STRUTTURALE MODIFICAZIONI POST-TRASCRIZIONALI FOSFORILAZIONE DI CDT DELLA RNA pol II legame a fattori che portano avanti l’allungamento dell’ mRNA e che regolano la formazione del Cap, la poli-adenilazione e lo splicing CDT RNA hnRNA (heterogeneus nuclear RNA) oppure pre-mRNA oppure trascritto primario che diventa mRNA (insieme di molecole eterogenee citoplasmatiche) + Elettroforesi in gel di agarosio con etidio bromuro rRNA 28S rRNA 18S tRNA FORMAZIONE DEL Cap al 5’ dell’ mRNA 5’ GTP GMP Legame 5’ – 5’ Legame al ribosoma metilazione mRNA Poli-adenilazione dell’mRNA poliA-polimerasi Cleavage stimulating factor Clavage and polyadenilation specific factor Terminazione RNAsi 5’ - 3’ “SILURO” CAMBIAMENTO CONFORMAZIONALE STRUTTURALE MODIFICAZIONI POST-TRASCRIZIONALI 5’ NT “non tradotto” 3’ NT Numero introni per gene n esoni = n introni +1 Media esoni: 150 basi Introni: anche migliaia di basi Sequenze consenso presenti sul pre-mRNA e che guidano lo splicing Sito di splicing 5’ (donatore) Y=CoU R=GoA N=AoGoCoU Sito di splicing 3’ (accettore) - Formazione del cappio - Giunzione degli esoni adiacenti - Rilascio dell’introne Prima trans-esterificazione Esone n Esone n+1 Seconda trans-esterificazione Esone n Esone n+1 Introne a cappio SNRP (“snurp”) SPLICEOSOMA Small nuclear ribonuclear particle simile al ribosoma 150 proteine e 5 small nuclear RNA (snRNA, U1, 2, 4, 5 e 6) RNA anche con ruolo catalitico SPLICING ALTERNATIVO • Presente nei trascritti del 75% dei geni umani • In genere, 2 prodotti diversi; in alcuni casi molti di più Il meccanismo di splicing “ignora” l’esone 3 oppure il 4 SPLICING ALTERNATIVO Modalità diverse di splicing alternativo Le diverse forme di mRNA possono essere prodotte contemporaneamente o essere mutualmente esclusive REGOLAZIONE DELLO SPLICING ALTERNATIVO GLI INTRONI sono stati persi dai procarioti (introni precoci) o acquisiti dagli eucarioti (introni tardivi) ? A COSA SERVONO I GENI INTERROTTI ? Rimescolamento degli esoni nell’evoluzione. Domini proteici spesso codificati da un esone Domini presenti in proteine diverse Duplicazione genica e trasposizione come possibile meccanismo DOMINIO ELIX-LOOP-ELIX b-HLH dimerizzazione Legame al DNA mRNA complessati con proteine specifiche che ne mediano l’esportazione • • • Proteine che regolano dello splicing che si legano alle giunzioni esone - esone che si legano alla coda di poli-A Complesso del poro nucleare Legame al ribosoma Cap STRUTTURALE MODIFICAZIONI POST-TRASCRIZIONALI 5’ NT “non tradotto” 3’ NT Beta-TALASSEMIE Sbilanciamento alfa/beta Interferenza a RNA RNA interference RNAi Premi Nobel 2006 Fenomeno scoperto nelle piante e poi studiato in Arabidopsis thaliana e Caenorhabditis elegans Pianta erbacea Con genoma piccolo Nematode, circa 1000 cellule Con genoma piccolo Craig Mello Andew Fire dsRNA Esogeni (p.e. virus) Pre-miRNA dsRNA siRNA DICER siRNA Fattore ARGONAUTA piccolissimi RNA associati a proteine con capacità idrolitica su RNA virali Difesa dall’infezione dsRNA Trascritti dal genoma Esogeni (p.e. virus) Pre-miRNA pri-miRNA siRNA e miRNA dsRNA pre-miRNA DICER mi-RNA Fattore ARGONAUTA siRNA piccolissimi RNA associati a proteine con capacità idrolitica su mRNA cellulari su RNA virali Controllo posttrascrizionale Difesa dall’infezione TRASCRITTI DA POL II Tagli successivi per la produzione di miRNA maturo miRNA pre-miRNA circa 22 basi circa 66 basi 16 mer = 4 x 109 combinazioni INF pri-miRNA (anche migliaia di basi) Esempi di pre-miRNA Dopo taglio con DICER in alcuni casi entrambi i filamenti diventeranno miRNA attivi Meccanismo antico (solo con siRNA) che nasce come difesa da virus e da trasposoni. Nelle piante è una sorta di sistema immunitario endocellulare antivirale In seguito si è evoluto il processo dei miRNA (sfrutta l’esistenza di DICER e Argonauta) per la regolazione genica In alcuni organismi il processo è andato completamente perso (S.cerevisiae) Somministrazione sperimentale di piccoli RNA interferenti (siRNA) Meccanismo antico (solo con siRNA) che nasce come difesa da virus e da trasposoni. Nelle piante è una sorta di sistema immunitario endocellulare antivirale In seguito si è evoluto il processo dei miRNA (sfrutta l’esistenza di DICER e Argonauta) per la regolazione genica In alcuni organismi è andato completamente perso (S.cerevisiae) Poi sono arrivati i biotecnologi ! possibilità di modulare a piacere l’espressione di specifici geni
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