PCR

Metodica fu ideata nel 1983
PCR - Polymerase Chain Reaction
ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il
premio Nobel per la chimica (1993).
Questa tecnica, utilizzando i principi della
duplicazione del DNA,
permette di ottenere in poco tempo
notevoli quantità di materiale specifico
Science. 1988 Jan 29;239(4839):487-91.
Related Articles Links
,
Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT,
Mullis KB, Erlich HA.
Cetus Corporation, Department of Human Genetics, Emeryville, CA
94608.
A thermostable DNA polymerase was used in an in vitro DNA
amplification procedure, the polymerase chain reaction. The enzyme,
isolated from Thermus aquaticus, greatly simplifies the procedure and,
by enabling the amplification reaction to be performed at higher
temperatures, significantly improves the specificity, yield, sensitivity,
and length of products that can be amplified. Single-copy genomic
sequences were amplified by a factor of more than 10 million with very
high specificity, and DNA segments up to 2000 base pairs were readily
amplified. In addition, the method was used to amplify and detect a
target DNA molecule present only once in a sample of 10(5) cells.
PCR schema
•
•
•
•
•
DNA bersaglio
Primers
Enzima
Nucleotidi trifosfati
Ioni Mg++
Campione
DNA bersaglio
Primers
Enzima
Oligonucleotidi sintetici complementari
a sequenze fiancheggianti il tratto di
DNA da studiare 20 – 25 bp
DNA polimerasi
Nucleotidi trifosfati
Termociclatori
Denaturazione del DNA
(94°C)
Ibridazione dei primers al bersaglio
(40°C – 60°C)
Sintesi del DNA
(72°C)
RT-PCR
Reverse transcription-PCR
Vantaggi
• Si può evitare l’uso di tecniche più
laboriose. Velocità di esecuzione
• Si possono analizzare campioni di
poche cellule (anche 1 cellula). Elevata
sensibilità
Biopsie
Analisi prenatale e Analisi preimpianto
Tracce di infezioni virali
Malattia mimima residua
Medicina forense
End Point PCR
Il campione si sottopone al numero di cicli stabiliti (30-40), alla fine della
reazione un’aliquota si sottopone ad elettroforesi su gel di agorosio per
verificare:
1. la lunghezza dell’amplificato (controllo del peso molecolare in bp
mediante ladder);
2. La quantità di amplificato ottenuto (proporzionale all’intensità della
banda);
3. L’assenza di frammenti aspecifici.
La PCR end-point non è un metodo quantitativo
Alla fine della reazione non sempre la quantità di DNA del campione d’origine è
proporzionale all’intensità della banda ottenuta.
Utilizzando particolari accorgimenti può diventare un metodo semi-quantitativo.
•Ricerca di mutazioni note;
•Ricerca di mutazioni non ancora identificate.
Log[DNA]
Plateau
Lineare
Prodotto
variabile
Esponenzial
e
N° cicli
termici
Polymerase Chain Reaction: plateau
Resa effettiva: effetto plateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”,
esso è limitato da:
Quantità dei primers
Attività della Taq polimerasi
Reannealing dei filamenti
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei
prodotti
Perché Real-Time?
Misura l'amplificazione in tempo reale
durante la fase esponenziale della
PCR, quando cioè l'efficienza di
amplificazione è influenzata
minimamente dalle variabili di
reazione, permettendo di ottenere
risultati molto più accurati rispetto alla
PCR tradizionale "end point"
Real Time PCR
Si utilizzano particolari termociclatori in grado misurare la fluorescenza
emessa da particolari fuorofori ad ogni ciclo.
La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata
utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori
fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di
PCR
Chimiche fluorescenti
per PCR RealReal-Time
•La fluorescenza si genera durante la PCR per
effetto di diverse possibili reazioni chimiche
•Le chimiche principali sono basate sia sul
legame di coloranti fluorescenti che si intercalano
nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,
s i a s ul l ' i br i d a z i o n e di s o n de s p e c i f i c h e .
SYBR Green:SYBR
principio
Green I
Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si
lega al solco minore del DNA
SYBR Green
Durante l’elongazione si verifica un aumento di
fluorescenza che corrisponde all’ aumento del
numero di copie dell’amplicone
SYBR green
• Metodica semplice
Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa
• Non costosa
• Non-specifica
– La molecola fluorescente si lega random a tutte le
doppie eliche, includendo i dimeri di primers
– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la
formazione di prodotti aspecifici
Curva di dissociazione
Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati
e la variazione dell'energia di fluorescenza viene
monitorata per generare una curva di dissociazione
Curva di dissociazione
Tm
melting peak
82.6
88.1
TaqMan
La Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego:
 coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano
in
maniera
aspecifica
a
tutto
il
DNA
 sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di
interesse, marcate con molecole fluorescenti
Esistono diversi tipi di sonde:
Dual-labeled (come le sonde TaqMan)
Molecular beacons
Scorpion
Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Sonde TaqMan
La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i
primers della PCR, viene disegnato per essere
complementare alla sequenza bersaglio da amplificare
R
5’
3’
5’
Primer
3’
5’
Q
3’
5’
3’
Primer
5’
La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno
del frammento amplificato nella reazione di PCR
3’
Sonda TaqMan
Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter”
ed all’estremità 3’ una molecola “Quencher”
5’
3’
Reporter-Quencher
5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza
3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che
spegne la fluorescenza del reporter
R
Q
5’
3’
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R
perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q
Real Time PCR
Fluorescence
resonance energy
transfer (FRET)
L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente
proporzionale al numero di ampliconi generati
Forward primer
Probe
Reverse primer
Curve di amplificazione
Fluorescenza
Plot lineare
Cicli di amplificazione
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il
cui CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla
quantità di template iniziale
Quantificazione
ASSOLUTA
i campioni sono quantificati in modo assoluto
Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione
assoluta (utilizzo di una standard curve)
Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche
quantità di campioni
RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT
Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una
standard curve)
Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro
CT con quello del controllo endogeno
Quantitativa relativa: analisi dei dati
 Normalizzare il target con un controllo endogeno (r)
espresso costitutivamente (CT)
 Comparare ciascun CT così ottenuto con il CT di un
trattamento di controllo anche detto “calibratore” (cb)
(CT)
2- (CT,r- CT,cb)= 2- CT
 Il valore così ottenuto permette di determinare la
concentrazione relativa del target
Real-Time PCR: applicazioni
• Quantificazione virale
• Quantificazione dell’espressione
genica
• Efficacia della terapia farmacologica
• Detenzione dei patogeni
• Controllo degli OGM
• Genotyping
• MRD
Mutation detection kits
DxS TheraScreen
TheraScreen®:
®: KK-RAS Mutation Kit
DxS TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit
(in breve, il kit K-RAS) è un test diagnostico in vitro che consente di
identificare sette mutazioni somatiche nell'oncogene K-RAS e di
eseguire una valutazione qualitativa dello stato mutazionale. Deve
essere utilizzato in ambiente di laboratorio su campioni di DNA estratti
da tessuto colorettale fissato in formalina e incluso in paraffina.
Spesso nei carcinomi umani vengono riscontrate mutazioni dell'oncogene
K-RAS. La presenza di tali mutazioni è correlata all'assenza di una
risposta a determinate terapie antitumorali basate sugli inibitori del
recettore del fattore di crescita epidermico (terapie anti-EGFR) nei
pazienti con carcinoma colorettale metastatico.
È possibile identificare sette mutazioni nel gene K-RAS su uno sfondo di
DNA genomico wild-type utilizzando un saggio PCR realreal-time basato sulla
tecnologia DxS Scorpions®
Scorpions®. Si tratta di un metodo estremamente selettivo.
Se il numero di copie di DNA è sufficiente,, è possibile determinare circa
l'1% dei mutanti su uno sfondo di DNA genomico wild
wild-type
type.
Il kit K-RAS è in grado di identificare sette mutazioni K-RAS
nei codoni 12 e 13 dell'oncogene K-RAS
Il kit K-RAS utilizza i saggi PCR real-time
associando due diverse tecnologie: ARMS® e Scorpions®
Scorpions®.
La tecnologia ARMS (Amplification
(Amplification Refractory Mutation System) supporta
l'amplificazione di specifici alleli o mutazioni.
La Taq DNA polimerasi è estremamente efficace per distinguere tra un
appaiamento corretto e un appaiamento errato all'estremità in 3’ di un
primer per PCR. È possibile eseguire un'amplificazione selettiva di
specifiche sequenze mutate anche in campioni in cui le sequenze non
mutate sono la maggioranza, in quanto:
• Quando il primer è perfettamente appaiato, l'amplificazione procede
con la massima efficienza.
• Quando la base in 3’ presenta un appaiamento errato, si osserva
soltanto un'amplificazione di basso livello sullo sfondo.
La ARMS (Amplification
(Amplification Refractory Mutation System) PCR è un sistema per
identificare mutazioni. Essenzialmente si fanno due PCR in parallelo, una con un
primer specifico per l'allele normale e l'altra per quello mutato; il secondo
primer è uguale per entrambe. I primer sono fatti, ovviamente, per legarsi solo
alla variante allelica di interesse, in modo da non legarsi con l'altra. A questo
punto puoi avere 3 casi (supposto che la reazione 1 sia con l'allele normale e la
2 con il mutato): 1) amplifico in 1 ma non in 2 -> omozigote wt
2) amplifico in 2 ma non in 1 -> omozigote mutato
3) amplifico in 1 e in 2 -> eterozigote
La tecnologia Scorpions consente di identificare il risultato
dell'amplificazione. Il termine Scorpions è utilizzato per descrivere
molecole a doppia funzione che contengono un primer per PCR legato
covalentemente a una sonda. Il fluoroforo in questa sonda
interagisce con un colorante quencher, anch'esso incorporato nella
sonda, che sopprime la fluorescenza. Quando si verifica una
reazione PCR e la sonda si lega all'amplicon, il fluoroforo e il
quencher si separano, determinando un aumento della fluorescenza
proveniente dalla provetta della reazione.
http://www.biosearchtech.com/support/applications/real-time-pcrprobe-animation-video
Analisi dei dati: metodo ΔCt
Nei saggi real
real-time Scorpions
Scorpions, il numero di cicli di PCR necessari per
rilevare un segnale fluorescente al di sopra del segnale dello sfondo è il
parametro con cui vengono misurate le molecole bersaglio presenti
all'inizio della reazione. Per conoscere i valori ΔCt dei campioni si
calcola la differenza tra il valore Ct del saggio di mutazione e il valore
Ct del saggio di controllo per lo stesso campione. I campioni vengono
classificati come positivi alla mutazione se restituiscono un valore ΔCt
inferiore al valore ΔCt 1% per il saggio.
Il kit K-RAS contiene otto saggi.
• Un saggio di controllo.
• Sette saggi di mutazione.
Tutte le miscele di reazione contengono un saggio di controllo esogeno, o
controllo interno, marcato con HEX (rilevato dal colorante JOE nel sistema
ABI7900). In questo modo viene monitorata la presenza di eventuali
inibitori, che potrebbero indurre risultati falsi negativi. Il saggio di controllo,
marcato con FAM, serve per ottenere una valutazione del DNA totale in un
campione. Il saggio di controllo amplifica una regione
dell'esone 4 del gene K-RAS.
Ogni saggio di mutazione, marcato con FAM, contiene una molecola
Scorpion e un primer ARMS che consentono di distinguere il DNA wildtype dall'eventuale DNA mutante rilevato con il saggio PCR real-time.

Download Report