trascrizione

TRASCRIZIONE
LA TRASCRIZIONE E’ IL PROCESSO
ATTRAVERSO CUI SI PASSA DAL
LINGUAGGIO DESOSSIRIBONUCLEOTIDICO
DEL DNA A QUELLO RIBONUCLEOTIDICO
DELL’RNA
ATTRAVERSO LA TRASCRIZIONE NON VENGONO
SINTETIZZATI SOLO GLI RNA CHE CODIFICANO
PROTEINE (mRNA
(mRNA),
), MA ANCHE SVARIATI
ALTRI TIPI DI RNA (tRNA
(tRNA;; rRNA
rRNA;; E PICCOLI
RNA NON CODIFICANTI QUALI: snRNA
snRNA;; snoRNA
snoRNA;;
scRNA;; miRNA etc…
scRNA
etc…)) CHE SVOLGONO FUNZIONI
CHIAVE NELLA FISIOLOGIA DELLA CELLULA.
IN GENERALE IL PRODOTTO (RNA) DELLA
TRASCRIZIONE PRENDE NOME DI TRASCRITTO
TRASCRITTO..
L’INSIEME DI MOLECOLE DI RNA
(CLASSICAMENTE mRNA
mRNA)) ALL’INTERNO DI UN
BEN PRECISO MOMENTO DELLA VITA DI UNA
SPECIFICA CELLULA, COSTITUISCONO IL SUO
TRASCRITTOMA.
GENE EXPRESSION FLOWCHART
Il primo passo attraverso cui una cella inizia
ad interpretare le sue istruzioni genetiche è
copiare una particolare porzione della sua
sequenza nucleotidica del DNA, un gene, in
una sequenza nucleotidica di RNA.
L’informazione in RNA, sebbene copiata in
un'altra forma chimica, viene comunque
scritta essenzialmente nella stessa lingua del
DNA attraverso il linguaggio di una sequenza
nucleotidica. Da qui il nome di trascrizione
trascrizione..
5’→3’
RNA chain is extended by one nucleotide at a time in the 5¢5¢-to
to--3¢
direction. The substrates are nucleoside triphosphates (ATP, CTP,
UTP, and GTP); as in DNA replication, the hydrolysis of highhigh-energy
bonds provides the energy needed to drive the reaction
forward..
forward
GENERALMENTE SOLO UNA DELLE DUE ELICHE DI DNA VIENE COPIATA
COME RNA. IL FILAMENTO CHE FUNGE DA STAMPO E’ DETTO FILAMENTO
SENSO,, MENTRE L’ALTRO FILAMENTO (CHE AVRA’ SEQUENZA IDENTICA
SENSO
ALL’RNA DI NEOSINTESI, A MENO DELLA T IN LUOGO DELL’U), E’ DETTO
ANTISENSO (O NON SENSO).
SENSO). UNO STESSO FILAMENTO PUO’ ESSERE
SENSO IN ALCUNI TRATTI ED ANTISENSO IN ALTRI! LA DIREZIONE
DI SINTESI DELL’RNA AVVIENE SEMPRE SECONDO L’ANDAMENTO 5’5’-3’!
RNA polymerase transcribes the longest known mammalian genes,
containing ≈2 X 106 base pairs, without dissociating from the DNA
template or releasing the nascent RNA. Since RNA synthesis occurs at a
rate of about 1000 nucleotides per minute at 37 C, the elongation complex
must remain intact for more than 24 hours to assure continuous RNA
synthesis..
synthesis
DNA is transcribed by the enzyme
RNA polymerase
BRUCO DI GEOMETRIDE
When RNA polymerase molecules follow hard on each other’s heels in this way,
each moving at about 20 nucleotides per second (the speed in eucaryotes
eucaryotes),
), over a
thousand transcripts can be synthesized in an hour from a single gene.
gene.
Although RNA polymerase catalyzes essentially the same chemical reaction
as DNA polymerase,
polymerase, there are some important differences between the activities
of the two enzymes:
1) First, and most obviously, RNA polymerase catalyzes the linkage of ribonucleotides
ribonucleotides,,
not deoxyribonucleotides
deoxyribonucleotides;;
2)Second, unlike the DNA polymerases involved in DNA replication, RNA polymerases
can start an RNA chain without a primer
primer..
3) Unlike DNA, RNA does not permanently store genetic information in cells. RNA
polymerases make about one mistake for every 104 nucleotides copied into RNA
(compared with an error rate for direct copying by DNA polymerase of about one in
107 nucleotides), and the consequences of an error in RNA transcription are much
less significant than that in DNA replication.
PROBLEMA TOPOLOGICO
TOPOISOMERASI I
RISOLVE IL SUPERAVVOLGIMENTO POSITIVO E
NEGATIVO (NEGLI EUCARIOTI) O SOLO NEGATIVO (NEI PROCARIOTI)
OPERANDO UNA ROTTURA A SINGOLO
FILAMENTO NEL DNA – NON C’è CONSUMO DI ATP
ATP!!
TOPOISOMERASI II
RISOLVONO IL SUPERAVVOLGIMENTO POSITIVO E
NEGATIVO OPERANDO UNA ROTTURA A DOPPIO
FILAMENTO NEL DNA – C’è CONSUMO DI ATP
ATP!!
NEI BATTERI LA GIRASI1 è UNA TOPOISOMERASI II CHE
INTRODUCE SUPERAVVOLGIMENTI NEGATIVI
PER FAVORIRE TRANSIZIONI STRUTTURALI
(ES.:APERTURA DELLA DOPPIA ELICA AD INIZIO
TRASCRIZIONE O DUPLICAZIONE).
1 LA DNA GIRASI DI E.coli E’ UN TETRAMERO COSTITUITO DA DUE SUBUNITA’ OGNUNA DELLE QUALI BERSAGLIO DI ANTIBIOTICI –
GyrA, SU CUI AGISCE L’AC.
GyrA,
L’AC. NALIDIXICO (ANTIBIOTICO CHINOLONICO USATO PER INFEZIONI VIE URINARIE); GyrB
GyrB,, SU CUI AGISCE LA
NOVOBIOCINA (VALIDO CONTRO LE INFEZIONI CAUSATE DA BATTERI COCCHI GRAM POSITIVI (ENTEROCOCCO, STRAFILOCOCCO E
PNEUMOCOCCO))
TRANSCRIPTION IN PROCARYOTES
APOENZIMA (core
(core))
OLOENZIMA (esistono diverse subunità σ)
Bacterial RNA polymerases are
composed of two related large
subunits (β
(β’ and β), two copies of
a smaller subunit (α
(α), and one
copy of a fifth subunit (ω
(ω) that is
not essential for transcription or
cell viability but stabilizes the
enzyme and assists in the
assembly of its subunits
subunits..
Initiation

RNA polymerase
 4 core subunits
 Sigma factor (σ)–
determines promoter
specificity
 Core + σ = holoenzyme
 Binds promoter sequence
 Catalyzes “open complex” and
transcription of DNA to RNA
RNAP binds specific promoter
sequences
Sigma factors recognize consensus
-10 and -35 sequences

A consensus nucleotide sequence is derived by comparing many
sequences with the same basic function and tallying up the most
common nucleotide found at each position
The promoters are characterized by two hexameric DNA sequences, the –
35 sequence and the –10 sequence named for their approximate location
relative to the start point of transcription (designated +1).
RNA polymerase promoters
TTGACA
TATAAT
Deviation from consensus -10 , -35 sequence leads to
weaker gene expression
Bacterial sigma factors






Sigma factors are “transcription factors”
Different sigma factors bind RNAP and recognize
specific -10 ,-35 sequences
Helps melt DNA to expose transcriptional start site
Most bacteria have major and alternate sigma factors
Promote broad changes in gene expression
 E. coli 7 sigma factors
 B. subtilis 18 sigma factors
Generally, bacteria that live in more varied
environments have more sigma factors
Sigma factors
Sigma subunit
Type of gene controlled
s70 RpoD
Growth/housekeeping
s54 RpoN
N2; stress response
~15
sS
RpoS
Stationary phase, virulence
~100
sS
RpoH
Heat shock
~40
sF
RpoF
Flagella-chemotaxis
~40
Extreme?heat shock, unfolded proteins
~5
Ferric citrate transport
~5
s32 RpoE
FecI
# of genes controlled
~1000
E. coli can choose between 7 sigma factors and about 350
transcription factors to fine tune its transcriptional output
An Rev Micro Vol. 57: 441-466 T. M. Gruber
σ54 differisce dagli altri fattori
σ perché è in grado di legare
il promotore anche in assenza del
core enzimatico (alpha
(alpha/beta)
/beta)
What regulates sigma factors




Number of copies per cell (σ70 more than
alternate)
Anti-sigma factors (bind/sequester sigma
factors)
Levels of effector molecules
Transcription factors
Bacterial RNAP numbers

In log-phase E. coli:
 ~4000 genes
 ~2000 core RNA polymerase molecules
 ~2/3 (1300) are active at a time
 ~1/3 (650) can bind σ subunits.

Competition of σ for core determines much of a cell’s
protein content.
Enhancers
IN ALCUNI CASI L’RNA POLIMERASI HA BISOGNO DI
ATTIVATORI PER POTER ESSERE SALDAMENTE
ANCORATA Al PROMOTORE (RECRUITMENT
(RECRUITMENT).
).
ES: CAP (CATABOLITE ACTIVATOR PROTEIN) IN OPERON
Lac..
Lac
Rho-independent termination
• Termination sequence has 2 features:
Series of U residues
GC-rich self-complimenting region
• GC-rich sequences bind forming stem-loop
• Stem-loop causes RNAP to pause
• U residues unstable, permit release of RNA chain
Rho-dependent termination





Rho is hexameric protein
70-80 base segment of RNA
wraps around
Rho has ATPase activity,
moves along RNA until site
of RNAP, unwinds DNA/RNA
hybrid
Termination seems to
depend on Rho’s ability to
“catch up” to RNAP
No obvious sequence
similarities, relatively rare
SEQUENZA PALINDROMICA
TERMINATORE ρ–INDIPENDENTE (O
INTRINSECO):
1) Forcina nella struttura secondaria dell’RNA;
2) Serie di ca. 6 U all’estremo finale dell’unità.
TERMINATORE ρ–DIPENDENTE
LE SEQUENZE NECESSARIE PER LA
TERMINAZIONE RHORHO-DIPENDENTE
SONO LUNGHE 5050-90 BASI (RICCHE IN C
E POVERE IN G) E SI TROVANO
A MONTE DEL TERMINATORE.
RHO è UNA PROTEINA DI
46KD CHE ESAMERIZZA
(275KD) ED HA ATTIVITA’
ATP--asica
ATP
asica!!
RHO INTERAGISCE CON L’RNA DIRETTAMENTE (RICONOSCENDO SEQ
SEQ.. SPECIFICHE
QUINDI “INSEGUE” (MODELLO
(MODELLO DELL’INSEGUIMENTO)
DELL’INSEGUIMENTO) LA RNARNA-POLIMERASI FINO
A RAGGIUNGERE LA SEQUENZA DI TERMINAZIONE E MEDIANTE ATTIVITà ELICASICA
PERMETTE LA SEPARAZIONE DELL’IBRIDO RNA/DNA ED IL CONSEGUENTE
DISTACCO DELLA MOLECOLA DI RNA
IN E. coli il DNA possiede sette copie di tratti di DNA ciascuno dei quali possiede
seq. per rRNA 16S, 23S e 5S, oltre a sequenze per tRNA vari.
IN ALCUNI tRNA di ARCHEA E CIANOBATTERI SONO
STATE IDENTIFICATE DELLE SEQ
SEQ.. INTRONICHE
CHE FUNGONO DA RIBOZIMI E SONO IN GRADO
DI AUTOELIMINARSI (SELF(SELF-SPLICING)
VIDEO TRASCRIZIONE IN PROCARIOTI
TRANSCRIPTION IN EUCARYOTES
3 RNARNA-POLIMERASI
POLIMERASI,, COSTITUITE DA UN CORE
ENZIMATICO E DA FATTORI GENERALI DI
TRASCRIZIONE O GTF
GTF.. I GTFs DELLA POLII
SONO ALMENO 7: TFIIA
TFIIA;; TFIIB
TFIIB;; TFIID
TFIID;; TFIIE
TFIIE;;
TFIIF;; TFIIH
TFIIF
TFIIH;; TFIIJ
TFIIJ..
NOME
LOCAL. CELL.
TIPO RNA
SENSIBILITA’
a-AMANITINA
RNA POL I
Nucleolo
45S (28S; 18S;
5.8S rRNA
rRNA))
-
RNA POL II
Nucleoplasma
mRNA; snRNA
mRNA;
snRNA;;
snoRNA;; miRNA
snoRNA
+++
RNA POL III
Nucleoplasma
tRNA; 5S rRNA
tRNA;
rRNA;;
scRNA;; alcuni snRNA
scRNA
+
RNA POLIMERASI II
SOMIGLIANZA STRUTTURALE DELLA POL II
EUCARIOTICA CON LA POLIMERASI BATTERICA.
LA POL II E’ PIU’ GRANDE DELLA POLIMERASI
PROCARIOTICA (12 SUBUNITà A FRONTE DI 5)
GENE CODIFICANTE PROTEINE
EUCARIOTICO
Promotore
geni codificanti
proteine!
STRUTTURA DEL PROMOTER DEI GENI
EUCARIOTICI CODIFICANTI PROTEINE
NOTA:: ESISTONO
NOTA
ANCHE PROMOTERS
TATA LESS
TATA--BOX CONSENSUS SEQUENCE
TATA
LA TATA BOX NON E’ L’UNICA SEQUENZA CHE SEGNALA L’INIZIO DELLA
TRASCRIZIONE MA PER MOLTI PROMOTORI DELLA POLII E’ LA PIU’
IMPORTANTE!
TBP SI ASSOCIA INSIEME CON ALTRI 88-12
FATTORI GENERALI DI TRACRIZIONE
(GTFs
GTFs)) A FORMARE IL TFIID
BENDING
TATA BOX BINDING PROTEIN
TBP
Saddle-like
domain
DNA
BINDING
TATA BOX
TAF5 stabilizes
TAFs interaction
interaction,,
specially histone
histonelike ones (TAF6,
TAF9)
TAF1: Acetyl
transferase
activity
Interaction with
TFIIF
TAF12
TAF8
TAF7
TAF4 TAF10 TBP
TAF6TAF11
TAF6
TAF11
TAF5
TAF5
TAF8 TAF3
TAF12
TAF11
TAF9TAF13
TATA BOX
TAF10
TAF6 TAF9
TAF13
TAF4
TAF3
DNA BENDING
TFIID
HETEROTETRAMER
(RAP30)2 (RAP74) 2
(RAP30)2 BINDS RNA POL II
AND TFIIB. RAP74 INTERACTS
WITH DNA. TFIIF
STABILIZES THE
INTERACTION OF
RNA POLII WITH
PROMOTER AND STIMULATES
ELONGATION RATE
DAB
TWO DOMAIN:
HETEROTRIMER
N-TERMINAL
(A, B, C SUBUNITS)
BINDS PROMOTER
REGION WITH TFIID
ZnZn
-RIBBON AND
TFIIA
TFIIF
TFIID
CORE DOMAIN
TFIIE
TFIIB
TFIIH
TFIIE MODULATES
THE HELICASE AND
KINASE
ACTIVITIESOF TFIIH
TFIIB INTERACTS WITH
SADDLESADDLE
-LIKE DOMAIN OF
P
TBP AND WITH BENDED DNA
ON SIDES OF TATA BOX.
TBP/TFIIB COMPLEX
RECRUITS RNA POLII AND
OTHER GTF
BY STIMULATING CTD
DOMAIN RNA POLII
PHOSPHORYLATION
TFIIH
STIMULATES
PROMOTER PHOSPHORYLATION OF
MELTING AND IT RNA POLII CTD
HAS KINASESTIMULATES PROMOTER
ACTIVITY
MELTING AND
AGAINST RNA
POL II TRANSCRIPTION START
NOTE: TFIIH HAS BOTH HELICASE AND KINASE ACTIVITIES
VIDEO
UNA VOLTA CHE LA POLII HA INIZIATO AD ALLUNGARE
IL TRASCRITTO DI RNA LA MAGGIORPARTE DEI GTF
VIENE RILASCIATA DAL DNA COSI’ DA DIVENTARE
DISPONIBILE PER INIZIARE UN NUOVO CICLO DI
TRASCRIZIONE CON UNA NUOVA MOLECOLA DI RNA POL!
LA FOSFORILAZIONE DEL DOMINIO CC-TERMINALE (CTD)
DELLA POLII DETERMINA UN CAMBIAMENTO CONFORMAZIONALE
TALE CHE SULLA POLII VENGONO CARICATE COMPONENTI
DEL MACCHINARIO DI MODIFICAZIONE DELL’RNA CHE COSI’
INIZIA AD ESSERE MODIFICATO GIA’ DAL MOMENTO IN CUI
VIENE SINTETIZZATO!
STEPWISE MODEL vs HOLOENZYME MODEL
A stepwise assembly model for transcription initiation
A pre
pre--assembly model
ENHANCER È IL TERMINE USATO PER DEFINIRE SPECIFICHE SEQUENZE
DI DNA IN GRADO DI AUMENTARE L'EFFICACIA DEI PROMOTORI
NELL'ATTIVAZIONE DELLA TRASCRIZIONE.
TRASCRIZIONE. GLI ENHANCER SVOLGONO IL
LORO RUOLO ATTRAVERSO L'ASSOCIAZIONE CON DIVERSE PROTEINE,
TRA CUI DIVERSI FATTORI COINVOLTI NELL'AVVIO DELLA
TRASCRIZIONE STESSA.
NEI GENI DEGLI EUCARIOTI GLI ENHANCERS POSSONO DISTARE DALLA
REGIONE CODIFICANTE ANCHE PIÙ DI 50 KB.
KB.
IL SILENCER È UNA SEQUENZA DI DNA IN GRADO DI LEGARE DEI
FATTORI DI TRASCRIZIONE DETTI REPRESSORI. QUANDO IL SILENCER
È LEGATO DAL REPRESSORE, L’RNA POLIMERASI NON È IN GRADO DI
INIZIARE LA TRASCRIZIONE.
ATTRAVERSO IL RICONOSCIMENTO DI SITI SPECIFICI, I FATTORI DI
TRASCRIZIONE SPECIFICI (STFs
(STFs)) POSSONO PERMETTERE LA
ATTIVAZIONE/REPRESSIONE DI GENI IN MANIERA TESSUTOTESSUTO-SPECIFICA O A
SEGUITO DI SPECIFICI CAMBIAMENTI DELL’AMBIENTE INTRA OD
EXTRACELLULARE!
ATTRAVERSO IL
RICONOSCIMENTO DI SITI
SPECIFICI, I FATTORI DI
TRASCRIZIONE SPECIFICI
(STFs
STFs)) POSSONO PERMETTERE
LA TTIVAZIONE/REPRESSIONE
DI GENI IN MANIERA TESSUTOTESSUTOSPECIFICA O A SEGUITO DI
SPECIFICI CAMBIAMENTI
DELL’AMBIENTE INTRA OD
EXTRACELLULARE!
IL MEDIATORE
The human Mediator complex is a large, multimulti-subunit protein assembly that
exists in 2 major forms: a core complex that contains 26 subunits and is 1.2
MDa in size, and a CDK8CDK8-Mediator complex that contains 29 subunits (25
shared with the core Mediator complex) and is approximately 1.8 MDa in size.
IL MEDIATORE
The core complex (typically referred to as Mediator) binds the RNA
polymerase II (pol
(pol II) enzyme and generally serves to activate gene
expression; by contrast, the CDK8CDK8-Mediator complex cannot bind pol
II. Mediator is present from yeast to human, but the amino acid sequence of
each individual Mediator subunit has diverged considerably throughout
evolution, in part in response to increasingly diverse transcriptional
regulatory factors. Because proper regulation of transcription is so critical
throughout development, and to prevent tumor formation and a host of other
potential disorders, humans have evolved elaborate mechanisms by which
the spatial and temporal patterns of gene expression are controlled.
IL MEDIATORE
Despite the structural and functional diversity of this regulatory
machinery, only a select few components—
components—pol II, TFIIH, and
Mediator—
Mediator
—are considered master regulators of transcription.
It is also evident that Mediator acts as a scaffold around which the
human PrePre-Initiation Complex (PIC) assembles.
assembles. This central
structural role for Mediator can at once explain its general
requirement for transcription, its ability to regulate the function of
other PIC factors, and its ability to regulate different stages of the
transcription cycle (e.g. initiation and elongation).
Workman's lab also recently had discovered the most powerful
molecular character involved in unwinding a gene, an enzyme called
"SWI/SNF" (pronounced "switch
"switch--sniff
sniff").
"). SWI/SNF breaks the grip of
the histone proteins in the core of the nucleosome spool, liberating
the gene on that stretch of DNA so it can unwind far enough to be
accessible to another molecule, the "Transcription Enzyme," whose
job is to move along the gene's length coping its code. Other
molecules then use this copy to make proteins, which do the work
specified by the gene.
TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE NEI GENI EUCARIOTICI
DUE PROTEINE (CstF
(CstF – Fattore di stimolazione del
taglio F; CPSF – Fattore di specificità del taglio e
della poliadenilazione
poliadenilazione)) SONO PARTICOLARMENTE
IMPORTANTI. ENTRAMBE SONO TRASPORTATE
CON LA CODA DELLA RNA POLIMERASI E SONO
TRASFERITE ALL’ESTREMITà
ALL’ESTREMITà 3’ DELLA CATENA
DI RNA NASCENTE.
L’mRNA
L’
mRNA SUBISCE MOLTE MODIFICHE
PRIMA DI ESSERE ESPORTATO DAL
NUCLEO AL CITOPLASMA.
TALI MODIFICHE SONO ESSENZIALI
PER IL SUO TRASPORTO NEL CITOSOL
E PER LA SUA SUCCESSIVA TRADUZIONE
LEGAME 5’5’-5’
IL CAPPING AL 5’ E’ IMPORTANTE PER:
1) ESPORTAZIONE DELL’
DELL’mRNA
mRNA ATTRAVERSO I PORI NUCLEARI;
2) PROTEZIONE DALLA RIBONUCLEASI CITOSOLICHE;
3) CONTROLLO POSITIVO DELL’INIZIO DELLA TRADUZIONE
SPLICING
PROCESSO ATTRAVERSO CUI VENGONO ELIMINATI GLI INTRONI
2 REAZIONI DI TRANSESTERIFICAZIONE.
IL COMPLESSO RIBONUCLEOPROTEICO (FATTO DA snRNA + PROTEINE,
A FORMARE LE snRNPs
snRNPs)) ADIBITO AL CONTROLLO DELLO SPLICING
PRENDE NOME DI SPLICEOSOMA (5 molecole di snRNA + 50 proteine)
PROCESSO ATTIVO, CHE PREVEDE CONSUMO DI ATP
ATP!!
PUO’ SEMBRARE UNO SPRECO ELIMINARE GLI INTRONI:
IN REALTA’ GLI INTRONI SONO ELEMENTI NECESSARI
PERCHè ATTRAVERSO L’INCREMENTO DELLE
RICOMBINAZIONI, ESSI FACILITANO INDIRETTAMENTE
L’EXON SHUFFLING!
1° STEP
STEP:: UN NUCLEOTIDE
ADENINICO SPECIFICO DELLA
SEQ INTRONICA ATTACCA
IL SITO DI SPLICING AL 5’
E TAGLIA L’OSSATURA ZUCCHEROZUCCHEROFOSFATO DELL’RNA IN QUEL PUNTO.
2° STEP
STEP:: L’ESTREMITA’ 3’3’-OH LIBERA
DELL’ESONE REAGISCE CON L’INIZIO
DELLA SEQUENZA ESONICA SUCCESSIVA,
UNENDO I DUE ESONI E RILASCIANDO
L’INTRONE COME UNA STRUTTURA
“A CAPPIO” (O LARIAT) CHE VERRA’
POI DEGRADATA.
LA SEQUENZA CONSENSO “GU……AG
“GU……AG””
1) IL BRANCH POINT VIENE DAPPRIMA
RICONOSCIUTO DALLE PROTEINE
BBP ED U2AF;
2) SUCCESSIVAMENTE snRNP U2 “SPOSTA”
BBP ED U2AF MENTRE snRNP U1 SI LEGA
ALL’ESTREMITA’ 5’ DELL’INTRONE;
3) LA TRIPLA snRNP U4/U6/U5 INFINE
CONSENTE LE DUE SUCCESSIVE REAZIONI
DI TRANSESTERIFICAZIONE.
NOTA: LA ROTTURA E RIUNIONE DEI
NOTA:
NUCLEOTIDI SONO DOVUTE ALL’ATTIVITA’
DEGLI snRNA CHE AGISCONO DA RIBOZIMI.
LO SPLICING E’ UN PROCESSO “ORDINATO”
1° EVENTO
EVENTO:: L’EVENTO DI SPLICING AVVIENE COLINEARMENTE ALLA SINTESI
DELL’RNA (CHE, AVVENENDO IN DIREZIONE 5’5’-3’, CONSENTE DI FAR RICONO=
SCERE IN MANIERA ORDINATA I SITI DI SPLICING AL 5’ ED AL 3’, SECONDO UN BEN
PRECISO ORDINE);
2° EVENTO
EVENTO:: IPOTESI DI DEFINIZIONE DEGLI ESONI (COMPLESSI DI PROTEINE
“SR” (SERINE RICH) LEGANO GLI ESONI MENTRE COMPLESSI hnRNP LEGANO SPECIFICA=
TAMENTE GLI INTRONI. CIO’ PERMETTE ALLO SPLICEOSOMA DI DISTINGUERE SEQ INTRONICHE
ED ESONICHE!
LA SEQUENZA CONSENSO “AT……AC
“AT……AC”” (EUCARIOTI
PIU’ COMPLESSI QUALI MOSCHE, MAMMIFERI E VEGETALI)
NELL’UOMO SI STIMA
CHE LO 0.1% DEGLI INTRONI
SIA RIMOSSO DA SPLICEOSOMA
AT--AC
AT
snRNAs U4 ATAT-AC, U6 ATAT-AC,
U11 E U12 FORMANO PARTE
DELLO SPLICEOSOMA
MINORE CHE PROCESSA I
RARI INTRONI AUAU-AC
IL TRANSTRANS-SPLICING (TRIPANOSOMI UNICELLULARI, NEMATODI)
ESONI DI DUE TRASCRITTI SEPARATI
SONO UNITI INSIEME A FORMARE UNA
UNICA MOLECOLA DI RNA MATURO.
DI NORMA UN SINGOLO ESONE AL 5’
VIENE UNITO A TUTTI (TRIPANOSOMI) O AD
ALCUNI (NEMATODI) mRNA
mRNA..
ESISTONO ANCHE ALTRI TIPI DI INTRONI – IL SELF SPLICING
VIENE RICHIESTA
UNA G “ESTERNA”
1) INTRONI DI GRUPPO I
(SI TROVANO FONDAMENTALMENTE
NEI GENI CHE CODIFICANO PER
rRNA NEI NUCLEI DEGLI EUCARIOTI
INFERIORI Tetrahymena thermophila – UN
CILIATO- E Physarum polycephalum – UNA
MUFFA MUCILLAGINOSA-, OLTRE CHE
IN 3 GENI FAGO T4 SPECIFICI ED IN
ALCUNI BATTERI)
2) INTRONI DI GRUPPO II
(SI TROVANO PRINCIPALMENTE
ALL’INTERNO DI GENI PER mRNA
MITOCONDRIALI)
S
E
L
F
S
P
L
I
C
I
N
G
STESSO MECC. DI
SPLICING
“PRINCIPALE”
SPLICING ALTERNATIVO
Insieme a: uso di promoters alternativi e segnali di poliadenil. alternativi
permette di formare diversi mRNA maturi da uno stesso gene
POLIADENILAZIONE
LA PROTEINA PAP (POLI(POLI-A POLIMERASI) E’
RESPONSABILE DELL’AGGIUNTA DI UNA SERIE
DI A (CA
(CA.. 200) A VALLE DEL SITO DI TAGLIO
DELL’mRNA
DELL’
mRNA..
STRUTTURA DELL’ mRNA MATURO
Cap
5’
7mGppp
initiation
5’ untranslated region
AUG
translated region
UGA
3’ untranslated region
termination
polyadenylation signal
AAUAAA
(A)~200
poly(A) tail
3’
GENI DI CLASSE I
1) SONO I GENI CHE CODIFICANO PER GLI rRNA 28S; 18S E 5.8S;
2) SONO ORGANIZZATI IN CLUSTER
CHE SPESSO SI RIPETONO IN
TANDEM;
3) CITOGENETICAMENTE SONO DI=
SPOSTI IN REGIONI CROMOSOMALI
SPECIFICHE CHE CONVERGONO IN
UNA SUB-STRUTTURA NUCLEARE
NOTA COME NUCLEOLO
PROMOTERS DEI GENI DI CLASSE I
I PROMOTERS DEI GENI DI CLASSE I :
• PRESENTANO SCARSA VARIABILITA’;
• COSISTONO IN UNA SEQUENZA BIPARTITA NELLA REGIONE CHE PRECEDE
IL PUNTO DI INIZIO: SI DISTINGUONO UN NUCLEO DEL PROMOTER (-45/+20)
ED UN UCE (UPSTREAM CONTROL ELEMENT) (-180/-107);
• ENTRAMBE LE REGIONI SONO PARTICOLARMENTE RICCHE IN GC;
• PERCHE’ LA TRASCRIZIONE INIZI, DAPPRIMA SI LEGANO DUE FATTORI:
UBF1 ED SL1 (TBP + 3TAFs) E SOLO DOPO SI LEGA LA POL I
PROMOTER DI GENI DI CLASSE I:
PIC
MATURAZIONE DEGLI rRNA EUCARIOTICI
LA SINTESI DEL
PRECURSORE DEGLI
rRNA 28S, 18S E 5.8S È UNA
GRANDE MOLECOLA
(PRE-rRNA 45S)
TRASCRITTA DALLA RNA
POL I NEL NUCLEOLO.
ANCHE LA MATURAZIONE
AVVIENE NEL NUCLEOLO.
NUMEROSI PICCOLI RNA
NUCLEOLARI (snoRNA)
PARTECIPANO AL PROCESSO
GENI DI CLASSE III
1) CODIFICANO PER I tRNA; PER L’rRNA 5S E PER VARI
snRNA;
2) POSSONO PRESENTARE DEI PROMOTERS “INTERNI” (ICR);
3) PRIMA DI INIZIARE A TRASCRIVERE LA POL III NECESSI=
TA DI TFIII (IN PARTICOLARE DEL FATTORE DI
POSIZIONAMENTO TFIIIB)
PIC DELLA RNA POLIII
tRNA;
rRNA5S
snRNA
TFIIIB È COSTITUITO DA TBP E DA
ALMENO UN TAF3
MATURAZIONE DEI tRNA
MODIFICAZIONI POST-TRASCRIZIONALI DEI TRNA
•
ELIMINAZIONE DELLA SEQUENZA AL 5’ (LEADER)
ED AL 3’ (TRAILER)
•
AGGIUNTA DI CCA AL 3’
•
MODIFICAZIONE DI ALCUNE BASI AZOTATE
•
IN ALCUNI tRNA ELIMINAZIONE DI UN PICCOLO INTRONE
(PRESENTE SOLO NEI tRNA DEGLI AA. Tyr; Phe; Trp;
Lys; Ser; Leu ed Ile)
NOTA: IL PROCESSAMENTO AVVIENE
NEL NUCLEO DELLE CELL.
EUCARIOTICHE, SICCHE’ NEL
CITOPLASMA SI TROVA SOLO
tRNA MATURO
CA. 40 DEI 400 GENI NUCLEARI DI tRNA SONO INTERROTTI CIACUNO
DA UN SINGOLO INTRONE. NON ESIST. SEQ. CONSENSO CHE POTREBBERO
ESSERE RICONOSCIUTE DAGLI ENZIMI DI SPLICING.
STESSE REGOLE GENERALI VALGONO PER tRNA DI VEGETALI; ANFIBI E
MAMMIFERI. LO SPLICING AVVIENE ATTRAV. PROCESSI DI “TAGLIO E RIUN.
SOLO IL 4% DEI TRASCRITTI E’ TRADOTTO!

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