Uso di DNA telomerico per rompere il cromosoma Y - e

Dissecting the centromere of the human Y chromosome with cloned telomeric DNA.
Brown et al. Hum. Mol. Genet..1994; 3: 1227-1237.
Uso di DNA telomerico per rompere il cromosoma Y umano nelle sequenze alfoidi
centromeriche.
Ricombinazione omologa con plasmidi contenenti piccoli repeats di DNA α satellite e
sequenze telomeriche per dividere la regione centromerica del cromosoma umano Y
in modo da ottenere due parti e verificare se questi due nuovi cromosomi fossero in
grado di segregare correttamente.
Risultato, due cromosomi ciascuno formato da:
 braccio corto e 140 kb di DNA alfoide (~ 12 Mb),
 braccio lungo e 480 kb di DNA alfoide.
Entrambi segregano normalmente in mitosi
1
EcoRI 1 volta ogni 5,7 kb
XbaI 2 volte ogni 5,7 kb
2
Proteine centromeriche
• 
La maggior parte delle informazioni sulle proteine centromeriche derivano dalla scoperta casuale
nel 1980 di anticorpi anti-centromerici in pazienti affetti da un disordine autoimmune definito
CREST [Calcinosi, Raynard s (spasmi vascolari), Esofago (perdita controllo muscolare di),
Sclerodattilia (deformità delle dita), Telangiectasia (spot rossi sulla pelle)].
Sono state identificate varie proteine (ad es. CENP-A, CENP-B, CENP-C CENP-G e CENP-H)
specifiche per il centromero.
Tre hanno la capacità di legarsi al DNA e studi condotti negli ultimi anni hanno messo in evidenza
il ruolo centrale svolto da CENP-A (proteina simile all istone H3, chiamata talvolta CENH3) nella
determinazione dell identità centromerica.
3
S. Cerevisiae
CDE II è una regione di 78-86 bp ricca in AT (>90%) fiancheggiata dalla sequenza conservata
CDE I (PuTCACPuTG) e dalla sequenza consensus CDE III.
4
Schizosaccaromyces pombe
La sequenza del core centrale (4-5 kb) è costituita da DNA non ripetuto fiancheggiato da diverse
classi di larghi repeats (incluso il repeat K di ~ 6 Kb) organizzati in orientamento invertito.
5
Neurospora Crassa
Il DNA centromerico del cromosoma VII è lungo circa 400 Kb. E costituito da repeats, alcuni simili a
retrotrasposoni.
Caenorhabditis elegans
Presenta cromosomi olocentrici, cioè in grado di assemblare il cinetocore lungo l intera lunghezza quindi senza
una sequenza determinante specifica.
Arabidopsis thaliana
Le regioni centromeriche variano in lunghezza tra 550 e 1260 Kb e contengono lunghe sequenze di 180 bp
ripetute in tandem. Le ripetizioni cen 180 sono trascritte e vengono poi processate in siRNA (small interfering)
mediante il macchinario dell RNAi (interfering).
Drosophila melanogaster
Un centromero funzionalmente e molecolarmente ben definito è quello del minicromosoma Dp1187 lungo 1,3 Mb
e derivato dal cromosoma X di D.m.. Delezioni progressive hanno definito una regione di 420 Kb in grado di
assicurare la corretta segregazione cromosomica. E costituito da un core di un DNA satellite, di 5 bp ed
elementi trasponibili, fiancheggiato da altre sequenze ripetute. Ogni regione centromerica ha sequenze diverse
di DNA ripetuto. Sono stati analizzati un dodecasatellite del cr.3 ricco in GC e il satellite 18HT del cromosoma
Y, formato da sequenze simili ai trasposoni Het-A e TART. E stata anche osservata la formazione di
neocentromeri.
Mus musculus
I centromeri sono costituiti da sequenze di DNA ripetuto in tandem di 120 bp chiamato satellite minor che
occupa ~ 300 Kb in ogni cromosoma ad eccezione del cromosoma Y in cui è assente.
I repeats di 120 bp contengono una regione di 17 bp chiamata CENP-B box, presente anche nei primati e 6
importante per il legame con una proteina centromerica (CENP-B).
Primati (DNA alfoide o a-satellite)
Costituito da una sequenza di 171 bp ripetuta in tandem ~10.000 volte in tutti i centromeri dei primati incluso l uomo. La più
piccola quantità è presente nel cromosoma Y umano (~200Kb). Probabilmente i cromosomi più grandi necessitano un numero
maggiore di motivi ripetuti. Nelle sequenze alfoidi un tratto di DNA è altamente conservato (54 bp) mentre la parte
rimanente, più variabile, è diversa nei vari cromosoi. Ogni cromosoma differisce nella parte variabile ed è così possibile
riconoscere, mediante le sequenze alfoidi, i singoli cromosomi umani. Non c è similarità con il satellite minor del topo ma è
presente una CENP-B box che ha in comune 16 dei 17 nt presenti nel topo.
CENP-A
Questa proteina (17KD) sembra essere di fondamentale importanza nel mantenimento dei centromeri nei mammiferi. E
presente nei centromeri nativi e nei neocentromeri ma è assente nei centromeri mutati o inattivi.
E un membro della famiglia proteica dell istone H3, copurifica con i nucleosomi, prende il posto dell istone H3 nei nucleosomi
purificati ed è in grado di assemblare le particelle nucleoproteiche in assenza dell istone H3.
Proteine simili a CENP-A sono presenti negli altri eucarioti (eccetto Arabidopsis thaliana).
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a. Subdominii dei nucleosomi contenenti
l istone centromerico CENP-A (rosso)
sono interspersi con H3 dimetilato
alla lisina 4 (verde) a formare un
dominio di cromatina CEN su una frazione
della regione di DNA α-satellite umano.
Il resto di DNA α-satellite è organizzato
in eterocromatina (viola) che fiancheggia
entrambi i lati del dominio della
cromatina CEN.
b. In metafase, con la condensazione dei
cromosomi, i dominii interspersi
promuovono la spiralizzazione della
cromatina in modo tale che le parti con
nucleosomi CENP-A possano interagire
con le proteine del cinetocore.
I nucleosomi con H3 sono orientati
verso l interno.
c. L eterocromatina definita da nucleosomi
con H3 metilato (H3-K9, viola), è
assemblata in domini distinti dalla
cromatina CEN.
L impacchettamento di ordine superiore
dell eterocromatina tra i cinetocori fratelli
può promuovere l orientamento di CENP-A,
dirigendolo verso la parte esterna del
cromosoma. L eterocromatina presente in
questa regione è importante anche per il
reclutamento delle proteine di coesione che
permangono al centromero fino alla
separazione dei cromatidi in anafase.
Fig. 3
8
Organizzazione delle CENP-A e CENP-B sul DNA α-satellite a formare
strutture di ordine superiore
• 
Nelle sequenze alfoidi un tratto di DNA è altamente conservato (54 bp) mentre la parte
rimanente, più variabile, è diversa nei vari cromosomi.
• 
Ogni cromosoma differisce nella part variabile ed è così possibile riconoscere, mediante le
sequenze alfoidi, i singoli cromosomi umani.
9
Su tutti i cromosomi si trovano anche altre sequenze ripetute in
tandem, presenti con frequenze e combinazioni diverse.
Esistono inoltre altre sequenze satelliti quali il satellite ß nel
centromero del cromosoma 9 (ripetizioni di 68 bp) e la sequenza
sn-5 sui cromosomi acrocentrici.
Come il Centromero diventa Cinetocore
- Centromero e cinetocore sono strutture dinamiche la cui
composizione cambia in modo da riflettere le funzioni proprie
dei specifici stadi del ciclo cellulare.
- Il centromero acquisice la capacità di reclutare i componenti
chiave del cinetocore che, a loro volta, attraggono proteine
responsabili per il legeme con i microtubuli e con gli aspetti
sequenziali della regolazione mitotica.
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Proteine fondamentali per il Cinetocore
Complesso Mis12:
è il primo ad essere reclutato dai centromeri associandosi direttamente alle
proteine del CCAN (Constitutive Centromere Associated Network) o con la
cromatina centromerica.
Mis12 Complex:
composto da 4 proteine: Mis12, nnf1, Nsl1, Dsn1. Tutte sono necessarie
perché il complesso si assembli propriamente.
Spc105: in quasi tutti gli eucarioti superiori sembra servire come scaffold a cui si
legano altri componenti del cinetocore.
Ndc80 Complex:
comprende 4 proteine. Sembra che il ruolo fondamentale di questo
complesso sia la capacità di legarsi con i microtubuli.
KMN Network: core essenziale del cinetocore
Formato dalla proteina KNL-1/Spc105/Blinkin e dai subcomplessi Ms12
e da Ncc80.
11
Akiyoshi & Gull. Discovery of Unconventional Kinetochores in Kinetoplastids. Cell (2014),
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.049
(Tripanosoma brucei)
Summary
The kinetochore is the macromolecular protein
complex that directs chromosome segregation
in eukaryotes.
It has been widely assumed that the core
kinetochore consists of proteins that are
common to all eukaryotes.
However, no conventional kinetochore
components have been identified in any
kinetoplastid genome, thus challenging this
assumption of universality.
Here, we report the identification of 19
kinetochore proteins (KKT1–19) in
Trypanosoma brucei.
The majority is conserved among kinetoplastids,
but none of them has detectable homology to
conventional kinetochore proteins.
These proteins instead have a variety of
features not found in conventional kinetochore
proteins.
We propose that kinetoplastids build kinetochores using a distinct set of proteins.
These findings provide important insights into the longstanding problem of the position
of the root of the eukaryotic tree of life.
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Akiyoshi & Gull. Discovery of Unconventional Kinetochores in Kinetoplastids. Cell (2014),
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.049
Three Possible Models for the Evolutionary History of Kinetochores
Figure S5.
(A)  The LECA (last eukaryotic common ancestor) had conventional kinetochores.
In this scenario, kinetoplastids lost conventional kinetochores and evolved KKT-based kinetochores
after they branched from other eukaryotic lineages.
(B) The LECA had KKT-based kinetochores. In this scenario, only kinetoplastids retained them.
(C) The LECA had a hitherto unknown type of kinetochores.
Note that this is a highly simplified set of possibilities of how the diversity of kinetochore types may have
arisen in evolution. The diagrams are presented as simple branch points and do not incorporate multiple
other branch points leading to the diversity of other eukaryotic groups.
La proteina CENP-A e le proteine ad essa corrispondenti negli altri organismi sono costituite da un dominio
carbossiterminale che ha un identità tra il 38% e il 68% con lo stesso dominio dell istone H3.
Il dominio aminoterminale è molto variabile, lungo da 27 a 196 aa ed essenzialmente non presenta omologia di
sequenza con la coda dell istone H3 e tra le diverse proteine.
Ciò è in contrasto con l estrema conservazione filogenetica degli altri istoni.
L istone H3 interagisce con l intero genoma, mentre le varianti centromeriche interagiscono soltanto con
sequenze specifiche (repeats) che sono quelle a più rapida evoluzione nel genoma eucariotico.
14
Evidenze sperimentali hanno confermato che:
 Cse4p in Saccharomyces cerevisiae,
 HCP-3 in Caenorhabditis elegans,
 Cid (centromere identifier) in D. melanogaster e
 SpCENP-A (Cnp1) in Schizosaccharomyces pombe
 sono proteine esclusivamente
centromeriche.
 S. cerevisiae presenta Cse4p nell unico nucleosoma
in corrispondenza del centromero puntiforme.
  In S. pombe SpCENP-A è presente solo nella
regione core del centromero e non nelle sequenze
di DNA ripetuto fiancheggianti.
  In C. elegans, in cui l olocinetocore si estende da
una estremità all altra del cromosoma, HPC-3 è
diffusa ovunque.
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Sullivan et al., Nature Genetics, 2:584-596, August 2001
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CENP-B
E localizzata sui centromeri umani e murini attraverso un legame diretto alle 17 bp presenti
nella CENP-B box dell α satellite umano e del satellite minore di topo.
La presenza di questa proteina sui i centromeri attivi e inattivi dei cromosomi pseudodicentrici e multicentrici suggerisce che l assemblaggio di questa proteina è insufficiente
per la centromerizzazione.
L assenza di questa proteina nei neocentromeri attivi e nel centromero del cromosoma Y
umano suggerisce che la proteina sia dispensabile o ridondante.
Il possibile ruolo svolto da CENP-B consiste nell organizzare il DNA satellite centromerico.
CENP-C
• 
Nelle cellule umane, CENP-C è localizzata verso la parte esterna del centromero.
• 
Potrebbe così svolgere un ruolo di connessione tra la cromatina e il cinetocoro esterno.
• 
E presente solo sui centromeri attivi. Esperimenti di iniezioni di anticorpi , analisi di
knockouts in cellule di pollo e in topi hanno dimostrato che CENP-C è essenziale per le
segregazione mitotica.
• 
Proteine omologhe a CENP-C sono state descritte in S.Cerevisiae (Mif2p), vertebrati e
piante e similarità sono state riscontrate anche in S.pombe(Cnp3) , Caenorhabditis
(HCP-4).
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CENP-E
E un membro della famiglia delle chinesine presente nella corona fibrosa e nella piastra esterna del
cinetocore. E presente solo sui centromeri attivi.
Dati ultrastrutturali e cinetici supportano il ruolo di CENP-E come proteina motore coinvolta nel legame ai
microtubuli e nel movimento dei cromosomi.
Interagisce con le proteine effettrici del checkpoint mitotico e con chinasi che ne regolano l interazione con i
microtubuli.
CENP-F
E assemblata sui cinetocori durante la tarda fase G2 ed è stata osservata su ogni cromosoma dall inizio della
profase in corrispondenza della piastra esterna del cinetocore.
Interagisce con CENP-E e la sovra-espressione di questa proteina mancante della parte aminoterminale blocca
la progressione del ciclo cellulare alla transizione S/G2.
CENP-G e CENP-H
Sono le proteine centromeriche identificate recentemente nei mammiferi.
CENP-G è una proteina associata alla matrice nucleare ed è localizzata sulla piastra interna del cinetocore, la
sequenza non è ancora nota.
CENP-H è una proteina associata ai centromeri in tutti gli stadi del ciclo cellulare. La funzione non è ancora
nota.
Proteine checkpoint
Funzionano da meccanismo di controllo e bloccano le cellule in metafase fino alla riparazione di un eventuale
danno o anomalia centromerica.
Topoisomerasi II
Taglia i cromosomi legati prima della loro migrazione ai poli opposti del fuso.
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Sullivan et al., Nature Genetics, 2:584-596, August 2001
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Schizosaccaromyces pombe
L assemblaggio dell eterocromatina mediato da RNAi richiede il complesso RNA-induced
Initiation
Transcriptional Silencing (RITS) e una polimerasi Rdp1 (RNA-dipendente).
RNA interference (RNAi): piccole sequenze di interfering RNA (siRNA) possono interrompere il
processo di traduzione o guidare la degradazione dell mRNA (Post Transcriptional Gene
Silencing;
PTGS) oppure inibire la trascrizione (Transcriptional Gene Silencing; TGS).
Ekwall 2007
-  Nell
assemblaggio dell eterocromatina mediato da RNAi, lo siRNA favorisce e mantiene il
corretto posizionamento della cromatina nelle regioni pericentromeriche.
-  Mutazioni nei componenti del pathway dell RNAi causano difetti nella coesione dei cromatidi
fratelli durante la segregazione cromosomica .
Meccanismi simili sono stati descritti anche per l eterocromatina centromerica dei cromosomi
umani, nei centromeri del topo e in cellule di pollo.
In Drosophila, RNAi direziona la formazione della eterocromatina pericentromerica.
Quindi, le modificazioni della cromatina RNAi-directed nell eterocromatina pericentromerica
e un fenomeno comune negli eucarioti.
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22
Neocentromeri
23
Neocentromeri
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Sono presenti 22 proteine centromeriche classiche.
Ciò indica che i neocentromeri utilizzano le stesse proteine e i meccanismi dei
centromeri normali.
Nessuna delle regioni neoattivate differisce nella sequenza nucleotidica rispetto al
locus parentale omologo e le regioni non acquisiscono sequenze α-satellite.
Inoltre i diversi neocentromeri non mostrano un omologia significativa tra loro.
Tre neocentromeri studiati a livello molecolare hanno però evidenziato alcune
caratteristiche comuni quali alta percentuale di basi AT (>60%) e un elevato numero
di elementi retrovirali, long terminal repeats e/o short terminal repeats
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Neocentromeri in Drosophila
Possono essere indotti sperimentalmente sul
DNA non centromerico ed eucromatico dopo
rotture indotte da irradiazione su minicromosomi
di Drosophila.
E un fenomeno che sembra verificarsi tramite
la propagazione in cis delle proteine centromeriche
a patto che non sia presente eterocromatina
interposta.
Sullivan et al., Nature Genetics, 2:584-596, August 2001
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Replication-time model
CENP-A può essere incorporata nei centromeri in quanto queste
regioni replicano molto tardi nella fase S in un momento in cui la
cromatina che contiene H3 è già stata duplicata.
Lo stesso potrebbe verificarsi nel caso in cui le regioni
centromeriche replichino prima del rimanente DNA.
Nuclear organization model
L incorporazione di CENP-A nei nucleosomi avviene tramite il
sequestro dei fattori che assemblano il centromero in domini
isolati.
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Sullivan et al., Nature Genetics, 2:584-596, August 2001
S.Cerevisiae
Il DNA centromerico replica all inizio della fase S. Cse4 è espressa durante tutto il ciclo
cellulare a bassi livelli.
Non si conosce quando viene depositata nella cromatina e se l assemblaggio del
centromero è legato alla replicazione.
S.pombe
L espressione di Cenp1 avviene tra la fase G1/S e la fase S, probabilmente questa
proteina viene incorporata nel DNA prima della fase S. Anche in questo caso non c è
contemporaneità con la replicazione.
Drosophila melanogaster
La proteina cid è incorporata nei centromeri in assenza di replicazione del DNA.
Di recente è stato dimostrato che i centromeri di Drosophila in vivo replicano in maniera
asincrona tra la metà e la fine della fase S simultaneamente alla cromatina contenente
H3.
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Homo sapiens
L mRNA e i livelli proteici di CENP-A sono altissimi nella tarda fase S e in G2.
I centromeri umani replicano in maniera asincrona tra la metà e la fine della fase
S e CENP-A è assemblata attivamente in fase G2.
La proteina istone-like è incorporata nei centromeri anche quando la replicazione
è bloccata. Non c è quindi simultaneità tra quest ultimo processo e la
specificazione dell identità centromerica intergenerazionale.
FATTORE DI CARICAMENTO
 (loading factor)
potrebbe riconoscere i nucleosomi contenenti CENP-A segregati nei cromatidi fratelli e quindi
depositare questa proteina ristabilendo il contenuto in CENP-A dei cromatidi.
Lo stesso meccanismo è valido per l istone H3 nella cromatina non centromerica.
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Sullivan et al., Nature Genetics, 2:584-596, August 2001
Il centromero di S.pombe fornisce
un modello interessante per
l organizzazione di questa struttura
negli eucarioti.
La struttura a ripetizioni invertite
dell eterocromatina fiancheggiante
fa ipotizzare un modello stem-loop
(stelo con anello) in cui il core è
nel loop e le ripetizioni interne
ed esterne sono nello stelo e
nella base.
Questa organizzazione è postulata
anche in C.elegans (cromosomi
olocentrici) in cui HCP-3
è presente in pochi foci in interfase
e va incontro a coalescenza nel
corso della mitosi.
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CCAN= Constitutive Centromere Associated Network
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34
35
Bandeggio C
Colorazione dell eterocromatina costitutiva.
Trattamento del preparato cromosomico con HCl (depurinazione), con una soluzione
alcalina (NaOH) (denaturazione), incubazione in una soluzione salina e colorazione in
Giemsa.
E consigliabile l utilizzo di una soluzione moderatamente alcalina per un miglior
controllo della denaturazione.
La perdita di DNA si verifica preferenzialmente nelle regioni non-C.
C-bande
Centromeri di tutti i cromosomi, porzione distale del braccio lungo del cromosoma Y
e costrizioni secondarie dei cromosomi 1, 9 e 16.
Probabilmente proteine non istoniche legate all eterocromatina preservano
l integrità del DNA in queste regioni.
Le C-bande possono presentare variazioni in grandezza sia tra cromosomi omologhi
sia tra diversi individui.
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La posizione del centromero permette di catalogare i cromosomi
in base alla loro forma:
METACENTRICO: costrizione primaria centrale
ACROCENTRICO: costrizione primaria ad un estremità
TELOCENTRICO: costrizione primaria in corrispondenza del telomero
SUBMETACENTRICO: costrizione primaria quasi centrale
SUBTELOCENTRICO: costrizione primaria quasi telomerica
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Piastra metafasica 46,XY
Cariotipo della fig. A

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