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Debora Pensi

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Development and validation of an UPLC-MS/MS
method for Sildenafil and N-desmethysildenafil
plasma determination and quantification
Debora Pensi, Marco Simiele, Daniela Pasero, Francesca Ivaldi, Mauro
Rinaldi, Giovanni Di Perri, Vito Marco Ranieri, Antonio D'Avolio
Università degli Studi di Torino / ASL TO2
Dipartimento di Scienze Mediche, Malattie Infettive Laboratorio di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica
Padiglione Q, Ospedale Amedeo di Savoia, C.so Svizzera 164 10149 TORINO (Italy)
Web Site: www.tdm-torino.org e-mail: [email protected]
UNI EN ISO 9001:2008 CERTIFIED LABORATORY
Sildenafil
1986 : sintetizzato dalla Pfizer in Inghilterra come inibitore della
fosfodiesterasi 5 (PDE5)
1996 : viagra brevettato dalla Pfizer
1998 : approvato dall’FDA per la cura della disfunzione erettile
2005 : approvato da FDA e EMA per il trattamento ipertensione
polmonare arteriosa di classe II e III
2013 : termine del brevetto della Pfizer possibile commercializzazione
di farmaci generici contenenti il sildenafil
Sildenafil
N-desmetilsildenafil
ha il 50% della potenza del
sildenafil
Sildenafil e N-desmetilsildenafil
sono inibitori selettivi delle fosfodiesterasi
inibisce
Non inibisce
PDE 1
PDE 2
PDE 7
PDE 8
PDE 9
PDE 3
PDE 5
PDE 5 A1
875 aa
PDE 6
PDE 5 A2
833 aa
vescica, colon, prostata, corpo
cavernoso, piccolo intestino,
stomaco, condrociti, muscolatura
liscia dei vasi
Meccanismo d’azione del sildenafil
NO
Guanilato
ciclasi
5’-GMP
PDE
cGMP
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
4
Farmacodinamica
Muscolo vascolare liscio
 riduzione transitoria della
pressione sanguigna sistemica
Piastrine
 azione antitrombotica
 aumento rischio emorragico
Intestino
 riduzione traffico intestinale
 reflusso gastrico
 rilassamento sfintere gastro-esofageo
Corpo cavernoso
 solo in seguito a stimolo sessuale
 rilascio di Ach  NO  ↑[cGMP]
Vescica, Colon, Prostata, Placenta
Retina (PDE-6)
 incapacità temporanea di
distinguere blu-verde
5
Farmacocinetica
Assorbimento
 somministrazione orale a digiuno
 a livello del tratto gastrointestinale
 30-120 min raggiungimento Cmax
TEMPO INFUSIONE = 15 min
C max = 15 min
T max = 15 min
Infusione
endovena
Distribuzione
Metabolismo
Eliminazione
 volume di distribuzione SIL circa 105 L
 SIL e N-desmetil legati a proteine del plasma
 legano sostanza nera, pelle, retina




SIL metabolizzato a livello epatico a N-desmetil
metabolita secondario UK150,564
CYP3A4 e CYP2C9
anche l’N-desmetil viene metabolizzato
 eliminato principalmente nelle feci
 eliminazione in misura minore nelle urine
 tasso di eliminazione è 41L/h
6
Farmaci che possono interferire sulla farmacocinetica del sildenafil
Bosentan
Induttore del CYP3A4, co-somministrazione aumenta metabolismo sildenafil
Cimetidina
Inibitore CYP3A4, co-somministrazione induce aumento del 56% delle
concentrazioni plasmatiche di sildenafil
Eritromicina
Inibitore CYP3A4, co-somministrazione induce aumento del 182% delle
concentrazioni plasmatiche di sildenafil
Indinavir
Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil
Ritonavir
Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil
Saquinavir
Antiretrovitrale, co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil
Beta-bloccanti
Succo di pompelmo
Co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil
Co-somministrazione aumenta concentrazione plasmatica sildenafil
7
PAH:
ipertensione polmonare arteriosa
 Malattia rara (2/1000000 abitanti)
 Associata a malattie del connettivo, del fegato, HIV,
cardiopatie congenite, trombo-embolia polmonare
 Aumento pressione polmonare
 Malattie del sistema vascolare (casi gravi)
Stanchezza
Sensazione di affanno
Ritenzione liquidi
Il cuore destro si dilata e non risulta
più in grado di pompare sangue nel
circolo polmonare
Vita quotidiana compromessa
2013 termine del brevetto della
Pfizer
farmaci generici contenenti il
sildenafil
Indagini antidoping
Assenza di metodi QUANTITATIVI dedicati
Studio clinico 2013
(ancora in corso) presso La
Città della Salute (presidio
Molinette) di Torino
Trattamento sildenafil di pazienti sottoposti
a chirurgia cardiaca per :PATOLOGIA DELLA
VALVOLA MITRALE PRESENTANTI
IPERTENSIONE POLMONARE SEVERA
Scopo del lavoro
Messa a punto e validazione di un
metodo bioanalitico per la
quantificazione plasmatica (con
finalità cliniche) di sildenafil e Ndesmetilsildenafil
adattabile alla pratica clinica
rapido e preciso
sensibile e specifico
UPLC vs HPLC
Velocità delle analisi aumentata di 2-3 volte rispetto all’HPLC
Riduzione lunghezza colonna
Riduzione dimensioni particelle
Aumento delle pressioni da 6000 psi a 15000 psi
Fasi stazionarie con particelle < a 2µm
15000 psi
Efficienza separativa e
alta risoluzione
Sensibilità e
produttività
Controlli di Qualità e Curva di Calibrazione
Concentrazioni uguali per sildenafil e N-desmetilsildenafil
QC H
QC M
QC L
750 ng/mL
100 ng/mL
10 ng/mL
Cal 9
Cal 1
1000 ng/mL
3,9 ng/mL
Pensi et al.,2014 Submited
Cromatogramma di un mix chimico
(sildenafil, N-desmetilsildenafil e quinaxolina alla concentrazione di 10µg/mL)
6,06
min
Run Time
10 minuti
5,11
min
5,06
min
Pensi et al.,2014 Submited
Validazione del metodo secondo linee guida FDA (2013)
PRECISIONE
Misura la distanza tra i vari valori misurati,
espressa in CV%
ACCURATEZZA
Misura la distanza dei valori
misurati dal valore vero
STABILITA’
Calibratori, controlli di qualità, campioni devono
essere stabili fino al momento delle analisi
SPECIFICITA’
Capacità di riconoscere l’analita d’interesse senza
interferenze da parte di altri farmaci
LLOD
Limite minimo di rilevazione (3 volte rumore di fondo)
LLOQ
Limite minimo di quantificazione (RSD<20%; 5 volte rumore di fondo)
ULOQ
Limite massimo di quantificazione
Recupero
Effetto matrice
Efficienza della procedura estrattiva
Rumore di fondo causato da analiti che
competono con l’analita d’interesse
sildenafil
Risultati della
sildenafil
PRECISIONE
QC H
QC M
QC L
1,2µg/mL
FDA
160 ng/mL
16 %
ng/mL
CV
< 15%
LLOQ
PLASMA BIANCO
RICOSTITUITO
validazione
MIX CHIMICO
RISULTATI
QC M
5 prove intra-day :(8,26-2,58%) e 5 inter-day(1,02-3,25%)
ACCURATEZZA
< 15%
-7,16% - 9,01%
Curva di
calibrazione
deviazione % dalla conc nominale
<15%, per Cal 1 <20%;
Coefficiente di regressione >0,995
STABILITA’
_
SPECIFICITA’
No interferenze
LLOQ
RSD%<20% ; almeno 5
volte rumore di fondo
3,9 ng/mL (= CAL1)
LLOD
almeno 3 volte rumore
di fondo
1,95 ng/mL (diluizione 1:1 CAL 1)
RECUPERO
Costante per ogni
campione (>70%)
Effetto Matrice
Assente (<20%)
LLOD
r2 = 0,995-0,999
Deviazione % dalla concentrazione nominale <15%, per tutti
i calibratori
Vos et al., 2008 : stabili per 6 mesi a -20°C
6 campioni di plasma bianco, senza interferenze
Recupero medio per sildenafil 83,2%
Recupero medio per N-desmetilsildenafil 84,5%
6 campioni di plasma bianco ricostituiti, deviazione
percentuale 3-4 % effetto matrice <15%
Pensi et al.,2014 Submited
Applicazione del metodo
20 pazienti dell’ospedale La Città della Salute presidio Molinette
(studio clinico di Fase III)
 somministrati 10 mg di sildenafil per via endovenosa
(ogni 8 h per un massimo di 72h)
Prelievi ematici
T0
T1
T2
T3
T4
-15 min (Ctrough)
20 min (Cmax)
1h
4h
8h
1° infusione
steady state
I valori delle concentrazioni plasmatiche dei
Tutti i campioni dei pazienti sono stati analizzati in doppio
pazienti rientrano nei range di curva
Pensi et al.,2014 Submited
Parametri farmacocinetici allo steady-state dei pazienti analizzati
Cmin
Concentrazione più bassa di farmaco nel plasma
tra una somministrazione e l’altra
Cmax
Concentrazione più alta di farmaco nel plasma
tra una somministrazione e l’altra
AUC
Area sottesa alla curva nella concentrazione
plasmatica nel tempo
emivita
(t1/2) tempo di dimezzamento necessario
affinchè la concentrazione plasmatica di
farmaco si dimezzi
Volume
distribuzione
Valore correlato alla concentrazione
plasmatica rispetto alla
concentrazione totale di farmaco
sildenafil
N-desmetil
38.0 ng/mL
[31.7-93,0]
52,50 ng/mL
[38,75-85,75]
328,50 ng/mL
[177,0-475,2]
74.0 ng/mL
[55,7-101,5]
655,7 h*ng/mL
[535,9-1249,9]
493,5 h*ng/mL
[352,83-717,8]
5,1 h
[4,0-5,5]
15.4 h
[14,7-15,7]
75,2 L
[57-128]
403,3L
[385-615]
Pensi et al.,2014 Submited
Conclusioni
 primo metodo sviluppato su sistema UPLC-MS/MS
 seguite le norme UNI EN ISO 9001: 2008 (progettazione e
sviluppo metodi)
 validazione del metodo seguendo le linee guida FDA 2013
 separazione efficace del sildenafil da N-desmetilsidenafil
(metodo molto specifico)
 alta sensibilità (nonostante il piccolo volume di plasma)
 assenza di effetto matrice e buon recupero
 rapidità e affidabilità: analisi adatta alla pratica clinica
Conclusioni
tutte queste caratteristiche rendono
questo metodo utilizzabile nella
routine di laboratorio e, in base alle
necessità dei clinici, per un futuro
TDM plasmatico del sildenafil
Sviluppi futuri di questo lavoro
Ricerca dei polimorfismi genetici che correlino con le concentrazioni
plasmatiche degli analiti in oggetto:
 per prevedere a priori le concentrazioni del sildenafil e del suo
metabolita
 per spiegare le eventuali differenze inter-paziente
 applicazione di tale metodo anche ad indagini anti-doping
Grazie per l’attenzione
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