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1.315 Scheda tecnica FV H1299R

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IDENTIFICAZIONE DEL POLIMORFISMO H1299R
DEL GENE CODIFICANTE IL FATTORE V DELLA COAGULAZIONE
AMPLI-set-FV H1299R
Cat. n. 1.315
L’eterogeneità del fenotipo clinico e la variabilità delle manifestazioni trombotiche presenti nei pazienti con familiarità per patologie
trombotiche ha fatto ipotizzare che la predisposizione a tali disordini sia attribuibile a più fattori genetici.
Recentemente è stato identificato un complesso aplotipo del fattore V (HR2), che comprende 13 differenti polimorfismi. Tra questi, 7
provocano una sostituzione aminoacidica ed una modificazione funzionale della proteina, risultando in un eccesso della
concentrazione plasmatica della isoforma FV1, maggiormente trombogenica.
Non è ancora chiaro se l’aplotipo HR2 rappresenti da solo un fattore di rischio. E’ certo che aumenta il rischio di manifestazioni
cliniche nei soggetti portatori della mutazione FV Leiden.
La ricerca del polimorfismo H1299R viene eseguita previa amplificazione con primers specifici per l’esone 13 di un frammento di
703 bp, con successivo taglio di restrizione ad opera dell’enzima Rsa I. La presenza della mutazione viene rivelata dalla acquisizione
di un sito di restrizione.
Principio del metodo: A) estrazione del DNA genomico B)
amplificazione C) digestione enzimatica D) rivelazione sul
gel di agarosio.
Applicabilità: Su DNA genomico estratto e purificato da
campioni di Sangue Intero.
Numero di Test: 40.
CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE
ESTRAZIONE
Reagente 1 (Buffer di separazione)
Reagente 2 (Buffer di lisi)
Reagente 3 (Soluz. di deproteinizzazione)
Reagente 4 (Proteinase k)
Reagente 5 (soluzione satura NaCl)
AMPLIFICAZIONE e DIGESTIONE
PCR mix
H2O sterile
Taq Polymerase (5U/µl)
Enzima Rsa I (10 U//µl)
BUFFER di digestione 10X
Controllo positivo Eterozigote
RIVELAZIONE
Gel precast di agarosio 1% per elettroforesi in
TBE 1X
Loading buffer 10 X
Buffer di corsa 5 X (TBE 5X)
Marker di peso molecolare
+4°C
+4°C
+4°C
-20°C
+4°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
T.A.
T.A.
T.A.
-20°C
Stabilita': superiore a 12 mesi se correttamente conservato (I
gels di agarosio, se conservati lontano dalla luce, sono stabili
per un anno a temperatura ambiente).
Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; tubi da 15 ml in
polipropilene; portaprovette refrigerato; puntali sterili con
barriera antiaerosol; bacchetta di vetro (o pasteurs di vetro);
portaprovette refrigerato; tubi PCR.
Reagenti richiesti non compresi nel kit: acqua bidistillata
sterile, cloroformio, etanolo 100 %, etanolo 70 %.
Strumenti richiesti: centrifuga con rotore ad angolo fisso
per tubi da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante
con adattatori per tubi da 15 ml (1.500 x g), set di pipette prePCR e post-PCR: 1)0.5 – 10 microlitri 2)5 – 50 microlitri
3)50 – 200 microlitri 4)200 – 1000 microlitri; Termociclatore
programmabile; Cappa Biohazard classe II; Camera
elettroforetica con alimentatore; Transilluminatore UV;
Apparato fotografico.
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono
essere sterili, DNase e RNase free e monouso.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Il prodotto di amplificazione e’ un frammento di 703 bp. Il
successivo taglio di restrizione ad opera dell’enzima Rsa I
può dare i seguenti risultati:
1
Assenza della
mutazione
Soggetto
Omozigote
Normale
Presenza di 1
banda
703 bp
3
2
Presenza della
Presenza della
mutazione
mutazione
Soggetto
Soggetto
Omozigote
Mutato
eterozigote
Presenza di 3
bande
703 bp
493 bp
210 bp
Presenza di 2
bande
493 bp
210 bp
REFERENZE:
Thrombosis and Haemostasis, 1996, 75; 45-48.
Blood, 1997, 90, 4; 1552-1557.
Blood, 2000, 96, 4; 1443-1448.
Thrombosis and Haemostasis, 2000, 83; 577-82.
Haematologica, 2001, 86, 6; 629-633.
Blood, 2001, 98, 2; 358-367.
Hum. Genet., 2002, 111; 59-65.
REV. 01
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