Ionizzazione electrospray (ESI) Campione in fase liquida Analizzatore + e- - Il potenziale applicato alla fine dell’ago e’ sufficientemente alto da nebulizzare la soluzione in una miriade di “goccioline cariche”, contenenti il campione Quando il solvente evapora, la concentrazione di carica alla superficie della gocciolina aumenta fino a superare la tensione superficiale causando una “esplosione coulombica”. Si formano così ioni dell’analita privi di solvente. +3 +--++ ++ - ++- +- -++ - +-+ + Evaporazione --+ + -++-++---+++ +++-- +4 “Esplosione coulombica” Le cariche sono statisticamente distribuite tra i siti disponibili dell’analita, portando spesso alla formazione di ioni a cariche multiple. +5 +6 Determinazione della massa molecolare con ESI m1 = M+nX n n= m2 = M + (n - 1) X (n - 1) m2 - X m2 - m1 M = n (m1 – X) m1 e m2 (m/Z) delle specie ioniche che si formano M Peso molecolare dell’analita n Numero di cariche X Carica Spettro ESI della Neurotensina Spettro di massa “deconvoluto” ESI ElectroSpray Ionisation Ioni a carica multipla diminuisce m/z L’analisi viene solitamente fatta con spettrometri a quadrupolo o trappola ionica ESI si adatta all’interfacciamento con HPLC e CE (Capillary Electrophoresis). Sensibilita’ ed Estensione di Dimensioni Molecolari un po’ minori rispetto alla tecnica MALDI. ESI (LC-MS) Separazione e analisi di una proteina dopo proteolisi, tramite abbinamento di HPLC a fase inversa e spettrometria di massa Quadrupole Mass Analyzers Sono piu’ piccoli, piu’ leggeri e meno costosi dei sistemi a settore. Di solito pero’ hanno una risoluzione minore (≈ 2000) e possono rilevare m/z solo fino a ≈ 4000. Tensioni continue Radiofrequenza + + + + + + + Provocano un moto complicato degli ioni + + Solo alcune traiettorie sono stabili permettendo agli ioni di massa specifica di essere trasmessi al detector ION TRAP Analizzatore a trappola ionica Elettrodi superiore ed inferiore Elettrodo ad anello + + + + + + + Gli ioni vengono delimitati e mantenuti in moto costante nello spazio definito dagli elettrodi Detector Elettrodi superiore ed inferiore Elettrodo ad anello Gli ioni descrivono particolari orbite (figure di Lisajous) Variando le condizioni del campo elettrico si permette a ioni di massa progressivamente maggiore di essere espulsi in successione dalla trappola SORGENTE ESI Sample should not contain: • Salts (such as NaCl, K2HPO4, etc.) decrease electrospray signal, form adducts complicating spectra • Buffers (TRIS, MES, MOPS) same reason as salts • Reducing agents (BME, DTT) • Stabilizers (glycerol, PEG) overwhelm spectra, difficult to rinse • Detergents includes ionic (SDS) and non-ionic (Triton X-100) avoid during sample preparation, difficult to get rid of decrease electrospray signal Vantaggi: ELECTROSPRAY 9 Buono per composti carichi, polari o basici. 9 Massima accuratezza nelle misure 9 Permette l’analisi di composti ad elevata massa con rapporti massa/carica che sono facilmente determinati mediante la maggior parte degli spettrometri di massa (m/z minore di 2000 - 3000). 9 Possibilità di “controllare” eventuali processi di frammentazione. 9 Compatibile con tecniche MS/MS e LC/MS. Limiti: 9 Specie a carica multipla richiedono algoritmi complessi per l’analisi dei dati 9 Estremamente sensibile alla presenza di contaminanti (sali, metalli, composti basici,…..). 9 Hardware relativamente complesso in confronto ad altre sorgenti ioniche. 9 Range di massa: generalmente minore di 200,000 Da Spettrometro di massa a triplo quadrupolo ANALISI MS/MS: Determinazione della sequenza amminoacidica mediante CID (Collision Induced Dissociation) • I peptidi vengono preferenzialmente frammentati a livello dei legami peptidici • Il processo di frammentazione è solitamente una reazione unimolecolare • La rottura del legame peptidico è mediata dalla protonazione • Il processo di frammentazione inizia solitamente con un attacco nucleofilo a centri elettrofili • Le interazioni che determinano la formazione di anelli a 5 componenti sono favorite Formazione di ioni “b” e “y” Ioni Y: dal C all’N terminale NH2 R1 O C H C b1ion Y ion 3 R2 N H C H b ion 2 Y ion 2 R3 O C N H C H Y ion 1 R4 O O C b ion 3 Ioni b: dall’N al C terminale N H C H C OH FORMAZIONE DEGLI IONI “Y” H H Protonazione dell’N ammidico Protonazione dell’O carbonilico Trasferimento H+ oxazolone ione “Y” FORMAZIONE DEGLI IONI “b” Protonazione dell’N ammidico Protonazione dell’O carbonilico Ioni “b” Ione acylium + Peptide “N-terminale Oxazolone protonato Formazione di ioni “a” e ioni immonio R1 NH NH2 O R1 O O + NH NH2 R3 ¨ NH C O + R2 R3 N H R2 O O R1 O protonated oxazolone NH NH2 b type ion O R3 ¨ NH C + O R2 acylium ion R1 H O N NH2 H + R2 R3 N NH2 N ¨ O R1 R3 + O H R2 + ¨ NH2 O b type ion a type ion H+ transfer + CO R1 ¨ R3 N NH2 R2 O O + + NH3 immonium ion Frammentazione di peptidi mediante CID • Sono sempre prevalenti ioni della serie “y” e “b” • Gli ioni b possono “perdere” CO (-28 Da), formando ioni “a” • Residui di Cys, Ser, Thr, Glu possono perdere H2O (-18 Da) • Residui di Gln, Asn, Lys, Arg possono perdere NH3 (-17 Da) • A bassi intervalli di m/z si possono osservare ioni immonio formatisi da singoli amminoacidi liberati • La Met, se ossidata, può perdere CH3SOH (-64 Da) • Residui di fosfo-Ser e fosfo-Thr possono perdere PO4H3 (-98 Da) • La rottura di legami Pro-Xxx è impedita • In condizioni particolari si possono produrre serie interne di ioni aggiuntive. La rottura di alcuni legami può essere favorita rispetto ad altri Perché è così difficile interpretare gli spettri MS/MS? - I frammenti b e y si presentano contemporaneamente sullo spettro e non sappiamo riconoscere a priori se un frammento appartiene alla serie b o alla serie y - Le serie b e y possono presentarsi incomplete - Il peptide può contenere modificazioni inattese, che alterano la massa degli amminoacidi e quindi dei frammenti - I frammenti b e y, pur essendo generati in proporzione predominante, non sono gli unici frammenti che vengono generati dagli eventi di collisione - La misura delle masse relative ai vari frammenti è affetta da errore sperimentale - Un “rumore di fondo” non interpretabile viene generato in ogni analisi sperimentale Sequenziamento de novo di un peptide y020 2 + 1076.3 100 y”182+ y”17 y”15 y”14 y”13 y”12 y”11 y”10 y”9 y”8 y”7 y”6 y”5 y”4 y”3 (Y,D)-T-A-A-S-K-L-E-E-A-S-K-A-A-D-E-S-E-R b8 b9 b10 b11 b12 b13 b14 b15 b16 b17 b18 b19 y’’192+ 1004.0 Relative abundance y’’9+ 992.0 b9+ y’’15+ 979.0 50 b172+ + y’’182+ y’’10 947.0 1108..0 1063.2 + y’’ 0 + 4 y 4 520.0 502.0 y’’152+ 850.0 825.0 390.9 1562.0 b16+ 1651.5 1394.0 1179.0 905.0 y’’14+ 1434.4 b13+ b11+ y’’8+ b14+ y’’12+ + y’’6+ y’’7 777.2 y’’3+ y’’13+ y’’11+ 1192.0 890.2 b8+ 1649.4 b10+ 1465.0 y’’17+ b15+ 1321.47 706.0 b17+ 1536.0 y’’5+ b12+ 635.0 1266.2 b19+ 1996.0 1791.0 1779.8 b18+ 1867.0 0 400 600 800 1000 m/z 1200 1400 1600 1800 2000 Post-Source-Decay (PSD) per analisi di sequenza di peptidi • Il peptide è analizzato in reflectron mode • Il peptide è analizzato per più di 10-15 volte, ogni volta riducendo il “reflectron voltage” del 5-10% Il PSD avviene nel tubo di volo: Laser sorgente Il decadimento può avvenire in qualsiasi punto dell’analizzatore Reflector detector Reflector Linear detector Grafico dell’Energia Interna degli ioni precursore N° ioni Energia Interna Solo una piccola frazione degli ioni precursore ha abbastanza energia per frammentarsi! FONDAMENTI DEL PSD 1. PSD è un metodo per identificare e misurare le masse degli ioni frammento che si formano da uno ione precursore selezionato durante il tempo di volo 2. Gli ioni frammento si formano principalmente per decomposizione unimolecolare degli ioni precursore, già accelerati all’interno dell’analizzatore (ovvero dopo l’uscita dalla sorgente ⇒ “post source decay”) 3. Gli ioni frammento sono separati nel REFLECTOR Inconvenienti del PSD • Frammentazione poco efficiente dello ione precursore • Gli spettri completi sono di difficile interpretazione • La selezione dello ione precursore può essere fatta solo su “picchi isolati” • I tempi di acquisizione sono lunghi in quanto per ottenere lo spettro completo è necessario modificare via via il voltaggio del Reflector; in linea teorica, per lo stesso motivo, cambiano anche i parametri di calibrazione Il PSD è un metodo valido per il controllo di una sequenza conosciuta