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2. Splicing

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MODIFICAZIONI
POST-TRASCRIZIONALI
5’ NT “non tradotto”
3’ NT
Numero introni per gene
n esoni = n introni +1
Media esoni: 150 basi
Introni: anche migliaia di basi
Sequenze consenso presenti sul
pre-mRNA
e che guidano lo splicing
Sequenza ricca in Pyr
Sito di splicing 5’
(donatore)
Y=CoU
R=GoA
N=AoGoCoU
Sito di splicing 3’
(accettore)
- Formazione del cappio
- Giunzione degli esoni adiacenti
- Rilascio dell’introne
Prima trans-esterificazione
Esone n
Esone n+1
Seconda trans-esterificazione
Esone n
Esone n+1
Introne
a cappio
Spliceosoma
Enorme macchina molecolare
•
•
•
•
•
150 proteine,
5 snRNA (100-300 basi, U1 – U6) complessati a proteine (snRNP, SNURP,
simili al ribosoma),
Gli snRNA riconoscono le zone di confine e forse hanno potere catalitico
Ci sono anche non-snRNP (solo proteina)
Proteine e RNA:
1) riconoscimento dello spicing site 5’, del sito di ramificazione,
della sequenza poly-Y e dello splicing site 3’
2) avvicinano le varie porzioni
3) catalizzano taglio e giunzione (ribozimi ?)
Interazioni RNA-RNA, RNA-proteina e proteina-proteina
Esempi di interazioni
Prima BBP
e poi U2
Sito di
ramificazione
Doppio controllo
Prima
Trans-eserificazione
Avvicina
gli esoni
Seconda
Trans-eserificazione
degradazione
RNA
recogn. motif
Domini di legame
all’ RNA
Domini funzionali
Duplex
RNA-RNA
Interazioni anche con
singolo filamento
Confronto fra le forme A, B e Z
Forma A
Forma B
Forma Z
Senso dell’elica
Destrorsa
Destrorsa
Sinistrorsa
Diametro
26 Å
20 Å
18 Å
Coppie basi/giro
11
10.5
12
Distanza fra le basi
2.6 Å
3.4 Å
3.7 Å
Piegamento basi rispetto
alla normale all’asse
20°
6°
7°
MECCANISMI DI SPLICING
Moderno
Antico
PRECISIONE DELLO SPLICING
FOSFORILAZIONE DI CDT DELLA RNA pol II
legame a fattori che portano avanti l’allungamento dell’ mRNA
la formazione del Cap, la poli-adenilazione e lo
CDT
splicing
RNA
Legame con siti spl. 5’ e 3’
PRECISIONE DELLO SPLICING
Proteine che marcano gli esoni
S- and R-rich Proteins
Exonic splicing enhancers
Varianti “in-cis”
Beta-TALASSEMIE
Sbilanciamento alfa/beta
AS
Alternative Splicing
• 24.000 geni che codificano per proteine
• Più del 90% presentano AS
• Lo AS è spesso regolato
• Spesso 2 prodotti, ma a volte anche centinaia
• Ciò giustifica il fatto che il proteoma sia composto da
circa 100.000 proteine diverse.
SPLICING ALTERNATIVO
Modalità diverse di splicing alternativo
Le diverse forme di mRNA possono essere
prodotte contemporaneamente o essere mutualmente esclusive
Primo e ultimo esone INVARIANTI (costitutivi)
•RT-PCR
•Microarray con sonde alle giunzioni
Espressione tessuto-specifica
AS specifico
Le isoforme derivano da un gene comune:
Esone1
2
3(3f)
4(3s)
5
6
7
Sito criptico di splicing
IF1
IF2
SV3
SV4
LMW - PTP
POSSIBILI
MECCANISMI
DI REGOLAZIONE
DI AS
Legano le regioni di controllo
e RICHIAMANO SPLICEOSOMA
Legano le regioni di controllo
e INIBISCONO
EXONIC / INTRONIC
SPLICING
ENHANCER / SILENCER
Fibrosi cistica (CFTR)
mutazioni “in cis”
• Gene con 27 esoni
• Più di 1000 varianti
• 13-20% sono varianti “in cis” di splicing, che
portano ad AS.
• Mutazioni in tutte le
sequenze regolative dello splicing
GENE MAPT
Microtubule associated protein
mutazioni “in cis”
Proteina Tau
• Stabilità dei microtubuli
• Trasporto assonale
• 6 isoforme da AS, in quantità bilanciate.
• Se non bilanciate:
deposito di proteina filamentosa.
• Probabile causa di varie malattie neurodegenerative
p73
• Omologo di p53
• Regola apoptosi e ciclo cellulare
• E’ un oncosoppressore
• Esistono diverse varianti per AS, tutte funzionali
• Splicing alternativo errato in seguito a mutazione:
proteina non funzionale
POSSIBILI TRATTAMENTI
• Farmaci convenzionali
bloccano le isoforme indesiderate
• RNAi
bloccano le isoforme indesiderate
• Oligo(ribo)nucleotidi antisenso
agiscono direttamente sul
meccanismo di splicing
dsRNA
Trascritti dal
genoma
Esogeni
(p.e. virus)
Pre-miRNA
pri-miRNA
siRNA
e
miRNA
dsRNA
pre-miRNA
DICER
mi-RNA
siRNA
piccolissimi RNA
associati a proteine
con capacità idrolitica
su mRNA cellulari
su RNA virali
Controllo
posttrascrizionale
Difesa
dall’infezione
RNA editing
• Cambia la sequenza di un RNA dopo la
trascrizione (in AS).
• Cambiamento di singole basi per deaminazione
• Esiste anche il fenomeno della inserzione di U
(tripanosoma)
Si accoppia ad A
Si accoppia a C
Che agisce su RNA
Apolipoproteina B
APOB
Costituente delle LDL, trasporto del colesterolo
Editing tessuto-specifico
della apo-lipoproteina
Codone per Gln
Specificità ?
Codone di Stop
Complessi con
proteine che
legano l’RNA
Codice genetico
Ridondante (degenerato)
Codoni sinonomi
Non ambiguo
Universale (quasi !)
Letto in direzione 5’ – 3’
Produce polipeptide in direzione NH2 - COOH
Senza punteggiatura
Un mRNA ha un solo “frame” di lettura (determinato da AUG)
GCN
GCY
GCR
Perche’ questo codice ?
Contenuti in GC possono cambiare
Mut. in pos.1 = spesso AA simili.
Mut in pos. 2: Pur = polare Pyr = idrof.
A to I
RNA editing
•
•
•
•
Specifico dei primati
E’ molto comune (a differenza di C – U, che è molto raro)
Per il 90% a carico di trascritti da sequenze Alu e per 1.5% sequenze L1
Alu è, probabilmente, un substrato “ideale” (dsRNA)
•
Varie conseguenze (se a carico di pre-mRNA):
Cambiamento di un codone
Creazione di codone di STOP
Modificazione della struttura tridimensionale dell’ RNA
Modificazione dello splicing
Modificazione della stabilità di un RNA (3’ NT)
•
Anche a carico di sequenze di mi-RNA
Inibizione dell’azione
Modificazione dell’azione (substrati diversi, non distruzione dell’RNA)
TRASPOSONE
RETROTRASPOSONE
RETROTRASPOSONI POLY-A
detti anche “non virali”
molto abbondanti nell’uomo
Sequenze LINE
long interdispersed nucleotidic sequences
elementi L1 nell’uomo (6-7 kbasi, 15% del genoma)
Sequenze SINE
short interdispersed nucleotidic sequences
sequenze ALU (300 basi x106 ripetizioni, 10% del genoma)
dsRNA
Trascritti dal
genoma
Esogeni
(p.e. virus)
Pre-miRNA
pri-miRNA
siRNA
e
miRNA
dsRNA
pre-miRNA
DICER
mi-RNA
siRNA
piccolissimi RNA
associati a proteine
con capacità idrolitica
su mRNA cellulari
su RNA virali
Controllo
posttrascrizionale
Difesa
dall’infezione
A to I
RNA editing
• Particolarmente importante nel CNS
• Cambiamento di un singolo codone (Q/R)
• Coinvolti molti diversi recettori per neurotrasmettitori (glutammato,
serotonina ecc.)
• Editing necessario per il corretto sviluppo
• Topi difettivi nell’editing del recettore per il glutammato (ADAR2 -/-)
mostrano epilessia
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