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1.429 Scheda tecnica PARP-1 Val762Ala

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IDENTIFICAZIONE DEL POLIMORFISMO Val762Ala
dell’ENZIMA PARP-1 (Poly-ADP-ribose)-polymerase-1
AMPLI-set-Val762Ala PARP-1
Cat. n.1.429
Il DNA genomico nella maggior parte delle cellule è danneggiato da mutageni endogeni ed esogeni. Il danno non
riparato può provocare l’apoptosi o può portare alla crescita cellulare non regolata e quindi al cancro. Il danno può
essere riparato a livello del DNA permettendo alle cellule di replicare come programmato. A causa dell’importanza del
mantenimento dell’integrità genomica, i geni codificanti per molecole riparatrici del DNA sono stati proposti come geni
candidati ad influenzare la suscettibilità al cancro.
L’enzima Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP-1) è un’enzima coinvolto nel riparo del DNA che catalizza la poly(ADP-ribosilazione) di proteine usando il NAD+ come substrato. La Poly-ADP-ribosilazione è stata implicata in molti
processi cellulari come la replicazione, la trascrizione, il mantenimento della stabilità genomica e la regolazione della
progressione del ciclo e del differenziamento cellulare.
E’ probabile che tale enzima abbia la potenzialità di inibire lo sviluppo del cancro, promuovendo la stabilità genomica
attraverso il riparo del DNA ed il controllo del ciclo cellulare. Coerentemente con questa visione, l’esistenza di
polimorfismi che conferiscano una ridotta attività di PARP potrebbe rappresentare un fattore di rischio per lo sviluppo
di neoplasie.
Recentemente è stato individuato un polimorfismo a carico del gene codificante per la proteina PARP, la sostituzione
T2444C, che provoca la sostituzione dell’aminoacido valina con un residuo di alanina (Val762Ala). Tale variazione
aminoacidica causa una ridotta attività enzimatica della proteina PARP1. Tale polimorfismo, infatti, è stato associato ad
una maggiore suscettibilità allo sviluppo di neoplasie della prostata, dell’esofago e del polmone.
L’identificazione della mutazione T2444C viene eseguita previa amplificazione con primers specifici di un frammento
di 110 bp, con successivo taglio di restrizione ad opera dell’enzima HpyCH4-IV. La sostituzione T-C, infatti, causa la
perdita di un sito di restrizione riconosciuto da tale enzima. In altri termini il prodotto di digestione dell’allele
normale produce due frammenti di 90 e 20 bp, mentre quello dell’allele mutato non può essere digerito (110bp).
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
WT
Eterozigote
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
PCR
Marker
AMPLIFICAZIONE e DIGESTIONE
PCR mix
H2O sterile
Taq Polymerase (5U/µl)
Enzima HpyCH4-IV (10 U/µl)
BUFFER di digestione 10X
Controllo WT
RIVELAZIONE
Gel precast di agarosio 3% per elettroforesi in
TBE 1X
Loading buffer 10 X
Buffer di corsa 10 X (TBE 10X)
Marker di peso molecolare (es ladder 100 bp)
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere
sterili, DNase e RNase free e monouso.
WT
CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE
T.A.
WT
T.A.
T.A.
-20°C
Principio del metodo: A) estrazione del DNA genomico B)
amplificazione C) digestione enzimatica D) rivelazione sul gel di
agarosio.
Applicabilità: Su DNA genomico estratto e purificato tessuto fresco
o paraffinato.
Numero di Test: 24 reazioni
Stabilità: superiore a 18 mesi se correttamente conservato (I gels di
agarosio, se conservati lontano dalla luce, sono stabili per 18 mesi a
temperatura ambiente).
Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; portaprovette refrigerato; puntali
sterili con barriera antiaerosol; bacchetta di vetro (o pasteurs di
vetro); portaprovette refrigerato; tubi PCR.
Reagenti richiesti non compresi nel kit:
-Reattivi per l’estrazione del DNA.
Strumenti richiesti: set di pipette pre-PCR e post-PCR: 1) 0.5 –
10 µl 2) 5 – 50 µl 3)50 – 200 µl 4)200 – 1000 µl; Termociclatore
programmabile; Cappa Biohazard classe II; Camera elettroforetica
con alimentatore; Transilluminatore UV; Apparato fotografico.
ETERO
OMO
110
110
90
90
20
20
110bp
90bp
REFERENZE:
Mol Biol Rep (2009) 36:1461-1467.
British Journal of Cancer (2009) 101, 256-262.
New England Journal of Medicine (2009) 361, 2, 123133.
Clin Cancer Res (2008) 14: 5919-5924.
Nota: il protocollo finale potrebbe prevedere delle modifiche rispetto alla scheda
tecnica al solo scopo di rendere più semplice la procedura.
REV. 01
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