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07-ESI e CID

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Ionizzazione electrospray
(ESI)
Campione in
fase liquida
Analizzatore
+
e-
-
Il
potenziale
applicato
alla
fine
dell’ago
e’
sufficientemente alto da nebulizzare la soluzione in una
miriade di “goccioline cariche”, contenenti il campione
Quando il solvente evapora, la concentrazione di carica alla
superficie della gocciolina aumenta fino a superare la tensione
superficiale causando una “esplosione coulombica”.
Si formano così ioni dell’analita privi di solvente.
+3
+--++ ++
- ++- +- -++ - +-+ +
Evaporazione
--+
+
-++-++---+++
+++--
+4
“Esplosione coulombica”
Le cariche sono statisticamente distribuite tra i
siti disponibili dell’analita, portando spesso alla
formazione di ioni a cariche multiple.
+5
+6
Determinazione della massa molecolare con ESI
m1 =
M+nX
n
n=
m2 =
M + (n - 1) X
(n - 1)
m2 - X
m2 - m1
M = n (m1 – X)
m1 e m2
(m/Z) delle specie ioniche che si formano
M
Peso molecolare dell’analita
n
Numero di cariche
X
Carica
Spettro ESI della Neurotensina
Spettro di massa “deconvoluto”
ESI
ElectroSpray
Ionisation
Ioni a carica multipla
diminuisce m/z
L’analisi viene solitamente fatta con
spettrometri a quadrupolo o
trappola ionica
ESI si adatta all’interfacciamento
con
HPLC
e
CE
(Capillary
Electrophoresis).
Sensibilita’
ed
Estensione
di
Dimensioni Molecolari un po’ minori
rispetto alla tecnica MALDI.
ESI
(LC-MS)
Separazione e analisi di una proteina
dopo proteolisi, tramite abbinamento
di HPLC a fase inversa e spettrometria
di massa
Quadrupole Mass Analyzers
Sono piu’ piccoli, piu’ leggeri e meno costosi dei sistemi a settore.
Di solito pero’ hanno una risoluzione minore (≈ 2000) e possono rilevare m/z
solo fino a ≈ 4000.
Tensioni continue
Radiofrequenza
+
+
+
+
+
+
+
Provocano
un
moto
complicato
degli ioni
+
+
Solo alcune traiettorie sono stabili permettendo agli
ioni di massa specifica di essere trasmessi al detector
ION TRAP
Analizzatore a trappola ionica
Elettrodi
superiore ed
inferiore
Elettrodo ad anello
+
+
+
+
+
+
+
Gli ioni vengono delimitati e
mantenuti in moto costante
nello spazio definito dagli
elettrodi
Detector
Elettrodi
superiore ed
inferiore
Elettrodo ad
anello
Gli ioni descrivono particolari
orbite (figure di Lisajous)
Variando le condizioni del campo
elettrico si permette a ioni di massa
progressivamente maggiore di essere
espulsi in successione dalla trappola
SORGENTE
ESI Sample should not contain:
• Salts (such as NaCl, K2HPO4, etc.)
decrease electrospray signal, form adducts complicating spectra
• Buffers (TRIS, MES, MOPS)
same reason as salts
• Reducing agents (BME, DTT)
• Stabilizers (glycerol, PEG)
overwhelm spectra, difficult to rinse
• Detergents
includes ionic (SDS) and non-ionic (Triton X-100)
avoid during sample preparation, difficult to get rid of
decrease electrospray signal
Vantaggi:
ELECTROSPRAY
9 Buono per composti carichi, polari o basici.
9 Massima accuratezza nelle misure
9 Permette l’analisi di composti ad elevata massa con rapporti massa/carica che sono
facilmente determinati mediante la maggior parte degli spettrometri di massa (m/z
minore di 2000 - 3000).
9 Possibilità di “controllare” eventuali processi di frammentazione.
9 Compatibile con tecniche MS/MS e LC/MS.
Limiti:
9 Specie a carica multipla richiedono algoritmi complessi per l’analisi dei dati
9 Estremamente sensibile alla presenza di contaminanti (sali, metalli, composti basici,…..).
9 Hardware relativamente complesso in confronto ad altre sorgenti ioniche.
9 Range di massa: generalmente minore di 200,000 Da
Spettrometro di massa a triplo quadrupolo
ANALISI MS/MS:
Determinazione della sequenza amminoacidica
mediante CID (Collision Induced Dissociation)
•
I peptidi vengono preferenzialmente frammentati a livello dei legami
peptidici
•
Il processo di frammentazione è solitamente una reazione
unimolecolare
•
La rottura del legame peptidico è mediata dalla protonazione
•
Il processo di frammentazione inizia solitamente con un attacco
nucleofilo a centri elettrofili
•
Le interazioni che determinano la formazione di anelli a 5 componenti
sono favorite
Formazione di ioni “b” e “y”
Ioni Y: dal C all’N terminale
NH2
R1
O
C
H
C
b1ion
Y ion
3
R2
N
H
C
H
b ion
2
Y ion
2
R3
O
C
N
H
C
H
Y ion
1
R4 O
O
C
b ion
3
Ioni b: dall’N al C terminale
N
H
C
H
C
OH
FORMAZIONE DEGLI IONI “Y”
H
H
Protonazione dell’N ammidico
Protonazione dell’O carbonilico
Trasferimento H+
oxazolone
ione “Y”
FORMAZIONE DEGLI IONI “b”
Protonazione dell’N ammidico
Protonazione dell’O carbonilico
Ioni “b”
Ione acylium
+
Peptide “N-terminale
Oxazolone protonato
Formazione di ioni “a” e ioni immonio
R1
NH
NH2
O
R1
O
O
+
NH
NH2
R3
¨
NH
C O
+
R2
R3
N
H
R2
O
O
R1
O
protonated oxazolone
NH
NH2
b type ion
O
R3
¨
NH
C
+
O
R2
acylium ion
R1
H
O
N
NH2
H
+
R2
R3
N
NH2
N
¨
O
R1
R3
+
O
H
R2
+
¨
NH2
O
b type ion
a type ion
H+ transfer
+
CO
R1
¨
R3
N
NH2
R2
O
O
+
+
NH3
immonium ion
Frammentazione di peptidi mediante CID
• Sono sempre prevalenti ioni della serie “y” e “b”
• Gli ioni b possono “perdere” CO (-28 Da), formando ioni “a”
• Residui di Cys, Ser, Thr, Glu possono perdere H2O (-18 Da)
• Residui di Gln, Asn, Lys, Arg possono perdere NH3 (-17 Da)
• A bassi intervalli di m/z si possono osservare ioni immonio
formatisi da singoli amminoacidi liberati
• La Met, se ossidata, può perdere CH3SOH (-64 Da)
• Residui di fosfo-Ser e fosfo-Thr possono perdere PO4H3 (-98
Da)
• La rottura di legami Pro-Xxx è impedita
• In condizioni particolari si possono produrre serie interne di ioni
aggiuntive. La rottura di alcuni legami può essere favorita
rispetto ad altri
Perché è così difficile interpretare gli spettri MS/MS?
- I frammenti b e y si presentano contemporaneamente sullo
spettro e non sappiamo riconoscere a priori se un frammento
appartiene alla serie b o alla serie y
- Le serie b e y possono presentarsi incomplete
- Il peptide può contenere modificazioni inattese, che alterano la
massa degli amminoacidi e quindi dei frammenti
- I frammenti b e y, pur essendo generati in proporzione
predominante, non sono gli unici frammenti che vengono generati
dagli eventi di collisione
- La misura delle masse relative ai vari frammenti è affetta da
errore sperimentale
- Un “rumore di fondo” non interpretabile viene generato in ogni
analisi sperimentale
Sequenziamento de novo di un peptide
y020 2 +
1076.3
100
y”182+ y”17
y”15 y”14 y”13 y”12 y”11 y”10 y”9 y”8 y”7 y”6 y”5 y”4 y”3
(Y,D)-T-A-A-S-K-L-E-E-A-S-K-A-A-D-E-S-E-R
b8 b9 b10 b11 b12 b13 b14 b15 b16 b17 b18 b19
y’’192+
1004.0
Relative abundance
y’’9+
992.0
b9+
y’’15+
979.0
50
b172+
+
y’’182+ y’’10
947.0
1108..0
1063.2
+
y’’
0
+
4
y 4 520.0
502.0
y’’152+
850.0
825.0
390.9
1562.0
b16+
1651.5
1394.0
1179.0
905.0
y’’14+
1434.4
b13+
b11+
y’’8+
b14+
y’’12+
+
y’’6+ y’’7
777.2
y’’3+
y’’13+
y’’11+
1192.0
890.2
b8+
1649.4
b10+
1465.0
y’’17+
b15+
1321.47
706.0
b17+
1536.0
y’’5+
b12+
635.0
1266.2
b19+
1996.0
1791.0
1779.8
b18+
1867.0
0
400
600
800
1000
m/z
1200
1400
1600
1800
2000
Post-Source-Decay (PSD) per analisi di
sequenza di peptidi
• Il peptide è analizzato in reflectron mode
• Il peptide è analizzato per più di 10-15 volte, ogni volta riducendo
il “reflectron voltage” del 5-10%
Il PSD avviene nel tubo di volo:
Laser
sorgente
Il decadimento può
avvenire in qualsiasi
punto dell’analizzatore
Reflector
detector
Reflector
Linear
detector
Grafico dell’Energia Interna degli ioni precursore
N° ioni
Energia Interna
Solo una piccola frazione degli ioni precursore ha abbastanza
energia per frammentarsi!
FONDAMENTI DEL PSD
1. PSD è un metodo per identificare e misurare le masse
degli ioni frammento che si formano da uno ione
precursore selezionato durante il tempo di volo
2. Gli ioni frammento si formano principalmente per
decomposizione unimolecolare degli ioni precursore, già
accelerati all’interno dell’analizzatore (ovvero dopo
l’uscita dalla sorgente ⇒ “post source decay”)
3. Gli ioni frammento sono separati nel REFLECTOR
Inconvenienti del PSD
• Frammentazione poco efficiente dello ione precursore
• Gli spettri completi sono di difficile interpretazione
• La selezione dello ione precursore può essere fatta solo su
“picchi isolati”
• I tempi di acquisizione sono lunghi in quanto per ottenere lo
spettro completo è necessario modificare via via il voltaggio del
Reflector; in linea teorica, per lo stesso motivo, cambiano
anche i parametri di calibrazione
Il PSD è un metodo valido per il controllo di una
sequenza conosciuta
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