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1.425 Scheda tecnica c kit 11

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IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI
NELL’ESONE 11 DEL GENE c-Kit
AMPLI-c-KIT 11
Cat. n. 1425
I tumori stromali gastrointestinali (GISTs) sono le neoplasie mesenchimali più frequenti del tratto gastrointestinale.
Rappresentano il 2% dei tumori dello stomaco, il 14% dei tumori dell’ intestino tenue e lo 0,1% dei tumori del colon.
L’85% di tali tumori esprime il recettore tirosino-chinasi KIT (stem cell factor receptor CD 117). L’attivazione di tale
recettore innesca una cascata di segnali intracellulari che controllano la proliferazione, l’adesione e l’apoptosi cellulare.
Le mutazioni a carico del gene c-kit sono responsabili dell’attivazione costitutiva del recettore in assenza del ligando.
Coinvolgono più frequentemente l’esone 11 del gene, più raramente gli esoni 9, 13 e 17. Molteplici studi hanno
evidenziato che tra il 50 ed il 90% dei tumori GIST presentano mutazioni a carico del gene c-kit. La presenza di tali
mutazioni, inoltre, correla con un fenotipo più aggressivo del tumore.
I tumori GISTs che risultano negativi per mutazioni a carico del gene c-kit, inoltre, presentano frequentemente
mutazioni attivanti a carico del gene codificante per il recettore del PDGF.
Il kit permette l’identificazione di mutazioni a carico dell’esone 11 del gene c-kit. La metodica prevede l’amplificazione
con oligonucleotidi specifici e successiva analisi di sequenza nucleotidica.
La caratterizzazione delle mutazioni rappresenta un importante target terapeutico e prognostico. Il recettore attivato,
infatti, rappresenta il bersaglio della terapia attualmente più efficace contro la proliferazione di tali tumori.
Il principio attivo Imatinib (Gleevec in USA; Glivec in Europa) è un potente inibitore competitivo di proteine attivate
quali KIT, BCR-ABL e PDGFR α e β.
Principio del metodo: A) estrazione del DNA
genomico da tessuto B) amplificazione C) rivelazione
sul gel di agarosio D) sequenza nucleotidica.
Applicabilità: Su DNA genomico estratto e purificato
da campioni di tessuto.
Numero di Test: 40.
200 – 1000 microlitri; Termociclatore programmabile;
Cappa Biohazard classe II; Camera elettroforetica con
alimentatore; Transilluminatore UV; Apparato
fotografico.
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test
devono essere sterili, DNase e RNase free e monouso.
CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE
ESTRAZIONE
Reagente 1 (Buffer di separazione)
Reagente 2 (Buffer di lisi)
Reagente 3 (Soluz. di deproteinizzazione)
Reagente 4 (Proteinase k)
Reagente 5 (soluzione satura NaCl)
AMPLIFICAZIONE e DIGESTIONE
PCR mix esone 11
H2O sterile
Taq Polymerase (5U/µl)
RIVELAZIONE
Gel precast di agarosio 2% per elettroforesi in TBE 1X
Loading buffer 10 X
Buffer di corsa 5 X (TBE 5X)
Marker di peso molecolare
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
+4°C
+4°C
+4°C
-20°C
+4°C
M
1
2
3
-20°C
-20°C
-20°C
T.A.
T.A.
T.A.
-20°C
Stabilita': superiore a 18 mesi se correttamente
conservato (I gels di agarosio se conservati lontano
dalla luce, sono stabili per un anno a temperatura
ambiente).
Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; tubi da 15 ml in
polipropilene; portaprovette refrigerato; puntali sterili
con barriera antiaerosol; bacchetta di vetro (o pasteurs
di vetro); Portaprovette refrigerato; tubi PCR. Reagenti
richiesti non compresi nel kit: acqua bidistillata
sterile, cloroformio, etanolo 100 %, etanolo 70 %.
Strumenti richiesti: centrifuga con rotore ad angolo
fisso per tubi da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore
oscillante con adattatori per tubi da 15 ml (1.500 x g),
Set di pipette pre-PCR e post-PCR: 1) 0.5 – 10
microlitri 2) 5 – 50 microlitri 3) 50 – 200 microlitri 4)
1, 2, 3: prodotto di PCR
dell’esone 11.
Il prodotto di amplificazione e’ un frammento di 303 bp.
L’analisi di sequenza nucleotidica rivelerà la presenza o
l’assenza di mutazioni.
REFERENZE:
World J Gastroenterol 2005; 11 (7): 1052-1055.
Cancer Research 64, 5913-5919 (2004).
Science 279 (1998) 577-580.
Cancer Control (2005) 12, 44-56.
REV. 01
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