Differenziamento cardiomiogenico di cellule stromali multipotenti da tessuto adiposo. Lo scopo generale del progetto STIMIOTE consiste nel differenziare le cellule stromali multipotenti (ASCs) estratte dal tessuto adiposo in cardiomiociti o progenitori cardiaci. A lungo termine questo studio contribuirà allo sviluppo di un protocollo clinico per lo studio di patologie cardiache. Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte nei paesi industrializzati con il 44% della totalità dei decessi: al primo posto la cardiopatia ischemica con il 28% e al secondo le lesioni cerebrovascolari con il 13%, subito dopo i tumori 1. La necrosi tissutale che segue il fenomeno ischemico determina una diminuzione del numero e della funzionalità delle cellule muscolari cardiache nella zona colpita. Poiché i cardiomiociti adulti non sono in grado di dividersi e rispondono agli stimoli mitotici per l’ipertrofia, la perdita cellulare si manifesta con una disfunzione contrattile conseguente alla progressiva sostituzione delle cellule cardiache con tessuto cicatriziale. Il rimodellamento ventricolare che segue l’infarto miocardico acuto può portare quindi ad un danno cardiaco irreversibile 2. Il trattamento di elezione nelle fasi finali dello scompenso cardiaco è il trapianto d’organo, ma poiché risulta limitato dalla disponibilità dei donatori e dalle complicazioni legate alle problematiche immunologiche, particolare attenzione è stata recentemente rivolta allo sviluppo del trapianto cellulare come alternativa al trapianto d’organo. L’obiettivo di questa nuova strategia di intervento consiste nell’ottenere cellule in grado di sostenere il lavoro cardiaco, di integrarsi con le cellule circostanti quali cardiomiociti e cellule interstiziali e di rispondere adeguatamente a stimoli fisiologici o fisiopatologici. Per ottenere la riparazione o la rigenerazione tissutale più efficace, le cellule usate per il trapianto devono avere le seguenti caratteristiche: elevata capacità di sopravvivenza e proliferazione, devono essere quindi capaci di raggiungere l’area danneggiata, mantenersi vitali e proliferare in quel tessuto, devono possedere grande capacità differenziativa e potenzialità per un innesto efficace che consenta l’integrazione con cellule ospiti. A questo scopo il nostro interesse è stato rivolto proprio verso le cellule staminali e in particolari alle cellule stromali provenienti da tessuto adiposo. Negli ultimi anni nel nostro laboratorio è stato sviluppato un protocollo per l’isolamento e la caratterizzazione, mediante markers di superficie, di cellule stromali staminali estratte da tessuto adiposo proveniente da liposuzione. Il tessuto adiposo è ricco di cellule vasculo stromali in grado di favorire la rigenerazione di tessuti. Partendo da queste cellule, lo scopo del progetto risulta quello di differenziare le ASCs in cardiomiociti o progenitori cardiaci seguendo due approcci innovativi: utilizzare fattori di crescita in un terreno di induzione serum-free e l’applicazione di stimoli meccanici ed elettrici per mimare l’effetto fisiologico del cuore (Fig.1). Fig.1. Schema del progetto. Una rappresentazione schematica delle strategie per il differenziamento cardiaco. Tre differenti approcci saranno studiati, il primo basato sull’utilizzo di fattori di crescita e citochine, il secondo basato sull’applicazione di stimoli meccanici ed elettrici per stimolare la cardiomiogenesi con lo scopo di mimare l’effetto fisiologico del cuore ed infine l’ultimo consisterà nella combinazione dei primi due. Lo studio bibliografico ha permesso di evidenziare i differenti approcci usati per indurre il differenziamento delle ASCs verso la linea cardiaca: i principali sono l’uso di terreno semisolido con metilcellulosa, la co-coltura con cardiomiociti di topo neonatali e l’utilizzo dell’agente chimico 5-azacitidina. Poiché l’uso di derivati animali o agenti chimici potrebbe incidere sulla stabilità genomica delle cellule, nessuno dei sopra riportati metodi risulta essere compatibile con l’uso delle ASCs nella pratica clinica 3. Inoltre il cuore è considerato un organo complesso nel quale la conduzione elettrica ha un ruolo molto importante. Per il razionale di questo studio ci siamo ispirati alla biologica dello sviluppo. Dopo un approfondito studio dei principali pathways biochimici coinvolti nella formazione del muscolo cardiaco durante l’embriogenesi, siamo riusciti ad identificare alcuni tra i principali fattori di crescita e citochine coinvolti nel differenziamento in precursori cardiaci (Fig.2). Fig.2. Pathway biochimici principali coinvolti nella formazione del muscolo cardiaco. La figura evidenzia il lavoro pionieristico effettuato per identificare I numerosi pathway coinvolti nella formazione e nella specificazione cardiaca 4. Questi fattori, agendo sui pathways principali, sono stati usati nei cocktails di induzione per ottenere precursori di cardiomiociti fisiologicamente indistinguibili da quelli derivati dal tessuto cardiaco. Abbiamo quindi selezionato 28 fattori di crescita e testato 16 differenti combinazioni di terreni di induzione. Il tempo di ciascuna induzione è stato di 3 settimane. In questa fase di screening la presenza di cellule differenziate è stata monitorata mediante standard PCR e PCR quantitativa. Dopo aver testato l’effetto di differenti cocktails cardiogenici, abbiamo selezionato quello che ha dato il miglior risultato in riferimento all’espressione dei markers cardiaci Nkx2.5 e Mef2C, considerati fattori di trascrizione chiave coinvolti nella morfogenesi cardiaca (Fig.3). Fig.3. Espressione dei geni Nkx2.5 e Mef2C. Legenda PCR: M:Marker, N.I.: cellule non indotte, I: Cellule indotte, H: biopsia cardiaca. Fig.4. Cambiamento morfologico dopo induzione cardiaca. A: MSC non indotte ad ingrandimento 10x; B: MSC indotte ad ingrandimento 10x. La Fig 4 Cambiamento morfologico delle ASC dopo tre settimane di induzione con il cocktail cardiogenico sviluppato da SSCF. Alla luce dei risultati finora raggiunti, complessivamente questi dati dimostrano che abbiamo trovato un potenziale terreno di induzione cardiogenica. Tutte le analisi a livello molecolare hanno infatti evidenziato una induzione dei principali geni e fattori di trascrizione cardiaci nelle cellule differenziate rispetto alle cellule non indotte. Per quanto riguarda gli obiettivi futuri ci prefiggiamo di confermare questi risultati con altri esperimenti usando tecniche diverse come per esempio l’immunofluorescenza e il western blot e verificare la presenza di geni funzionali nelle cellule indotte. In ultimo vogliamo simulare l’effetto fisiologico del cuore mediante l’applicazione di un campo elettrico in combinazione con il terreno di induzione. Un dispositivo su misura è infatti attualmente in costruzione per permettere la coltura di tessuto cardiaco ingegnerizzato. Bibliography 1. 2. 3. 4. Palpant, N.J. and J.M. Metzger, Aesthetic cardiology: adipose-derived stem cells for myocardial repair. Curr Stem Cell Res Ther, 2010. 5(2): p. 145-52. Zhu, Y., et al., ADSCs differentiated into cardiomyocytes in cardiac microenvironment. Mol Cell Biochem, 2009. 324(1-2): p. 117-29. Palpant, N.J., et al., Non-canonical Wnt signaling enhances differentiation of Sca1+/c-kit+ adiposederived murine stromal vascular cells into spontaneously beating cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol, 2007. 43(3): p. 362-70. Noseda, M., et al., Cardiopoietic factors: extracellular signals for cardiac lineage commitment. Circ Res, 2011. 108(1): p. 129-52.