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Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis Kit

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DUPLIC α RealTime
Advanced Dual Easy
Chlamydia trachomatis Kit
h: PI EBR029032 – 32 tests
CV
0459
INTENDED USE
DUPLICaRealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis kit is a qualitative assay for the detection of Chlamydia trachomatis 16s gene
and the cryptic plasmid DNA from clinical specimens (such as urine, swab) or from lysed Roche Cobas 4800® or from BD ProbeTec ETTM samples .
PRINCIPLE OF THE TEST
DUPLICaRealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis kit is an assay for the DNA-based detection of Chlamydia trachomatis. The
reagents for the amplification are ready to use and provided in three separate tubes:
 AMPLIFICATION MIX with Hot Start Taq DNA polymerase (modified Antibody technology), nucleotides, MgCl2 and buffer.
 OLIGO MIX with primers and fluorogenic probes.
 INTERNAL CONTROL OF AMPLIFICATION verifies the success of the reaction of amplification; it is identified by a hydrolysis probe.
The Advanced Real Time PCR, patented by EuroClone, exploits the features a classic PCR reaction as well as the features of a standard Real Time
PCR. Briefly, nucleic acid amplification occurs through two phases: in the first phase target nucleic acids are pre-amplified by PCR reaction, whereas
in the second phase are further amplified and detected by a Real Time PCR reaction.
From the analytical point of view the use of this technology allows a sharp decrease of the threshold cycle (Ct) and therefore increasing the system
sensitivity as well as the data reproducibility. This features is extremely useful in case of clinical samples that for several reasons (e.g. the nature of
the specimens or of the target or the efficiency of the purification system) have a low amount of target DNA and/or an high amount of interfering
substances.
Most commonly, PCR is carried out in three steps: denaturation, annealing (primers binding) and extension. These steps, which are carried out
in a thermal cycler that allows heating and cooling, represent the basic cycle of amplification; the continual repetition of a basic cycle produces
billions of fragments of the examined DNA. The denaturation of DNA which is carried out at high temperatures is followed by the annealing of
specific primers to the target DNA: the Taq enzyme polymerase recognizes the 3’-ends of these primers and polymerizes the DNA using the dNTPs,
thus creating several copies of the template. In all PCR-real time systems the amplified products are detected by using a fluorescent dye that in
fluorogenic probes is called “reporter”.
The DUPLICaRealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis kit allows the detection of bacterial DNA by using specific fluorogenic
sequence probes. The kit uses a probe dyed with a different fluoride for each investigated sequence; in particular one probe detects the allele target
that binds covalently as a fluorophore at the 5’-end the FAM molecule (6-carboxyfluorescein) while the other probe detects the internal control
(IC) bound as a fluorophore at 5’-end the HEX molecule (hexa-chloro-fluoresceine). The two probes have at their 3’-ends a quencher called BHQ-1.
REAGENTS PROVIDED
Each kit contains enough reagents to perform 32 tests and includes an internal control that must be co-amplified with any sample that identifies
any inhibitions in the amplification reaction. The kit allows to set up 4 assays, each of them include: 6 samples, 1 control and 1 reaction blank.
For Real Time PCR
Reagents
Amplification mix (400 ml)
Oligo Mix* (400 ml)
Colour Code
Blue Cap
Green Cap
Control 1 (Positive C. of amplification) (>50 ml)
Red Cap
Control 2 (Internal C. of amplification) (>50 ml)
Yellow Cap
Reaction blank (B)(50 ml)
*store the tube away from light
White Cap
STORAGE AND HANDLING
All reagents have to be stored at -22°C/-18°C. All reagents can be used until the expiration date printed on the labels. EuroClone recommends
freezing and thawing the products at most six times.
Warning: after complete thawing and before using the kit is recommended to spin all reagents and to resuspend them by pipetting
3 times.
REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
• Micropipette 1-10 ml
• Micropipette 10-100 ml
• Sterile filter tips
• Rack for 0.2 ml tubes
• Optical tubes or microplate for Real Time PCR
• Thermal cycler for Real Time PCR
PRECAUTIONS AND WARNINGS
• Do not use the reagents after the date of expiration.
• Mix the reagents of the kit before use.
• Periodically verify the calibration of micropipette and instrumentation.
• Change gloves frequently.
• Laboratory equipments (pipettes, tips etc.) should not be moved from one working area to another.
• Periodically wash the working area with hypochlorite 5%.
• Use powder-free gloves. Do not leave fingerprints on optical caps. Do not write on caps as this may cause an interference with fluorescence
detection.
OPERATING PROCEDURE
a1) DNA extraction for clinical specimens
Collect the first morning urine into a clean, sealed container with no preservative.
The specimens should be stored between +2°C and +8°C and ideally tested immediately or within 24 hours. Alternatively, the specimens should
be frozen immediately upon receipt and stored up to ten days at -20°C or colder. A single freeze thaw cycle should not affect the results.
Any commercial bacterial DNA extraction kit could be used. EuroClone recommend for Automatic extraction Duplicα®Prep Body Fluid kit ref.
EDI004200 and for Manual Extraction EDR004050 Bact Extra Pure Kit.
a2) DNA extraction for Roche cobas® 4800 samples
From previously lysed Roche cobas® 4800 samples. EuroClone recommends to use the Duplica®Prep Body Fluid kit according to the plasma
protocol (ref. EDI004200).
a3) DNA extraction for BD ProbeTecTM samples
From previously lysed BD ProbeTecTM samples, please either use the Duplica®Prep Body Fluid kit according to the plasma protocol (ref. EDI004200)
or Clone Pure CT/GC kit (ref. EDR003050).
b) Thermal Cycler set up
EuroClone recommends using Smart Cycler II (Cepheid) for DNA detection.
Refer to the specific handbook of the equipment used but be sure to set the following thermal profile.
EuroClone recommends switching on the instrument, setting the thermal profile and having the plate or tubes ready, before preparing the reaction
mix.
Thermal Profile:
Time
Temperature
5 min
95°C
15 sec
95°C
60 sec
68°C
15 sec
95°C
60 sec
54°C
N° of Cycles
1
X 10 Fluorescent Acquisition off
X 50 Fluorescent Acquisition on
c) Preparation of PCR mix
For each experiment prepare a PCR mix for the 1 control (Control 1), 1 reaction blank, n+1 samples. The reagents of PCR mix have to be added
in this ratio:
REAGENT
VOLUME (ml)
Amplification mix
10
Oligo mix
10
Control 2 (Internal C.)
1
Once the mix is ready, aliquot 21 µl of Master Mix into the tubes or microplate for PCR and then add to each tube 5 µl of extracted DNA or control
(Control 1); place the tubes inside the instrument and start the program of amplification you had set before.
Remember at the end of the program to remove the tubes from the thermal cycler.
d) ANALYSIS and INTERPRETATION of the RESULTS
The fluorescence signal registered by the instrument detects the presence of the DNA; in particular the fluorescence detected in the FAM channel
reveals the target DNA, while the fluorescence detected in the HEX channel reveals the amplification of the internal control (Control 2). Results are
interpreted by analyzing the threshold Cycle (Ct) value for each sample.
The Ct is defined as the cycle at which the amplification curve crosses the threshold line. The threshold line is calculated by the mean of fluorescence
background multiplied by three times standard deviation
during the initial cycles of PCR, prior to significant accumulation of the target amplicon. During these early PCR cycles, the background signal is
used to determine the “baseline fluorescence”.
When a signal at fluorophore FAM (Ct > 0) is detected, the sample is surely positive and the signal detected by HEX fluorophore (Ct ³ 0) is not
relevant. When no signal at fluorophore FAM (Ct = 0) is detected, to confirm a negative result, the completed amplification of internal control, and
therefore the appearance of a fluorescent signal at HEX (Ct > 0) fluorophore level, must be verified. Only in this case we can state that the sample
is definitely negative. The absence of amplification signal at level of the two FAM-HEX (Ct=0) fluorophores indicates the presence of inhibition of
the PCR. In this case EuroClone recommends to re-extract the sample.
FAM
HEX
RESULT
Ct > 0
Not relevant (Ct ≥ 0)
POSITIVE
Ct = 0
Ct > 0
NEGATIVE
Ct = 0
Ct = 0
INHIBITED
Warning:
The run is valid only if:
• The Blank is positive in the HEX channel, but negative in the FAM channel.
• The Positive Control is positive in the FAM channel.
If these two conditions have been met, the run is valid and it is possible to analyse the data. Otherwise the run is not valid.
It is responsibility of the user to validate the run by checking that these conditions have been met.
TROUBLESHOOTING
Problem 1: No signal
1. Wrong channel/filter was chosen.
2. Pipetting error due to omitted reagents or samples.
3. Inhibitory effect of the sample: genomic DNA with a insufficient purification and/or insufficient extraction
4. Check the kit was stored correctly.
5. Assess the performance of the thermal cycler
Problem 2: Fluorescence intensity too low
1. Deterioration of dyes and/or primers in the reagents due to unsuitable storage conditions.
2. Very low starting amount and/or purity of genomic DNA.
Problem 3: Fluorescence intensity varies
1. The prepared PCR master mix is not well mixed
2. Air bubbles trapped in the PCR tubes
“THE PURCHASE OF THIS PRODUCT GRANTS THE PURCHASER RIGHTS UNDER CERTAIN
ROCHE PATENTS TO USE IT SOLELY FOR PROVIDING HUMAN IN VITRO DIAGNOSTIC
SERVICES. NO GENERAL PATENT OR OTHER LICENSE OF ANY KIND OTHER THAN THIS
SPECIFIC RIGHT OF USE FROM PURCHASE IS GRANTED HEREBY”
Rev 0 EBR029032 – 01-2013
DUPLIC α RealTime
Advanced Dual Easy
Chlamydia trachomatis Kit
h: PI EBR029032 – 32 tests
CV
0459
FINALITA’ D’USO
DUPLICaRealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis kit è un test qualitativo, impiegato per la ricerca del gene 16s e del plasmide
criptico di Chlamydia trachomatis in campioni clinici (come urina e tamponi) o in lisati di Roche Cobas 4800® e BD ProbeTec ETTM.
PRINCIPIO DEL TEST
DUPLICaRealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis kit é un test molecolare basato sul riconoscimento del DNA di Chlamydia
trachomatis. I reagenti per la reazione di amplificazione sono pronti all’uso e suddivisi in tre mix di reazione:
 AMPLIFICATION MIX: contenente Hot Start Taq DNA polymerase (modified Antibody technology), nucleotidi, MgCl2 e buffer.
 OLIGO MIX contenente i primers e le sonde fluorogeniche.
 CONTROLLO INTERNO DI AMPLIFICAZIONE: permette di valutare il successo della reazione di amplificazione, ed è identificato da una
specifica sonda a idrolisi.
La nuova tecnologia Advanced Real Time PCR brevettata da EuroClone sfrutta le caratteristiche di una classica reazione di PCR e quelle della
standard Real Time PCR. Brevemente l’amplificazione degli acidi nucleici avviene attraverso due fasi: nella prima fase vengono pre-arricchiti gli acidi
nucleici bersaglio attraverso una PCR, mentre nella seconda i target vengono amplificati ulteriormente e poi rilevati grazie ad una Real Time PCR.
Da un punto di vista analitico, l’applicazione di questa tecnologia si traduce in una netta diminuzione del ciclo soglia (Ct) e quindi accresce la
sensibilità del sistema così come la riproducibilità dei dati. Questa caratteristica risulta estremamente vantaggiosa per quei campioni clinici che
per vari motivi (quali ad esempio la natura stessa del campione o del target o l’efficienza del sistema estrattivo) sono caratterizzati da una scarsa
quantità di DNA target nel campione di partenza e/o da elevata quantità di sostanze interferenti.
La polymerase chain reaction (PCR) è una reazione che permette di amplificare una sequenza target di DNA generando numerose copie di un
templato. La reazione si compone generalmente di tre fasi: denaturazione del DNA, annealing (appaiamento dei primers) ed estensione.
Queste fasi, che si realizzano attraverso riscaldamenti e raffreddamenti automatizzati mediante un termociclatore, rappresentano un ciclo di
amplificazione; la ripetizione in continuo del ciclo base porta alla produzione di miliardi di frammenti del DNA in studio. Alla denaturazione del DNA
che avviene ad alte temperature segue l’appaiamento di specifici primers al DNA target: l’enzima Taq polymerase riconosce le estremità 3’ di questi
primers ed utilizzando i nucleotidi trifosfati (dNTPs) polimerizza il DNA, creando in questo modo numerose copie del templato. In tutti i sistemi PCR
real-time la rivelazione dell’ amplificato avviene utilizzando un marcatore fluorescente che nelle sonde fluorogeniche viene chiamato “reporter”.
DUPLICaRealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis kit permette di rilevare il DNA batterico mediante l’impiego di sonde fluorogeniche
sequenza specifiche. Le sonde fluorogeniche sono costituite da una sequenza oligonucleotica che presenta all’estremità 5’ un marcatore
fluorescente chiamato «reporter », mentre all’estremità 3’ legano un secondo marcatore chiamato « quencher ». Il saggio è in grado di rilevare il
prodotto specifico di amplificazione andando a monitorare l’incremento del segnale di fluorescenza che risulta essere direttamente proporzionale
alla quantità di prodotto amplificato; l’elevata specificità del sistema consente alla sonda di discriminare tra frammenti che differiscono di un solo
nucleotide.
Nel kit viene usata una sonda marcata con un differente fluoroforo per ogni sequenza investigata; in particolare una sonda che va a rilevare
l’allele target e ha legato in modo covalente come fluoroforo all’estremità 5’ la molecola FAM (6-carbossi-fluoresceina) mentre l’altra sonda che
va a rilevare il controllo interno (IC) ha legato come fluoroforo all’estremità 5’ la molecola HEX (Esa-cloro-fluoresceina). Le due sonde hanno
all’estremità 3’ un quencher chiamato BHQ-1. Se eccitata, la sonda integra non emette fluorescenza, in quanto la vicinanza del quencer al reporter,
impedisce a quest’ ultimo l’emissione della fluorescenza (effetto di quencing).
COMPOSIZIONE DEL KIT
Questo Kit è stato disegnato per poter eseguire 32 reazioni, è incluso un controllo interno di amplificazione che deve essere coamplificato insieme
ad ogni campione e che permette di identificare inibizioni nelle reazioni di amplificazione. Il kit permette di effettuare 4 corse, ciascuna delle quali
include: 6 campioni, 1 controllo e 1 bianco di reazione.
Per Real Time PCR
Reagenti
Codice Colore
Mix di Amplificazione (400 ml)
Tappo Blu
Oligo Mix* (400 ml)
Tappo verde
Controllo 1 (Controllo Positivo di Amplificazione) (>50 ml)
Tappo Rosso
Controllo 2 (Controllo Interno di Amplificazione) (>50 ml)
Tappo Giallo
Bianco di Reazione (B) (50 ml)
Tappo Bianco
*Proteggere la fiala da fonti luminose
CONSERVAZIONE E STABILITA’
Tutti i reagenti devono essere conservati a -22°C/-18°C fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. EuroClone raccomanda di non
scongelare e ricongelare il prodotto più di sei volte.
Attenzione: dopo il completo scongelamento e prima dell’utilizzo si raccomanda di centrifugare tutti i reagenti e risospenderli
pipettandoli 3 volte.
MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO
• Micropipette 1-10 ul
• Micropipette 10-100 ul
• Puntali con filtro
• Rack per tubi da 0.2 ml
• Micropiastra ottica per real time PCR
• Tubi per PCR da 0. 2 ml con tappi ottici
• Thermal cycler for Real Time PCR
PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI DI UTILIZZO
• La strumentazione di laboratorio (pipette, tubi, etc.) non deve circolare da una stazione di lavoro all’altra.
• Non utilizzare reagenti dopo la data di scadenza.
• Miscelare i reagenti del kit prima dell’utilizzo.
• Periodicamente verificare la precisione delle pipette, e il corretto funzionamento della strumentazione.
• Cambiare spesso i guanti.
• Lavare periodicamente il banco di lavoro con Ipoclorito al 5%.
• Utilizzare i guanti senza talco e evitare di lasciare ditate sui tappi ottici. Non scrivere sui tappi, questo potrebbe creare dei problemi nella rivelazione
della fluorescenza.
PROTOCOLLO OPERATIVO
a1) Estrazione DNA Batterico da campioni clinici
Raccogliere la prima urina del mattino in un contenitore pulito e chiuso senza alcun conservante.
I campioni devono essere conservati tra +2 ° C e +8 ° C e, preferibilmente, testati immediatamente o entro le 24 ore. In alternativa, i campioni
devono essere congelati immediatamente dopo la ricezione e conservati fino a dieci giorni a -20 ° C . Si consiglia un singolo ciclo di scongelamento.
Possono essere utilizzati i principali sistemi di estrazione del DNA batterico presenti sul mercato, tuttavia EuroClone raccomanda Duplicα®Prep Body
Fluid kit (ref. EDI004200) come piattaforma di estrazione automatica e Bact Extra Pure Kit (Ref. EDR004050) per l’estrazione manuale.
a2) Estrazione DNA Batterico da lisati Roche Cobas® 4800
Da lisati derivati dal trattamento dei campioni con Roche Cobas® 4800. EuroClone raccomanda l’uso del Duplicα®Prep Body Fluid kit (ref.
EDI004200) utilizzando il protocollo plasma.
a3) Estrazione DNA Batterico da lisati BD ProbeTecTM
Da lisati derivati dal trattamento dei campioni con BD ProbeTecTM samples, EuroClone raccomanda l’uso del Duplicα®Prep Body Fluid kit (ref.
EDI004200) utilizzando il protocollo plasma oppure il Clone Pure CT/GC kit (ref. EDR003050).
b) Programmazione del Termociclatore
Riferirsi allo specifico manuale dello strumento ma assicurarsi di impostare il seguente profilo termico:
Profilo termico:
Tempo
Temperatura
5 min
95°C
15 sec
95°C
60 sec
68°C
15 sec
95°C
60 sec
54°C
N° di Cicli
1
X 10 Acquisizione Fluorescenza off
X 50 Acquisizione Fluorescenza on
c) Preparazione della PCR mix
Per ogni esperimento preparare una mix di PCR per 1 controllo (Controllo 1), 1 bianco di reazione, n campioni più uno. La mix deve essere preparata
miscelando i reagenti nei rapporti volumetrici di seguito indicati:
REAGENTI
VOLUME (ml)
Amplification mix
10
Oligo mix
10
Controllo 2 (C. Interno)
1
Terminata la preparazione della mix, aliquotare 21ul della Master Mix nei tubi o nelle micropiastre per PCR e aggiungere in ogni tubo 5 μl di
DNA estratto o del controllo (Controllo 1); disporre i tubi all’interno dello strumento e avviare il programma di amplificazione precedentemente
impostato.
Al termine del protocollo di amplificazione, rimuovere i tubi dal termociclatore.
d) ANALISI ed INTERPRETAZIONE dei RISULTATI
Il segnale di fluorescenza registrato dalla strumentazione identifica la presenza del DNA, in particolare la fluorescenza rilevata dal CANALE FAM
identifica il DNA target, mentre la fluorescenza rilevata dal canale HEX identifica l’amplificazione del Controllo Interno (Controllo 2). I risultati
sono interpretati attraverso l’analisi del ciclo soglia Ct (Threshold Cycle Ct) per ciascun campione.
Il ciclo soglia è definito come il ciclo, a livello del quale, la curva di amplificazione interseca la linea soglia (Threshold line). La linea soglia viene
calcolata dalla media della fluorescenza di background per tre volte la deviazione standard; durante i cicli iniziali di amplificazione, prima di un
significativo accumulo di DNA target. Durante i primi cicli di amplificazione della PCR viene calcolata la fluorescenza di background utilizzata per
il calcolo della fluorescenza basale.
Quando si registra un segnale a livello di fluoroforo FAM (Ct > 0), il campione è sicuramente positivo, ed il segnale rilevato dal fluoroforo HEX (Ct≥ 0)
non è rilevante. Quando non si registra segnale a livello di Fluoroforo FAM (Ct = 0), per confermare la negatività del risultato, si deve verificare l’avvenuta
amplificazione del controllo interno e quindi la comparsa di un segnale di fluorescenza a livello di Fluoroforo HEX (Ct>0). Solo in questo caso si può
affermare che il campione è sicuramente negativo. L’assenza di segnale di amplificazione a livello dei due fluorofori FAM-HEX (Ct=0) indica la presenza
di inibizione della PCR. Il campione deve essere ripetuto, si suggerisce di effettuare una diluizione 1:10 del DNA target.
FAM
Ct > 0
Ct = 0
Ct = 0
HEX
Non rilevante (Ct ≥ 0)
Ct > 0
Ct = 0
RISULTATO
POSITIVO
NEGATIVO
INIBITO
Attenzione:
La corsa é valida solo se:
• Il Bianco é positivo nel canale HEX e negativo nel canale FAM.
• Il Controllo Positivo é positivo nel canale FAM.
Se si verificano queste due condizioni la corsa risulta valida ed é possibile analizzare I dati, altrimenti la corsa non é valida.
É responsabilità dell’operatore convalidare la corsa controllando che queste due condizioni si siano verificate.
TROUBLESHOOTING
Problema 1: Mancanza completa di segnale
1. E’ stato scelto il canale/filtro sbagliato.
2. Errore nel pipettaggio per omissione di un reagente o del campione.
3. Effetti inibitori del campione: DNA genomico con purificazione insufficiente e/o estrazione insufficiente.
4. Controllare la corretta conservazione del kit.
5. Controllare le prestazioni del termociclatore.
Problema 2: Intensità di fluorescenza è troppo bassa
1. Deterioramento del fluoroforo e/o dei primer dovuto ad una cattiva condizione di conservazione del Kit.
2. Quantità di DNA troppo inferiore e/o di bassa purezza.
Problema 3: Intensità di fluorescenza variabile
1. La PCR Master Mix non è stata miscelata in modo corretto.
2. Ci sono bolle d’aria intrappolate nei tubi di PCR.
“L’acquisto di questo prodotto assicura all’acquirente i diritti coperti da alcuni brevetti
Roche allo scopo unico di offrire servizi di diagnostica umana in vitro. L’acquisto di
questo prodotto non concede nessun altro brevetto generale, diritto o licenza di alcun
tipo, al di fuori dello specifico diritto di utilizzo.“
Rev 0 EBR029032 – 01-2013
DUPLIC α RealTime
Advanced Dual Easy
Chlamydia trachomatis Kit
h: PI EBR029032 – 32 tests
CV
0459
INTRODUCTION
Le kit DUPLICaRealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis propose un dosage qualitatif de la bactérie Chlamydiae Trachomatis par
amplification du gène 16s et du plasmide cryptique dans les échantillons cliniques tels que prélèvements vaginaux, urétraux et urine ou des échantillons lysés Roche Cobas 4800® ou BD ProbeTec ET™.
PRINCIPE DU TEST
Le kit DUPLICaRealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis permet la détection de l’ADN Chlamydia trachomatis. Les kits de réactifs
pour la réaction d’amplification sont prêts à l’emploi et contenus dans des tubes séparés.
• MIX AMPLIFICATION: Hot Start Taq DNA polymerase (modifiée avec Technologie Anticorps), nucléotides, MgCl2 et tampon.
• OLIGO MIX : amorces et sondes fluorescentes.
• CONTROLE INTERNE D’AMPLIFICATION : permet d’évaluer le succès de la réaction d’amplification et identifié par une sonde spécifique à hydrolyse.
La PCR en temps réel “Advanced”, brevetée par Euroclone, utilise les techniques d’une PCR traditionnelle alliée à une technique de PCR en temps
réel standard. En résumé, l’amplification des acides nucléiques se passe en deux phases : dans la première phase, les acides nucléiques sont préamplifiés par une réaction PCR, alors que dans la deuxième phase, les acides nucléiques sont amplifiés et détectés par une réaction de PCR en
temps réel. D’un point de vue analytique, l’utilisation de cette technologie réduit le nombre de Ct (threshold cycle) et augmente ainsi la sensibilité
du système ainsi que la reproductibilité des données. Ces spécifications sont très utiles (selon, la nature des échantillons ou la cible ou le système
de purification) pour les échantillons cliniques qui présentent une faible quantité d’ADN cible ou une quantité élevée de substances interférentes.
De façon générale, la PCR (polymérase chain reaction) est une technique qui se compose de trois étapes : la dénaturation de l’ADN, l’hybridation
des amorces sur l’ADN, et l’élongation ou extension. Ces différentes phases sont réalisées à l’aide de variation de température de réchauffement
et de refroidissement, et représentent un cycle de base de l’amplification. La répétition en continu d’un cycle de base génère des milliards de
fragments d’ADN à analyser. La dénaturation de l’ADN qui est réalisée à hautes températures est suivie de l’hybridation des amorces spécifiques
sur l’ADN cible : l’enzyme Taq polymérase reconnaît les terminaisons 3’ de ces amorces et polymérise l’ADN en utilisant les dNTPs, créant ainsi
plusieurs copies du brin matrice. Dans les systèmes de PCR en temps réel les amplicons sont révélés à l’aide de fluorochromes intitulés “reporter.
Le kit DUPLICaRealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis permet de détecter l’ADN bactérien en utilisant des sondes fluorogéniques
de séquences spécifiques. Une sonde colorée avec un fluorophore différent pour chaque séquence investiguée. En particulier une sonde détecte
l’allèle cible qui lie le fluorophore FAM (6-carboxyfluoresceine) de manière covalente à la terminaison 5’ tandis que l’autre sonde détecte le contrôle
interne (IC) lié à la terminaison 5’ du fluorophore HEX (hexa-chloro-fluoresceine). Les deux sondes présentent au niveau de leurs terminaisons 3’
un quencher appelé BHQ-1.
COMPOSITION DU KIT
Le kit est conçu pour procéder à 32 réactions et inclut un contrôle interne qui doit être également amplifié avec chaque échantillon afin de s’assurer
qu’il n’y a pas d’inhibition dans la réaction d’amplification. Le kit permet de réaliser 4 runs qui intègrent : 6 échantillons, 1 contrôle positif, et un
contrôle négatif.
PCR en temps réel
Réactifs
Code couleur
Mix Amplification (400μl)
Bouchon bleu
Oligo Mix* (400μl)
Bouchon vert
Contrôle 1 (Contrôle Positif) (>50μl)
Bouchon rouge
Contrôle 2 (Contrôle Interne) (>50μl)
Bouchon jaune
Blanc (B) (50μl)
* protéger le tube de la lumière
Bouchon blanc
STOCKAGE ET STABILITE
Tous les réactifs doivent être stockés à -22°C/-18°C jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette. Euroclone recommande de ne pas congeler
et décongeler le kit plus de six fois.
Attention : après complète décongélation et avant l’utilisation des kits, il est recommandé de centrifuger tous les réactifs et de les resuspendre à
l’aide de la pipette 3 fois.
MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
• Micropipettes de précision 1-10 µl
• Micropipettes de précision 10-100 µl
• Pointes filtrées stériles
• Portoir de tubes 0.2 ml
• Tubes PCR en temps réel
• Thermocycleur PCR en temps réel
RECOMMANDATIONS ET PRECAUTIONS D’EMPLOI
• Ne pas utiliser des réactifs après la date de péremption.
• Mélanger les réactifs du kit avant emploi.
• Vérifier régulièrement la précision des pipettes, et le fonctionnement correct de l’instrumentation.
• Changer souvent de gants.
• Les équipements du laboratoire (pipettes, tubes, etc.) ne doivent pas circuler d’une station de travail à une autre.
• Laver périodiquement la paillasse de travail avec de l’hypochlorure à 5%.
• Utiliser les gants sans poudre. Ne pas toucher la partie optique des tubes.
PROTOCOLE D’UTILISATION
a1) Extraction ADN des échantillons cliniques
Collecter les premières urines du matin dans un flacon stérile sans conservateur.
Les échantillons doivent être conservés entre +2°C et +8°C et idéalement être rapidement testés dans les 24 heures. Sinon, les échantillons devront
être congelés à -20°C. Une simple décongélation n’affectera pas les résultats.
Tout type de kit d’extraction d’ADN bactérien peut être utilisé. Euroclone recommande pour l’extraction automatisée le kit Duplicα®Prep Body Fluid
(Ref. EDI004200) et pour l’extraction manuelle le kit Bact Extra Pure (Ref. EDR004050).
a2) Extraction ADN des échantillons Roche cobas® 4800
A partir des échantillons lysés du Roche cobas® 4800. Euroclone recommande pour l’extraction automatisée le kit Duplicα®Prep Body Fluid (Ref.
EDI004200) avec le protocole plasma (ref. EDI004200).
a3) Extraction ADN des échantillons BD ProbeTecTM
A partir des échantillons lysés du BD ProbeTec™, veuillez utiliser soit le kit Duplicα®Prep Body Fluid (Ref. EDI004200) ou le kit Clone Pure CT/GC
(Ref. EDR003050).
b) Thermal Cycler set up
EuroClone recommande d’utiliser le SmartCycler® II (Cepheid) pour la détection de l’ADN.
EuroClone recommande d’allumer l’instrument, de paramétrer le profil thermique et de préparer les tubes ou la plaque avant de préparer le mix
de réaction.
Profil thermique :
Durée
Température
N° de Cycles
5 min
95°C
1
15 sec
95°C
60 sec
68°C
15 sec
95°C
60 sec
54°C
X 10 Lecture fluorescence non active
X 50 Lecture fluorescence active
c) Préparation du mix PCR
Pour chaque expérience, préparer un mix de PCR pour le témoin positif, le contrôle négatif et n+1 échantillons. Le master mix doit être préparé en
tenant compte des volumes ci-dessous pour un échantillon.
Réactif
VOLUME (μl)
Amplification mix
10
Oligo mix
10
Contrôle 2 (Contrôle interne)
1
Après la préparation du mix, mettre 21 μl de Master Mix dans les tubes de PCR et ajouter dans chaque tube 5 µl d’ADN ou de contrôle (Contrôle
1). Placer les tubes dans l’instrument et lancer le programme d’amplification précédemment paramétré. A la fin du protocole d’amplification, retirer
les tubes du thermocycleur.
d) ANALYSE DES RESULTATS ET INTERPRETATION des résultats
Le signal de fluorescence enregistré par l’instrument détecte la présence d’ADN, en particulier la fluorescence détectée par le canal FAM identifie
l’ADN cible, alors que la fluorescence détectée par le canal HEX identifie le signal du contrôle interne (Contrôle 2). Les résultats sont interprétés en
analysant la valeur du Ct (Cycle Threshold) pour chaque échantillon. Le Ct est défini comme le cycle, au niveau duquel, la courbe d’amplification
coupe la ligne de seuil (Threshold line). La ligne de seuil est calculée par la moyenne de la fluorescence du bruit de fond multipliée trois fois par la
déviation standard pendant les premiers cycles d’amplification, avant une accumulation de cible ADN. Pendant les premiers cycles d’amplification
de la PCR on calcule la fluorescence du bruit de fond afin de calculer « la fluorescence de base ».
Quand l’on enregistre un signal au niveau du fluorophore FAM (Ct > 0), l’échantillon est sûrement positif, et le signal relevé par le fluorophore
HEX (Ct≥ 0) peut ne pas sortir en raison de la compétition avec le résultat positif. Quand l’on n’enregistre pas de signal au niveau du Fluorophore
FAM (Ct = 0), pour confirmer la négativité du résultat, vérifier l’amplification du contrôle interne et donc l’apparition d’un signal de fluorescence
au niveau du fluorophore HEX (Ct>0). Seulement dans ce cas, nous pouvons affirmer que l’échantillon est sûrement négatif. L’absence du signal
d’amplification au niveau des deux fluorophores FAM-HEX (Ct=0) indique la présence d’inhibition de la PCR. L’échantillon doit être répété, il est
conseillé de répéter l’extraction à partir de l’échantillon.
FAM
HEX
RESULTAT
Ct > 0
Sans objet (Ct ≥ 0)
POSITIF
Ct = 0
Ct > 0
NEGATIF
Ct = 0
Ct = 0
INHIBE
Attention :
La série n’est valide que si :
• Le blanc est positif sur le canal HEX et négatif sur le canal FAM.
• Le contrôle est positif dans le canal FAM.
Si ces deux conditions sont réunies, la série est valide et il est possible d’analyser les données. Sinon, la série n’est pas valide.
La responsabilité de valider la série revient à l’utilisateur en vérifiant ces conditions.
DEPANNAGE
Problème 1: Absence complète de signal
1. Choix du canal/filtre erroné
2. Erreur dans le pipetage par omission d’un réactif ou de l’échantillon
3. Effets inhibiteurs de l’échantillon: ADN génomique avec purification insuffisante et/ou extraction insuffisante
4. Contrôler la bonne conservation du Kit
5. Contrôler les performances du Thermocycleur
Problème 2: Intensité de fluorescence est trop basse
1. Détérioration du fluorophore et/ou des amorces en raison d’une mauvaise condition de conservation du Kit
2. Quantité d’ADN trop faible et/ou pureté insuffisante
Problème 3: Intensité de fluorescence variable
1. Le master mix n’a pas été bien mélangé
2. Bulles d’air présentes dans les tubes de PCR.
“L’achat de ce produit accorde à l’acheteur les droits de fournir un service unique dans le cadre de l’activité de diagnostic in vitro sous certains
brevets de Roche. L’achat de ce produit ne fournit en aucun cas ni brevet ou licence, en dehors de son utilisation spécifique. “
Rev 0 EBR029032 – 01-2013
PI-EBR029032/r0/0113/1_EN/ITAFR
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