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Ottenere delle fasi mediante atomi pesanti: M.I.R.
(Multiple Isomorphous Replacement)
Natomi
F(h,k,l) =
∫ ρ(x, y,z)exp[−2πi(hx + ky + lz)]dV = ∑ f
cell
j
[
exp −2πi(hx j + ky j + lz j )
j =1
]
Proprietà
strutturale
(posizione)
Fattore di scattering
atomico (atomo)
€
+
cristallo “derivato”
cristallo
“nativo”
atomi pesanti
I esp. di diffrazione
|FP|
II esp. di diffrazione
H
|FPH|
1
FPH = FP + FH
€
FPH (h) = FP (h) + FH (h)
∀ (h,k,l) ≡ h
€
|FH|
|FPH|
€
|FP|
αH
αP
αP
|FP|
αPH
Se troviamo la posizione degli atomi pesanti nella cella elementare abbiamo:
|FH|, αH (calcolati dalla posizione dell'atomo pesante)
|FP|, |FPH| misurati con 2 esperimenti di diffrazione (I ∝ |F|2)
2
Consideriamo il cerchio di raggio |FPH| centrato in
-FH le 2 intersezioni con il il cerchio di raggio |FP|,
danno 2 valori di fase possibile: αp1 e αp2
∀ (h,k,l) ≡ h
€
conosciamo solamente i moduli |FP|, |FPH|
li rappresentiamo come cerchi nel piano complesso
FP = −FH + FPH
i
i
€
FH
|FPH |
|FP |
r
FP
αp2
FP
αp1
r
-FH
|FPH |
2 soluzioni per la fase di FP: ambiguità di fase per ogni fattore di struttura FP(h)
3
Soluzione dell’ambiguità di fase
Esperimento con un altro atomo pesante |FPH2|:
FH2
|FP |
|FPH2|
FP = −FH1 + FPH1
FP = −FH 2 + FPH 2
€
€
|FPH2|
FP
-FH2
FP
αp!
-FH1
|FPH1|
Multiple Isomorphous Replacement (MIR)
con 3 esperimenti di diffrazione (1 nativo, 2 atomi pesanti) si ricavano le fasi αP
4
Rappresentazione algebrica
FPH = FP + FH
FPH e ia PH = FP e ia P + FH e ia H
2
*
2
2
FPH = ( FP + FH )( FP + FH ) = FP + FH + FP FH (e i(α P −α H ) + e− i(α P −α H ) )
€
€
2
2
F
− FP − FH
cos(α P − α H ) = PH
2 FP FH
€
noto dalle pos.
degli atomi pesanti
€
2
= AH
Ambiguità di fase
Soluzione dell’ambiguità di fase: 2 eq. in 2 inc.
(α P − α H )1
cos(α P − α H 1 ) = AH 1
(α P − α H )2
cos(α P − α H 2 ) = AH 2
€
€
5
Come trovare αH ⇔ posizione degli atomi pesanti ?
N atomi pesanti
FH (h,k,l) =
∫ρ
H
(x, y,z)exp[ −2πi(hx + ky + lz)] dV =
∑f
cell
Hj
j =1
posizione degli atomi pesanti
€
da dimostrare
Δ F iso ≡ FPH − FP ∝ FH
Δ F iso sin β = FH sin γ = -----
Δ F iso
sin γ
= FH
sin β
FPH
ΔF
α = α P − α PH €
δ = α PH − α H
β
iso
FH
FP
€
€ triangolo isoscele: γ e β in funzione di α e δ
€
'
π
'
π −α
β
=
,
'2 β + α = π
,β =
(
⇒(
2 ⇒(
)γ + δ = β
,
,γ = π
γ
=
β
−
δ
)
)
€
]
fattore di struttura
x H ↔ FH = FH e iα H
differenze isomorfe
€
€
[
exp −2πi(hx j + ky j + lz j )
FPH
α
−α
2
−α
−δ
2
γ
δ
δ
FH
αH
€
r
6
Δ F iso = FH
sin γ
sin β
(
π −α
*γ = 2 − δ
) €
*β = π − α
+
2
€
Δ F iso = FH
€
'π α
*
'α
*
sin) − − δ ,
cos) + δ ,
'
*
'α *
(2 2
+
(2
+
= FH
= FH ) cosδ − tan) , sin δ ,
'π α *
'α *
(2+
(
+
sin) − ,
cos) ,
(2 2+
(2+
$α
'
α
α
cos& + δ ) = cos cos δ − sin sin δ
%2
(
2
2
%α = α P − α PH
&
'δ = α PH − α H
€
€
+
.
%1
(
Δ F iso = FH -cos(α PH − α H ) − tan' (α P − α PH )* sin(α PH − α H )0
&2
)
,
/
7
€
+
.
%1
(
Δ F iso = FH -cos(α PH − α H ) − tan' (α P − α PH )* sin(α PH − α H )0
&2
)
,
/
€
Il modulo del fattore di struttura dell’atomo
pesante e’ piccolo rispetto a quello della proteina
⇔ la perturbazione indotta nel cristallo dall’atomo
pesante e’ piccola rispetto al contributo
complessivo della proteina
α P ≈ α PH
≈0
FPH − FP = Δ F iso ≈ FH cos(α PH − α H )
(Δ F )
2
iso
2
≈ FH cos 2 (α PH − α H ) =
1
FH
2
2
+
1
2
FH cos2(α PH − α H )
2
€
“RUMORE”
€ cos2α = cos2 α − sin 2 α = 2cos2 α −1 ⇒ cos 2 α = 1+ cos2α
2
€
(Δ F
€
iso
)
2
≈
1
FH
2
2
α PH ,α H
indipendenti!
+ rumore
8
fun. di Patterson delle diff. isomorfe = fun. di Patterson dei soli atomi pesanti!
⇒ posizioni degli atomi pesanti
P(u,v,w) =
1
V
=
+∞
1
V
+∞
∑ F(h,k,l)
2
exp( −2πi( hu + kv + lw )) =
h,k,l =−∞
2
∑ F(h,k,l) exp(−2πi(hu + kv + lw)) +
h,k,l =0
1
V
+∞
∑ ( F(h,k,l)
2
1
V
0
∑ F(h,k,l)
2
exp( −2πi( hu + kv + lw )) =
h,k,l =−∞
2
exp( −2πi( hu + kv + lw )) + F(−h,−k,−l) exp(2πi( hu + kv + lw ))) =
h,k,l =0
ρ(x) = ρ (x)* ⇒ F(h) = F * (−h) ⇒ F(h) = F(−h)
€
La funzione di Patterson è centrosimmetrica
1 +∞
1 +∞
2
2
= ∑ F(h,k,l) 2cos(2π (hu + kv + lw )) =
F(h,k,l) cos(2π (hu + kv + lw ))
∑
V
V h,k,l =−∞
€ h,k,l =0
P iso (u) =
€
2
1
1
Δ Fh iso cos(2πh⋅ u) = ∑ FPH − FP
∑
V h
V h
(
)
(
)
2
cos(2πh⋅ u) ≈
2
1 1
1
≈ ∑ FH cos(2πh⋅ u) + rumore ≈ P H (u)
V h 2
2
9
€
La mappa di Patterson è centrosimmetrica (invariante per inversione
rispetto all’origine): 2 set di posizioni di atomi pesanti ottenute per
inversione rispetto all’origine
… 2 set di fasi …
… che producono 2 mappe di densità elettronica enantiomorfe
controllo della chiralità della mappa e degli degli amminoacidi inseriti nella mappa e
degli elementi di struttura secondaria per risolvere l’ambiguita’ di fase
10
Riassunto MIR:
3 esp. di diffrazione:
FP , FPH1 , FPH 2
n
&Δ F
i
≡
F
−
F
⇒
x
{
}
(
PH1
P
H1
iso1
i=1
'
m
i
(
Δ
F
≡
F
−
F
⇒
x
{
}
PH
2
P
H
2
)
iso2
Patterson delle diff. isomorfe:
€
i=1
posizione degli atomi pesanti
€
2
cos(α P − α H1,2 ) =
2
FPH1,2 − FP − FH1,2
2 FP FH1,2
α H1,α H 2
2
fasi degli atomi pesanti
€
fasi:
€
€
αP
11
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