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API Interfaccia a pressione atmosferica (API)

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IONIZZAZIONE A PRESSIONE ATMOSFERICA
API
ESI
Elettrospray
APCI
Ionizzazione chimica a pressione
atmosferica
APPI
Fotoionizzazione a pressione
atmosferica
La CI richiede P più elevata rispetto a quella delle comuni sorgenti EI e negli
analizzatori di massa; molto efficiente nel produrre ioni, dato che le costanti di velocità
per le reazioni ioni-molecola sono direttamente collegate alla frequenza delle collisioni
dei reagenti quindi processo di CI a P atm avrà la massima efficienza.
Maggiore difficoltà: trasferire gli ioni ottenuti all'interno della camera ad alto vuoto (10-510-6 Torr) dell'analizzatore.
Le considerazioni appena espresse hanno indotto lo sviluppo di spettrometri di massa
con una sorgente ionica operante a P atmosferica e hanno portato nel corso degli anni
alla messa a punto di tre metodi di ionizzazione: APCI, ESI e ISI, più recentemente
anche APPI.
Interfaccia a pressione atmosferica (API)
Lenti con orifizi molto piccoli (skimmer o coni)
devono comunque permettere passaggio di più ioni possibile per garantire sensibilità
Problema nell’accoppiamento della zona sorgente
con la zona analizzatore sistema di pompaggio
differenziale, con 2 zone intermedie
1
Altro problema: raffreddamento causato dall’espansione adiabatica di
campione e solvente che favorisce la comparsa di cluster di ioni importante
la desolvatazione degli ioni, effettuata introducendo un transfer tube di metallo
riscaldato (ca. 200 °C) o flusso in contro-corrente di gas riscaldato (curtain gas)
Desolvatazione
migliorata
accelerando gli ioni
applicando voltaggio
tra le diverse lenti
Ioni collidono con le molecole di gas residuo, aumentano la loro energia
interna (che induce la desolvatazione finale con scomparsa dei cluster di
ioni). Queste collisioni potrebbero anche fornire abbastanza energia da
indurre frammentazione
FRAMMENTAZIONE IN SORGENTE (in
(in--source fragmentation)
fragmentation)
La desolvatazione è necessaria per evitare distribuzione dell’
dell’analita
analita in
più specie (clusters
(clusters),
), con riduzione sensibilità.
Trasferimento di ioni da P atm a vuoto dello spettrometro di massa
causa perdita di ioni, tuttavia compensata da più alta resa totale degli
ioni in sorgente API dovuta a rapida stabilizzazione termica a P atm.
atm.
Prime sorgenti API: geometria assiale, ora maggior parte ortogonale solo ioni e non solvente entrano dall’orifizio, che può essere più largo,
cosa che, insieme a riduzione del rumore, compensa la perdita di
trasmissione dovuti a questa geometria. Inoltre posso usare velocità di
flusso >
2
ESI
+
+
+
- - +
+
+
+ - +
- +CAPILLARY
(3-5 kV)
DROPLET CONTAINING
IONS
+ + -
+
-
- +
+
-+
AS DROPLET EVAPORATES,
THE ELECTRIC FIELD
INCREASES AND IONS MOVE
TOWARDS THE SURFACE
+
+
-
+
+
- --
+
+
-
+
+
+
IONS EVAPORATE FROM
THE SURFACE
Messa a punto alla fine degli anni ’80.
1989: formazione ioni multimulti-carica da proteine, con peso molecolare
determinabile con strumenti fino a 2000 m/z
All’inizio solo per proteine.
Attualmente copre circa l’80% delle applicazioni riguardanti l'impiego
della HPLCHPLC-MS
3
Concetti della sorgente elettrospray già annunciati in studi
precedenti:
Dole, M.; Mack, L.L.; Hines, R.L.; Mobley, R.C.; Ferguson, L.D.;
Alice, M.B. Molecular Beams of Macroions. J. Chem. Phys. 1968,
49, 2240-2249.
Zeleny, J. Instability of Electrified Liquid Surfaces. Phys. Rev.
1917, 10, 1-7.
Taylor, G.I. Disintegration of Water Drops in an Electric Field.
Proc. Royal Soc. London A 1964, 280, 383-397
John B. Fenn Nobel prize In chemistry 2002:
“La spettrometria di massa è l’arte di pesare atomi e molecole
per misurarne la massa. Tale informazione è a volte sufficiente,
frequentemente necessaria, e sempre utile per determinare
l’identità di una specie”
7
Electrospray ionization for mass spectrometry of
large biomolecules
JB Fenn, M Mann, CK Meng, SF Wong, CM Whitehouse
Science 6 October 1989: Vol. 246 no. 4926 pp. 64-71
Abstract: Electrospray ionization has recently emerged as a powerful technique
for producing intact ions in vacuo from large and complex species in solution. To
an extent greater than has previously been possible with the more familiar "soft"
ionization methods, this technique makes the power and elegance of mass
spectrometric analysis applicable to the large and fragile polar molecules
that play such vital roles in biological systems. The distinguishing features
of electrospray spectra for large molecules are coherent sequences of peaks
whose component ions are multiply charged, the ions of each peak differing
by one charge from those of adjacent neighbors in the sequence. Spectra have
been obtained for biopolymers including oligonucleotides and proteins, the
latter having molecular weights up to 130,000, with as yet no evidence of an
upper limit.
8
4
Electrospray ionization (ESI)
5 kV
Le nebulizzazione si produce per
effetto elettrostatico. Le gocce del
nebulizzato contenenti
prevalentemente cariche dello
stesso segno si respingono e lo
spray rapidamente diverge.
Limitazioni: Flusso fino a 20 µl/min;
volatilità e polarità del solvente.
5 kV
Gas di
nebulizzazione
Ionspray ionization (ISI)
L’elettronebulizzazione è assistita
da un flusso di gas coassiale all’ago
(assistenza pneumatica). Lo spray
risulta meno divergente.
Oggi tutte le sorgenti ESI hanno una qualche forma di assistenza
pneumatica.
L’acronimo ESI si utilizza indistintamente anche per sorgenti nella quali
l’elettronebulizzazione è assistita pneumaticamente.
10
5
Dettaglio dell’ugello elettrospray
Guaina di N2
Sonda riscaldata ESI
±5 kV
Gas di
nebulizzazione N2
Pennacchio di ioni
Ago ESI
12
6
La sorgente ESI è una cella elettrolitica
e- e- e- Campo elettrico: 106 V/m
13
Effetto del potenziale elettrospray sulla goccia alla punta del capillare, come
osservato all’aumentare del voltaggio.
Sinistra: a basso voltaggio, la goccia è per lo più sferica
Centro: a circa 1 o 2 kV, ma al di sotto del potenziale di onset, la goccia si allunga
sotto la pressione delle cariche che si accumulano sulla punta
Destra: al voltaggio di onset, la pressione supera la tensione superficiale, la
forma della goccia cambia completamente a cono di Taylor e vengono rilasciate
piccole goccioline. Le goccioline si dividono ed esplodono, producendo lo spray
[velocità di flussi: 1-10 µL/min]
On-set voltage: dipende, per una data sorgente, dalla tensione superficiale del
solvente, per esempio:
4 kV per acqua,
2.2 kV per metanolo,
2.5 kV per acetonitrile,
14
3 kV per dimetilsofossido
7
CARICAMENTO DELLA GOCCIA
Tra i due elettrodi si applica una elevata ddp (tra i 3 e i 5 kV)
rispetto al piatto con foro d’ingresso dello spettrometro;
l’elettrodo capillare può essere sia il polo positivo che quello
negativo.
Come conseguenza di questa differenza di potenziale si hanno
due fenomeni: l’ossidazione/riduzione agli elettrodi e la
migrazione elettroforetica delle specie ioniche formate
all’elettrodo capillare verso la superficie del liquido. I processi
elettrodici che normalmente avvengono sulla superficie
dell’elettrodo capillare sono l’ossidazione (capillare positivo) o
la riduzione (capillare negativo) dell’acqua e, se il capillare
contiene metalli ossidabili, si nota con il tempo una certa
corrosione dovuta all’ossidazione elettrochimica.
8
ESPULSIONE DELLE GOCCE
Se la velocità di flusso della soluzione attraverso il capillare è
sufficientemente bassa (< 5 µL/min) il menisco della gocciolina
continua a caricarsi e si deforma dando luogo al cosiddetto
“cono di Taylor (la geometria del cono di Taylor si ottiene per
flussi bassi, fino a 2 µL/min, oltre questo flusso l’ESI deve essere
assistita pneumaticamente).
All’aumentare della densità di carica dal cono di Taylor si
staccano delle microgocce cariche che, attratte dal
controelettrodo, vanno a chiudere il circuito. Il rilascio delle
goccioline cariche ristabilisce l’equilibrio del cono di Taylor, ma
altri ioni sono prodotti dal processo elettrodico, cosicché si
raggiunge uno stato di equilibrio dinamico in cui le goccioline
cariche sono continuamente, regolarmente emesse dal cono di
Taylor. Il raggio delle goccioline sarà tanto minore quanto minore
è la velocità di flusso della soluzione e quanto maggiore la sua
conducibilità. Il flusso di goccioline cariche costituisce la
corrente elettrica generata dal circuito e può essere misurata.
Electrospray ionization process
9
Sotto l’influenza del forte campo elettrico, avviene la
deformazione della goccia, che si allunga sotto la forza
risultante dall’accumulo di carica infine produce 19
nuovo cono di Taylor
µm
la
deformazione
permette la
rottura prima
di arrivare al
limite di
Rayleigh
Tot 2% volume, ma
15% carica rispetto
a goccia d’origine densità di carica >>
Limite di Rayleigh
Rayleigh:: forza di repulsione di Coulomb delle cariche sulla superficie è
uguale alla tensione superficiale della soluzione
q2 = 8π2ε0γd3
10
FRAMMENTAZIONE DELLE GOCCE
Se le gocce avessero un cammino libero, tenderebbero a
depositarsi sul controelettrodo, invece queste incontrano un
flusso di gas caldo (aria o azoto) che permette l’evaporazione del
solvente. La densità di carica aumenta fino al “limite di stabilità
di Rayleigh” in cui avviene l’esplosione colombiana: la
microgoccia si stacca e la carica si distribuisce su una superficie
minore. La forma della goccia carica risulta distorta
(alternativamente oblata e prolata) durante il suo percorso verso
il controelettrodo. Il processo avviene più volte fino ad arrivare
ad un diametro di circa 8 nm con circa 70 cariche.
A schematic representation of the possible pathways for ion formation from a charged liquid
droplet.
CRM of Dole, 1968
r = 8 nm
N = 70
Nguyen S , and Fenn J B PNAS 2007;104:1111-1117
IEM of Iribarne and Thomson, 1970
©2007 by National Academy of Sciences
11
FORMAZIONE DI IONI CARICHI
A questo punto non avviene più l’esplosione coulombiana, e gli
ioni in fase gassosa si originano dalle goccioline più piccole ad
elevatissima densità di carica. L’esatto meccanismo con cui gli
ioni sono trasferiti in fase gassosa non è stato interamente
chiarito.
La vecchia teoria, proposta da Dole, prevede che il fenomeno
prosegue fino a generare una sola molecola di analita ed una o
più cariche. L’evaporazione delle ultime molecole di solvente
produce una serie di ioni, tra cui quello della molecola di analita
con poche molecole di solvente coordinate. Questa teoria viene
chiamata “charged residue model” (ormai poco considerata).
Il secondo meccanismo, proposto da Iribarne e Thompson
prevede l’emissione (desorbimento) di ioni solvatati dalla
superficie delle microgocce quando queste raggiungono un
certo valore del raggio. Questo processo è chiamato “ion
evaporation mechanism” (accettata dai più come unica valida).
MECCANISMO DELLA IONIZZAZIONE ESI:
da ioni in soluzione a ioni in fase vapore
1- Il processo elettrochimico che avviene all’elettrodo costituito dal
capillare (per + ho ossidazione per fornire e-, per – ho riduzione per
consumare e-)
2- La formazione di goccioline cariche a partire dal liquido che
fuoriesce dal capillare.
3- l’evaporazione del solvente dalle goccioline con conseguente
instabilità ed “esplosione coulombiana”.
4- Passaggio degli ioni in fase gassosa:
Quando il campo elettrico sulla superficie della goccia diventa grande
abbastanza, avviene il desorbimento degli ioni dalla superficie: da ioni in
soluzione a ioni in fase gas
12
Poiché il desorbimento delle molecole cariche avviene dalla
superficie, la sensibilità sarà maggiore per quei composti che
hanno maggiore concentrazione sulla superficie, i lipofili effetto mascherante rispetto a composti più solubili nel bulk.
Nel caso di proteine: molecole non desorbono,
desorbono, ma sono
liberate per evaporazione del solvente.
Ioni ottenuti da molecole grandi portano un numero maggiore
di cariche se sono presenti diversi siti ionizzabili circa 1
carica ogni 1000 Da
25
ESI
Ioni tipici prodotti dalla ionizzazione elettrospray:
IONI MULTICARICATI
Modalità
Positiva:
[M+H]+ molecola protonata
[M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+… addotti con cationi
[M+CH3CN+H]+ molecola protonata + addotto
con solvente
Modalità
Negativa:
[M-H]- molecola deprotonata
[M+HCOO]- addotti con formiato, con acetato...
13
395.73
396.22
397.24
162.08
162.58
163.08
(M+3)/3
(M+2)/2
323.15
324.15
325.15
(M+1)/1
m/z
14
Spettro ESI di vanillil alcol ossidasi
ESI mass spectrum of denatured protein
[M+nH]n+
100
21+
808.3
22+
771.5
19+
893.3 18+
942.7
17+
998.1
23+
738.1
%
The charge state distribution
(or mass spectral ‘envelope’):
• range of charge states observed
• most abundant charge state
• relative abundance of ions
20+
848.6
24+
707.3
15+
1131.1
14+
1211.8
13+
1305.0
0
600
800
1000
1200
1400
11+
1542.0
1600
10+
1696.1
m/z
1800
15
Mass determination of a protein from ESI mass spectrum
M = 16951 Da
Take 2 adjacent m/z peaks: eg. 1414.0 and 1542.0
(m/z)n
=
(m/z)n+1 =
[M + nH] / n
(Eq 1)
[M + (n+1)H] / (n+1)
(Eq 2)
n = [(m/z)n+1 - H] / [(m/z)n - (m/z)n+1]
(Eq 3)
if H ~ 1 Da,
(Eq 4)
n ~ [(m/z)n+1 - 1] / [(m/z)n - (m/z)n+1]
M = n (m/z)n - nH = n [(m/z)n – H]
z1 = j (m2 − mp) / (m2 – m1),
z1 = 1 x (1542-1)/(1542-1414)
z1 = 12
Spettro ESI della mioglobina equina
16951.2
SF9
Rapporto m/z
(m)
1305.2
1211.9
1131.1
1060.3
998.2
942.8
893.1
848.5
808.2
771.4
Num. di cariche Massa molecolare
(n)
(M)
13
16954.6
14
16952.6
15
16951.5
16
16948.8
17
16952.4
18
16952.4
19
16949.9
20
16950.0
21
16951.2
22
16948.8
32
Media
16951.2
16
ESIESI
-MS Spectrum of Ubiquitin (MW 8564 Da
Da))
+12
715.99
Ubiquitina Ossidata
8580.00
+13
661.26
+11
Ubiquitina Intatta
786.97
8563.63
Ubiquitina Carbossilata
8594.25
+10
859.66
+9
955.00
+8
1073.07
Nessuna Frammentazione
Spettro Deconvoluto
Formazione di Ioni Multicarica
DISTRIBUZIONE DELLE CARICHE NEGLI IONI MULTICARICA
La distribuzione delle cariche negli ioni multicarica dipende da più
fattori.
STRUTTURA DELL’ANALITA
Per ogni analita c’è un determinato numero di siti che possono accettare il
protone, il cui valore dipende dalla conformazione (per le proteine struttura
terziaria), che influenza la disponibilità effettiva dei siti. Nel caso delle
proteine solo dopo una completa denaturazione (struttura nativa) tutti i siti
diventano disponibili per la ionizzazione.
CONCENTRAZIONE DELL’ANALITA
Si devono evitare condizioni di elevata concentrazione, perché, causa il
numero limitato di cariche disponibili, diminuisce il numero totale di
cariche per molecola. In condizioni di nanoelectrospray si può ottenere
una distribuzione di carica più uniforme.
CARATTERISTICHE DELLA SOLUZIONE
Caratteristiche quali: tensione superficiale, conducibilità, viscosità e
polarità del solvente, influenzano in generale il fenomeno ESI e anche la
distribuzione delle cariche delle macromolecole.
17
CONDIZIONI STRUMENTALI
La distribuzione finale delle cariche dipende: dalla configurazione della
sorgente, dalla distanza tra gli elettrodi, dalla temperatura e portata dei
gas, dal ∆V tra cono di campionamento e cono di skimmer, in quanto tutti
questi fattori influenzano i quattro stadi dell’ESI.
REAZIONE IONE MOLECOLA
Al momento della ionizzazione, possono avvenire trasferimenti di carica
tra il macro poli-ione e piccole molecole copresenti quali H2O, NH3
pH DELLA SOLUZIONE ED EVENTUALE CAPACITA’ TAMPONANTE
Teoricamente ad un basso pH corrispondono più protoni, quindi una
maggior quantità di carica e ioni multicarica, ma in pratica non si
osserva tutto ciò. A parte le situazioni che si verificano a valori estremi,
l’effetto del pH non è facilmente prevedibile e spesso, meno drammatico
di quanto ci si potrebbe aspettare. Ciò è dovuto al fatto che in ESI+ si
generano al capillare ioni H+ e in ESI- ioni H+ vengono neutralizzati.
Risulta allora di fondamentale importanza l’aggiunta di un elettrolita.
Tridimensional Structural Information
18
Positive or Negative Ionisation ?
723
100
[M+H]+
Basic Molecules
(-NH2)
%
m/z
0
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
721
100
[M-H]-
AcidicMolecules
(-OH, COOH)
%
m/z
0
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
37
Polarity Switching – Assists Identification of
Unknown
COOC4H9
100
Negative Ion
Butyl Paraben
M 194 Da
%
OH
[M-H]193
194
0
[M+Na]+
217
100
Positive Ion
[M+H]+
195
%
218
0
60
70
80
m/z
90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230
38
19
Mioglobina
At pH 3, negative ions are observed, the most intense ions bearing from 13 to 15
charges. A calculation based on known pK values shows that in the original
solution, only 1 molecule in approximately 3500 bears one negative charge
20
Sensibilità alla concentrazione
A differenza di altre tecniche di ionizzazione, la
risposta in ESI è proporzionale alla concentrazione e
non alla quantità di analita iniettata in sorgente
Poiché ESI = cella elettrolitica, quando si ha estrazione di ioni
positivi, devono essere forniti elettroni al circuito dal capillare.
Questo avviene tramite ossidazione delle specie N- in soluzione
alla punta del capillare.
In pratica, poiché si allontanano ioni + dalla soluzione (verso
analizzatore), devo allontanare stesso numero di cariche - dalla
soluzione.
Per ESI+ ho ossidazione per fornire e- da parte della soluzione; per
ESI- ho riduzione per consumare eil numero totale di ioni che possono essere estratti per unità di
tempo verso lo spettrometro è limitata dalla corrente elettrica
prodotta dal processo di ossidazione o riduzione sulla punta del
capillare. Ciò spiega dipendenza dalla concentrazione.
Altre variabili: solvente, velocità di flusso, natura e misura del
capillare, distanza dal controelettrodo, potenziale applicato…
42
21
The requirement for charge balance in such a continuous electric current
device, together with the fact that only electrons can flow through the metal wire
supplying the electric potential to the electrodes, leads to the conclusion that the
ES process must include an electrochemical conversion of ions to electrons.
the ES device can be viewed as a special type of electrolytic cell, special
because the ion transport does not occur through uninterrupted solution,
as is normally the case in electrolysis. Part of the ion transport occurs
through the gas phase.
In the positive ion mode where positively charged droplets and later positive
gas-phase ions are the charge carriers, a conventional electrochemical
oxidation reaction should be occurring at the positive electrode, that is, at the
liquid/metal interface of the spray capillary. This reaction supplies the extra
positive ions to the solution that prevents the build-up of a charge imbalance.
The other alternative for producing extra positive ions is the removal of negative
ions present in the solution by an oxidation reaction. For aqueous solutions:
43
Cella elettrochimica
a corrente costante
Itot (circa 1 µA)
costante, portata
dagli ioni
Se nel flusso ho troppi ioni
provenienti dai sali, essi
stessi saranno sufficienti a
produrre IM Pochi ioni del campione o
nessuno!
Se soluzione è troppo diluita
e con flusso basso, il flusso
di ioni non riuscirà a fornire
IM fenomeni di
ossidazione (+) di solvente e
campione che porteranno a
radicali cationi
22
La corrente elettrica del sistema ESI è trasportata da 3 tipi di ioni:
l’analita A, l’elettrolita B ed eventuali altre specie ionizzabili presenti in
soluzione che indichiamo con C. Avremo quindi:
Itot = IA + IB + IC
IA= KA[A], IB= KB[B], IC= KC[C]
Ki = costanti di desorbimento delle varie specie, dipendono sia dall’affinità
per la carica sia dalla costante di equilibrio tra interno e superficie della
microgoccia.
A noi interessa sapere la frazione di corrente trasportata dall’analita, la
quale determina la sensibilità con cui esso può essere misurato.
IM = f p Itot
f = la frazione di carica che effettivamente passa in fase vapore
p = l’efficienza di trasmissione degli ioni
Quindi, la presenza di elettroliti e di eventuali altre sostanze, se le costanti
o le concentrazioni sono elevate, influenzano negativamente l’intensità del
segnale dell’analita. Per aumentare la sensibilità: tenere la più bassa
45
possibile la concentrazione di eventuali elettroliti aggiunti alla fase mobile.
•
•
IA= KA[A]]
IB= KB[B]]
•
ITot = IA + IB ma è limitata f
p Itot = IM
Consideriamo [B] costante, ma [A] che varia. Ho quindi 2 casi limite. Il primo, per
kA[A] << kB[B],
Quindi intensità del segnale è proporzionale a [A], ma sensibilità è
inversamente proporzionale a [B] (curva di calibrazione rettilinea)
Per kA[A] >> kB[B],
IA rimane costante e la quantificazione non è più possibile. Il segnale
di B diminuirà all’aumentare di [A] 23
Se però KB[B] aumenta, la retta che otterremo sarà sempre meno inclinata
e la risposta sarà più bassa.
Quindi una certa concentrazione di B è necessaria per avere un range
di linearità sufficientemente esteso. In genere si lavora con
concentrazioni di elettrolita 10-2-10-3 moli/L per raggiungere un
buon compromesso tra range di linearità e sensibilità, ma per
specie che mostrano costanti di desorbimento basse può essere
utile diminuire la concentrazione di elettrolita.
Se si considera anche la specie C, si deve tener conto che la sua
presenza incide sulla risposta di A. Per una corretta analisi quantitativa
bisogna fare i conti con tale effetto che dipende dalla matrice che
costituiva il campione iniziale da analizzare.
La presenza di elettroliti e di eventuali altre sostanze influenzano
negativamente l’intensità del segnale dell’analita, se le costanti o le
concentrazioni sono elevate. Per aumentare la sensibilità devo
tenere basse le concentrazioni di eventuali elettroliti volatili
aggiunti alla fase mobile (generalmente HCOOH, NH3, TFA) per
renderla più adatta alle separazioni che vogliamo ottenere, o per
migliorare la forma dei picchi.
•
•
Anche se il segnale relativo a C (ed eventualmente anche a
D,E…n) non viene rilevato, la ionizzazione può avvenire
ugualmente. Se l’affinità per la carica e/o per la superficie di C,
ecc. è elevata il segnale di A viene soppresso, ma se l’affinità per
la carica è scarsa e l’affinità per l’interno della goccia è forte
(molecole molto polari) il segnale può anche aumentare.
Questo effetto, dovuto alla limitata quantità di cariche che si
formano nel processo ESI, ne rappresenta la limitazione più
importante.
24
In a solvent containing NH4+ and Na+ ions at
constant concentrations, an increasing amount of
morphine chlorhydrate is added.
On the top: number of
amperes at the capillary
tip;
Below: the intensity
monitored at the mass of
protonated morphine and
the sum of the
intensities for NH4+ and
Na+ ions. At low conc. of
morphine chlorhydrate,
IB ≈ IM, and linearity
towards morphine
concentration is
observed. At high
concentrations, the
intensity for morphine is
constant, and the signal
for the other ions
diminishes (IA ≈ IM). At
intermediate values, the
general Equation
applies.
ESI pneumaticamente assistita:
configurazione “fuori asse”
25
ESI pneumaticamente assistita:
configurazione ortogonale
Z-spay ionization source
26
Prestazioni Generali della Sorgente ESI
Vantaggi
Svantaggi
Funziona bene con analiti volatili
e non volatili, ionici e/o polari
Scarsa frammentazione
Informazioni sul peso molecolare
Scarsa frammentazione
Elevata sensibilità
Non compatibile con l’utilizzo
di tamponi non volatili e
solventi organici apolari.
Ionizzazione inibita da alte
concentrazioni saline
Permette la determinazione di alti
pesi molecolari
Interfacciamento con
Cromatografia Liquida
NANOSPRAY (ESI)
La diminuzione del diametro del capillare e la diminuzione del flusso della
soluzione sono alla base del cosiddetto NANOSPRAY
E’ una tecnica di ionizzazione ancora piu’ “soft” dell’ESI, dunque
crea ioni a più alto rapporto m/z rispetto all’ESI “convenzionale”.
Si possono ottenere spettri da pg (nmol/mL) di materiale grazie
al ridotto diametro interno del capillare e al potenziale più basso di
quello normalmente usato in ESI
Particolarmente adatto per la analisi di biomolecole
Più tollerante alla presenza di sali (perché gocce hanno diametro
< 200 nm, contro 1-2 µm della ESI, con volume 100-1000 volte
inferiore
Distanza controlettrodo ca. 1 mm, voltaggio dello spray 1-2 kV
27
ESI: configurazione nano
La differenza di
potenziale applicata
influenza moltissimo la
forma dello spray.
Si ha uno spray stabile e
con un cono di
diffusione ridotto solo
per opportuni valori
dipendenti dalla portata
e dal diametro del
capillare.
56
28
APCI
IONIZZAZIONE CHIMICA A PRESSIONE ATMOSFERICA
Precedente e complementare rispetto all'ESI, ma con meno successo.
Strumento LC-MS con ESI e APCI consente di affrontare qualsiasi
problematica di spettrometria di massa non risolvibile con la tradizionale GCMS con ionizzazione elettronica (EI) o ionizzazione chimica tradizionale (CI).
APCI
Non c’è spray voltage nebulizzazione è realizzata per azione solo del
nebulizzatore pneumatico
Trasformazione dell’aerosol in vapore (solvente + analita altamente diluito)
avviene nel blocco riscaldante
Si basa su trasferimento di specie cariche da uno ione reagente alla molecola
di analita
Più soft della CI classica
Ioni positivi: addotti della molecola di analita con piccoli cationi come H+,
NH4+, Na+ o altri cationi provenienti dalle reazioni del gas reagente.
Ioni negativi: perdita di protoni, cattura di e-, o addotti con piccoli anioni come
HCOO-, CH3COO- ecc.
Cl-,
Rispetto a ESI: genera ioni da sostanze neutre (meno polari)
Poco riproducibile: dipende dal solvente, dal gas nebulizzante, temperatura
ecc.
29
SCHEMA DI UNA SORGENTE APCI
400-500 °C
TRE FASI:
1. passaggio dell’analita in fase vapore (nebulizzazione e
desolvatazione);
2. ionizzazione dell’analita per mezzo di reazioni scambio di carica
ione-molecola in fase gassosa a pressione atmosferica;
3. introduzione degli ioni nella zona ad alto vuoto con esclusione della
maggior parte del solvente e delle specie neutre
La nebulizzazione avviene per effetto dell’azione simultanea del calore
che fa evaporare parte del solvente e di un flusso di gas ad elevata
velocità. Un tipico disegno di nebulizzatore per APCI consiste in un
capillare di silice fusa o altro materiale attraverso cui passa il flusso di
fase mobile proveniente dalla colonna LC e da un tubo più largo,
concentrico che viene riscaldato e all’interno del quale passa il flusso di
gas. Il tubo viene scaldato a temperature piuttosto alte, ma la maggior
parte del calore è utilizzato per la vaporizzazione del solvente cosicché la
temperatura massima a cui vengono a trovarsi gli analiti è molto più
bassa e la decomposizione termica in genere trascurabile.
60
30
Dettaglio dell’ugello APCI
Ago corona
±5 kV
Guaina
gassosa N2
Sonda riscaldata APCI
Pennacchio ioni
Gas di
nebulizzazione N2
Capillare APCI (ritratto)
Plasma ioni
Meccanismo di generazione
degli ioni in APCI
Nebulizzatore
riscaldato
Molecole del solvente
Molecole del campione
Trasferimento di carica
N2
Liquido
+
+
N2
+
+
+
+
Ago
corona
Aerosol
Molecole del
campione solvatate
Solvente
ionizzato
Campione
ionizzato
Le molecole di solvente ionizzate si comportano poi da reagente per la
ionizzazione chimica degli analiti, in modo analogo a quanto avviene per la
ionizzazione chimica tradizionale.
31
Il solvente evapora dalle goccioline per effetto del calore nella zona
successiva a quella dove avviene la nebulizzazione e la ionizzazione
delle specie, ormai in fase vapore, è iniziata per mezzo di una scarica a
corona provocata da una punta mantenuta ad un potenziale di 3-8 kV.
La scarica provoca la ionizzazione primaria del gas utilizzato per
sostenere la nebulizzazione (azoto o aria) dando inizio ad una serie di
reazioni ione molecola che porterà infine alla ionizzazione delle
molecole di analita.
A differenza della CI a bassa pressione, a PA le collisioni sono molto
frequenti e, a meno che la scarica a corona non sia fatta avvenire
troppo vicino al foro di campionamento (dopo l’espansione la pressione
diventa molto più bassa e le collisioni assai meno frequenti), il processo
arriva all’equilibrio termodinamico, cioè si ha la formazione delle specie
più stabili. Il trasferimento di protone è il meccanismo più frequente in
APCI positiva e il più utile per la successiva analisi MS.
Maggiore é l’affinità per il protone dell’analita, maggiore é l’efficienza di
ionizzazione.
Reazioni ione-molecola nella APCI
.
.
.
.
.
.
Se c’è ossigeno, si
forma anche O2+•
Si ha prima la formazione dello ione-radicale N2●+ che, essendo instabile,
reagisce trasformandosi nello ione-radicale N4●+. Questo reagisce con una
molecola di H2O (più in generale con una molecola di solvente) per dare
H2O●+ che a sua volta cede il protone ad una seconda molecola di H2O con
formazione dello ione H3O+, nella cui sfera di coordinazione possono essere
presenti n molecole di H2O. Infine lo ione (H2O)nH+ trasferisce lo ione H+ ad
una molecola di analita formando lo ione molecolare protonato [M+H]+.
32
Meccanismo Ioni Positivi
•
L’ago cattura elettroni
formando ioni N2+, O2+, H2O+…
(ioni primari).
•
Gli ioni primari, aventi un
tempo di vita molto breve,
trasferiscono la carica al
solvente, formando
principalmente ioni H3O+,
NH4+, RH2O+…(ioni reagenti).
•
Gli ioni reagenti trasferiscono
la carica all’analita, formando
prevalentemente specie
[M+H]+.
Meccanismo di formazione degli ioni positivi in APCI
MH+
MH+
MH+
H3 O+
N2
e-
+
ROH2+
O2 +
eee-
Alto voltaggio positivo
MH+
NH4+
NO+ H O+
3
H2 O+
MH+
ROH2+
Ioni primari (aria, tempo di vita 1 µsec)
Ioni reagenti (solvente, tempo di vita 500 µsec)
Ioni analita
SF9
66
33
Meccanismo Ioni Negativi
•
L’ago rilascia elettroni
formando ioni O3-, O2-, NO2-,
CO3-…(ioni primari).
•
Gli ioni primari, aventi un
tempo di vita molto breve,
trasferiscono la carica al
solvente, formando
principalmente ioni OH-, HCO3-,
RO-… (ioni reagenti).
•
Gli ioni reagenti trasferiscono
la carica all’analita formando
prevalentemente specie [M-H]-
Meccanismo di formazione degli ioni negativi in APCI
M-H-
M-H-
OHRO-
ROOH-
O-
O2
e-
-
M-H-
O3 e-
eee-
NO3-
CO3
NO2-
M-H-
-
M-H-
ROOH- M-H-
Alto voltaggio negativo
Ioni primari ( aria, tempo di vita 1 µsec)
Ioni reagenti (solvente, tempo di vita 500 µsec)
SF9
Ioni analita
68
34
Meccanismo di formazione degli ioni in APCI
Aria
Ioni positivi
Ioni negativi
N2, O2, H2O
N2, O2, H2O, CO2
Scarica a corona 5-6 kV (elettroni)
N2+, O2+, H2O+,
NO+
Ioni primari (1 µsec)
O2-, O-, O3-, NO2-,
NO2-, NO3-, CO3-
Solvente (H2O, MeOH)
Ioni reagenti (500 µsec)
(MeOH)n(H2O)nH+
MeO-, OH-
[M+H]+
[M-H]-
analita (M)
Ioni analita
SF9
69
Sensibilità relativa
ESI vs APCI - Sensibilità
Flusso (µL/min)
La ESI è sensibile alla concentrazione dell’analita, la APCI alla sua quantità. Per questo
l’ESI si presta ad essere accoppiata alla micro e nano HPLC.
35
APCI: sommario delle caratteristiche
•
La APCI è adatta a composti anche non particolarmente polari,
che possono essere in forma ionica in soluzione, ma non sono
tipicamente acidi o basi forti.
•
Il pH non ha una grossa influenza sulla risposta.
•
La velocità di flusso utilizzabile in APCI va da 0.2 a 2 mL/min (un
tipico flusso operativo è 1 mL/min).
•
In APCI il parametro da fissare è la corrente di scarica,
generalmente limitata a 2-3 µA. Questo valore induce un
voltaggio sull’ago paragonabile a quello normalmente
impiegato per la ionizzazione elettrospray.
•
La APCI non porta in nessun caso alla formazione di ioni
multicarica.
Multimode Source
ESI and APCI are very different processes and require very different conditions
for optimum performance…a single source with two electrically separated,
optimized zones, one for ESI and one for APCI. Ionization takes place
simultaneously in both zones and all ions are analyzed simultaneously by the
mass spectrometer.
36
APPI
Nuova interfaccia presentata nel 2000 da A. Bruins (University of
Groningen, Netherlands): usa fotoni per ionizzare molecole gassose
APCI modificata con lampada UV (Xe, Kr, 10 eV) al posto della corona
A. Trasferimento di carica mediato da una sostanza “dopante”
B. Trasferimento di un protone mediato dal dopante e solvente
37
APCI modificata: fotoni da lampada al posto degli elettroni da ago.
Lampade UV forniscono fotoni con Energia superiore a potenziali
di ionizzazione degli analiti, ma minore dei potenziali di ionizzazione
dei gas atmosferici e dei solventi usati FORMAZIONE SELETTIVA
DI IONI DEGLI ANALITI senza ionizzare solvente, quindi riducendo
rumore di fondo.
75
Il meccanismo della fotoionizzazione deve avvenire in maniera tale
da non ionizzare in maniera preponderante il solvente.
Il meccanismo di fotoionizzazione diretto:
M + hν M+• + eè possibile, ma non da una elevata percentuale di formazione di
ioni, perciò spesso si ricorre all’uso di un “dopante” (aumenta le
prestazioni) che agisce sul meccanismo di ionizzazione.
Chiaramente se non viene utilizzato il dopante il fotone colpisce
direttamente l’analita e ionizza o togliendo un elettrone oppure
favorendo la cattura di un elettrone in caso di ionizzazione
negativa.
Per ionizzazione diretta si ha sempre la formazione di uno ione
radicale come accade per tutte le reazioni di tipo fotochimico.
Invece nel caso del dopante possiamo avere:
76
38
TRASFERIMENTO DI CARICA
Il dopante presente in concentrazione preponderante rispetto
all’analita si ionizza formando uno ione dopante carico, che poi
trasferisce la carica alla molecola di analita M (nel caso analita abbia
Energia di ionizzazione più bassa di quella del dopante).
hν
+ e+
D
D
D
M
+
D
e-
+
M
e-
M
1. Un fotone colpisce una molecola del dopante D formando uno ione
dopante carico.
2. Lo ione dopante carico interagisce con la molecola dell’analita e si ha il
trasferimento di carica formando uno ione radicale
TRASFERIMENTO DEL PROTONE
Prevede la formazione di un cluster tra il solvente e il dopante
ionizzato, il passaggio del protone avviene dal dopante alle molecole
di solvente e dalle molecole di solvente alla molecola di analita
(favorita per solventi con alta PA).
hν
e+
D
D
S +
D
S
S
e-
S H+
D-H
S S
1. La molecola dopante carica si mescola con il
solvente LC formando una molecola di cluster
carica. Il protone è poi trasferito al cluster del
solvente per dare un cluster carico.
2. Il cluster del solvente carico interagisce con la
molecola dell’analita, trasferendo il suo protone e
declusterizzando, creando una molecola protonata.
S
H+
M
S S
S
+
M+H
S
S
39
IONIZZAZIONE NEGATIVA
Fondamentale la presenza del dopante: tutte le reazioni di
ionizzazione sono iniziate da elettroni termici prodotti dalla
fotoionizzazione del dopante solventi con alta affinità elettronica
positiva (es. alogenati) inibiscono ionizzazione perché catturano
tutti gli e- termici in sorgente
Cattura e-
M + e- M-•
per analiti con affinità elettronica positiva
O2 + e- O2-•
M + O2-• M-• + O2
per analiti con affinità eletronica >0.45 eV (O2)
Trasferimento di carica
Trasferimento del protone
M + [S-H]- [M-H]- + S
per analiti con acidità in fase gas > del solvente
DOPANTE
E’ una specie che si fotoionizza e poi cede la carica all’analita.
Acetone
Toluene
Anisolo
In genere dopante viene aggiunto
all’uscita della colonna
cromatografica utilizzando una
pompa a siringa
Alternativa: lavorare in cromatografia a fase normale (NP):
vantaggio consiste nel poter utilizzare ad esempio il toluene
(dopante) direttamente come componente della fase mobile
40
•
H2N
NH2
Cl
NH2
N pari massa pari, e- pari
M+• massa pari, e- dispari (radicale)
[M+ H]+ massa dispari, e- pari (ione)
N dispari massa dispari, e- pari
M+• massa dispari, e- dispari (radicale)
[M+ H]+ massa pari, e- pari (ione)
81
Ambient desorption ionization techniques
Consente l’analisi diretta di oggetti in atmosfera aperta
(laboratorio o loro ambiente naturale)
82
41
Desorption electrospray (DESI)
A pneumatically assisted ion spray source is oriented at 45°towards a sample
(deposited on holder of any material, conducting or non-conducting). The nitrogen
spray is adjusted so as to have a linear speed of the droplets of about 35 m s−1
42
DESI
DESI: usa un solvente per generare agenti energetici
che desorbono e ionizzano le molecole di analita
DART
DART: usa un gas per generare agenti energetici che
desorbono e ionizzano le molecole di analita
43
DESI utilizzato con successo per molecole piccole non polari o
per molecole grandi polari (peptidi e proteine, multicarica).
Applicazioni: farmaci, esplosivi, sezione di semi…
Anche per rilevare molecole di farmaci/droghe su superficie
della pelle, es.: esposizione di un dito di un soggetto dopo
somministrazione di 10 mg di antistaminico.
88
44
Cody et al., 2005
Determinazione diretta di composti su superfici, in liquidi e in
gas senza preparazione del campione.
He,
N2
Gas soggetto a fascio di e- con potenziale ad alto voltaggio fra i 2
elettrodi, con produzione di ioni, e- e specie neutre (eccitati). Plasma
passa fra altri elettrodi che rimuovono tute le specie cariche e
lasciando solo le specie neutre che poi interagiscono con campione e
atmosfera.
45
Il processo più semplice è la ionizzazione di Penning che
comporta il trasferimento di E dal gas eccitato all’analita, dando
il radicale catione:
G∗ + M → M•+ + G + e−
Un altro processo di ionizzazione (il principale se si usa elio) è il
trasferimento del protone, che avviene quando atomi metastabili
di He reagiscono con H2O dell’atmosfera per produrre cluster di
H2O ionizzata che possono protonare le molecole del campione
dando [M+H]+.
Ioni negativi formati per cattura di elettroni per presenza elettroni
termici da ionizzazione di Penning.
Ioni negativi anche prodotti da reazioni delle molecole di analita
con ioni negativi da H2O e O2 atmosferici
[M-H]-.
DART Produce [M+H]+ o M•+ (M-H]+- o M•-) , simile a DESI ma non
produce ioni multicarica.
46
… il campione è
costituito da
una
banconota…
…ecco il
risultato!
Sorgenti di ionizzazione inorganiche
Applicazione MS anche a composti inorganici e organometallici
Ampiamente usata per caratterizzazione inorganica e analisi delle
microsuperfici:
EI per composti inorganici volatili, SIMS, FD, FAB, LD, ESI per non volatili
Analysis of inorganic compounds by mass spectrometry.
1) EI spectrum of orthorhombic sulfur (S8).
2) ESI spectrum of Cr(CO)2(dpe)2.
47
Sorgenti di ionizzazione inorganiche
Per analisi elementare: atomizzazione del campione (= trasformazione
della materia solida in vapore atomico) e ionizzazione degli atomi
avvengono in sorgente. Atomi sono poi ordinati e “contati” con l’aiuto
della MS.
Decomposizione completa del campione nella sorgente nei suoi atomi
costituenti necessaria, perché se incompleta avrei spettri troppo
complessi , e distribuzione di ciascun elemento in differenti specie porta
a diminuzione sensibilità.
Quattro tecniche MS sono utilizzate per analisi in tracce multi-elementari
di composti inorganici in diverse tipologie di campioni, con
atomizzazione e ionizzazione del campione realizzate in diversi modi:
1. thermal ionization (TI) volatilizzazione da una superficie riscaldata
2. spark source (SS) attacco con scarica elettrica
3. glow discharge (GD) sputtering di ioni di gas rari
4. inductively coupled plasma (ICP) mass spectrometry vaporizzazione
in una fiamma calda
48
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