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Club Territorio | Touring Club Italiano

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Il segno della trasformata di Fourier
sˆ − sˆ0
sˆ0
2θ"
α1"
sˆ sˆ − sˆ0 = 2sin ϑ
α2"

r
€
sˆ0
sˆ
2θ"
€

Δ = r(sin α1 + sin α 2 ) = −r ⋅ ( sˆ − sˆ0 )
2π
2π 
 
Δ=−
r ⋅ ( sˆ − sˆ0 ) = −2πr ⋅ S
λ
λ
 
r ⋅ S = (hx + ky + lz)
€
€
F(h,k,l)
=
∫ ρ(x, y,z)exp[−2πi(hx + ky + lz)]dV
cell
€
1
Il problema della fase
misura sperimentale
F(h,k,l) =
I ∝ F (h,k,l)
∫ ρ(x, y,z)exp[−2πi(hx€+ ky + lz)]dV
cell
2
ρ(x, y,z) =
F.T.
I(€
h,k,l) ∝ F ( h,k,l)
€
1
∑ F(h,k,l)exp[2πi(hx + ky + lz)]
V h,k,l
2
€Il fattore di struttura e’ un numero complesso
F = F'+iF''= F(h,k,l) e iα (h,k,l )
1
ρ(x, y,z) =€ ∑ F(h,k,l) e iα (h,k,l ) exp[2πi(hx + ky + lz)]
V h,k,l
La fase non e’ misurabile direttamente
€
2

F( S )
ρ(x, y,z)
€

F( S )
ρ(x, y,z)
€
€
1
ρ(x, y,z) = ∑ F(h,k,l) duck e iα (h,k,l )cat exp[ −2πi(hx + ky + lz)]
V h,k,l
€
€
ρ(x, y,z) =
€
1
F(h,k,l) duck e iα (h,k,l )cat exp[ −2πi(hx + ky + lz)]
∑
V h,k,l
the phases contain the bulk of the structural information.
3
Soluzione del problema della fase
- Molecular Replacement (MR)
-  Atomi pesanti: Se, Fe, Hg, Pt, Sm, …
-  Metodi diretti (…)
MIR
Multiple Isomorphous Replacement (IR)
S/MIRAS
Single/Multiple IR with Anomalous Signal
MAD
Multiple Anomalous Dispersion
4
Molecular Replacement
Prerequisito:
modello atomico da cui possono essere calcolate
delle fasi approssimate per la proteina di cui si vuole
risolvere la struttura
proteina omologa
proteina!
modello!
proteina!
l’omologia strutturale e’ correlata col livello di identità in sequenza
(MR se > 25-30% identità di amminoacidi)
- stessa proteina
in una diversa forma cristallina
modello!
mutante!
- stessa proteina in forma ‘nativa’
(studi di mutanti o complessi)
modello!
complesso!
- parte di una proteina
multidominio
I!
modello!
II!
III!
5
Molecular Replacement
- orientare il modello nella cella elementare del cristallo così come è orientata la
proteina (ricerca di 3 parametri rotazionali). Si utilizza la funzione di Patterson
P(u) = P(u,v,w) ≡
€
2
1
Fh exp( −2πih⋅ u) =
∑
V h
3
∫ ρ(r)ρ(r + u)d r
cella
- posizionare il modello correttamente orientato nella posizione in cui si trova la
proteina nella cella elementare del cristallo (ricerca di 3 parametri traslazionali)
€
∑ F (obs) − k F (calc)
R=
∑ F (obs)
h
h
h
h
h
6
Quante sono le molecole nell’unità asimmetrica?
Numero di Matthews
(densita’):
VM ≡
%
( Å3
Vcella
∈ '1.7, 3.5 *
) Da
Z cella × Mw &
€
Esempio: gruppo spaziale C2
3
V = 319 ⋅ 10 Å
VM ≈ 2.15
€
4 unità asimmetriche nella cella elementare
$
Å3
z
=
1
,
2
.
48
!
!
Da
VM = #
3
! z = 2, 1.24 Å
!"
Da
3
Mw = 32.1 ⋅ 103 Da
Å3
Da
Z = 4z
z = numero di proteine
nell’unita asimmetrica
(incognita)
% di solvente nella cella elementare ?
Volume specifico medio di una proteina
ρ = 0.74
cm 3
10 24
Å3
= 0.74
=
1
.
23
gr
6 ⋅ 10 23
Da
$
&1 cm = 10 8 Å
%
&1 gr = 1 Da × N = 1 Da × 6⋅ 10 23
'
A
volume della cella elementare
€
VC = VP + VS = MwZρ + VS
volume proteina
%VS =
VS VC − VP
ZMwρ
1.23
=
=1−
=1−
VC
VC
VC
VM
volume solvente
&
#
%VS ∈ $28%, 65% !
%
"
%VS ≈ 43%
8
Funzione di Patterson
P(u) = P(u,v,w) =
2
1
Fh exp( −2πih⋅ u) = ∫ ρ (r ) ρ (r + u)d 3 r
∑
V h
V
∫ d rρ(r) exp(2πih⋅ r )
F€ = ∫ d rρ(r) exp( −2πih⋅ r )
3
Fh =
*
V
ρ(r) = ρ * (r) ∈ ℜ
3
h
V
€
P(u) =
€
1
€drdr "ρ (r)ρ(r ")exp(2πih ⋅ (r " − r))exp(−2πih ⋅ u) =
∑
∫
∫
V h V V
1
= ∑ ∫ ∫ drdr "ρ(r)ρ (r ")exp(−2πih ⋅ (u − r " + r)) =
V h V V
€
=
∫ drρ(r)ρ(r + u)
V
r" = r + u
€
La funzione di Patterson e’ diversa da€0 quando u e’ un vettore
€ che congiunge 2 atomi
9
Esempio di funzione di Patterson
P(u) =
Spazio Patterson:
∫ drρ(r)ρ(r + u)
N 2 − N = N ( N − 1) picchi
prot. di 200 aa. ~ 2000 atomi ~ 4×106 picchi
V
spazio patterson: 6 picchi
Spazio reale: 3 atomi
€
3
2
3
2
3
2
3,2
2,1
2,3
1
1
3
2
3
2
1
2
2
1
3
∫ d uP
inter-molecolari
intra-molecolari
1
esp
I ∝ z2
(u)PRmod (uR )
U
volume di integrazione U
€
1,2
3
Ricerca rotazionale: convoluzione di 2 funzioni di Patterson
R(α, β , γ ) =
1,3
3,1
1
3
1
3
2
1
3
2
1
(Atomi pesanti)
10
Ricerca rotazionale
Angoli polari
Angoli di Eulero
Funzione di sovrapposizione delle funzioni di Patterson sperimentale e del modello
x R = Cˆ x
€
R(α, β, γ ) =
€
Cˆ T = Cˆ −1
∫ d uP
3
esp
C=operatore di rotazione
(u)PRmod (uR ) =
U
=
1
V2
€
∫ d u∑ F
3
h
U
2
1
V2
∫ d u∑ F
3
2
h
U
( (
))
2
Fh' exp −2πi h⋅ u + h' Cˆ u =
h, h'
( (
) )
2
Fh' exp −2πi h + Cˆ −1h' ⋅ u
h, h'
H ≡ h + Cˆ −1h'
€
∫ d u exp(−2πiH⋅ u)
3
11
U
€
€
∫ d u exp(−2πiH⋅ u) = ∫ dudϕ sinϕdϑu
3
2
exp( −2πiHucos ϕ) =
U
= −2π
u ∈ [0,U ]
€
ϕ ∈ [0, π )
zˆ = H
€
ϕ
€
xˆ
ϑ
u
∫ dud(cosϕ )u
= 2π
∫ duu
2
ϑ ∈ [0,2π )€
=
€
yˆ
€
€
€
€
2
H
2
exp(−2πiHucosϕ ) =
1
2isin(2πHu) =
2πiHu
∫ duu sin(2πHu)
2πHu ≡ x
2πHU ≡ X
2
2
(2πH ) H
∫ dxx sin( x )
Integrazione per parti
X
∫ dxx sin( x ) = −x cos x
0
€
X
0
X
+
€
∫ dx cos( x ) = (−x cos x + sin x )
0
X
0
= sin X − X cos X
12
2
∫ d u exp(−2πiH⋅ u) = (2πH ) H [sin(2πHU ) − 2πHU cos(2πHU )] = F(H)
3
2
U
F(H) è massima quando H=0 e va a 0 quando H si allontana da 0
€
F(H) seleziona valori di H vicini a 0!
R(α, β , γ ) =
3
∫ d uP(u)P (u
R
U
H ≡ h + Cˆ −1h'
€
R
)=
2
1
2
F Fh' F(H)
2 ∑ h
V h, h'
h ≈ −Cˆ −1h'
F(H) limita la doppia sommatoria!
€
13
%
sin x − x cos x (
x sin x
3
lim F(H) = lim' 4 πU 3
=
* = 4 πU lim
3
H →0
x →0&
x
→0
)
x
3x 2
€
sin x + x cos x
cos x + cos x − x sin x 4 πU 3
3
= 4 πU lim
= 4 πU lim
=
x →0
x →0
6x
6
3
3
€
lim F(H) = 0
H →±∞
€
14
Ricerca traslazionale:
Minimizzazione di R:
Massimizzazione del coefficiente
di correlazione C:
∑ F (obs) − k F (calc)
R=
∑ F (obs)
h
h
h
h
h
∑ F (obs)
2
− Fh (obs)
h
C=
€
2
∑ F (cal)
k
h
2
− Fk (cal)
2
k
* $
2
2'
,∑&% Fh (obs) − Fh (obs) )(
+h
2
12
22
2'
$&
)
F
(cal)
−
F
(cal)
∑% k
k
( /.
k
Significato del coefficiente di correlazione:
€
∑( x
i
−x
i
)∑ ( y
j
j
)
− y = ∑ xi y j − N y∑ xi − N x∑ yi + N 2 x y = ∑ xi y j − N 2 x y
i, j
i
i
i, j
Se x e y sono grandezze scorrelate:
=0
15
€
Sommario molecular replacement
Ricerca di una struttura da usare come modello nella banca dati pdb
Numero di Matthews: quante sono le molecole nell’unità asimmetrica (u.a.) ?
z
Funzione di self rotation: eventuale(i) asse(i) di simmetria non cristallografica (NCS)
(i.e. z=3, ci potrebbe essere 1 asse di simmetria di ordine 3 = rot. di 120°)
R(α, β , γ ) =
3
∫ d uP
esp
(u)P esp R (uR )
U
Cross rotation: ricerca dell’orientazione del modello nel cristallo: m > z picchi rotazionali
€
R(α, β , γ ) =
3
∫ d uP
esp
(u)P mod R (uR )
U
Translation: partendo da ciascuna delle m orientazioni ricerca delle
z posizioni del modello nell’u.a.
€
massimizzo: C =
∑#%$ F (obs)
h
h
2
2&
2
2&
#
− Fh (obs) (∑% Fk (cal) − Fk (cal) (
'k$
'
12
2
2* #
2
2&
2
2&
#
,∑%$ Fh (obs) − Fh (obs) (' ∑%$ Fk (cal) − Fk (cal) (' /
+h
.
k
16
SOLUZIONE
€
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