cui estendere lo studio Dati clinici: Prof. Giuseppe De Michele, Elena Salvatore Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università di Napoli Federico II Ricerca di polimorfismi (SNPs) in potenziali geni modificatori SNPs selezionati nei geni: Proteine che interagiscono con l’huntingtina : • HAP1 (huntingtin-associated protein 1) Geni in linkage con il locus HTT : • MSX1 (muscle segment homeobox 1) Recettori di neurotrasmettitori : • GRIN2A (glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 2A) • GRIN2B (glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 2B) • ADORA2A (adenosine A2a receptor) Metabolismo energetico : • TFAM (transcription factor A, mitochondrial) • NRF1 (nuclear respiratory factor 1) • PPARGC1A (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 alpha) Pathway autofagico : • ATG7 (autophagy related 7) Geni implicati in altre malattie neurodegenerative : • UCHL1 (ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1) Risultati 11/3 ♀ Pazienti 11/1 ♀ 11/2 ♀ 7 ♂ 10 ♂ Disturbi motori e cognitivi, Disturbi motori Disturbi e cognitivi psichiatrici 23 ♀ 32 ♀ Disturbi motori e psichiatrici Fenotipo Disturbi motori borderline sana Età d’esordio 32 -- -- 47 41 34 40 Triplette CAG 19 - 46 19 - 46 19 - 46 17 - 46 17 - 46 17 - 46 22 - 46 gene SNP Disturbi psichiatrici regione HTT del GAG del esone wt wt wt wt wt wt del HAP1 rs4523977 (T/C) esone (T441M) T/T T441M (T/C) T/T T441M (T/C) T/T T/T T/T MSX1 rs36206445 (ripetizioni gt) Introne 9 - 11 9 - 11 9 - 11 9-9 9 - 11 9-9 9 - 11 rs2650427 (T/C) Introne T/C T/C T/C T/T T/T T/T T/C T=0.461 GRIN2A rs8057394 (G/C) Introne G/C G/G G/C C/C G/G G/C G/G C=0.410 rs1969060 (C/T) Introne C/T T/T C/T C/C T/T C/T T/T C=0.367 rs890 (T/G) 3’ UTR G/G T/G G/G T/G T/T T/G T/T G=0.328 rs1806201 (C/T) esone (T888T) C/C C/C C/C C/T C/C C/C C/T T=0.307 rs5751876 (T/C) esone (Y361Y) C/C C/C T/C T/C T/C T/C C/C T=0.481 rs11006132 (A/G) 3’ UTR A/A A/A A/G A/A A/G A/A G/G G=0.233 rs1049432 (G/T) 3’ UTR G/G G/G G/T G/G G/T G/G G/G T=0.204 rs7781972 (A/T) introne A/T T/T T/T T/T T/T A/A T/T T=0.483 rs6949152 (A/G) introne A/A A/A A/A A/A A/G A/G A/G G=0.232 rs2970870 (T/C) promotore T/C T/C C/C C/C T/T T/T T/C T= 0.473 rs2970848 (A/G) Introne A/A A/A A/G A/G A/G A/A A/G G=0.381 rs7665116 (C/T) Introne T/T T/T T/T C/T T/T C/T T/T C=0.269 rs6821591 (C/T) 3’ UTR C/T T/T C/T T/T C/T C/T C/T C=0.423 rs3736265 (C/T) esone (T612M) C/C C/C C/T C/T C/C C/C C/C T=0.109 ATG7 rs36117895 (C/T) esone (V471A) C/T C/T C/T T/T T/T T/T T/T C=0.024 UCHL1 rs5030732 (C/A) esone (S18Y) C/C C/C C/C S18Y (C/A) S18Y (C/A) C/C C/C A=0.242 GRIN2B ADORA2A TFAM NRF1 PPARGC1A C=0.024 In verde sono evidenziati gli SNPs riportati con effetto protettivo, in rosso sono evidenziati gli SNPs riportati con effetto peggiorativo Risultati più significativi Pazienti #11-1 ♀ 11-2 ♀ 11-3 ♀ 7 ♂ 10 ♂ 23 ♀ 32 ♀ Età d’esordio -- -- 32 47 41 34 40 borderline sana Disturbi motori Disturbi motori e cognitivi, Disturbi psichiatrici Disturbi motori e cognitivi Disturbi psichiatrici 19 - 46 19 - 46 19 - 46 17 - 46 17 - 46 17 - 46 22 - 46 fenotipo CAG Disturbi motori e psichiatrici gene SNP GRIN2A rs1969060 (C/T) T/T C/T C/T C/C T/T C/T T/T GRIN2B rs890 (T/G) T/G G/G G/G T/G T/T T/G T/T NRF1 rs7781972 (A/T) T/T T/T A/T T/T T/T A/A T/T UCHL1 rs5030732 (C/A) C/C C/C C/C C/A C/A C/C C/C In verde sono evidenziati gli SNPs riportati con effetto protettivo In rosso sono evidenziati gli SNPs riportati con effetto peggiorativo Prospettive future: estendere lo studio ad altri 10 pazienti indipendenti #6 #45 #19 #14-1 #14-2 Anno di nascita #4 #42 #33 #26 #39 1985 Età 29 Età d’esordio Fenotipo Disturbi motori Disturbi motori Disturbi motori Disturbi motori e psichiatrici Dati clinici: Prof. Giuseppe De Michele, Elena Salvatore Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università di Napoli Federico II sana Disturbi psichiatrici Disturbi motori e psichiatrici Disturbi motori e psichiatrici Disturbi motori, cognitivi e psichiatrici Disturbi motori e psichiatrici Prospettive future: analisi di potenziali geni modificatori con Next Generation Sequencing HAP1 Proteine che interagiscono HIP1 con l’huntingtina ZDHHC17 Pathway autofagico ATG7 Geni coinvolti in altre malattie neurodegenerative UCHL1 KALRN Geni in linkage al locus HTT Recettori neurotrasmettitori Fattori di trascrizione MSX1 TBP TCERG1 GRIN2A Apoptosi DFFB GRIN2B Regolazione del ciclo cellulare TP53 ADORA2A GRIK2 CNR1 Trasduzione del segnale Fattori di trascrizione TFAM Metabolismo energetico APOE NRF-1 PPARGC1A MAP3K5, ASK1 MAP2K6 BDNF OGG1 Stress ossidativo SOD1 GPX1 CO1 Analisi di tutte le regioni codificanti e regolatorie dei geni selezionati Scopo del progetto (II) Sviluppo di un modello cellulare paziente-specifico: cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 +L-Myc +Lin28 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/stem-cell-biology/ipsc.html Linea cellulare iPS • Modello cellulare paziente-specifico • Differenziamento in cellule neuronali e gliali • Approfondire i meccanismi molecolari che sottendono alle discordanze genotipo – fenotipo mediante studi di trscrittomica e proteomica differenziale
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