Indice DALLA SCOPERTA DEL DNA AL CODICE GENETICO E STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI 1 A Capitolo 1 Introduzione alla Biologia Molecolare 3 1.1Che cos’è la Biologia Molecolare? 3 1.2Il gruppo del fago e la nascita della Biologia Molecolare 4 1.3Dalla scoperta del DNA alla dimostrazione del suo ruolo come materiale genetico 6 Letture di approfondimento e siti web 11 Capitolo 2 Struttura degli acidi nucleici 12 2.1Struttura chimica degli acidi nucleici 12 2.2Struttura fisica del DNA: la scoperta della struttura a doppia elica 17 2.3Struttura fisica del DNA: i parametri strutturali della doppia elica 21 Stabilità della doppia elica di DNA in soluzione Strutture alternative e strutture superiori degli acidi nucleici 2.4Topologia del DNA e DNA topoisomerasi 23 25 DNA topoisomerasi 33 39 Finestra 2.1 - Varietà e classificazione delle dna topoisomerasi 42 2.5Struttura dell’RNA 43 Finestra 2.2 - L’RNA Tie Club 44 Finestra 2.3 - Struttura dell’RNA ed energia libera 47 Letture di approfondimento 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 7 54 12/05/14 11.46 VIII Indice ISBN 978-88-08-18567-9 Capitolo 3 Codice genetico 55 3.1Il “dogma centrale” e prime ipotesi sul codice genetico 55 3.2Decifrazione del codice genetico 56 3.3Fasi di lettura e ORF 60 3.4Mutazioni a soppressione e codice genetico B 61 Finestra 3.1 - Origine del nome Amber suppressor 62 3.5Struttura del codice genetico e sue proprietà 63 3.6Origine ed evoluzione del codice genetico 65 Letture di approfondimento e siti web 68 ORGANIZZAZIONE ED EVOLUZIONE DI GENI, CROMOSOMI E GENOMI 69 Capitolo 4 Impacchettamento del DNA genomico: cromosomi e cromatina 71 4.1Impacchettamento dei genomi virali 72 4.2Impacchettamento del genoma batterico 74 4.3Organizzazione e impacchettamento del DNA eucariotico 75 4.4Cromatina interfasica e cromosomi mitotici 76 4.5Organizzazioni atipiche di cromosomi e genomi 78 78 78 80 Cromosomi a spazzola Cromosomi politenici Micronucleo e macronucleo dei ciliati 4.6Centromeri 80 4.7Telomeri 81 4.8Nucleosomi e proprietà strutturali e funzionali della cromatina 84 90 Posizionamento in fase (phasing) dei nucleosomi Il posizionamento di un nucleosoma può essere “intrinseco“ o “estrinseco“ Nucleosomi e replicazione del DNA Nucleosomi e trascrizione dei geni Modificazioni post-traduzionali degli istoni e modulazione dell’attività trascrizionale della cromatina Letture di approfondimento 90 92 92 94 95 Capitolo 5 Genomi procariotici ed eucariotici 96 5.1Era genomica 96 5.2Genomi procariotici 97 97 99 Caratteristiche, struttura e plasticità dei genomi procariotici Contenuto genico e composizione in basi dei genomi procariotici 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 8 12/05/14 11.46 Indice ISBN 978-88-08-18567-9 Geni non codificanti proteine ed elementi mobili nei genomi procariotici Applicazioni della Genomica microbica 5.3Genomi eucariotici 100 101 Struttura e organizzazione dei genomi eucariotici Caratteristiche composizionali dei genomi eucariotici Contenuto genico dei genomi eucariotici Caratteristiche dei geni eucariotici Ruolo degli introni nell’evoluzione dei geni eucariotici Pseudogeni Sequenze ripetute dei genomi eucariotici DNA satellite o altamente ripetitivo DNA mediamente ripetitivo: microsatelliti e minisatelliti 102 102 103 104 105 106 108 110 111 113 Finestra 5.1 - Il test del DNA Sequenze di DNA ripetitivo intersperse nel genoma Duplicazioni segmentali Famiglie geniche Geni reiterati ed evoluzione parallela 114 116 119 119 121 5.4Genoma mitocondriale Finestra 5.2 - Patologie mitocondriali IX 123 127 5.5Genoma dei cloroplasti 129 5.6Genoma dei virus 130 Letture di approfondimento e siti web 130 REPLICAZIONE E MANTENIMENTO DEL GENOMA 131 C Capitolo 6 Replicazione del DNA 133 6.1Replicazione semiconservativa del DNA 134 134 L’esperimento di Meselson e Stahl 6.2Modello del replicone 136 6.3Identificazione delle origini di replicazione 138 138 140 143 Origine di replicazione di Escherichia coli Origini di replicazione negli eucarioti ARS del lievito Saccharomyces cerevisiae Origini precoci e origini tardive: influenza della struttura del cromosoma Finestra 6.1 - Mappatura fisica delle origini di replicazione 6.4Meccanismo della replicazione del DNA nei procarioti 144 146 147 Isolamento di mutanti letali-condizionali di Escherichia coli alterati nella replicazione del DNA “Replisoma” di Escherichia coli 147 148 Finestra 6.2 - Isolamento di mutazioni temperatura-sensibili in Escherichia coli Scoperta della DNA polimerasi e sue proprietà biochimiche 148 150 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 9 12/05/14 11.46 X Indice ISBN 978-88-08-18567-9 Finestra 6.3 - In Escherichia coli non tutte le dna polimerasi sono coinvolte nella replicazione del dna Fedeltà di replicazione del DNA Forcella di replicazione: sintesi del filamento continuo e del filamento discontinuo Innesco della sintesi di DNA Saggi di complementazione in vitro Proteine replicative di Escherichia coli 151 152 154 154 156 157 Finestra 6.4 - P urificazione di una proteina e saggio di complementazione in vitro 158 Finestra 6.5 - M odalità di generazione dell'estremità 3'oh richiesta come innesco dalle dna polimerasi 162 6.5Meccanismo della replicazione del DNA negli eucarioti Isolamento di proteine replicative negli eucarioti Sistemi di ricostituzione in vitro del processo di replicazione 164 164 164 Finestra 6.6 - R eplicazione del dna del virus sv40 e proteine umane richieste in tale processo Sintesi di DNA translesione 165 168 6.6Replicazione dei telomeri nei cromosomi lineari degli eucarioti Replicazione del DNA nella sua struttura cromatinica 6.7Controllo della replicazione del DNA durante il ciclo cellulare Aspetti generali del ciclo cellulare Motore del ciclo cellulare Controllo della replicazione del DNA durante il ciclo cellulare Letture di approfondimento 169 172 173 173 175 177 179 Capitolo 7 Riparazione del DNA 180 7.1Mutazioni 180 7.2Sistemi di riparazione del DNA 183 Finestra 7.1 - I meccanismi di riparazione sono funzionalmente conservati in tutti gli organismi viventi, dai procarioti agli eucarioti Riparazione per escissione delle basi (BER) Riparazione per escissione di nucleotidi (NER) Riparazione di errori replicativi (MMR) Meccanismi di tolleranza al danno (PRR) Riparazione di rotture su entrambi i filamenti del DNA 184 186 188 191 191 193 7.3Risposta cellulare a danni sul DNA e connessioni tra riparazione e ciclo cellulare 196 Letture di approfondimento 199 Capitolo 8 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 10 Ricombinazione 200 8.1Introduzione e ricombinazione in meiosi 200 12/05/14 11.46 Indice ISBN 978-88-08-18567-9 8.2Ricombinazione omologa o generalizzata 201 Finestra 8.1 - Conversione genica Ricombinazione sito-specifica 204 205 Finestra 8.2 - Proprietà e ciclo vitale del batteriofago lambda 206 8.3Trasposizione Finestra 8.3 - I retrovirus 208 210 Letture di approfondimento 216 Trascrizione e sue regolazioni 217 Capitolo 9 Trascrizione nei procarioti 219 9.1Unità di trascrizione 220 9.2Le tre fasi della trascrizione 221 9.3Struttura delle RNA polimerasi 224 9.4Inizio della trascrizione nei procarioti Promotori e fattore sigma Diversi fattori sigma controllano promotori diversi 226 228 229 Finestra 9.1 - Interazioni del fattore e dei suoi domini con l’rna polimerasi e con il promotore 230 9.5Distacco della RNA polimerasi dal promotore e allungamento dell’RNA Topologia e trascrizione 9.6Terminazione della trascrizione nei procarioti Terminatori intrinseci Terminatori Rho-dipendenti Letture di approfondimento XI D 232 233 234 234 236 238 Capitolo 10 Regolazione della trascrizione nei procarioti 239 10.1Elementi di controllo nella trascrizione dei procarioti 239 239 240 Attivatori trascrizionali, repressori e operatori Organizzazione degli operoni procariotici 10.2Operone lac Controllo negativo dell’operone lac Finestra 10.1 - Gli esperimenti di Jacob e Monod Repressore Lac e sue interazioni con il promotore Controllo positivo dell’operone lac e ruolo di CAP Interazione della regione promotore/operatore con CAP, repressore Lac e RNA polimerasi 10.3Operone del triptofano Finestra 10.2 - O peroni inducibili e reprimibili, controlli negativi e controlli positivi Regolazioni a livello di terminazione della trascrizione 10.4Controllo dell’espressione genica nel fago lambda 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 11 241 241 242 246 248 252 253 254 256 258 12/05/14 11.46 XII Indice ISBN 978-88-08-18567-9 I due cicli vitali del fago lambda: ciclo litico e ciclo lisogenico Ciclo litico Ciclo lisogenico Regione di controllo del fago Struttura del repressore e di Cro CI e Cro si legano con diversa affinità alla regione di controllo Il repressore CI e Cro controllano in modo mutuamente esclusivo la trascrizione nella regione di controllo del fago lambda Legame cooperativo del repressore al DNA Induzione del ciclo litico di lambda in un batterio lisogenico Ruolo dell’attivatore trascrizionale CII 259 261 263 263 264 266 Finestra 10.3 - Identificazione di mutazioni nella regione di controllo Controllo dell’integrazione e dell’escissione del fago nel cromosoma di Escherichia coli 271 Letture di approfondimento 267 268 270 271 273 275 Capitolo 11 Trascrizione e regolazione negli eucarioti 276 11.1Tre sistemi di trascrizione nel nucleo 277 11.2Promotore dei geni per gli rRNA e fattori che regolano la trascrizione della RNA polimerasi I 279 11.3RNA polimerasi III: promotori di Pol III interni ed esterni e suoi fattori di trascrizione 282 11.4RNA polimerasi II: struttura del promotore minimo di Pol II Fattori basali di Pol II e assemblaggio del complesso d’inizio Ruolo del “mediatore“ nella trascrizione di Pol II 282 285 287 Finestra 11.1 - Il “mediatore” e la sua scoperta Struttura di Pol II e reazione di allungamento nella sintesi dell’RNA 289 290 11.5Regolazione Struttura modulare dei promotori eucariotici 11.6Struttura modulare e domini dei fattori di trascrizione (trans-attivatori) 11.7Domini funzionali dei transattivatori: domini di legame al DNA 297 Elica-giro-elica (helix-turn-helix) e omeodominio Dominio a dita di zinco (zinc finger) Domini a cerniere di leucina (leucine zipper) Dominio elica-ansa-elica (helix-loop-helix) Controllo combinatoriale della trascrizione Reclutamento del complesso di trascrizione Attivatori e cromatina 299 300 301 302 303 304 307 307 Finestra 11.2 - I fattori di trascrizione agiscono attraverso una vasta rete di interazioni Attivazione e segnali I recettori degli ormoni steroidei Risposta all’AMP ciclico e fattore CREB Fattore trascrizionale NF-kB 308 311 311 311 312 Letture di approfondimento 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 12 292 292 313 14/05/14 18.09 Indice ISBN 978-88-08-18567-9 Processamento e maturazione dell’rna 315 XIII E Capitolo 12 Maturazione mediante tagli endonucleolitici ed esonucleolitici 317 12.1Processamento degli rRNA nei procarioti e negli eucarioti 317 Finestra 12.1 - Le nucleasi 318 12.2Processamento dei tRNA nei procarioti e negli eucarioti 320 12.3Ribozimi autocatalitici a “testa di martello” 321 12.4Maturazione dei microRNA 323 Letture di approfondimento 324 Capitolo 13 Modificazioni chimiche dell’RNA 325 13.1Modificazioni chimiche delle basi e del ribosio Modificazioni chimiche delle basi nei tRNA procariotici ed eucariotici Modificazioni chimiche degli rRNA eucariotici 325 325 327 Finestra 13.1 - Il nucleolo 327 13.2 Aggiunta del “cap” agli mRNA eucariotici 13.3Poliadenilazione e terminazione della trascrizione degli mRNA eucariotici Funzioni della coda di poli(A) Turnover della coda di poli(A) Poliadenilazione nei procarioti e negli organelli Letture di approfondimento 329 332 335 335 335 336 Capitolo 14 Splicing ed editing 337 14.1Splicing Geni “discontinui” e splicing Meccanismo dello splicing nucleare 337 337 340 Finestra 14.1 - Splicing e patologie Autosplicing: introni di gruppo I e II Splicing del tRNA 346 347 349 Finestra 14.2 - L’origine della vita e il mondo a RNA Trans-splicing Accoppiamento tra splicing e trascrizione Splicing alternativo Regolazione dello splicing 350 351 353 354 356 14.2Editing Editing per conversione di basi Editing inserzionale 359 360 363 14.3Traslocazione nucleo-citoplasmatica degli RNA 366 Letture di approfondimento 367 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 13 14/05/14 18.10 XIV Indice F ISBN 978-88-08-18567-9 TRADUZIONE E SUE REGOLAZIONI 369 Capitolo 15 Apparato di traduzione e suoi componenti 371 15.1Ribosoma 371 373 373 376 380 rRNA r-proteine Struttura tridimensionale Ribosoma come ribozima 15.2RNA transfer (tRNA, RNA di trasferimento) e amminoacil-tRNA sintetasi Finestra 15.1 - Q uanti amminoacidi sono codificati dal codice genetico? 15.3RNA messaggero (mRNA) 381 383 387 Finestra 15.2 - La coda di poli(A) come maniglia per purificare l’mRNA 388 Letture di approfondimento 389 Capitolo 16 Meccanismo della sintesi proteica 390 16.1Inizio nei procarioti 392 392 393 394 395 tRNA di inizio Riconoscimento del sito di inizio sull’mRNA Fattori di inizio nei procarioti Processo di inizio della traduzione nei procarioti 16.2Inizio negli eucarioti Fattori di inizio negli eucarioti Processo di inizio della traduzione negli eucarioti Meccanismo di inizio alternativo cap-indipendente negli eucarioti 16.3Allungamento imetismo molecolare dei fattori che interagiscono Finestra 16.1 - M con il sito A del ribosoma 396 397 398 402 402 407 16.4Terminazione 408 16.5Bilancio energetico 408 16.6Velocità e accuratezza della sintesi proteica 410 Finestra 16.2 - Sistemi di sintesi proteica in vitro 410 16.7Traduzione a livello strutturale Finestra 16.3 - Inibitori della sintesi proteica e antibiotici Letture di approfondimento 411 412 414 Capitolo 17 Regolazione della traduzione 415 17.1Regolazione generale della traduzione 415 415 416 “Risposta stringente” nei procarioti Controllo generale della traduzione negli eucarioti 17.2Regolazioni traduzionali di geni specifici Controlli traduzionali autogeni 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 14 417 418 14/05/14 18.10 Indice ISBN 978-88-08-18567-9 Controlli traduzionali non autogeni 17.3Regolazione della stabilità e degradazione degli mRNA Degradazione dell’mRNA nei procarioti Degradazione dell’mRNA nelle cellule eucariotiche Meccanismi di “controllo qualità” dell’mRNA 17.4Controllo della traduzione e della stabilità degli mRNA da parte di RNA regolatori XV 420 424 424 424 427 sRNA procariotici Riboswitch MicroRNA 431 431 433 434 Finestra 17.1 - Patologie dell’apparato di traduzione 434 Finestra 17.2 - R NA non codificanti (ncrna), lunghi rna non codificanti (lncrna) e reti (network) regolative del trascrittoma 436 17.5Trasporto e localizzazione degli mRNA Localizzazione dell’mRNA di ASH1 in lievito Localizzazione di mRNA nell’uovo di Drosophila Localizzazione di mRNA nei dendriti neuronali 437 439 439 441 17.6Granuli citoplasmatici di RNA 442 Letture di approfondimento 443 Altri livelli di regolazione: modificazioni genomiche, epigenetiche e post-traduzionali 445 G Capitolo 18 Riarrangiamenti genomici come meccanismi di regolazione dell’espressione genica 18.1Cambiamenti quantitativi delle sequenze genomiche Amplificazione genica Politenizzazione Diminuzione genica, cromatinica e cromosomica Micro- e macronucleolo dei protozoi ciliati 18.2Riarrangiamenti delle sequenze di DNA Cambiamento della specificità d’ospite del fago Mu Variazione di fase di Salmonella Cambiamento del tipo sessuale in lievito (locus MAT) Variazione antigenica in Trypanosoma (geni VSG) Ricombinazione V(D)J nei vertebrati Letture di approfondimento 447 448 448 449 450 451 452 452 454 455 456 458 459 Capitolo 19 Regolazioni epigenetiche: metilazione del dna e rimodellamento della cromatina 19.1Metilazione del DNA ed espressione genica Metilazione del DNA genomico nei mammiferi 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 15 460 460 461 12/05/14 11.46 XVI Indice ISBN 978-88-08-18567-9 Finestra 19.1 - Epigenesi, epigenetica e regolazioni epigenetiche 461 Finestra 19.2 - Identificazione delle CpG metilate nel dna genomico Isole CpG Metilazione delle CpG e trascrizione Imprinting genetico 462 463 465 465 Finestra 19.3 - Regolazioni epigenetiche e patologia 467 19.2Rimodellamento della cromatina Modificazioni post-traduzionali degli istoni Complessi di rimodellamento (rimodellatori) ATP-dipendenti Sostituzione di varianti istoniche Letture di approfondimento 467 468 469 471 471 Capitolo 20 H Modificazioni e regolazioni post-traduzionali di proteine 472 20.1Stabilità e processamento di proteine 473 20.2Ubiquitinazione di proteine 475 20.3Sumoilazione di proteine 478 20.4Fosforilazione e defosforilazione di proteine 480 20.5Acetilazione di proteine 485 20.6Metilazione di proteine 486 20.7Glicosilazione e modificazioni lipidiche di proteine 487 Letture di approfondimento 490 Approcci, tecniche e modelli in Biologia Molecolare 491 Capitolo 21 Tecniche della Biologia Molecolare 21.1Tecniche spettrofotometriche per l’analisi della denaturazione e riassociazione del DNA Spettro di assorbimento Denaturazione del DNA, Tm Riassociazione del DNA, cinetica di riassociazione, Cot 21.2Uso di sonde di DNA per l’identificazione e analisi di sequenze nucleotidiche Finestra 21.1 - Marcatura del dna con atomi radioattivi Ibridazione a saturazione Ibridazione in situ o citologica Southern e Northern blot Ibridazione su colonia o su placca Microarray (o microchip) 21.3Ultracentrifugazione Sedimentazione in gradienti di saccarosio Gradienti di densità di cloruro di cesio (CsCl ) 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 16 493 493 493 494 495 498 499 499 499 500 501 501 503 504 506 12/05/14 11.46 Indice ISBN 978-88-08-18567-9 Finestra 21.2 - Ultracentrifuga analitica 21.4Tecnologie di base per l’isolamento e la manipolazione di geni Finestra 21.3 - U tilizzo dell’elettroforesi per separare molecole di acidi nucleici e proteine Enzimi di restrizione e DNA ligasi Vettori di clonaggio Plasmidi Trasformazione di cellule di Escherichia coli e selezione dei trasformanti Plasmidi della serie pUC: selezione bianco o blu Vettori di espressione e produzione di proteine ricombinanti Batteriofago lambda come vettore di clonaggio Cosmidi Vettori per il clonaggio e l’espressione in cellule eucariotiche Vettori di lievito Vettori per il trasferimento genetico in cellule animali Trasferimento di DNA nei vegetali 21.5Banche di DNA Banche genomiche Rappresentatività di una libreria di DNA genomico Librerie di cDNA Identificazione del clone contenente il DNA d’interesse da una libreria 508 508 510 512 515 515 517 518 518 524 525 525 527 530 531 532 532 534 535 537 21.6PCR: reazione a catena della polimerasi 543 21.7Determinazione della sequenza nucleotidica del DNA 546 21.8Piattaforme di sequenziamento di nuova generazione 550 21.9Valutazione dell’espressione di un gene Finestra 21.4 - Il Northern blot e il Western blot 21.10Inibizione dell’espressione di geni specifici: RNA antisenso e interferenza da RNA Finestra 21.5 - Mutagenesi sito-specifica o mutagenesi mirata 21.11Interazioni tra macromolecole biologiche Interazioni proteina-DNA Interazioni proteina-proteina Letture di approfondimento XVII 558 559 561 562 564 564 569 577 Capitolo 22 Bioinformatica e Genomica 578 22.1Sequenziamento e assemblaggio di genomi completi 578 22.2Sequenziamento del trascrittoma 582 22.3Identificazione e annotazione di geni 586 22.4Confronto e allineamento di sequenze 587 22.5Identificazione e annotazione di regioni regolatorie e caratterizzazione delle proprietà epigenetiche della cromatina 589 Finestra 22.1 - R appresentazione di motivi regolativi mediante il sequence logo 591 22.6Annotazione delle sequenze proteiche 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 17 591 12/05/14 11.46 XVIII Indice ISBN 978-88-08-18567-9 22.7Banche dati e browser genomici 592 22.8Evoluzione molecolare 594 Indirizzi web delle principali risorse bioinformatiche 596 Capitolo 23 000_VII-XVIII_Biologia_Sommario.indd 18 Organismi modello 597 23.1Il lievito Saccharomyces cerevisiae 599 23.2Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster 605 23.3Il nematode Caenorhabditis elegans 609 23.4L’anfibio Xenopus laevis e il suo successore Xenopus tropicalis 611 23.5Il pesce Danio rerio o “zebrafish” 614 23.6Il topo comune Mus musculus 617 23.7La pianta Arabidopsis thaliana 623 Letture di approfondimento 624 Indice analitico 625 12/05/14 11.46
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