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2 - adriano angelucci

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LABORATORIODITECNICHECELLULARIEMOLECOLARIAPPLICATE2014
Esperienzadifisiopatologia(Prof.AdrianoAngelucci)
ProtocollodelsaggiodiAdesione
PARTEI
1‐Rivestirepiastrada24pozzetticoncollagene(1ug/ml)efibronectina(1ug/ml)
2‐Incubarea37°Cper1oraoppurea4°Cper12ore
3‐Duelavaggiconsoluzione0,1%BSAinterrenodicoltura
4‐Incubareconsoluzione0,5%BSAinterrenodicolturaper60minuti
5‐Lavaggioconsoluzione0,1%BSAinterrenodicoltura
6‐preparazionecelluledaseminare:
6a‐togliereilterrenodicoltura
6b‐lavarecontamponePBS
6c‐aggiungeretripsina/EDTA(1ml/25cm2)
6d‐incubarea37°Cpermassimo5minuti
6e‐recuperarelecelluleeneutralizzareconterrenocompleto
6f‐centrifugarea300gper5minuti
6g‐risospenderein2mlditerrenoecaricare8ulnellacamerettadiBurker
6h‐contarealmicroscopioeaggiustarealladensitàdi5x105 /ml
7‐aggiungereunugualvolumedisospensionecellulareneipozzetti(200‐500ul)
8‐incubareper30minutia37°C
9‐agitareleggermentelapiastraperfacilitareildistaccodellecelluledebolmenteadese
10‐Lavareconsoluzione0,1%BSAinterrenodicolturaper3volte
11‐Fissareconparaformaldeideal4%per10minutiatemperaturaambiente
12‐sostituirelaparaformaldeideconPBS
13‐conservarea4°C
1 LABORATORIODITECNICHECELLULARIEMOLECOLARIAPPLICATE2014
Esperienzadifisiopatologia(Prof.AdrianoAngelucci)
ProtocollodelsaggiodiAdesione
PARTEII
14‐TogliereilPBSdallepiastre
15‐Aggiungerelasoluzionedicolorazione(volume200‐500ul)eincubareper10minuti
atemperaturaambiente.
16‐Lavarealmeno6volteconacquadirubinettofacendoattenzioneanonfarstaccarele
cellule
(lavareconacquapulitafinoaquandononvièpiùcolorazionedisottofondo)
17‐Dopol’ultimolavaggiolasciarasciugarelapiastracapovoltasucartaassorbente
18‐Aggiungereunvolumeugualedisoluzionedisolubilizzazioneperpozzetto.
18‐Diluireinmanieraappropriataconsoluzionedisolubilizzazioneeleggereallo
spettrofotometro(tra540e600nm)
19‐Calcolarelapercentualerelativadicelluleprendendounpuntosperimentalecome
riferimento
(fissatocome100%)
SOLUZIONI
Soluzionedicolorazione‐CrystalViolet12mMinunasoluzioneal20%dimetanoloin
acqua
Soluzionedisolubilizzazione‐ 1%SDSinunasoluzioneal50%inmetanoloinacqua
2 Procedurradicontadivitalità
àconTrypaanblue
1‐Centrifu
ugareereccuperareilp
pelletcellu
ulare
2‐Risospeendereinu
unpiccolov
volumediteerrenocom
mpleto(1‐5
5ml)
3‐Prelevaare500uld
disospensio
one
4‐Aggiunggereunugu
ualvolume
ediTrypan Blue(0,4%
%)
5‐Riempirrelecamerredelvetrino(5‐10ull)
6‐Osservaarealmicro
oscopioadingrandim
mento20x
7‐Calcolarreilnumerrodicellule
esecondollespecifichedelvetrin
nodicontaa
Camerad
dicontadiBurker:Volumedellaaconta(qu
uadratodellimitatodatrelinee
parallele)=
=0,1x
1mm2=0,1
1mm3 =>F
Fattoredicconversionee=104(0,1
1mm3 =0,1u
ul=10‐4 ml))
Modalitàd
diconta(pu
untineri=ccelluledaccontare,pun
ntichiari= celluledannoncontare)
Concentraz
C
zionecellulevive=A*C
C*D(n°diccellule/mlssospension
nedipartennza)
Concentraz
C
zionecellulemorte=B*C*D(n°diicellule/mlsospensio
onediparteenza)
A=mediad
A
dellecelluleevive(suallmeno3qu
uadrati)
B=mediad
B
dellecelluleemorte(colorateinbllu,sualmenotrequad
drati)
C=fattored
C
didiluizion
ne(2nelcassosisiadilluito1:1co
ontrypanblue)
D=fattored
D
diconversiione(10.00
00nelcasoodellacam
meradiBurrker)
3 CrystalVio
C
olet
Il
I Crystal V
Violet legaa il DNA in
i manieraa proporziionale alla quantità di DNA rendendo
r
possibilequ
p
uindilasuaaquantifica
azione.L’u sodelCrysstalVioletè
èstatoquinndiproposstoanche
perlaquan
p
ntificazionee del nume
ero di cellu
ule in una coltura, a patto che la coltura sia pura
e
e che non siconfrontino linee cellulari diiverse o pu
untisperim
mentali connquantità di
d mitosi
troppo
t
diveersa. Il Cry
ystalViolett può esserre usato qu
uindiper dosaggicol
d
lorimetrici tenendo
peròpresen
p
ntechenon
npuòdiscriminaretraacelluleviv
veemorte..
TrypanBlu
T
ue
Il
I Trypan B
Blue (Blu beenzamina, Blu
B naftilam
mmina, Blu Niagara) è stato sinteetizzato aglii inizi del
novecento
n
ccome derivaato del tolu
uene, e devve il suo no
ome alla proprietà di eessere tossico per il
parassitatri
p
panosoma((analoghide
eltrypanblu
uesonoattu
ualmenteusa
aticomeageentifarmaco
ologici).
Il
I Trypan B
Blue viene comunemen
c
nte usato neella colorazzione vitale con un m etodo defin
nito come
colorazione
c
per esclusiione. Infattii, le membrrane cellulaari sono normalmente impermeab
bili a tale
colorante,m
c
mentrelecellulemorte,siaapoptotiichecheneccrotiche,siccoloranodibblu(senzap
possibilità
didistinzion
d
ne).
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