17. sintesi proteica e codice genetico - E

17. Sintesi Proteica e Codice Genetico contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è
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dall’mRNA alle proteine 1
L RNA messaggero viene trado5o dai ribosomi Ribosomi costituiti da complessi di ribonucleoproteine (RNA + Proteine) e deputati alla sintesi proteica da RNA messaggero 2 tipi di ribosomi nel citosol: RIBOSOMI LEGATI ALLA MEMBRANA ESTERNA DEL RE (poliribosomi): sintetizzano tutte le proteine transmembrana e quelle destinate ad essere secrete RIBOSOMI LIBERI: non attaccati a nessuna membrana, i quali sintetizzano tutte le altre proteine codificate dal genoma. Ribosomi liberi e quelli associati alla membrana sono strutturalmente e funzionalmente identici 2
Ribosomi presentano due subunità (maggiore e minore) libere nel citoplasma, si associano per
operare la traduzione degli mRNA
I Ribosomi associati al RER sono impegnati nella sintesi di proteine che possono essere secrete o incorporate nella membrana Le proteine che entrano nel reticolo, proseguiranno successivamente per l'apparato di Golgi e verranno infine espresse sulla membrana plasmatica o secrete. 3
Le due subunità
vengono riferite in
base loro valore S
(coefficiente di
sedimentazione)
4
Confronto tra Ribosomi batterici ed eucariotici
Coefficiente di sedimentazione s = v / ω2r v = velocità di sedimentazione (dipende da massa, densità propria e del mezzo, e dal campo centrifugo applicato) ω = velocità angolare del rotore in radianti/s r = distanza radiale della particella dall'asse di rotazione, cm I valori comuni di s sono nell'ordine di 10-‐13 sec = 1 svedberg (S) se rRNA ha s = 5·∙10-‐13 sec è
coefficiente = 5S. 5
La codifica dell mRNA avviene sui RIBOSOMI Forma; da 4 RNA e 80 proteine diverse In vitro le
2 subunità
si
dissociano
se < Mg
6
Al Microscopio elettronico i ribosomi appiano associati in catene di 5 -‐20 elementi, denominati POLISOMI, dove avviene la traduzione degli mRNA, ovvero la sintesi proteica. 7
Ogni ribosoma presenta -‐ un sito di legame per l mRNA -‐ 3 si; di legame per il tRNA Sito A (Amminoacil-‐tRNA) Sito P (Pep;dil-‐tRNA) Sito E (Exit (uscita)) Poliribosomi
(≈ 35 aa)
mRNA tradotto simultaneamente da più ribosomi che si muovono in
direzine 5’-3’
In ogni istante ribosoma accoglie 2 tRNA:
-  Con proteina nascente
-  Con aa da aggiungere
8
COMPONENTI MACROMOLECOLARI E. COLI
25 % massa batterica secca è costituito da componenti
dell’espressione genica
9
I codoni di mRNA NON riconoscono dire5amente gli aa cui corrispondono Sono necessarie molecole ada5atrici che riconoscono e legano sia il codone che l aa a si; diversi L RNA transfer è l adattatore 10
braccio acce/ore (chiamato anche braccio amminoacidico): 7 paia di basi (i nucleo;di che si appaiano sono quelli 5'-‐ e 3'-‐terminali). Al 3 : OH per l'a5acco dell'amminoacido. Al 5 : gruppo fosfato NB Alla terminazione 3' si trova trinucleo5de molto conservato dalla sequenza CCA (de:a anche coda CCA). importante per il riconoscimento dei tRNA durante la traduzione. braccio D: è una regione contenente un loop che presenta spesso diidrouridina. braccio A: (o braccio dell'an/codone) è composto di 5 paia di basi e termina in un loop contenente l'an;codone. braccio T: composto da 5 paia di basi, con;ene una sequenza molto conservata TΨC. (pseudouridina) braccio extra: composizione variabile da 3 a 21 basi altre cara5eris/che tRNA -‐ sinte;zza; so5o forma di precursori -‐ sequenze extra eliminate da endo-‐/ eso-‐ nucleasi -‐ 3 nucleo;di all estremità 3 sempre CCA -‐ esiste almeno un tRNA per ogni aa Denominazione
dell aa
-‐ in apice abbreviazione a tre le5ere ex. tRNAAla -‐ in pedice numero se + tRNA per stesso aa ex. tRNA1Ala
tRNA2Ala -‐ se tRNA porta già l aa aggiungere prefisso dell aa ex. Ala-‐tRNA 11
tRNA + aa = amminoacil-‐tRNA (AMP+aa)
amminoacil
-tRNA
sintetasi
Domanda:
La sequenza dell’anFcodone consente da sola all amminoacil-‐tRNA di riconoscere il codone corre/o? esperimento Risposta: SI: una volta che tRNA è caricato, aa NON ha influenza sulla specificità data solo dall an/codone 12
La struttura secondaria di ogni
tRNA si ripiega in una
struttura terziaria a forma di L
con stelo accettore ed
anticodone alle estremità
opposte
ñ
Siti con funzioni particolari
sono separati dalla max
distanza
Modello a spazio pieno 13
Passaggi ripetu; fino al codone di stop 14
I si; dei tRNA si estendono in entrambe le subunità INTERAZIONI tRNA-‐Ribosoma 15
tRNA e mRNA si spostano attraverso il ribosoma nella stessa direzione
16
Nei batteri l inizio della traduzione richiede le subunità 30S e fattori accessori 17
il Ciclo delle unità ribosomiali
INIZIO: richiede subunità
ribosomiali libere
Le subunità si riassociano e fattori
d’inizio vengono rilasciati
IF-‐3 perme5e al ribosoma di legare mRNA IF-‐2 si lega a tRNA iniziatore IF-‐1 si lega al sito A e impedisce ingresso aminoacil-‐tRNA 18
IF-‐3 controlla equilibrio subunità ribosomi Uno speciale tRNA iniziatore incomincia la sintesi La traduzione di un mRNA comincia sempre con un codone AUG e richiede sempre un tRNA iniziatore che reca l aa METIONINA 19
Nei ba5eri (e negli organelli eucario;ci) il tRNA iniziatore è formilato Impedisce
allungamento ma
permette l’inizio
Codoni d’inizio nei ba5eri: AUG GUG (< efficienza) UUG ( “ ) NB non tutte le proteine presenti in natura cominciano con Met che verrà eliminata da ammino peptidasi 20
Specificità stru5urali del tRNA iniziatore NB è l’unico tRNA che entra nel sito P IdenFficazione della triple/a d’inizio [AUG] nei procarioF complementare
è
guida subunità minore x legare mRNA contenente sempre GGAGG a
monte codone di inizio
NB: mol5 RiBosomeSite (RBS): mRNAprocario5 sono policistronici (codificano per + pep5di) 21
fa/ori accessori controllano Inizio sintesi proteica nei procarioF Nell mRNA eucariotico le subunità piccole migrano sui siti d inizio 22
IndenFficazione dell’AUG iniziale negli eucarioF Modello
della
scansione
Importante presenza
AUGG a valle
Coppia GA a monte
eIF5B media il corre5o posizionamento del tRNA iniziatore nel sito P complesso di pre-‐inizio Lega il cap dell’mRNA mediante interazione IF3 e eIF4F 23
eucarioti hanno + fattori d’inizio dei batteri hairpin
eIF4A: elicasi, aiutato da eIF4B eIF4E: cap binding protein Consente svolgimento stru5ure a forcina eIF4G: ada/atore 24
allungamento 25
Ingresso amminoacil tRNA nel sito A è mediato dal fattore di allungamento Tu
Procarioti
EF-Tu
Eucarioti
eEF1α
EF-Tu ricicla fra una forma legata al GTP e una legata al GDP
26
I fattori di allungamento EF-Tu ed EF-G si legano
alternativamente al ribosoma
Attivi solo se
legano il GTP
EF-Tu +amminoacil-tRNA ≈ EF-G EF-‐G può cosi entrare nel sito A e promuovere la traslocazione 27
La catena polipeptidica si sposta sull’amminoacil-tRNA
Peptidil trasferasi
Puromicina inibisce sintesi proteica proprio sfru5ando questa reazione Ribosoma scambia puromicina per amminoacil-‐tRNA e trasferice la catena polipep5dica al NH2 della puromicina 28
MolF anFbioFci inibiscono specifiche fasi della traduzione La traduzione è serie ordinata di even;: completamento di quello precedente è necessario per l’inizio di quello successivo. Se viene bloccato o inibito uno di ques; even;, l’intero processo si blocca. 40% degli an;bio;ci conosciu; ha come bersaglio l’apparato della traduzione. Ciclo di aggiunta degli aa è completato dalla TRASLOCAZIONE 29
TRASLOCAZIONE
avviene in 2 fasi a.  50S si muove rispetto a 30S
b.  30S si muove lungo mRNA
fino a ritrovare la
conformazione originale
Modello dello stato ibrido:
Estremità aa dei tRNA si spostano nei nuovi siti Estremità con gli anticodoni ancora unita ai codoni Legami ibridi: 50S E/30S P 50S P/30S A Tre codoni causano la terminazione della sintesi proteica • UAG (amber)
• UAA (ochre)
• UGA (opal)
30
I codoni di termine sono riconosciu; da fa/ori di rilascio (RF) RF1 riconosce UAA e UAG RF2 riconosce UGA e UAA Agiscono a livello del sito A in presenza del polipep5dil tRNA 31
La terminazione richiede molteplici fattori proteici
Ribosome
Recycling
Factor
32
Il ruolo dell RNA ribosomico nella sintesi proteica rRNA 16S ruolo a`vo nelle funzioni della subunità 30S interagisce dire5amente con l’mRNA e con gli an;codoni dei tRNA nei si; P ed A rRNA23S a`vità pep;diltrasferasica SiF dell’rRNA 16S necessari per determinate funzioni 33
La traduzione Successivamente su ogni odone si a5accherà l tessaggero RNA con si a5acca La fase di traduzione ha cinizio quando l RNA im
lal an;codone ribosoma. complementare, portandosi dietro un amminoacido. Gln G U Ala U C G Val A C A Gly U G G A an;codone codone G C U C A A C C U G U A La traduzione Successivamente su ogni odone si a5accherà l tessaggero RNA con si a5acca La fase di traduzione ha cinizio quando l RNA im
lal an;codone ribosoma. complementare, portandosi dietro un amminoacido. Gln G U Ala U C G C U C A G A Val A C C C U G U A Gly U G G A A 34
La traduzione Successivamente su ogni odone si a5accherà l tessaggero RNA con si a5acca La fase di traduzione ha cinizio quando l RNA im
lal an;codone ribosoma. complementare, portandosi dietro un amminoacido. Gln Val Gly Ala G U U C C G C U G C A U G G A A A A C C U G U A La traduzione Successivamente su ogni odone si a5accherà l tessaggero RNA con si a5acca La fase di traduzione ha cinizio quando l RNA im
lal an;codone ribosoma. complementare, portandosi dietro un amminoacido. Gln Val Gly Ala G U U C C G A G C U C A A C C U G U A U G G A A 35
La traduzione Successivamente su ogni odone si a5accherà l tessaggero RNA con si a5acca La fase di traduzione ha cinizio quando l RNA im
lal an;codone ribosoma. complementare, portandosi dietro un amminoacido. Gln Val Gly Ala G U U C C G A G C U C A A C C U G U A U G G A A La traduzione Successivamente su ogni odone si a5accherà l tessaggero RNA con si a5acca La fase di traduzione ha cinizio quando l RNA im
lal an;codone ribosoma. complementare, portandosi dietro un amminoacido. Gln Val Gly Ala G U U C C G A G C U C A A C C U G U A U G G A A 36
La traduzione Successivamente su ogni odone si a5accherà l tessaggero RNA con si a5acca La fase di traduzione ha cinizio quando l RNA im
lal an;codone ribosoma. complementare, portandosi dietro un amminoacido. Val Gly Gln Ala C G U U C G A G C U C A A C C U G U A U G G A A La traduzione Successivamente su ogni odone si a5accherà l tessaggero RNA con si a5acca La fase di traduzione ha cinizio quando l RNA im
lal an;codone ribosoma. complementare, portandosi dietro un amminoacido. Val Ala Gly Gln C C G A G U U G C U C A A C C U G U A U G G A A 37
La traduzione L amminoacido del primo tRNA si lega poi a quello del secondo… Val Ala Gly Gln C C G A G U U G C U C A A C C U G U A U G G A A La traduzione L amminoacido del primo tRNA si lega poi a quello del secondo… Val Gly Ala Gln C C G A G U U G C U C A A C C U G U A U G G A A 38
La traduzione L amminoacido del primo tRNA si lega poi a quello del secondo… Val Gly Ala Gln C C G A G U U G C U C A A C C U G U A U G G A A La traduzione … il primo tRNA si allontana… Val Gly Ala Gln C C G A U G G A A G C U G U U C A A C C U G U A 39
La traduzione … il primo tRNA si allontana… Val Gly Ala Gln C G A C G C U G U U C A A C C U G U A U G G A A La traduzione … il primo tRNA si allontana… Val Gly Ala Gln C G A C G C U G U U C A A C C U G U A U G G A A 40
La traduzione … e un nuovo tRNA si a5acca all RNA messaggero Val Gly Ala Gln C G A C G C U G U U C A A C C U G U A U G G A A La traduzione … e un nuovo tRNA si a5acca all RNA messaggero Val Gly Ala Gln C G C U G U U C A A C C U G U A U G G A A 41
La traduzione … e un nuovo tRNA si a5acca all RNA messaggero Val Gly Ala Gln C A G G C U G U U C A A C C U G U G U A A La traduzione … e così via. Val Ala Gln Gly C G C U G U U G G A C A A C C U G U A U A 42
La traduzione … e così via. Val Ala Gln Gly C G C U G U U G G A C A A C C U G U A U A La traduzione … e così via. Val Ala Gln Gly C G G C U U C A U U A A G G A C C U G U A 43
La traduzione … e così via. Val Ala Gln Gly G G U C U U C C A A G G A C C U G U A U A La traduzione … e così via. Val G U Ala Gln Gly U C G C U C A A G G A C C U G U A U A 44
La traduzione … e così via. Val Ala Gln Gly C G C U C A A G G A C C U G U A U A … e così via. Ala Gln Gly Val C G C U C A A G G A C C U G U A U A 45
… e così via. Ala Gln Gly G C U C A A Val G G A C A U C C U G U A … e così via. Ala Gln Gly G C U C A A Val G G A C A U C C U G U A 46
… e così via. Ala Gln Gly Val G C U C A A G G A C A U C C U G U A In questo modo si viene a costruire un polipep;de sempre più grande finché non si arriva ad un codone di stop e la sintesi si interrompe. 47
L interpretazione del codice gene;co Perché avvenga la traduzione è necessario passare da un linguaggio fatto di NUCLEOTIDI ad un linguaggio di AMINOACIDI. Gli aminoacidi presenti in tutte le proteine sono 20 mentre le basi sono solo 4. Se ogni base specificasse per 1 amminoacido, avremmo: 41 = 4 è
solo 4 aminoacidi specificati. Se la combinazione di 2 basi specificasse per 1 aminoacido, avremmo: 42 = 16 aminoacidi specificati. Se la combinazione di 3 basi specificasse per 1 aminoacido, avremmo: 43 = 64 combinazioni per 20 aminoacidi. 48
Il codice pertanto è a triplette: cioè la combinazione di tre basi specifica per 1 aminoacido. Ogni tripletta è detta CODONE. Esistono 3 triplette che non codificano per nessun aminoacido e sono dette codoni di STOP: UAG; UAA; UGA. CODICE GENETICO Regole a5raverso cui la cellula traduce una sequenza di codoni (o triple:e di basi) di RNA in una sequenza di amminoacidi durante la sintesi proteica. Tu5e le cellule procario;che e eucario;che usano lo stesso codice gene;co* Usando sistemi di sintesi proteica in vitro, estra` di E.coli possono tradurre mRNA di qualsiasi specie * alcune differenze nel DNA mitocondriale 64 -‐ 3 (codoni di stop) = 61 triplette per 20 aa Codice è ridondante: ogni aa può essere specificato da + di 1 codone. NB i diversi codoni per un aminoacido sono diversi soprattutto nella 3° base
49
Una molecola di RNA è traducibile in 3 modi diversi a seconda del MODULO di LETTURA CARATTERISTICHE DEL CODICE GENETICO -‐Il codice genetico è a TRIPLETTE cioè la combinazione di tre basi specifica per 1 aminoacido -‐Il codice genetico è RIDONDANTE cioè ogni aminoacido può essere specificato da più di un codone. -‐Il codice genetico NON è AMBIGUO cioè un determinato codone specifica per un solo aminoacido -‐Il codice genetico è UNIVERSALE cioè uguale per tutti gli esseri viventi tranne alcune eccezioni. -‐Il codice genetico è SENZA PUNTEGGIATURA cioè viene letto linearmente (di tre basi in tre basi di seguito) e NON è SOVRAPPONIBILE (es. la stessa base non può essere letta come l ultima di un codone e la prima del successivo). 50
Non vi è correlazione tra numero di codoni per aa e frequenza di u;lizzo nelle proteine 51
Nella sintesi proteica il tRNA corre5o viene selezionato dalla interazione tra codone ed anFcodone. L aminoacido NON partecipa al processo di riconoscimento tra tRNA e mRNA Nel riconoscimento codone-‐an;codone : 5 -‐ A C G -‐3
codone 3 -‐ U G C -‐5
anFcodone La prima base dell anFcodone riconosce la terza base del codone Va scri/a ACG/CGU AnFcodone va le/o a rovescio! Il legame tra codone e anticodone è complementare e antiparallelo. Il numero dei codoni (61) è più grande di quello degli anticodoni. 61 codoni mentre i tRNA sono circa 30-‐40 in procarioti e anche 50 in Eucarioti) Questo implica che alcune molecole di tRNA con il loro anticodone sono capaci di accoppiarsi a più di un codone. L OSCILLAZIONE DELLE BASI Alcuni tRNA hanno una struttura tale da richiedere un appaiamento accurato nelle prime due posizioni del codone (5') e da tollerare un appaiamento scorretto (oscillante) in terza posizione. Questo appaiamento approssimativo rende possibile combinare 20 AA ai loro 61 codoni servendosi per esempio di solo 30/50 molecole di tRNA. 52
53
Il tRNA contiene basi modificate
54
spesso al 5' dell'anticodone (alla terza base del codone) esiste la base modificata inosina capace di complementarsi sia con A, C, U. 55
2-tiouracile ha appaiamenti limitati
Cambiamen/ del codice gene/co 1.  Assegnazione di un aa ad un codone di stop 2.  Cambiamento codone che non specifica più per aa (NULLA) 56
Sintetasi: caricano aa su tRNA
Ogni sintetasi riconosce un tRNA:
Vi sono 20 amminoacil-tRNA sintetasi
tRNA che rappresentano lo stesso aa
tRNA ISOACCETTORI
(o tRNA affini o congiunti):
Riconosciuti tutti dalla stessa sintetasi
1.  aa attivato dalla sintetasi:
amminoacil-AMP
1.  Gruppo amminoacidico
trasferito a tRNA:
amminoacil-tRNA
57
Le sintetasi si suddividono in 2 classi:
Classe I
Classe II
differiscono per:
• Motivi strutturali
• Riconoscimento del tRNA
• Riconoscimento dell’anticodone
• Sito di aminoacilazione (2’, 3’)
L accuratezza delle sintetasi dipende
dalla correzione delle bozze
58
Correzione può avvenire a due livelli: 1.  dopo legame tRNA a sintetasi 2.  dopo caricamento tRNA su tRNA 1
2
Errori possono essere commessi in varie fasi della sintesi proteica 59
ex. Ile tRNA sintetasi di E Coli
può caricare la Valina con AMP ma idrolizza il valil-adenilato una
volta raggiunto il tRNA
Ile-‐tRNA sintetasi si serve delle dimensioni per discriminare tra gli aa 2 siti attivi:
60
I tRNA soppressori possiedono an;codoni muta; che leggono nuovi codoni deJ anche tRNA mutan5: superano gli effe` di mutazioni in geni che codificano proteine Soppressori NONSENSO
sopprimono
mutazione nonsenso
riconoscono un codone non senso NB aa inserito è ≠ (Tyr invece di Leu) ê alterazione proprietà proteina?? 61
Ogni soppressore non senso è specifico per uno dei 3 codoni non senso (UAA, UAG, UGA) MA queste triplette costituiscono ANCHE I normali segnali di STOP tRNA Soppressore può sopprimere anche la normale terminazione di qualsiasi gene CONTINUAZIONE della LETTURA (readthrough) 62
Soppressori di SENSO
Sopprimono
mutazione di senso
NB aa inserito è ≠ ê alterazione proprietà proteina?? Il tRNA può influenzare lo schema di le5ura Schema di le5ura può essere cambiato da: -‐  spostamento del modulo di le/ura frameshiI bypass
-‐  salto di un codone 63
frameshiI Amminoacil-‐tRNA scivola di una base La terminazione viene soppressa bypass comporta movimento dei ribosomi
Ribosoma salta da un codone all’altro iden;co Traduzione con;nua al di là di qualunque codone di stop eventualmente presente 64
bypass Sono necessari 2 codoni iden;ci all’estremità della sequenza saltata Si; di -‐ DECOLLO -‐ ATTERRAGGIO 65

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