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17.mycobacterium - Università degli Studi di Perugia

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UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA
Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA
Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia
AA 2013-2014
Mycobacterium spp
1993 WHO: “Emergenza Mondiale”
i fattori che favoriscono l’espansione della malattia sono
principalmente quattro:
1. La concomitante diffusione dell’HIV: un individuo HIV
positivo presenta un rischio 100 volte superiore di ammalarsi di
TBC
2. L’aumento degli spostamenti per viaggi
tra paesi anche molto distanti tra loro;
3. La scarsa opera di prevenzione e cura in particolar modo a livello
delle fasce sociali a maggior rischio di infezione;
4. L’uso improprio dei farmaci che di fatto ha indotto la comparsa di
ceppi batterici multi resistenti (MDR- TB)
1995 WHO: DOTS (Directly Observed Treatment Short-course), una
terapia di breve durata, somministrata sotto il controllo medico,
efficace nel 95% delle situazioni.
2001 WHO : “Stop TB strategy”
etc ………………..
Mycobacterium spp
• Ordine Actinomycetales
• Famiglia Mycobacteriaceae
• Genere Mycobacterium
• circa 100 specie
caratteri generali
bacilli
immobili
non sporigeni
aerobi obbligati
0.2-0.6 x 1-10 m
Acido-resistenza
contenenti molecole a 60-90 atomi di C (ac. micolici)
elevato contenuto Guanina - Citosina (60-70%)
Mycobacterium spp
• Ordine Actinomycetales
• Famiglia Mycobacteriaceae
• Genere Mycobacterium
• circa 100 specie
caratteri generali
bacilli
immobili
non sporigeni
aerobi obbligati
0.2-0.6 x 1-10 m
Acido-resistenza
contenenti molecole a 60-90 atomi di C (ac. micolici)
elevato contenuto Guanina - Citosina (60-70%)
diversi dagli altri batteri per:
• struttura della parete (lipidi)
• patogenesi infezione
• diagnosi
• suscettibili a chemioterapici specifici
FATTORI DI VIRULENZA
M. tuberculosis :
• non produce esotossine,
solo alcune emolisine e lipasi
• non e’ provvisto di endotossina
• non sintetizza la capsula
I fattori di virulenza sono i componenti cellulari (lipidi, fattore
cordale, cere) dotati di azione tossica nei confronti dei
macrofagi, inibendo il killing macrofagico attraverso la
mancata fusione del fagosoma-lisosoma e la mancata
acidificazione del fagolisosoma
Regione RD1
• La regione RD1 è un frammento del genoma di 10.7 kb
che codifica per molti geni, tra cui ESAT-6 e CFP-10.
• L’ESAT-6 è in grado di indurre la formazione di pori nelle membrane dei
vacuoli dei macrofagi il cui micobatterio si moltiplica e consentire la
fuoruscita del micobatterio nel citoplasma.
La regione RD1 comprende anche altre proteine che costituiscono
l’apparato secretorio e che la regione genomica codificante prende anche il
nome di ESX. Nel genoma del M. tuberculosis sono presenti 5 cassette
ESX che presentano un elevato grado di omologia.
Assente nei micobatteri non virulenti e nel vaccino BCG
Oltre ai sistemi di secrezione delle proteine ESAT-6 e CFP10, il M. tuberculosis presenta altri sistemi di secrezione
come il Sec e il TAT. Il sistema Sec è ad es. coinvolto
nella secrezione della SOD, un enzima che consente al
micobatterio di rendere meno battericida l’ambiente
all’interno del fagolisosoma.
Parete cellulare: ricca di lipidi

• resistenza a fattori ambientali (essiccamento)
• tempo di replicazione (12-24 ore)
• caratteristiche di crescita in vitro
(colonie visibili dopo 40 gg)
•
•
•
•
antigenicità (componente proteica)
tendenza alla aggregazione (fattore cordale)
resistenza a molti detergenti e antibiotici
alcool-acido resistenza
Cell wall
Lipidi : 60% del peso secco della parete cellulare
30% del peso secco del corpo batterico.
Fattore cordale (dimycolyltrealosio)
Cere (A, B, C, D)
Proteine: 15% della parete cellulare (attività antigenica,
attivazione della CMI)
PPD: derivato proteico purificato
Glicolipidi di superficie
Lipo-arabino-mannano
Acidi micolici
Arabinogalactano
P
Proteine
P
Peptidoglicano
glico-lipidi di Mycobacterium = micosidi
Acidi micolici: lipidi a 60 - 90 atomi di C + carboidrati (legame covalente)
Fattore cordale (dimycolyl-trealosio):
responsabile della crescita in forma di catene parallele
tossico se inoculato nel topo
implicato nella virulenza dei micobatteri
Cera D: responsabile della reazione di ipersensibilità di IV tipo
Classificazione (I)
Mycobacterium tuberculosis complex
M. tuberculosis
M. bovis
M. bovis BCG
M. africanum
M. microti
Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT)
Mycobacterium leprae
Classificazione (II)
M. tuberculosis
M. bovis
M. bovis BCG
M. africanum
M. leprae
Gruppo non-Runyon
Gruppi Runyon
GRUPPO I
crescita lenta, fotocromogeni
M. kansasii
M. marinum
M. simiae
GRUPPO II
crescita lenta,
scotocromogeni
M. scrofulaceum
M. paratuberculosis
M. szulgai
M. xenopi
GRUPPO III
crescita lenta, non cromogeni
GRUPPO IV
crescita rapida
M. avium
M. intracellulare
M. genavense
M. haemophilum
M. malmoense
M. ulcerans
M. fortuitum
M. chelonae
M. abscessus
Nonostante si conoscano circa 100 specie di micobatteri,
più del 95% di tutte le infezioni nell’uomo sono causate
soltanto da 7 specie:
 M. tuberculosis
 M. leprae
 M. avium complex (M. avium, M. intracellulare)
 M. kansasii
 M. fortuitum
 M. chelonae
 M. abscessus
Nel 1998 è stato completamente sequenziato il
GENOMA del ceppo H37Rv di M. tuberculosis.
Il genoma circolare comprende 4.411.529 paia
di basi che costituiscono circa 4000 geni; una
caratteristica distintiva del genoma è
rappresentata dall’alto contenuto (circa 65.6%
del totale) di guanina e citosina.
Circular map of the chromosome of M. tuberculosis H37Rv
4.411.532 bp
G+C 65.6%
52% funzione definita
~ 4.000 geni codificanti proteine
48% funzione ipotetica o sconosciuta
50 geni codificanti RNA stabile
Oltre il 51% dei geni è derivato dalla duplicazione genica
Il 3.4% del genoma è composto da sequenze di inserzione e profagi
Mycobacterium tuberculosis
Bacillo di Koch
Premio Nobel, 1905
Patogenesi
Trasmissione dell’infezione tubercolare
Infezione da M. tuberculosis
Malattia tubercolare
– se il sistema immunitario non riesce a
controllare l’infezione
Infezione latente (assenza di malattia)
– se l’infezione rimane sotto il controllo
del sistema immunitario
Mycobacterium
Goccioline di Pflügge
Sospensione nell’aria
Evaporazione e riduzione a dimensioni di
1-5 m con bacilli vivi e vitali
Possibilità di inalazione
fino al distretto alveolare
Fattori di rischio per il contagio
• carica batterica
• contagiosità del paziente:
positività dell’esame diretto dell’espettorato
presenza di caverne
• frequenza/durata di esposizione
• luogo del contatto:
spazi piccoli e mal ventilati
• condizioni di recettività (suscettibilità dell’ospite)
• ritardo di diagnosi e di inizio della terapia
Infezione
Inalazione bacilli tubercolari
 lesioni primarie: lobo medio dx; lobo sup sn (sede inf.); lobo inf. sn (sede sup)
 tubercolosi primaria
 asintomatica
 sintomatica
evoluzione
Guarigione
Cronicizzazione
tubercolosi secondaria (endogena/esogena)
polmonare (apici)
continuità
pleurica
tracheo-bronchiale
ingestione
digestiva
miliare
via ematica
isolata d’organo
(SNC, rene, app. genitale, ossa)
Tubercolosi: lesione istopatologica specifica
Inalazione bacilli

Infiammazione aspecifica

Sensibilizzazione (risposta immune specifica)
Richiamo macrofagi alveolari

Attivazione risposta T helper
GRANULOMA
TUBERCOLO
FOCOLAIO DI GHON
COMPLESSO DI GHON
Cellule coinvolte
MACROFAGI
(ISTIOCITI, CELLULE EPITELIOIDI, CELLULE GIGANTI DI LANGHANS)
LIFOCITI T CD4+, CD8+
FIBROBLASTI (tessuto cicatriziale, calcificazioni)
Risposta immune specifica
Inalazione aerosols infetti
 fagocitosi da parte dei macrofagi alveolari
 blocco fusione lisosoma-fagosoma (fattore cordale, blocco
della “molecola ponte specifica” EEA1) = patogeni
intracellulari
 attivazione risposta immune cellulo-mediata
= produzione di IL-12, IL-18, TNF- (infiammazione, T CD4+ e
CD8+, NK)
Attivazione T CD4+ 
• produzione di anticorpi (non proteggenti a causa della localizzazione
intracellulare di BK)
• Produzione di IFN- e IL-2  attivazione dei macrofagi  macrofagi
attivati possono fagocitare e uccidere i micobatteri.
Attivazione T CD8+ 
• Lisi di cellule fagocitiche contenenti micobatteri in replicazione
Risposta immune alla tubercolosi
FOCOLAIO DI GHON
Focolaio primario di infezione parenchimale (subpleurica) = lesione
grigio-biancastra di 1-1.5 cm a livello sub-pleurico (espressione
macroscopica del granuloma o tubercolo)
COMPLESSO DI GHON (= complesso primario o di Ranke)
Evoluzione possibile del focolatio di Ghon, con interessamento dei
linfonodi peribronchiali o tracheobronchiali attraverso una stria
linfangitica.
Focolaio di Ghon + stria linfangitica + linfonodi regionali.
Visibile all’esame radiografico
(da Anton Ghon (1866-1936), a Czech pathologist)
GRANULOMA:
al centro = istiociti-cellule epitelioidi + bacilli tubercolari
In periferia = linfociti, fibroblasti
TUBERCOLO:
Granuloma + necrosi caseosa centrale
TUBERCOLO
zona centrale con materiale necrotico
caseoso (materiale eosinofilico amorfo),
circondata da cellule epitelioidi (istiociti) e
linfociti
tipica cellula di Langhans (nucleo a ferro di
cavallo)
Tubercolosi: evoluzione delle lesioni
Guarigione: fibrosi
cicatrizazione
calcificazione
ossificazione
con/senza bacilli vivi all’interno
Lesioni evolutive: necrosi tissutale (caseificazione)
caverne tubercolari
superinfezione delle caverne (Aspergillus sp)
lesioni per diffusione per contiguità
lesioni per diffusione ematogena
Evoluzione: calcificazione
Sub-pleural fibro-calcific nodule (Healed Ghon focus)
Evoluzione: NECROSI CASEOSA
Necrosi caseosa
Lesione cavitaria
Necrosi o caverne
Infezione
Inalazione bacilli tubercolari
 lesioni primarie: lobo medio dx; lobo sup sn (sede inf.); lobo inf. sn (sede sup)
 tubercolosi primaria
Tubercolo, focolaio di Ghon, complesso di Ghon
 asintomatica
 sintomatica
evoluzione
Necrosi caseosa, caverne
Guarigione
Cronicizzazione
tubercolosi secondaria (endogena/esogena)
polmonare (apici)
continuità
pleurica
tracheo-bronchiale
ingestione
digestiva
miliare
via ematica
isolata d’organo
(SNC, rene, app. genitale, ossa)
Infezione latente vs malattia attiva
Infezione tubercolare latente
Infezione subclinica con bacilli tubercolari senza segni
clinici, batteriologici o radiologici di malattia manifesta.
Test alla tubercolinica positiva ed un Rx torace
normale: possono essere contatti di un precedente
caso di tubercolosi.
Tubercolosi
Stato di malattia manifesta dal punto di vista clinico,
batteriologico e/o radiologico.
Polmonare
malattia primaria
malattia postprimaria
Extrapolmonare
patogenesi della TB
infezione latente vs. malattia attiva
Storia naturale dell’infezione di BT
Esposizione al TB
No infezione
(70-90%)
Infezione
(10-30%)
TB latente
(90%)
Non sviluppano
Malattia attiva
Morte entro 2 anni
TB attiva
(10%)
Non trattati
trattati
Sopravvivono
Morti guariti
Epidemiologia
• Serbatoio: l’uomo (con TBC aperta) è l’unico
serbatoio
• Trasmissione: inalazione di aerosol infetti
• Soggetti a rischio: contatti di pz, tossicodipendenti,
senzatetto, alcolizzati, carcerati, pz AIDS
Clinica
Manifestazioni cliniche
Tubercolosi polmonare
• Malattia primaria
- risultato dell’iniziale infezione di MTB
- si osserva spesso nei bambini
- prevalentemente nei campi medi ed inferiori,
accompagnata da linfoadenopatia ilare
- nella maggioranza dei casi guarisce
spontaneamente
- negli immunocompromessi si può sviluppare
una forma “miliare”
Malattia postprimaria
– riattivazione endogena di un’infezione latente
– prevalentemente ai segmenti apicali e posteriori dei
lobi superiori
– l’estensione è variabile (da piccoli infiltrati ad estese
malattie cavitarie) con la formazione di caverne, il
contenuto necrotico viene eliminato nelle vie aeree
e
dà luogo a lesioni satelliti
– l’interessamento massivo di segmenti o di lobi
polmonari produce la polmonite tubercolare
Possibili forme di malattia
• TBC primaria in immunocompetente : per di più
asintomatica o paucisintomatica (febbre e malessere)
• TBC primaria in persone a rischio: TBC polmonare
primaria progressiva (febbre, tosse, espettorazione,
emottisi, dispnea)
• TBC secondaria (= post primaria): riattivazione endogena
di una infezione latente. Tosse cronica, espettorazione,
emottisi, febbre, dispnea, dolore toracico, anoressia,
dimagrimento, consunzione
• TBC extrapolmonare: può colpire vari organi e apparati:
linfonodi 25%, pleura 20%, tratto genito-urinario 15%,
ossa 10%, meningi 5%.
• TBC miliare: piccole lesioni a forma di seme di miglio,
che si diffondono rapidamente dai polmoni ai visceri
Fasi della infezione e della malattia tubercolare
(American Thoracic Society, 1993)
PPD Rx Sintomi Batteriologia
Contatto senza infezione
Infezione
TB attiva
TB inattiva
+
+
+
+
+
(stabile)
+
+/-
+
-
Micobatteriosi non tubercolari
Malattia polmonare:
M. avium. kansasii, abscessus, xenopi, malmoense
Linfadeniti:
M. avium, scrofulacem, malmoense
Malattie cutanee:
M. marinum, fortuitum, chelonae, abscessus, ulcerans
Malattia disseminata:
M. avium, kansasii, chelonae, haemophylum
Mycobacterium Avium Complex (MAC)
MAC= M. avium e M. intracellulare
Soggetti immunocompetenti: entrambi causa di
infezione
Soggetti HIV+: solo M. avium
Forme possibili:
- infezioni in soggetti anziani fumatori con malattie
polmonari
- infezioni in femmine anziane non fumatrici, che
sopprimono il riflesso della tosse (“Lady Windermere
syndrome”)
- infezioni nodulari localizzate al polmone
- infezioni disseminate ad altissima carica in
pazienti AIDS
Diagnosi di laboratorio della patologia del
Mycobacterium
Immunodiagnosi:
Test cutaneo della tubercolina
Saggi di rilascio dell’interferone gamma
Microscopia:
Colorazione di Ziehl-Neelsen (acido alcol resistenza a caldo)
Colorazione di Kinyoun (acido alcool resistenza a freddo)
Colorazione acido-resistente a fluorocromo di Truant
Test basati sugli acidi nucleici
Test di amplificazione degli acidi nucleici
Coltura:
Terreni a base di agar o uovo
Terreni a base di brodo
Identificazione
Proprietà morfologiche
Reazioni biochimiche
Analisi dei lipidi della parete cellulare
Sonde per acidi nucleici
Sequenziamento degli acidi nucleici
IMMUNODIAGNOSI
Immunodiagnosi
Mantoux:
test alla tubercolina
test IGRA (Interferon-Gamma Release Assays)
QuantiFERON® TB GOLD in tube
(ELISA per IFN-
Test della tubercolina = intradermoreazione di Mantoux
n.b.: PPD, Purified Proteic Derivative
PPD 0,1 mg = 5UT per via intradermica
 valutazione della reazione dopo 48 h
 misurazione del diametro della lesione (infiltrato =
nodulo)
Test alla tubercolina
Introdotto nel 1890, è il più vecchio test diagnostico
ancora in uso
Tubercolosi attiva
Infezione latente
Positivo Esposizione recente a M. tuberculosis
Esposizione a micobatteri ambientali
Vaccinazione con BCG
Punti di forza della Mantoux
• Il trattamento dei soggetti Mantoux-positivi riduce drasticamente
il rischio di passaggio alla tubercolosi attiva
• Basso costo
• Non richiede l’intervento del laboratorio
Limiti della Mantoux
Falsi positivi
- 5-60% dei vaccinati
- Esposizione a micobatteri non tubercolari (NTM)
- Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con tubercolosi
avanzata)
Falsi negativi
- Errori di inoculo
- Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza della misurazione)
Problemi di ordine pratico
- Doppia presentazione del paziente
- Mancata lettura nel 30% dei casi
Interferon-Gamma Release Assays
L’infezione tubercolare stimola la risposta della cellule
T
Le cellule-T attivate secernono citochine
IFN-
TNF
IL8
Le cellule-T effettrici producono IFN- entro poche ore
dalla stimolazione
Le cellule-T memoria devono prima proliferare
trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi
in grado di produrre IFN- prima di 24h
L’IFN- non è normalmente presente in circolo, è
stabile e misurabile
La scelta degli antigeni
I linfociti T dei soggetti con infezione
tubercolare producono IFN-γ se vengono in
contatto con uno o più antigeni del
M. tuberculosis che sono:
ESAT-6 (early secretory antigenic target 6)
CFP-10 (culture filtrate protein 10)
TB 7.7
Tali antigeni sono codificati nella regione genica
(RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i
micobatteri non-tubercolari
QuantiFeron
I linfociti del soggetto in esame vengono posti in
contatto con antigeni specifici, con un controllo
negativo privo di antigeni e con un controllo positivo
che contiene fitoemoagglutinina
Ricerca dell’IFN-γ dopo opportuna incubazione
assenza di IFN-γ = ASSENZA DI INFEZIONE
presenza di IFN-γ = INFEZIONE
presenza di IFN-γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO
assenza di IFN-γ nel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO
QuantiFERON®-TB GOLD Test
IFN-g
3 antigeni: ESAT-6, CFP-10, TB7.7
T
T
T
T
T
T
ELISA
Test positivo:
sviluppo di colore
Test Quantiferon con metodo ELISpot
• ELISPOT = come un normale test
ELISA, ma le cellule invece che
essere in sospensione sono aderenti
sul fondo del pozzetto
• Man mano che una cellula secerne
IFN-γ, questo viene legato dagli Ab
sottostanti, si forma quindi uno spot
che si colora perché l’anticorpo
secondario modifica enzimaticamente
un substrato
• contando il numero di spots si può
valutare quante cellule producono
IFN-γ
Vantaggi dei metodi basati su IFN-
Test in vitro
Nessun effetto booster
Specificità elevata
Non influenzati dalla vaccinazione con
BCG
Praticità: occorre solo un prelievo di
sangue e non è richiesta la
collaborazione del paziente
Interpretazione oggettiva
Eliminano il ricorso a trattamenti non
necessari
Correlazione Quantiferon/Mantoux
IFN-γ
Mantoux
Sensibilità
89.0%
65.7%
Specificità
98.2%
35.4%
Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004
Test Quantiferon vs. Mantoux
Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva:
SOVRAPPONIBILE
Sensibilità nei casi di sospetta infezione latente:
MAGGIORE per IFN-γ
I casi con Mantoux NEG e IFN-γ POS sono generalmente
associati con l’esposizione
I casi con Mantoux POS e IFN-γ NEG non sono
generalmente associati con l’esposizione
Microscopia
Il Mycobacterium tuberculosis
• non si colora con la colorazione diGRAM
e
• non cresce nei normali terreni di coltura
quindi…..
….occorre richiedere specificamente la
ricerca di BK !
Esame microscopico: tutte le
colorazioni sfruttano la ALCOOL
ACIDO RESISTENZA 
evidenziazione BAAR (bacilli alcool
acido resistenti = AFB)
colorazioni
utilizzate:




Ziehl-Neelsen (carbolfucsina a caldo)
Kinyoun (carbolfucsina a freddo)
Auramina
Fluorescenza
Ziehl Neelsen
micobatteri = batteri rossi in campo blu
BAAR: bacilli alcool acido resistenti
Ziehl Neelsen
Auramina O
Kinyoun
FITC
Valutazione Ziehl-Neelsen
(Kent and Kubuka, 1985, CDC)
BAAR/campi
Referto
0 / 300
Negativo per BAAR
1-2 / 300
Dubbio: ripetizione
1-9 / 100
Positivo per BAAR + - - -
1-9 / 10
Positivo per BAAR + + - -
1-9 / 1
Positivo per BAAR + + + -
>9/1
Positivo per BAAR + + + +
si leggono 300 campi a 1000 ingrandimenti
Ziehl-Neelsen
Sensibilità
10.000 – 100.000 BAAR/ml campione
Falsi negativi dipendono da:
carica
campione biologico
errori tecnici
operatore
Specificità
Falsi positivi:
Nocardia spp, Rhodococcus, Legionella
micdadei, cisti di Cryptosporidium spp. e
Cyclospora spp.
… inoltre …
 L’esame microscopico non fornisce alcuna
informazione riguardo alla vitalità dei
micobatteri osservati: in pazienti in terapia è
possibile il reperto di esame microscopico
positivo ed esame colturale negativo
 I micobatteri atipici possono variare nella
capacità di colorarsi (trattenere la
carbolfucsina dopo decolorazione)
Test basati sugli acidi nucleici
Tecniche di amplificazione degli acidi nucleici
(PCR)
Ricerca di un gene codificante per una
proteina secretoria, il gene sec A, è un
bersaglio utile per identificare tutte le
specie di micobatteri direttamente nei
campioni biologici
Esame colturale
Esame colturale
Sensibilità: 10 – 100 BAAR/ml campione biologico
Processazione del campione:
Decontaminazione
Fluidificazione
Semina in terreni solidi
Semina in terreni liquidi
Esame colturale
Decontaminazione:
NaOH al 10%
Fluidificazione:
N-acetilcisteina
Terreni solidi
A base di uovo:
Lowenstein-Jensen
Petragnani
Sintetici (agarizzati):
Middlebrook 7H10 -7H11
altre componenti:
asparagina, verde malachite, glicerolo
Terreni solidi
• crescita lenta e/o difficile
• rilevazione manuale
• rilevazione colture miste
• analisi morfologia colonie
• determinazione carica
Quantificazione della crescita su terreni solidi
ATS. Diagnosic Standars and Classification of Tuberculosis in Adults and Children
Am J Respir Crit Care Med 161:1376-1395, 2000
N. COLONIE VISTE
0
REFERTO
negativo
< 50
N. colonie
50 - 100
positivo 1 +
100 - 200
positivo 2 +
200 – 500
positivo 3 +
> 500 (patina)
positivo 4 +
TERRENI LIQUIDI
sistema MGIT
(Becton Dickinson)
• crescita più rapida
• rilevazione automatizzata
• necessità di sub-colture su solidi
• impossibilità di quantificare carica
Sistema MGIT
(Becton Dickinson)
Coltura in terreno liquido Middlebrook 7H9
Sul fondo della provetta è presente silicone contenente
un composto fluorescente (complesso metallico di
Rutenio), sensibile alla riduzione della tensione di
ossigeno, che funge da sistema rivelatore
Il consumo di O2 ad opera
del metabolismo dei micobatteri
comporta l’aumento
dell’emissione di fluorescenza
+ O2
- O2
Sistema BACTEC
(Becton Dickinson)
All’interno di un flacone sigillato è presente un
terreno di coltura liquido contenente acido
palmitico marcato con 14C. L’utilizzo di tale
sostanza da parte di micobatteri comporta la
produzione di 14CO2 che si accumula all’interno
del flacone stesso.
Il gas presente nel flacone sigillato viene
analizzato automaticamente dallo strumento e la
quantità di 14CO2 viene rilevata da un beta-counter,
quantificata ed espressa come “indice di
crescita”.
n.b.: non più in uso (meglio non usare isotopi…..)
NUOVI TESTS DIRETTI
Rilevazione diretta di acidi nucleici di
Mycobacterium tuberculosis
complex nei campioni biologici
Probetec SDA (Strand Displacement Amplification)
amplificazione e determinazione del DNA target (IS 61 10)
Test di amplificazione MTD
MTD: Mycobacterium tuberculosis direct
Rileva rRNA di Mycobacterium tuberculosis
complex
Identificazione
IDENTIFICAZIONE
TRADIZIONALE
 Morfologia delle colonie
 Prove biochimiche
MOLECOLARE
 uso di sonde
oligonucleotidiche:
breve sequenze di
nucleotidi
complementari alla
sequenza target
(INNO-LiPA, AccuProbe)
 Sequenziamento
genomico
Identificazione molecolare
Si basa su:
 presenza nel genoma di sequenze
nucleotidiche altamente conservate
specie-specifiche
 uso di sonde oligonucleotidiche: breve sequenze di
nucleotidi complementari alla sequenza target

AccuProbe
bersaglio: 16S rRNA

INNO-LiPA
bersaglio: regione spaziatrice presente tra il gene 16S
e 23S rDNA (ITS)
M. tuberculosis complex
M. kansasii
M. gordonae
M. avium
M. intracellulare
M. avium complex
Terapia, profilassi, controllo
Terapia combinata con
farmaci attivi sulla
parete e sulla sintesi di
acidi nucleici
Attivi sulla parete cellulare:
Isoniazide
Etionammide
Etambutolo
Cicloserina
Attivi sulla sintesi degli acidi nucleici:
Rifampicina
Chinoloni (levofloxacina)
Isoniazide e etionammide: influenzano la sintesi dell’acido
micolico
Etanbutolo: interferisce con la sintesi di arabinogalattano
Cicloserina: inibisce due enzimi, la D-alanina sintetasi e
l’alanina racemasi, che catalizzano la sintesi della parete
Antibiotici attivi sulla
parete dei micobatteri
Prevenzione, Trattamento e Controllo
Mycobacterium tuberculosis
- isoniazide
- rifampicina
- pirazinamide
- etambutolo
(per 9 mesi, 2 volte a
settimana)
Chemioprofilassi:
isoniazide (per 1
anno).
Mycobacterium avium complex
claritromicina o
azitromicina combinata
con etambutolo e
rifabutina.
Mycobacterium kansasii
isoniazide, rifampicina ed
etambutolo con o senza
streptomicina.
Micobatteri a rapida
crescita: claritromcina,
amikacina, imipenem,
cefoxitina, sulfamidici.
Prevenzione, Trattamento e Controllo
Immunoprofilassi:
Vaccino a germi vivi ed attenuati, BCG
(Bacillo di Calmette e Guerin, M. bovis attenuato su
patata glicerinata e biliata).
Controllare dopo la vaccinazione il PPD.
N.B:
Problema attuale:
ceppi MDRTB (multidrug resistant TB)
resistenti a Isoniazide e Rifampicina
e soprattutto XDRTB (extensively multidrug resistant TB)
resistenti a isoniazide e rifampicina +
chinolonici (kanamicina, amikacina)
First-Line Treatment of TB
for Drug-Sensitive TB
MDR TB occurs when a Mycobacterium tuberculosis strain is resistant to
isoniazid and rifampin, two of the most powerful first-line drugs. To cure MDR TB,
healthcare providers must turn to a combination of second-line drugs, several of
which are shown here. Second-line drugs may have more side effects, the
treatment may last much longer, and the cost may be up to 100 times more
than first-line therapy. MDR TB strains can also grow resistant to second-line drugs,
further complicating treatment
XDR TB occurs when a Mycobacterium tuberculosis strain is resistant
to isoniazid and rifampin, two of the most powerful first-line drugs,
as well as key drugs of the second line regimen—any fluoroquinolone
and at least one of the three injectable drugs shown above. XDR TB strains
may also be resistant to additional drugs, greatly complicating therapy.
New Tuberculosis (TB) Drugs Under
Development
La sensibilità ai farmaci
L'aumento di ceppi farmacoresistenza rende l’identificazione del
ceppo necessaria per la selezione
del trattamento farmacologico
adeguato.
Antimycobacterial
agent
Primary agents
Rifampin
Isoniazid
Diversi geni sono stati trovati a
conferire specifiche resistenze. Tali
geni sono ora facilmente identificati
utilizzando tecniche molecola( PCRamplificazione), almeno per la
farmacoresistenza i geni associati
già sequenziati.
Pyrazinamide
Streptomycin
Ethambutol
Secondary agents
Capreomycin
Kanamycin
Cycloserine
Ethionamide
Alternative agents
Rifapentine
Rifabutin
Amikacin
Quinolones,
ciproflaxin
Genetic marker
rpoB (RNA polymerase subunit)
katG (catalase-peroxidase)
inhA
(enoyl-acyl
carrier
protein
reductase)
ahpC (alkyl-hydroperoxide reductase)
kasA (keto-acyl synthase)
Ndh (NADH dehydrogenase)
pncA (pyrazinamidase)
rpsL (S12), rrs (16S rDNA)
embB (arabinosyl transferase)
inhA
(enoyl-acyl
reductase)
carrier
protein
rpoB
rpoB
gyrA, gyrB (DNA gyrase)
Bersagli genetici importanti per la ricerca diretta
dello sviluppo della resistenza ai farmaci antimicobatterici
http://www.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Pages/Default.aspx
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