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HLA-DQ2 / HLA-DQ8
Celiac Disease
REF: RT-59
Genotyping of HLA DQ2 and HLA-DQ8
INTRODUCTION AND PURPOSE OF USE
The Celiac Disease system is a test that allows the
identification of HLA DQ2 and DQ8 aplotypes, by means of
Real Time PCR, specifically it performs the genotyping of
alleles: HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05 and DQB1*02,
DQB1*0302, after genomic DNA extraction from biological
samples.
The Procedure allows the detection of the DNA target by
means a genomic amplification reaction.
The analysis of the results is made by an instrument of Real
Time PCR, composed by a thermal cycler with a system of
fluorescence detection.
CONTENT
The kit contains reagents enough to perform 48 amplification
tests:
R1
R2
R3
Quantity
Description
3 x 430 µl
Amplification mMix
dNTPs, Tris-HCl, KCl, MgCl2, Taq Polymerase,
Nuclease-free water
3 x 130 µl
HLA DQA1 probes Mix
Upstream primer 1, Upstream primer 2, downstream
primer, Target probes (FAM for DQA1*02, VIC for
DQA1*03 and NED for DQA1*05), Nuclease-free
water
3 x 130 µl
HLA DQB1 probes Mix
Upstream primer, downstream primer, Target probe
(FAM for DQB1*02, VIC for DQB1*0302 and NED for
IC •-Globin ), Nuclease-free water
R4
3 x 35 µl
Cloned DNA corresponding to the DQA1*02 allele
R5
3 x 35 µl
Cloned DNA corresponding to the DQA1*03 allele
R6
3 x 35 µl
Cloned DNA corresponding to the DQA1*05 allele
R7
3 x 35 µl
Cloned DNA corresponding to the DQB1*02 allele
R8
3 x 35 µl
Cloned DNA corresponding to the DQB1*0302 allele
R9
1 x 30 µl
Negative Control
Istruction for use: ST.RT59-ENG.4
MATERIALS AND STRUMENTATION REQUIRED
BUT NOT SUPPLIED
Disposable latex powder-free gloves or similar material;
Bench microcentrifuge (12,000 - 14,000 rpm);
Micropipettes and Sterile tips with aerosol filter;
Vortex;
Plastic materials (microplate and optica adesive cover);
Reagents
Manual Extraction
EX05 – DNA Extraction from Blood, Uretral, Vaginal and
Cervical Swab. The kit allows the manual DNA extraction from
Human samples. The kit contains reagents enough to perform
the DNA extraction for 50 samples. (Clonit srl)
Strumentation
Real Time PCR
• 7500 Fast from Lifetechnologies
• StepOne Plus from Lifetechnologies
SAMPLES AND STORAGE
The Celiac Disease system must be used with extracted DNA
from the following biological samples: Blood EDTA. Collected
samples must be shipped and stored at +2 - +8°C and used
within 3 days from the collected data.
Store the sample at -20°C if it is used after 3 days.
PRECAUTIONS USE
This kit is for in vitro diagnostic (IVD), for professional use only
and not for in vivo use.
After reconstitution, the amplification master mix must be
used in one time (16 reactions). Do not re-frost already
used material.
At all times follow Good Laboratory Practice (GLP) guidelines.
Wear protective clothing such as laboratory coats and
disposable gloves while assaying samples.
Avoid any contact between hands and eyes or nose during
specimens collection and testing.
Handle and dispose all used materials into appropriate biohazard waste containers. It should be discarded according to
local law.
Keep separated the extraction and the reagents preparation.
Never pipette solutions by mouth.
Avoid the air bubbles during the master mix dispensing.
Eliminate them before starting amplification.
Wash hands carefully after handling samples and reagents.
Do not mix reagents from different lots.
It is not infectious and hazardous for the health (see Material
Safety data Sheet – MSDS).
Do not eat, drink or smoke in the area where specimens and
kit reagents are handled.
Read carefully the instructions notice before using this test.
Do not use beyond the expiration date which appears on the
package label.
Do not use a test from a damaged protective wrapper.
LIMIT OF THE METHOD
The extreme sensitivity of gene amplification may cause false
positives due to cross-contamination between samples and
controls. Therefore, you should:
physically separate all the products and reagents used for
amplification reactions from those used for other
reactions, as well as from post-amplification products;
use tips with filters to prevent cross-contamination
between samples;
use disposable gloves and change them frequently;
carefully open test tubes to prevent aerosol formation;
- close every test tube before opening another one.
The proper functioning of the amplification mix depends on the
correct collection, correct transportation, correct storage and
correct preparation of a biological sample.
As with any diagnostic device, the results obtained with this
product must be interpreted taking in consideration all the
clinical data and other laboratory tests done on the patient.
As with any diagnostic device, with this product there is a
residual risk of obtaining invalid, false positives or false
negatives results.
STORAGE AND STABILITY
Store the product Celiac Disease at –20°C.
An intact and well stored product has a stability of 12 months
from the date of production.
Do not use beyond the expiration date which appears on the
package label.
ANALYTICAL PROCEDURE
Human DNA Extraction
Manual Extraction
EX05 - DNA Extraction from Blood, Uretral, Vaginal and
Cervical Swab
1. add 0.2 ml of whole blood from each specimen to the
relevant test tube after mixing it
2. if a precipitate has formed in buffer AL, dissolve by
incubating at 56°C
3. add 20 µl proteinase K solution and 200 µl buffer AL. Mix
immediately by vortexing for 15 seconds
4. incubate at 56°C for 10 minutes. Briefly centrifuge the tube
to remove drops from the inside of the lid
5. add 200 µl ethanol 95% to the sample, and mix again by
pulse-vortexing for 15 seconds. Briefly centrifuge the tube to
remove drops from the inside of the lid
6. carefully apply the mixture from step 5 to the spin column
(in a 2 ml collection tube) without wetting the rim, close the
cap and centrifuge at 6000 g for 1 minute. Place the spin
column in a clean 2 ml collection tube and discard the tube
containing the filtrate
7. carefully open the spin column and add 500 µl buffer AW1
without wetting the rim. Close the cap and centrifuge at
6000 g for 1 minute. Place the spin column in a clean 2 ml
collection tube and discard the collection tube containing
the filtrate
8. carefully open the spin column and add 500 µl buffer AW2
without wetting the rim. Close the cap and centrifuge at full
speed for 3 minutes
9. place the spin column in a clean 1.5 ml microcentrifuge tube
and discard the collection tube containing the filtrate.
Carefully open the spin column and add 50 µl buffer AE.
Incubate at room temperature for 1 minute and then
centrifuge at 6000 g for 1 minute
Samples are now ready for amplification or storage at -20°C.
SOFTWARE SETTING:
Lifetechnologies 7500 fast/StepOne plus
Turn the instrument and the computer on and open the control
software. Click on “Advance Setup”: by default the sofware
will shows the page “experiment properties”. Write in the
“experiment name” the file name, choose the type of
instrument (ABI7500 or ABI7500fast), the type of reaction
(quantitation standard curve), the type of used reagent
(TaqmanReagents) and the reaction time of analysis
(Standard ≈ 2 hours to complete a run).
Open the page named “page setup” (sheet Define Target
and Samples).
In the window Define Targets set:
Target
HLA DQA1*02 probe:
HLA DQA1*03 probe:
HLA DQA1*05 probe:
HLA DQB1*02 probe:
HLA DQB1*0302 probe:
IC (β-globin) probe:
Reporter
FAM
VIC
NED
FAM
VIC
NED
Quencer
NFQ
NFQ
NFQ
NFQ
NFQ
NFQ
Distribute, in the amplification plate, 20 µl of just
reconstituted mix in chosen positions and already setted on
the instrument software.
Distribute, in the negative conrol position, 5µl of solution taken
by the negative control vial.
Distribute, in chosen positions for the positive controls, 5µl of
DQA1*02 positive control, DQA1*03 positive control,
DQA1*05 positive control, DQB1*02 positive control and
DQB1*0302 positive control solution.
Seal up accurately the plate using an optichal adesive film and
verify that there aren’t air bubbles in the mix to avoid the
amplification interferences.
Transfer the plate in the instrument and push the button “Start
Run”.
QUALITATIVE ANALYSIS
Lifetechnologies 7500 Fast, StepOne Plus.
At the end of the PCR run, the software automatically opens
the "Analysis" window in the "Amplification plot" sheet on
the menu on the left.
Select an area of the plate where the controls will be placed:
select wells of the plate and set both targets (HLA DQA1*02,
DQA1*03, DQA1*05, DQB1*02, DQB1*0302 and β-globin).
Select “Assign target to selected wells” in the blank, the
“task Standard (S)” for HLA DQA1 and DQB1 targets and set
the controls’concentration.
Select the wells corresponding to the positive control, negative
control and samples for analysis.
Choose an area in the plate where negative control will be
placed: select “Assign target to selected wells” in the blank,
the “task Negative (N)” for the HLA DQA1*02, DQA1*03,
DQA1*05, DQB1*02, DQB1*0302 and β-globin targets.
Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up
menu the HLA DQA1*03 target. Enter the threshold indicated
in the table.
S1
S2
S3
S4
S5
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
N
N
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
Mix HLA DQA1
Set ROX as passive reference, using it as normalizer of
detected fluorescence.
Open “Run Method” (sheet Graphic View) and set the
thermal cycling as follows:
cycles
1
1
35
Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up
menu the HLA DQA1*02 target. Enter the threshold indicated
in the table.
Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up
menu the HLA DQA1*05 target. Enter the threshold indicated
in the table.
Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up
menu the HLA DQB1*02 target. Enter the threshold indicated
in the table.
denaturation
50° C 2 min
95°C 10 min
95° C 15 sec
In the window “Reaction volume plate per well” set a volume
of 25 µl.
After having prepared the plate, and correctly inserted in the
instrument, press the button “Start Run”.
PREPARATION OF THE REACTIONS:
Defrost a tube of Amplification mMix;
Defrost one tube of HLA DQA1 probes Mix and one tube of
HLA DQB1 probes Mix;
Mix carefully by vortex 210µl of Amplification mMix, 126µl di
HLA DQA1 probes Mix and 210µl di Amplification mMix
with 126µl di HLA DQB1 probes Mix (the mix as produced is
enough to prepare 16 reactions of amplification).
Parameter
Positive control HLA DQB1.02
Positive control HLA DQB1.03.02
If the amplification reaction of each controls produces a Ct >
27 the session can’t be considered valid and so it must be
cancelled.
Be sure that there isn’t any specific fluorescence increasing for
examining target in negative control (FAM).
In the amplification reaction of each sample, the Ct values for
the internal control (β-globin) specific probe are used for
validating the analysis session. Beginning from extraction
process until detection step. Be sure that emitted fluorescence
from internal control amplification has not a Ct > 27 or
undetermined. If the internal control Ct > 27 means that some
problems happened in the extraction step or in the
amplification step; therefore the sample could be a false
negative. Repeat the sample.
ANALYSIS OF THE RESULTS
The most relevant genetic factor present in HLA region is
represented by DQ2 heterodimer; it is coded by HLA DQA1*05
and DQB1*02 genes. Celiac disease affected that are negative
for DQ2 show, in the major part of cases, the DQ8
heterodimer, coded by HLA DQA1*03 and DQB1*0302.
HLA DQ2
NEGATIVE
VIC
Threshold
0.1
0.1
NED
Threshold
0.1
0.1
The analysis of the results is made selecting from the menu in
the left the page “Analysis”. From the page “Amplification
Plot” verify the amplification plot for every single sample.
Opening the sheet “view well table” in the right side of the
software it is possible to verify the data obtained from
experiments: Threshold Cycles and emitted fluorescences.
Clicking from the menu file and selecting the box export, the
window “export properties” will open. Indicate the file name,
select the position to save it (Browse) and click on button
“Start export”. In this way the software will permit to save a
excel file with all the data corresponding to selected
experiment.
INTERPRETATION OF RESULTS
In the Real Time PCR reaction the Ct values of specific probe
are used for detect the presence of the Target in analysis.
As with any diagnostic device, the results obtained with this
product must be interpreted taking in consideration all the
clinical data and other laboratory tests done on the patient.
The use of positive and negative control in each amplification
session allows to verify the correct functioning of the
amplifcation mix and the absence of any contamination.
The instrument software is able to analyze the fluorescences
that are emitted by the specific probe for HLA DQA1*02 (FAM),
DQA1*03 (VIC), DQA1*05 (NED) and DQB1*02 (FAM),
DQB1*0302 (VIC) and β-globin (NED).
Reference
Ct ≤ 27
Ct ≤ 27
Be sure that there isn’t any specific fluorescence increasing for
examining target in negative control (FAM, VIC and NED).
Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up
menu the IC • -Globin target. Enter the threshold indicated in
the table.
FAM
Threshold
0.2
0.2
Reference
Ct ≤ 27
Ct ≤ 27
Ct ≤ 27
Mix HLA DQB1
POSITIVE
annealing/extension
60° C 1 min
Parameter
Positive control HLA DQA1.02
Positive control HLA DQA1.03
Positive control HLA DQA1.05
Select in the "Option" window inside the "Target" pop-up
menu the HLA DQB1*0302 target. Enter the threshold
indicated in the table.
7500 Fast
StepOne Plus
Mix HLA DQB1
A proper functioning of the amplification mix can be verified
analyzing these parameters:
Mix HLA DQA1
Distribute, in chosen position for each sample, 5µl of
corresponding sample.
Set the samples’ name in the window “Define Samples”.
In the same page “plate setup” select the sheet “Assign
Target and Samples”. On the screen you will see the
microplate draft.
Select an area of the plate where samples will be placed:
select the wells and set both targets (HLA DQA1, DQB1 and βglobin). Link every well to a sample, through the window
“Assign samples to selected wells”.
For each sample, select in the blank “Assign targets to
selected wells” the “task UnKnown (U)” for the HLA
DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05, DQB1*02, DQB1*0302 and βglobin targets.
Concerning the haplotype DQB1*0302, are considered as
positive only samples with a Ct <31.
DQB1*02
X
X
X
X
DQA1*05
DQA1*02
X
X
X
X
X
X
X
X
The main genetic factor is localized in the HLA-DQ region and
it’s represented by DQ2 heterodimer coded by HLA-DQA1*05
and DQB1*02 genes.
DQB1*02: only beta chain DQ2
DQB1*02 and DQA1*05: DQ2
DQB1*02 and DQA1*02: Only beta chain DQ2 heterodimer
DQB1*02, DQA1*05 and DQA1*02: DQ2 heterodimer
HLA DQ8
POSITIVE
DQA1*03
X
NEGATIVE
X
DQB1*0302
X
X
In people suffering from celiac disease that are negative for
HLA-DQ2, this genetic illness is dued to the presence of DQ8
heterodimer coded by HLA-DQA1*03 and DQB1*0302 genes.
PERFORMANCES
Clinical Sensitivity:
With the aim of this evaluation, clinic sensitivity is considered
as the capacity of determinate real positive in whole number of
screened positive samples. The analysis is prepared on
positive sample for DQ2 and DQ8 and the test is performed
following the instruction present in the method, making a
comparison between our method and a system with CE mark,
already marked.
Analyzed samples
Obtained Results
Clinical Sensitivity
HLA-DQ2
29
29
HLA-DQ2/HLA-DQ8
6
6
HLA-DQ8
13
13
100%
100%
100%
Diagnostic Specificity:
With the aim of this evaluation, diagnostic specificity is
considered as the capacity of determinate real negative
samples. Diagnostic specificity of the system is valued
analyzing genomic human samples tested and confirmed to be
negative with another system already marked.
Samples
Donors’ EDTA blood
N
50
Positive
1
Negative
49
Diagnostic specificty results at 98% for samples of DNA
extracted by whole blood EDTA
Analytical Specificity:
Test’s specificity is guaranteed by the use of specific primers
for determining HLA DQ. haplotypes.
The alignment of the choose regions for specific primers’
hybridization for HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05 and
DQB1*02, DQB1*0302 with available sequences present in
database, demonstrated their conservation, the absence of
significative mutations and the complete specificity for the
analyzed target.
INTERFERENCES:
Verify that in DNA extracted from the sample there aren’t
nucleoproteins and haemoglobin, in way of exclude possible
inhibition of PCR reactions. The interference due to
contaminants
can
be
highlighted
through
the
spectrophotometric analysis and obtained data report at 260
nm (maximum absorbtion of Nucleic Acids) and 280 nm
(maximum absorbtion of Proteins). A pure DNA might have a
rate of approximately 1.8.
QUALITY CONTROL
It is therefore recommended to insert as quality control of
every extraction session, amplification and detection of a
negative sample and of a positive sample which have already
tested before or referential material with known concentration.
BIBLIOGRAPHY
TROUBLESHOOTING
Petronzelli F. et al. “Genetic contribution of the HLA region
to the familial clustering of celiac disease”. Ann. Hum.
Genet. 1997; 61: 307-17
Presence, in the negative control, of the fluorescence specific
for the target:
Bevan S., et al. “Contribution of the MHC region to the
familial risk of celiac disease”. J. Med Genet 1999; 36: 68790
Possible causes
Contamination during
the dispensing of the
positive sample or of
the positive control
De Marchi et al. “Two HLA-DR alleles are associated with
celiac disease”. Tissue Antigens 1979; 14: 309-16
Karell K et al. “HLA types in celiac disease patients not
carrying DQ2 heterodimer”. Hum Immunol 2003; 64: 469-77
M. Valisi, A. Colombo, A. Donnangelo, A. Marzorati, D.
Stangalini , A. Stangalini, C. Roccio, D. Russo.”Multiplex Real
Time PCR evaluation of celiac disease predisposition
(HLA-DQ2 AND HLA-DQ8) in 102 cases and relative
correlation with HLA-DRB1 HAPLOTYPE investigated by
reverse Dot-Blot Hybridication”. SIBIOC 2012 congress.
http://www.clonit.it/en-GB/research-and-development/scientificreferences-and-medical-publication/
Contamination of the
amplification mixes
Badly
sealed
microplate
Error
during
the
setup of the plate on
the instrument
In vitro diagnostic device
Read the instruction’s manual
Solutions
•
Use only micropipettes and Sterile tips
with aerosol filter
•
Always change tip between a sample and
another
•
Clean surfaces and instruments with
aqueous detergents, wash lab coats,
replace test tubes and tips in use
•
During analytical stage, dispense the
positive control at the end of the analytical
procedure
•
During analytical stage, dispense the
negative control at the beginning of the
analytical procedure
•
Don’t dispense the amplification mix with
the same pipettes used in the extraction
or detection area
•
Use only micropipettes and Sterile tips
with aerosol filter
•
Clean surfaces and instruments with
aqueous detergents, wash lab coats,
replace test tubes and tips in use
•
Seal the amplification mix and return it at 20°C before to open the other sample
tubes
•
Seal very carefully the microplate
•
•
Contamination of the
area dedicated to the
amplification stage
Check
the
correct
correspondence
between setting on the instrument and the
real positions on the microplate (for
samples, negative controls and standard)
Clean surfaces and instruments with
aqueous detergents that can degrade
DNA, wash lab coats, replace test tubes
and tips in use
Range of temperature
Use within (dd/mm/yyyy: yearmonth)
Lot (xxxx)
Code
Manufacturer
Contains sufficient for <n> tests
EDMA code: 1601049000
CND: W0105040205
Failure or incorrect amplification of the positive control:
Possible causes
Possible mistakes in
the dispensation of
the positive control
Positive
Control
Degradation
Wrong heat protocol
The reaction mix is
mantained at room
temperature for too
long
Solutions
•
Dispense carefully the positive control
•
Check the calibration of micropipettes
used
•
Verify that the amount of positive control
dispensed corresponds to the quantity
indicated in the Analytical Procedure (5•l)
•
Test the mixture through a new batch of
positive control
•
Check the thermal cycler setting
•
Keep the amplification mix on ice during
the use and store it at -20 ° C immediately
after finishing the preparation of test
samples
Failure or incorrect amplification of internal control in tested
samples:
Possible causes
Presence
of
possibile
interferences
Extracted DNA in
insufficient
quantity
Solutions
•
Carefully repeat sample extraction stage
•
•
Carefully repeat sample extraction stage
Accurately samples storage
CLONIT S.r.l.
Headquarter: Via Varese 20 – 20121 Milano
Production Site: Via B. Quaranta 57 - 20139 Milano
Tel. + 39. (0)2.56814413 fax. +39. (0)2.56814515
www.clonit.it - [email protected]
for in vitro diagnostic use
ST. RT59-ENG.4
Printed: 07th July 2014
HLA-DQ2 / HLA-DQ8
Celiac Disease
REF: RT-59
Genotipizzazione degli alleli HLA DQ e DR
INTRODUZIONE E DESTINAZIONE D’USO
Il prodotto Celiac Disease è un saggio che consente
l’identificazione degli aplotipi HLA DQ2 e DQ8 mediante
metodica Real Time PCR; nello specifico, permette la
genotipizzazione degli alleli HLA DQA1*02, DQA1*03,
DQA1*05 e DQB1*02, DQB1*0302 dopo estrazione di DNA
genomico da campioni biologici.
La procedura prevede il rilevamento del DNA target di
interesse mediante una reazione di amplificazione genomica in
micropiastra. L’analisi dei risultati viene effettuata tramite uno
strumento di Real Time PCR, composto da un thermal cycler
provvisto di un sistema di rilevamento della fluorescenza.
COMPOSIZIONE
Il sistema contiene reagenti sufficienti per l’esecuzione di 48
test.
Quantità
Descrizione
3 x 420 µl
Amplification mMix
dNTPs, Tris-HCl, KCl, MgCl2, Taq Polymerase,
Nuclease-free water
3 x 130 µl
HLA DQA1 probes Mix
Upstream primer 1, Upstream primer 2, downstream
primer, Target probes (FAM for DQA1*02, VIC for
DQA1*03 and NED for DQA1*05), Nuclease-free
water
R3
3 x 130 µl
HLA DQB1 probes Mix
Upstream primer, downstream primer, Target probe
(FAM for DQB1*02, VIC for DQB1*0302 and NED for
IC •-Globin ), Nuclease-free water
R4
3 x 35 µl
Controllo positivo allele DQA1*02
R5
3 x 35 µl
Controllo positivo allele DQA1*03
R6
3 x 35 µl
Controllo positivo allele DQA1*05
R7
3 x 35 µl
Controllo positivo allele DQB1*02
R1
R2
R8
3 x 35 µl
Controllo positivo allele DQB1*0302
R9
1 x 30 µl
Controllo negativo
Istruzioni per l’uso: ST.RT59-ITA.3
MATERIALE E STRUMENTAZIONE NECESSARIA
MA NON FORNITA
Gli utilizzatori devono seguire le norme “Good Laboratory
Practice” (GLP).
Indossare abiti protettivi come camice di laboratorio e guanti
monouso durante la manipolazione di campioni.
Evitare il contatto con tra le mani e occhi o naso durante la
raccolta ed uso dei campioni.
La raccolta di tutti i materiali utilizzati deve essere fatto in
appositi contenitori e lo smaltimento svolto in accordo con le
leggi locali.
Disporre aree separate per l’estrazione e l’allestimento delle
reazioni.
Non pipettare a bocca alcuna soluzione.
Evitare la formazione di aria nel depositare la miscela
all’interno delle provette. Eliminare ogni bolla prima di
procedere con l’amplificazione.
Lavare bene le mani dopo aver maneggiato i campioni ed i
reagenti.
Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi.
Non è infettivo o pericoloso per la salute (vedi schede di
sicurezza).
Non mangiare, bere o fumare dove i campioni ed i kit vengono
utilizzati.
Leggere attentamente le istruzioni d’uso prima di utilizzare il
test.
Non utilizzare oltre la data di scadenza riportata sulla scatola.
Non utilizzare il kit se l’involucro è danneggiato.
LIMITI DEL METODO ED AVVERTENZE
L’elevata sensibilità della metodica di amplificazione genica
rende possibile l’insorgenza di falsi positivi, dovuti a
contaminazioni crociate fra campioni e controlli. E’ pertanto
necessario attenersi alle seguenti indicazioni:
•
separare fisicamente tutti i materiali e reagenti
dedicati alla reazione di amplificazione da quelli
utilizzati per altre metodiche e dai prodotti già
amplificati
•
utilizzare puntali con filtro per evitare contaminazioni
crociate fra campioni
•
cambiare frequentemente i guanti
•
aprire le provette con cautela per prevenire la
formazione di aerosol
•
chiudere ogni provetta prima di aprirne un’altra
L’ottimale funzionamento della miscela di amplificazione
dipende dalla corretta raccolta, dal corretto trasporto, dal
corretto stoccaggio nonché da una corretta preparazione del
campione biologico prelevato.
I risultati ottenuti utilizzando il prodotto devono essere
interpretati considerando tutti i dati clinici e laboratoristici legati
al paziente.
Come per qualunque altro dispositivo diagnostico, esiste un
rischio residuo di ottenere risultati non validi che non può
essere eliminato o ridotto ulteriormente.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Guanti senza polvere monouso in lattice o simili;
Microcentrifuga da banco;
Micropipette e puntali sterili con filtro incorporato per la
prevenzione di aerosol;
Vortex;
Materiale plastico monouso sterile (Micropiastra e pellicole
ottiche adesive);
Conservare il prodotto Celiac Disease a –20°C.
Il prodotto integro e correttamente conservato ha una stabilità
di 12 mesi dalla data di produzione.
Non utilizzare oltre la data di scadenza riportata sulla scatola.
Reagenti
EX05 - Estrazione di DNA da sangue o tampone uretrale,
vaginale e cervicale
Il Sistema consente l’estrazione del DNA dai campioni in
esame. Il kit contiene reagenti utili per 50 estrazioni.
Estrazione Manuale
EX05 - Estrazione di DNA da sangue o tampone uretrale,
vaginale e cervicale.
Strumenti
Real Time PCR
• 7500 Fast from Lifetechnologies
• StepOne Plus from Lifetechnologies
CAMPIONI E CONSERVAZIONE
Il prodotto Celiac Disease è progettato per essere utilizzato
con DNA estratto dai seguenti campioni biologici: Sangue
intero EDTA. I campioni raccolti devono essere trasportati e
conservati a +2-+8°C ed utilizzati entro 3 giorni dalla data del
prelievo. Conservare il campione a -20°C se utilizzato dopo 3
giorni.
PRECAUZIONI D’USO
Il kit è per un uso diagnostico in vitro (IVD), per uso
professionale e non per uso in vivo.
Una volta ricostituita, la miscela di amplificazione deve
essere utilizzata in un'unica sessione (16 reazioni). Non
ricongelare il materiale già utilizzato.
PROCEDURA ANALITICA
Estrazione di DNA genomico
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
porre 200 µl di sangue in una provetta da 2 ml
se nel buffer AL è presente un precipitato, scaldarlo a
56°C per scioglierlo
aggiungere 20 µl di soluzione di proteinasi K e 200 µl di
buffer AL: miscelare vortexando per 15 secondi
incubare a 56°C per 10 minuti e centrifugare brevemente
per togliere eventuali gocce dal tappo della provetta
aggiungere 200 µl di etanolo 95%, vortexare per 15
secondi e ricentrifugare brevemente
predisporre le colonnine, inserite nei tubi di raccolta, in
un numero pari a quello dei campioni trattati
aggiungere la miscela ottenuta al punto 6 all'interno delle
colonnine e centrifugare a 6.000 g per 1 minuto. Porre le
colonnine in un tubo di raccolta pulito ed eliminare
quello contenente il filtrato
aggiungere 500 µl di buffer AW1 in ogni colonnina e
centrifugare a 6.000 g per 1 minuto. Porre le colonnine in
un tubo di raccolta pulito ed eliminare quello
contenente il filtrato
aggiungere 500 µl di buffer AW2 in ogni colonnina e
centrifugare a 14.000 g per 3 minuti. Porre le colonnine
in una provetta da 1,5 ml ed eliminare quella contenente
il filtrato
aggiungere 50 µl di buffer AE in ogni colonnina,
incubare a temperatura ambiente per 1 minuto e
centrifugare a 6.000 g per 1 minuto: nell'eluato è
presente il DNA
Aprire la pagina “Run Method” (sheet Graphic View) ed
impostare il ciclo termico corretto:
Il campione così preparato può essere utilizzato subito oppure
conservato a -20°C.
Nella finestra “Reaction volume plate per well” impostare il
volume di 25 µl.
10.
IMPOSTAZIONI DEL SOFTWARE
Lifetechnologies 7500 fast/StepOne plus
Accendere lo strumento, il computer ed avviare il software di
controllo. Dalla schermata principale del software cliccare sul
bottone “Advanced Setup”: di default il software vi mostra la
pagina “experiment properties”. Digitare nella finestra
“experiment name” il nome con il quale verrà salvato
l’esperimento. Scegliere il tipo di strumento che si utilizza
(ABI7500 o ABI7500fast – StepOne o StepOne plus),
scegliere il tipo di esperimento (quantitation standard curve),
il tipo di reagenti utilizzati (Taqmanreagents) ed il tempo di
reazione (Standard ≈ 2 hours to complete a run).
Aprire la pagina “page setup” (sheet Define Target and
Samples).
Nella finestra “Define Targets” impostare:
Target
HLA DQA1*02 probe:
HLA DQA1*03 probe:
HLA DQA1*05 probe:
HLA DQB1*02 probe:
HLA DQB1*0302 probe:
IC (β-globin) probe:
Reporter
FAM
VIC
NED
FAM
VIC
NED
Quencer
NFQ
NFQ
NFQ
NFQ
NFQ
NFQ
Nella finestra “Define Samples” impostare il nome dei
campioni in analisi.
Sempre nella pagina “plate setup” selezionare lo sheet
“Assign Target and Samples”: comparirà nella vostra
schermata la piastra schematizzata.
Scegliere una zona della piastra dove verranno posizionati i
controlli HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05: selezionare i
pozzetti della piastra ed impostare tutti i target in analisi (HLA
DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05). Selezionare nello spazio
“Assign target to selected wells” il “task Standard (S)”
Scegliere una zona della piastra dove verranno posizionati i
controlli DQB1*02, DQB1*0302
selezionare i pozzetti della piastra ed impostare tutti i target in
analisi (DQB1*02, DQB1*0302). Selezionare nello spazio
“Assign target to selected wells” il “task Standard (S)”
Scegliere una zona della piastra dove verrà posizionato il
controllo negativo: selezionare nello spazio “Assign target to
selected wells” il “task Negative (N)” per i target HLA DQA1,
DQB1 e •-globina.
Scegliere una zona della piastra dove verranno posizionati i
campioni in analisi per i target HLA DQA1*02, DQA1*03,
DQA1*05: selezionare i pozzetti della piastra ed impostare tutti
i target (DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05). Associare,ad ogni
pozzetto un campione in analisi mediante la finestra “Assign
samples to selected wells”. Selezionare per ciascun
campione nell’apposito spazio “Assign targets to selected
wells” il “task UnKnown (U)”
Scegliere una zona della piastra dove verranno posizionati i
campioni in analisi per i target HLA DQB1*02, DQB1*0302 e •globina: selezionare i pozzetti della piastra ed impostare tutti i
target (HLA DQB1*02, DQB1*0302 e •-globina). Associare,ad
ogni pozzetto un campione in analisi mediante la finestra
“Assign samples to selected wells”. Selezionare per ciascun
campione nell’apposito spazio “Assign targets to selected
wells” il “task UnKnown (U)”
S1
S2
S3
S4
S5
N
N
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
Mix HLA DQA1
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
cycles
1
1
35
denaturation
50° C 2 min
95°C 10 min
95° C 15 sec
annealing/extension
60° C 1 min
Non appena preparata la piastra, e dopo averla correttamente
inserita nello strumento, premere il pulsante “Start Run”.
ALLESTIMENTO DELLE REAZIONI:
Scongelare una provetta di Amplification mMix;
Scongelare una provetta di HLA DQA1 probes Mix e una di
HLA DQB1 probes Mix.
Miscelare accuratamente mediante vortex 210 µl di
Amplification mMix, 126 µl di HLA DQA1 probes Mix;
Miscelare accuratamente mediante vortex 210 µl di
Amplification mMix con 126 µl di HLA DQB1 probes Mix;
Le miscela così prodotte sono sufficienti per l’esecuzione di 16
reazioni di amplificazione.
Dispensare, nella piastra di amplificazione, 20 µl della
miscela appena ricostituita nelle posizioni prescelte e gia’
predisposte sul software dello strumento.
Dispensare, nella posizione del controllo negativo, 5 µl di
soluzione prelevata dalla vial controllo negativo.
Dispensare, nelle posizioni predefinite per ciascun campione,
5 µl del campione corrispondente.
Dispensare, nelle posizioni predisposte per i controlli positivi,
5 µl di soluzione DQA1*02 positive control, DQA1*03
positive control, DQA1*05 positive control, DQB1*02
positive control e DQB1*0302 positive control
Sigillare accuratamente la piastra mediante l’utilizzo di optichal
adesive film e verificare che, nella miscela, non vi siano bolle
d’aria che possano interferire con l’amplificazione.
Trasferire la piastra nello strumento e premere il pulsante
“Start Run”.
ANALISI QUALITATIVA
Lifetechnologies 7500 Fast, StepOne Plus.
Al termine della corsa di PCR il software apre
automaticamente la finestra “Analysis” nella sezione
“Amplification plot” posta nel Menu a sinistra.
Selezionare dalla piastra i pozzetti corrispondenti ai controlli
positivi, al controllo negativo ed ai campioni in analisi.
Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target”
e impostare HLA DQA1*02. Inserire il Threshold indicato in
tabella.
Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target”
e impostare HLA DQA1*03. Inserire il Threshold indicato in
tabella.
Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target”
e impostare HLA DQA1*05. Inserire il Threshold indicato in
tabella.
Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target”
e impostare HLA DQB1*02. Inserire il Threshold indicato in
tabella.
Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target”
e impostare HLA DQB1*0302. Inserire il Threshold indicato in
tabella.
Selezionare nella finestra “Option” il Menu a tendina “Target”
e impostare IC Control. Inserire il Threshold indicato in
tabella.
7500 Fast
StepOne Plus
Mix HLA DQB1
Impostare come passive reference, utilizzato
normalizzatore della fluorescenza rilevata, il ROX.
come
FAM
Threshold
0.2
0.2
VIC
Threshold
0.1
0.1
NED
Threshold
0.1
0.1
Selezionando lo sheet “view well table” è possibile
visualizzare al posto della rappresentazione della piastra in
analisi, la tabella con i risultati ottenuti. Cliccando sul Menu
“file” e successivamento su “export” è inoltre possibile
esportare i dati su file exel.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Nelle reazioni di amplificazione di ciascun campione, i valori di
Ct delle sonda specifiche sono utilizzate per rilevare la
presenza dei Target in analisi.
I risultati ottenuti con questo saggio devono essere interpretati
considerando tutti i dati clinici e gli altri esami di laboratorio
relativi al paziente.
L’utilizzo del controllo positivo e negativo all’interno di ogni
sessione di amplificazione consente di verificare il corretto
funzionamento della miscela e l’assenza di possibili
contaminazioni.
Il software dello strumento è in grado di analizzare le
fluorescenze emesse dalle sonde specifiche per HLA
DQA1*02 (FAM), DQA1*03 (VIC), DQA1*05 (NED) e DQB1*02
(FAM), DQB1*0302 (VIC) e IC •-Globina (NED). Una corretta
analisi dei risultati necessita di un corretto setting della
strumentazione. A tale scopo impostare:
Per quanto riguarda l’aplotipo DQB1*0302 sono da
considerarsi positivi solamente i campioni che presentano un
Ct < 31.
Un corretto funzionamento della miscela di amplificazione può
essere verificato analizzando i seguenti parametri :
Mix HLA DQA1
Parameter
Positive control HLA DQA1.02
Positive control HLA DQA1.03
Positive control HLA DQA1.05
Reference
Ct ≤ 27
Ct ≤ 27
Ct ≤ 27
Mix HLA DQB1
Parameter
Positive control HLA DQB1.02
Positive control HLA DQB1.03.02
Reference
Ct ≤ 27
Ct ≤ 27
N.B.: In tutti i campioni in esame, il target IC •-Globina dovrà
presentare un Ct ≤ 27, per confermare all’utente una corretta
seduta di estrazione.
Assicurarsi che non vi sia nel controllo negativo alcun aumento
della fluorescenza specifica per i target in esame (FAM, VIC e
NED).
Nelle reazioni di amplificazione di ciascun campione, i valori di
Ct della sonda specifica per il controllo interno (β-globina)
vengono utilizzati per convalidare la sessione d’analisi a partire
dal processo di estrazione sino alla fase di detection.
Assicurarsi che la fluorescenza emessa dall’amplificazione del
controllo interno non presenti un Ct > 27 o undetermined. Se
un campione presenta Target undetermined e Ct del controllo
interno >27 significa che si sono verificati problemi nella fase di
estrazione o nella fase di amplificazione e quindi il campione
potrebbe essere un falso negativo. Ripetere il campione.
ANALISI DEI RISULTATI
La tipizzazione HLA nella Celiachia è un test genetico di
suscettibilità che valuta la maggiore o minore predisposizione
di un individuo a sviluppare la malattia.
L’analisi dei geni HLA di suscettibilità ha soprattutto valore
predittivo negativo, in quanto l’assenza di alleli a rischio rende
altamente improbabile lo sviluppo della malattia.
HLA DQ2
POSITIVE
NEGATIVE
DQB1*02
X
X
X
X
DQA1*05
DQA1*02
X
X
X
X
X
X
X
X
Il principale fattore genetico si trova nella regione HLA-DQ ed
è rappresentato dall’eterodimero DQ2 codificato dai geni HLADQA1*05 e DQB1*02.
DQB1*02: Solo catena beta eterodimero DQ2
DQB1*02 e DQA1*05: Eterodimero DQ2
DQB1*02 e DQA1*02: Solo catena beta eterodimero DQ2
DQB1*02, DQA1*05 e DQA1*02: Eterodimero DQ2
Gli affetti da celiachia negativi per HLA-DQ2 presentano per la
maggior parte l’eterodimero DQ8 codificato dai geni HLADQA1*03 e DQB1*0302.
HLA DQ8
POSITIVE
DQA1*03
X
NEGATIVE
X
DQB1*0302
X
X
CARATTERISTICHE FUNZIONALI
Sensibilità clinica:
Ai fini della presente valutazione, viene considerata sensibilità
clinica la capacità di determinare veri positivi sulla totalità di
campioni positivi screenati. L’analisi è stata effettuata su
campioni positivi per DQ2 e DQ8 ed il test è stato eseguito
seguendo le indicazioni riportate nella metodica confrontando
la metodica con un sistema marcato CE già presente in
commercio.
Campioni Analizzati
Risultati ottenuti
HLA-DQ2
29
29
HLA-DQ2/HLA-DQ8
6
6
HLA-DQ8
13
13
Sensibilità Clinica
100%
100%
100%
Specificità Diagnostica:
Ai fini della presente valutazione viene considerata specificità
diagnostica la capacità del metodo di determinare campioni
veri negativi. La specificità diagnostica del sistema è stata
valutata analizzando campioni genomici umani testati e
confermati negativi con un altro sistema presente in
commercio.
Samples
Donors’ EDTA blood
N
50
Positive
1
Negative
49
La specificità diagnostica risulta essere al 98% per i campioni
di DNA estratto da sangue intero con EDTA.
Specificità Analitica:
La specificità del test è garantita dall’utilizzo di primers specifici
per la determinazione degli aplotipi HLA DQ.
L’esame di allineamento delle regioni scelte per l’ibridazione
dei primers specifici per HLA DQA1*02, DQA1*03, DQA1*05 e
DQB1*02, DQB1*0302 e •-Globina, con le sequenze
disponibili in banca dati ha dimostrato la loro conservazione,
l’assenza di mutazioni significative e la completa specificità per
i target analizzati. Campioni riconosciuti come positivi per un
determinato aplotipo devono essere riconosciuti come tali dal
sistema di amplificazione descritto.
INTERFERENZE
Verificare che nel DNA estratto dal campione di partenza non
vi siano presenti mucoproteine ed emoglobina in modo da
escludere eventuali inibizioni nella reazione di PCR.
L'interferenza dovuta a contaminanti può essere evidenziata
mediante l’analisi spettrofotometrica e rapporto dei dati ottenuti
a 260 nm (Assorbimento massimo Acidi Nucleici) e 280 nm
(Assorbimento massimo Proteine). Un DNA puro dovrebbe
avere un rapporto di circa 1.8.
CONTROLLO QUALITA’
Si consiglia inoltre di inserire come controllo di qualità interno
di ciascuna sessione di estrazione, amplificazione e
rilevamento un campione negativo ed un campione positivo già
testati in precedenza o materiale di riferimento a titolo noto.
BIBLIOGRAFIA
TROUBLESHOOTING
Petronzelli F. et al. “Genetic contribution of the HLA region
to the familial clustering of celiac disease”. Ann. Hum.
Genet. 1997; 61: 307-17
Comparsa, nel controllo negativo, della fluorescenza specifica
per il Target in esame:
Bevan S., et al. “Contribution of the MHC region to the
familial risk of celiac disease”. J. Med Genet 1999; 36: 68790
De Marchi et al. “Two HLA-DR alleles are associated with
celiac disease”. Tissue Antigens 1979; 14: 309-16
Possibili Errori
Possibile
contaminazione
durante
la
dispensazione di un
campione positivo o
del controllo positivo
Karell K et al. “HLA types in celiac disease patients not
carrying DQ2 heterodimer”. Hum Immunol 2003; 64: 469-77
M. Valisi, A. Colombo, A. Donnangelo, A. Marzorati, D.
Stangalini , A. Stangalini, C. Roccio, D. Russo.”Multiplex Real
Time PCR evaluation of celiac disease predisposition
(HLA-DQ2 AND HLA-DQ8) in 102 cases and relative
correlation with HLA-DRB1 HAPLOTYPE investigated by
reverse Dot-Blot Hybridication”. SIBIOC 2012 congress.
http://www.clonit.it/en-GB/research-and-development/scientificreferences-and-medical-publication/
Contaminazione
della
Miscela
Amplificazione
di
Micropiastra sigillata
male
Errore
durante
l’impostazione della
piastra
sullo
strumento
Contaminazione
dell’area
dedicata
all’allestimento delle
reazioni
di
Amplificazione
Possibili Rimedi
•
Utilizzare micropipette e puntali sterili con
filtro incorporato per la prevenzione di
aerosol
•
Cambiare sempre puntale tra un campione
e l’altro
•
Pulire attentamente le superfici e gli
strumenti
in
caso
di
accidentale
dispersione di DNA da provette in esame
•
Nella fase di procedura analitica
dispensare il controllo positivo per ultimo
•
Nella fase di procedura analitica
dispensare il controllo negativo per primo
•
Gestire la miscela di amplificazione con
micro pipette differenti da quelle utilizzate
nella fase di estrazione o detection
•
Utilizzare micropipette e puntali sterili con
filtro incorporato per la prevenzione di
aerosol
•
Pulire attentamente le superfici e gli
strumenti
in
caso
di
accidentale
dispersione di DNA da provette in esame
•
Chiudere la miscela di amplificazione e
riporla a -20°C prima di aprire le provette
potenzialmente inquinanti
•
Sigillare con molta attenzione la
micropiastra
•
Controllare che non vi siano differenze di
posizione (per i campioni, i controlli
negativi e standard) tra la micropiastra e
quanto impostato sullo strumento.
•
Pulire attentamente le superfici e gli
strumenti con appositi detergenti in grado
di degradare il DNA presente
Dispositivo In vitro diagnostico
Consultare le istruzioni per l’uso
Intervallo di temperatura
Utilizzare entro (aaaa/mm)
Lotto (xxxx)
Codice prodotto
Fabbricante
Contenuto sufficiente per "n" saggi
EDMA code: 1601049000
CND: W0105040205
Mancata o non corretta amplificazione del controllo positivo:
Possibili Errori
Possibile
errore
durante
la
dispensazione del
controllo positivo
Degradazione
del
controllo positivo
Protocollo termico
errato
Miscela di reazione
mantenuta a T°
ambiente troppo a
lungo
Errore durante la
dispensazione del
prodotto
di
amplificazione nella
fase di detection
Possibili Rimedi
•
Dispensare attentamente il controllo
positivo
•
Verificare la calibrazione delle micropipette
utilizzate
•
Verificare che la quantità di controllo
positivo utilizzato corrisponda a quanto
descritto in metodica nella sezione
Procedura Analitica (3µl)
•
Verificare il funzionamento della miscela
mediante analisi del Ct del controllo interno
•
Verificare le impostazione del Thermal
Cycler
•
Mantenere la miscela di amplificazione in
ghiaccio durante l’uso e riporla a -20°C
immediatamente dopo aver terminato la
predisposizione dei campioni da analizzare
•
Prestare attenzione durante la fase di
caricamento degli amplificati sul gel
Mancata o non corretta amplificazione del controllo interno nei
campioni in esame:
Possibili Errori
Presenza possibili
interferenti
Quantitativo
di
DNA estratto non
sufficiente
Possibili Rimedi
•
Ripetere attentamente la fase di estrazione
del campione
•
Ripetere attentamente la fase di estrazione
del campione
•
Conservare correttamente i campioni
CLONIT S.r.l.
Headquarter: Via Varese 20 – 20121 Milano
Production Site: Via B. Quaranta 57 - 20139 Milano
Tel. + 39. (0)2.56814413 fax. +39. (0)2.56814515
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ST. RT59-ITA.3
Stampata il 07 luglio 2014

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