Enzimi • Catalizzatori biologici • Proteine • Caratteristiche (con l’eccezione di piccoli gruppi di molecole di RNA catalitico) (dipendenti dalla struttura) –Specificità –Regolabilità Enzimi caratteristiche (1) Specificità – di reazione – di substrato Lattico deidrogenasi CH3 | + CO + NADH+H | COOH LDH CH3 | CHOH + NAD+ | COOH 1 Glutammico-piruvico transaminasi COOH | CH3 CH2 | | CO + CH2 | | CHNH2 COOH | COOH GPT COOH | CH2 CH3 | | CHNH2 + CH2 | | CO COOH | COOH Enzimi caratteristiche (1) Specificità – di reazione – di substrato Glutammico-piruvico transaminasi COOH | CH3 CH2 | | CO + CH2 | | CHNH2 COOH | COOH GPT COOH | CH2 CH3 | | CHNH2 + CH2 | | CO COOH | COOH 2 Glutammico-ossalacetico transaminasi COOH | CH2 | + CO | COOH COOH | CH2 | CH2 | CHNH2 | COOH GOT COOH COOH | | CH2 CH2 | | + CH2 CHNH2 | | CO COOH | COOH Enzimi caratteristiche (2) Regolabilità – allosterici – modificazioni covalenti reversibili Inibizione retroattiva (feedback) L-treonina treonina deidratasi L-isoleucina 3 Enzimi caratteristiche (2) Regolabilità – allosterici – modificazioni covalenti reversibili Ser14 Ser14 Regolazione mediante modificazioni covalenti Fosforilasi b (meno attiva) fosforilasi fosfatasi fosforilasi kinasi Fosforilasi a (più attiva) Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) • • • • • • Report of the Enzyme Commission (1961) Enzyme Nomenclature (1964) Enzyme Nomenclature (1972) Enzyme Nomenclature (1978) Enzyme Nomenclature (1984) Enzyme Nomenclature (1992) 712 875 1770 2122 2477 3196 • • • • • Release of 26-Feb-2008 (4069 active entries) Release of 03-Mar-2009 (4132 active entries) Release of 02-Mar-2010 (4205 active entries) Release of 08-Mar-2011 (4449 active entries) Release of 22-Feb-2012 (4802 active entries) • Release of 06-Mar-2013 (5096 active entries) http://www.expasy.org/enzyme/ Con il termine isoenzima si indica una delle diverse strutture chimiche nelle quali può esistere un enzima in una stessa specie animale, tra individui diversi, o anche in un stesso organismo a livello di distretti cellulari differenti. LDH 1.1.1.27 GSH 2.5.1.18 4 Classificazione internazionale degli enzimi (1) 1. Ossidoreduttasi Trasferimento di elettroni (ione idruro o atomi di H) Reazioni di trasferimento di gruppi Reazioni di idrolisi (trasferimento di gruppi funzionali all'acqua) Addizione di gruppi a doppi legami o creazione di doppi legami per rimozione di gruppi Trasferimento di gruppi all'interno di una molecola con produzione di forme isomere Formazione di legami C-C, C-S, C-O e C-N mediante reazioni di condensazione accoppiate all'idrolisi di ATP 2. Transferasi 3. Idrolasi 4. Liasi 5. Isomerasi 6. Ligasi Classificazione internazionale degli enzimi (2) 1. Ossido reduttasi 1. Agenti sul gruppo CH-OH come donatore 1. Che utilizzano il NAD+ o il NADP+ come accettori 1. 2. 3. 2. Che utilizza il citocromo come accettore 1. 3. . . Malato ossidasi [1.1.3.3] Agenti sul gruppo carbonilico 1. Che utilizzano il NAD+ o il NADP+ come accettori 1. 2. 3. 2. 3. 4. 5. 6. Mannitolo deidrogenasi [1.1.2.1] Che utilizza l'Ossigeno come accettore 1. 2. 3. 2. Alcol deidrogenasi [1.1.1.1] Alcol deidrogenasi (NADP+) [1.1.1.2] Omoserina deidrogenasi [1.1.1.3] . . Aldeide deidrogenasi [1.2.1.3] Transferasi Idrolasi Liasi Isomerasi Ligasi La ricerca sugli enzimi Estratti di lievito funzionavano anche se rimossi dalla struttura della cellula vivente. Contro il postulato di Pasteur. Primo studio di uno specifico enzima. Isolamento e cristallizzazione dell’enzima ureasi. Trattato Enzimi con nuove ipotesi sul coinvolgimento di interazioni deboli enzima-substrato per destabilizzare e catalizzare. 5 Chimotripsina legata ad un substrato Serina-proteasi (aromatici e leucina) Grafico della coordinata di reazione di una reazione chimica Confronto tra il grafico della coordinata di reazione di una reazione non catalizzata e di una reazione catalizzata da un enzima 6 Forme complementari tra un substrato e il sito di legame su un enzima. Diidrofolato reduttasi. NADP+ (rosso), tetraidrofolato (giallo). Le interazioni tra una proteina e un ligando spesso determinano un adattamento indotto. La complementarità del substrato alla conformazione enzimatica dello stato di transizione più che a quella nativa è importante per la catalisi. Energia di legame (si libera dall’interazione enzima-substarato determina anche la specificità). Adattamento indotto nell’esochinasi 7 Meccanismo chimotripsina Riduzione entropica Reazione Aumento della velocità Funzione dell’energia di legame nella catalisi Fattori che contribuiscono a determinare l’Eatt. 1. Riduzione entropica 2. Desolvatazione 3. Distorsione del substrato 4. Corretto allineamento dei gruppi funzionali Energia di legame. Per abbassare l’energia di attivazione, il sistema deve acquisire una quantità di energia corrispondente alla diminuzione di E att. Gran parte di questa deriva dall’energia liberata dalle interazioni deboli con il substrato (delta GB). 8 Attività enzimatica e pH Papaina Attività relativa Colinesterasi Tripsina Pepsina 2 4 pH 6 8 10 Attività enzimatica e Temperatura Relazione tra la concentrazione del substrato e la velocità delle reazioni catalizzate dagli enzimi (1) k1 E + S k2 ES k3 E + P v=k3[ES] v = [E] [S] f k1 vs = ( k + k )[ES] 2 k1 3 [E] [S] = ( k + k )[ES] [E] = [Et] - [ES] 2 3 L’enzima libero può essere indicato anche come enzima totale meno l’enzima legato al substrato k1 ([Et]-[ES]) [S] = ( k + k ) [ES] 2 3 9 Relazione tra la concentrazione del substrato e la velocità delle reazioni catalizzate dagli enzimi (2) k1 ([Et]-[ES]) [S] = ( k + k ) [ES] k1 [Et] [S] - k [ES] [S] = ( k + k ) [ES] k1 [ES] [S] + ( k + k ) [ES] = k [Et] [S] 2 1 3 2 2 3 3 1 ( k [S] + k + k ) [ES] = k [Et] [S] 1 2 3 1 [Et] [S] [S] + k + k k1 [ES] = k1 2 3 Relazione tra la concentrazione del substrato e la velocità delle reazioni catalizzate dagli enzimi (3) [Et] [S] k [S] + k + k [Et] [S] [ES] = k k [S] + +k [ES] = k1 1 2 3 2 3 k2 +k =K m k 3 1 1 [ES] = [Et] [S] [S] + Km v=k3[ES] Relazione tra la concentrazione del substrato e la velocità delle reazioni catalizzate dagli enzimi (4) k3[ES] = k3[Et] [S] [S] + Km v= k3[ES]= v k3 [Et] = Vmax Vmax [S] Km+ [S] 10 Michaelis Menten Equazione di Michaelis-Menten Disc_eq I due studiosi formularono l’equazione partendo dall’ipotesi di base che la tappa limitante di una reazione enzimatica fosse la demolizione del complesso ES per formare l’enzima libero e il prodotto. Equazione di Michaelis Menten Vmax 100 v 50 equazione 0 0 Km 60 120 [S] Equazione di Lineweaver-Burk equazione 11 Grafico dei doppi reciproci pendenza equazione Inibizione competitiva equazione Inibizione mista equazione 12 Doppi reciproci 1/v Lineweaver Burk 1 Retta di controllo Vmax 1 Km -2 -1 0 1 1/[S] 2 3 4 equazione compe titiva Lineweaver Burk Inibizione competitiva Vmax = Vmax 1/v Km > Km Retta di controllo -2 -1 0 1 1/[S] 2 3 4 equazione ki<k’i Lineweavermista Burk Inibizione KI < KI’ Vmax < Vmax 1/v Km > Km Retta di controllo -2 -1 0 1 1/[S] 2 3 4 equazione 13 Ki=k’i Lineweaver Burk Non competitiva KI = KI’ Vmax < Vmax 1/v Km = Km -2 -1 0 1 1/[S] 2 3 4 equazione Ki>k’i Lineweavermista Burk Inibizione KI > KI’ Vmax < Vmax 1/v Km < Km -2 -1 0 1 1/[S] 2 3 4 equazione Inibizione? 1/v Lineweaver Burk Inibizione ……….. -2 -1 0 1 1/[S] 2 3 4 equazione 14 Inibizione impossibile Lineweaver Burk È possibile ? 1/v Impossibile -2 -1 0 1 1/[S] 2 3 4 Non Inibizione 1/v Burk Non Lineweaver è una inibizione -2 3 8 1/[S] 13 18 equazione Inibizione? 1/v Lineweaver Burk Inibizione ……….. -2 -1 0 1 1/[S] 2 3 4 equazione 15 Inibizione acompetitiva Lineweaver Burk Inibizione acompetitiva Vmax/ Km = Vmax /Km Vmax < Vmax 1/v Km < Km -2 -1 0 1 1/[S] 2 3 4 equazione Inibizione acompetitiva equazione 16
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