Mercodia Oxidized LDL Competitive ELISA

Mercodia
Oxidized LDL
Competitive ELISA
Istruzioni per l’uso
10-1158-01
REAGENTI PER 96 RILEVAZIONI
Per uso diagnostico in vitro
Prodotto da
Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A,
SE-754 50 Uppsala,
Svezia
SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI USATI SULLE ETICHETTE
Reagenti per 96 rilevazioni
∑ = 96
Data di scadenza
Conservare tra 2-8 ˚C
Lotto n.
Per uso diagnostico in vitro
© Mercodia 2008, 2009, 2010
USO PREVISTO
Il kit Mercodia Oxidized LDL Competitive ELISA è adatto all'uso per la determinazione quantitativa in vitro delle LDL (Low Density Lipoprotein) ossidate nel plasma ematico umano. Le
misurazioni delle lipoproteine sono utilizzate nella diagnosi e nel trattamento di malattie quali il
diabete mellito, l'aterosclerosi e varie patologie epatiche e renali.
RELAZIONE
La conversione ossidativa delle basali LDL in LDL ossidate è considerato un evento chiave nel
processo biologico che avvia e accelera lo sviluppo delle lesioni aterosclerotiche iniziali, le strie
lipidiche [1–5].
Studi sperimentali hanno dimostrato che le LDL basali divengono aterogeniche quando sono
convertite in LDL ossidate [1–5]. Le LDL ossidate si trovano in macrofagi derivati da monociti
nelle lesioni aterosclerotiche, ma non nelle arterie normali [6].
L'assorbimento delle LDL ossidate nei macrofagi non avviene per mezzo del classico recettore
LDL Brown/Goldstein [7]. Numerosi studi [1–5,8] hanno stabilito che le LDL, principale mezzo di
trasporto del colesterolo nel sangue, devono prima essere convertite in LDL ossidate per essere
riconosciute dai recettori "scavenger" o "ox-LDL" su macrofagi derivati da monociti. Il legame
delle LDL ossidate ai macrofagi è un passo necessario tramite il quale le LDL ossidate inducono
l'accumulo di colesterolo nei macrofagi e quindi trasformano i macrofagi in cellule schiumose
cariche di lipidi [8].
Holvoet e i suoi colleghi [9] sono stati i primi a dimostrare chiaramente che i pazienti con
cardiopatia coronarica presentano livelli elevati di LDL ossidate nel plasma e che questi livelli in
circolazione di LDL ossidate sono molto simili in pazienti con cardiopatia coronarica stabile e in
pazienti con sindromi coronariche acute. Hanno notato che i livelli di LDL ossidate nel plasma
erano significativamente più elevati in pazienti con angina stabile, angina instabile e infarto
miocardico acuto, comparati a soggetti di controllo della stessa età presumibilmente sani.
Nelle pubblicazioni di Holvoet e colleghi [9,10], i livelli di LDL ossidate nel plasma erano
misurati da un competitive ELISA utilizzando un anticorpo monoclonale murino specifico, mAb4E6. Il kit Mercodia Oxidized LDL Competitive ELISA utilizza la stessa tecnologia per l'analisi e
lo stesso anticorpo monoclonale murino specifico, mAb-4E6, utilizzato da Holvoet per le sue
ricerche [9,10,11,12,13].
Diversi notevoli studi sono stati condotti da ricercatori clinici che hanno utilizzato i kit Mercodia Oxidized LDL ELISA. Hulthe e Fagerberg [14] hanno dimostrato il rapporto tra l'aterosclerosi
subclinica e i livelli di LDL ossidate circolanti, mostrando che i livelli di LDL ossidate sono legati
allo spessore del complesso intima-media e l'occorrenza di placche nell'arteria carotidea e femorale. Sigurdardottir, Fagerberg e Hulthe [15] hanno trovato livelli elevati di LDL ossidate in
pazienti con sindrome metabolica. Inoltre, hanno scoperto che livelli elevati di LDL ossidate in
pazienti con sindrome metabolica sono associati alle dimensioni piccole delle particelle di LDL.
Kopprasch et al. [16] hanno scoperto livelli elevati di LDL ossidate circolanti in soggetti con ridotta tolleranza al glucosio (IGT). Duntas, Mantzou, e Koutras [17] hanno notato livelli significativamente elevati di LDL ossidate nel plasma in pazienti non trattati affetti da ipotiroidismo overt.
Nel 2006, Johnston et al. [18] hanno dimostrato che il rapporto LDL ossidate / HDL discriminava il migliore tra uomini e donne apparentemente sani senza evidenza clinica di cardiopatia
coronarica e pazienti con cardiopatia coronarica che hanno partecipato allo studio FRISC-II.
3
Lo stesso anno Johnston et al. [19] hanno esaminato il rapporto tra livelli di LDL ossidate circolanti e gli esiti nei pazienti affetti da CAD instabile al controllo a lungo termine. In questo studio
è stato dimostrato che le LDL ossidate sono un importante fattore predittivo indipendente di
infarto miocardico.
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PRINCIPIO DI PROCEDURA
Mercodia Oxidized LDL Competitive ELISA si basa sull'anticorpo monoclonale 4E6. Le LDL ossidate nella provetta competono con una quantità fissa di LDL ossidate legate al pozzetto di
microtitolazione per il legame degli anticorpi specifici marcati con biotina. Dopo una fase di
lavaggio che rimuove i componenti non reattivi del campione, l'anticorpo marcato con biotina
legato al pozzetto è rilevato da streptavidina coniugata con HRP. Dopo una seconda incubazione
e una fase di lavaggio aggiuntiva, il coniugato legato è rilevato tramite reazione con 3,3´,5,5´-tetrametilbenzidina (TMB). La reazione è fermata mediante aggiunta di acido per dare un punto
finale colorimetrico che è letto tramite spettrofotometria.
PRECAUZIONI E AVVISI
• Per uso diagnostico in vitro.
• Non adatto all’uso interno o esterno in umani o animali.
• I contenuti di questo kit e i loro residui non devono essere ammessi al contatto con animali
ruminanti o suini.
• La Stop Solution in questo kit contiene 0.5 M H2SO4. Seguire le precauzioni di routine per la
manipolazione di sostanze chimiche pericolose.
• Tutti i campioni dei pazienti devono essere manipolati come capaci di trasmettere infezioni.
Avviso! Questo kit contiene reagenti potenzialmente infettivi!
Questo kit contiene reagenti prodotti da componenti ematici umani. La fonte del materiale è
stata sottoposta a test immunologico per l'antigene di superficie dell'epatite B e per anticorpi
per il virus HIV con risultati negativi. Ciononostante, devono essere osservate tutte le precauzioni
raccomandate per la manipolazione di derivati ematici. Come riferimento si consiglia la pubblicazione n. (CDC) 88-8395 del US Department of Health and Human Service o altro regolamento
locale o nazionale relativo alle Norme di Sicurezza per i laboratori.
MATERIALI RICHIESTI MA NON INCLUSI
• Pipette da 25, 50, 100, 200 e 1000 μL (per l'aggiunta della soluzione enzyme conjugate 1X,
Substrate e Stop Solution si raccomandano le pipette a ripetizione.)
• Beaker 1000 mL
• Acqua ridistillata
• Provette, 3.5 mL
• Lettore di micropiastre con filtro da 450 nm
• Agitatore di piastre (La velocità raccomandata è di 700-900 giri/minuto, movimento orbitale)
• Dispositivo di lavaggio per micropiastre
• Dispositivo di miscelazione adeguato
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REAGENTI
Ogni kit Mercodia Oxidized LDL Competitive ELISA contiene reagenti per 96 pozzetti, sufficienti
per 41 campioni e una curva di calibrazione in duplicato. Per serie di analisi più ampie, usare reagenti provenienti da confezioni portanti identici numeri di lotto. La data di scadenza del kit completo è indicata sull'etichetta esterna. Si raccomanda di conservare a una temperatura di 2-8ºC.
Coated Plate 1 piastra 96 pozzetti Pronto all’uso
LDL umane ossidate
strisce da 8 pozzetti
Per le strisce per micropiastra non utilizzate, risigillare la busta utilizzando nastro adesivo,
conservare a 2–8°C e utilizzare entro 2 settimane.
Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 fiale 500 µL LDL umane ossidate
Codificato con colore giallo Concentrazione indicata sull'etichetta della fiala.
Conservazione dopo la ricostituzione: 2-8ºC per 2 settimane.
Liofilizzato
Aggiungere 500 µL
acqua ridistillata
a fiala.
Calibrator 0 Codificato con colore giallo
Pronto all’uso
1 fiala 2.0 mL Enzyme Conjugate 11X 1 fiala Streptavidina coniugata con perossidasi
1.2 mL Enzyme Conjugate Buffer
Codificato con colore blu
12 mL
1 fiala Preparazione,
vedi sotto
Pronto all’uso
Antibody 6X
1 fiala 1000 µL LDL antiossidate monoclonali murine marcate con biotina
Conservazione dopo la ricostituzione:
2–8°C per 2 settimane.
Liofilizzato
Aggiungere 6 mL
Antibody Buffer per
preparare soluzione antibody 1X.
Antibody Buffer
Codificato con colore rosso
1 fiala
6 mL
Pronto all’uso
Sample Buffer
Codificato con colore giallo
1 bottiglia
50 mL Pronto all’uso
Wash Buffer 21X 1 bottiglia 50 mL Conservazione dopo la diluizione: per 2-8ºC per 8 settimane.
Diluire con 1000 mL
acqua ridistillata
preparare soluzione
wash buffer 1X
Substrate TMB
Soluzione incolore
Nota! Sensibile alla luce!
1 bottiglia 22 mL Pronto all’uso
Stop Solution 0.5 M H2SO4
1 fiala 7 mL Pronto all’uso
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Preparazione della soluzione enzyme conjugate 1X
Preparare la quantità necessaria della soluzione enzyme conjugate 1X con la diluizione dell’Enzyme Conjugate 11X (1+10) nell’Enzyme Conjugate Buffer in base alla tabella sottostante.
Quando si prepara la soluzione enzyme conjugate 1X per tutta la piastra, versare tutto il tampone Enzyme Conjugate Buffer nella fiala dell’Enzyme Conjugate 11X. Miscelare con cura prima
dell'uso.
Numero di strisce
Enzyme
Conjugate 11X
Enzyme
Conjugate Buffer
12 strisce
6 strisce
4 strisce
1 fiala
600 μL
350 μL
1 fiala
6.0 mL
3.5 mL
La soluzione Enzyme conjugate è stabile per 2 settimane a 2-8ºC dopo la preparazione.
RACCOLTA E MANIPOLAZIONE DEI CAMPIONI
Il campione raccomandato per l'uso con Mercodia Oxidized LDL Competitive ELISA è plasma
fresco EDTA.
Prelevare il sangue mediante puntura endovenosa in provette contenenti EDTA come anticoagulante e separare la frazione plasmatica. I campioni possono essere conservati a 2-8ºC
fino a una settimana o a -80ºC per almeno sei mesi. Evitare di ripetere il congelamento e
scongelamento.
Possono essere utilizzati anche siero e eparina o plasma citrato.
Diluizione dei campioni
I campioni devono essere diluiti lo stesso giorno dello svolgimeno delle analisi. Preparare una
provetta per ogni campione del paziente. Ogni campione è diluito in una fase con una diluizione
finale di 41 volte come indicato di seguito:
Campione del paziente 25 µL
Sample Buffer 1000 µL
È IMPORTANTE che tutti i campioni siano mescolati adeguatamente prima dell'uso.
Il campione diluito 41 volte in Sample Buffer rimane stabile per 1 giorno a 2-8ºC.
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PROCEDURA DEL TEST
Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell’uso. Eseguire ogni rilevazione in duplicato per B0, bianco, Calibrator e campioni. Preparare una curva di
calibrazione per ciascuna sessione analitica.
Aggiungere ai pozzetti
LDL ossidate:
B0
Bianco
Calibrator
Campione
1 Calibrator 0 50 μL 100 μL –
–
2 Calibrator –
–
50 μL –
3 Campione –
–
–
50 μL
4 Soluzione Antibody 1X 50 μL –
50 μL 50 μL
Notare che la soluzione antibody 1X è aggiunta a tutti i pozzetti eccetto il bianco!
5 Incubare in un agitatore (700-900 rpm) per 2 ore a temperatura ambiente (18-25°C).
6 Lavare 6 volte con 700 µL di soluzione wash buffer 1X per pozzetto usando un lavatore
automatico per piastre con la funzione lavaggio overflow. Nella procedura di lavaggio
non utilizzare la funzione immersione.
Oppure eliminare manualmente il volume di reazione capovolgendo la micropiastra
su un lavabo. Aggiungere 350 µL di soluzione wash buffer 1X a ogni pozzetto.
Eliminare la soluzione wash buffer 1X, picchiettare con decisione varie volte contro
carta assor bente per rimuovere l'eccesso di liquido. Ripetere 5 volte. Evitare immersioni prolungate durante la procedura di lavaggio.
7 Aggiungere la soluzione enzima coniugato 1X 100 μL a tutti i pozzetti.
8 Incubare in un agitatore per 1 ora a temperatura ambiente (18-25°C).
9 Lavare come descritto sopra.
10 Aggiungere substrate TMB 200 μL a tutti i pozzetti.
11 Incubare per 15 minuti a temperature ambiente, senza agitare.
12 Aggiungere Stop Solution 50 μL a tutti i pozzetti. Mettere la piastra in un agitatore per
5 secondi per garantire la miscelazione.
13 Misurare l'assorbanza a 450 nm e calcolare i risultati.
Nota! Per evitare qualsiasi contaminazione tra l'enzima coniugato e il substrato devono essere
usate pipette distinte.
CONTROLLO DI QUALITÀ INTERNO
I controlli commerciali e/o i pool di plasma/siero interni con concentrazioni di MPO basse, intermedie e alte devono essere analizzati periodicamente come campioni, e i risultati tracciati di
giorno in giorno. È buona norma di laboratorio registrare i seguenti dati per ciascuna analisi:
numero di lotto del kit, diluizione e/o date di ricostituzione dei componenti del kit, valori OD
per B0, bianco e Calibrator.
8
CALCOLO DEI RISULTATI
Nota! Il calibrator 0 (bianco) non deve essere utilizzato nel calcolo della curva di calibrazione.
Calcolo computerizzato
La concentrazione di LDL ossidate in campioni sconosciuti deve essere calcolata se possibile
utilizzando la riduzione di dati computerizzata. Utilizzare la %B0 in contrapposizione alle concentrazioni note di Calibrator 1-5 e l'analisi di regressione spline cubica per costruire la curva di
calibrazione. Moltiplicare le concentrazioni di LDL ossidate calcolate con il fattore di diluizione
(es. × 41).
Calcolo manuale
1. Esprimere l'assorbanza (B) per Calibrator e campioni come un'inibizione percentuale dell'assorbanza media del legame massimo a inibizione zero (B0).
%B0 =
B (di Calibrators o Campioni)
B0 (ass media a inibizione zero)
× 100
2. Tracciare i valori percentuali calcolati (%B0) ottenuti per i Calibrator contro la concentrazione
nota di LDL ossidate su carta lin-log e costruire una curva di calibrazione manualmente.
3. Leggere la concentrazione dei controlli e campioni dalla curva di calibrazione.
4. Moltiplicare la concentrazione dei campioni con il fattore di diluizione (es. ×41).
Esempio di foglio di calcolo
Pozzetti
Identità
Media
A450nm
Media
%B0
Media
Conc. U/L
× 41
U/L
1A-B
1C-D
1E-F
1G-H
2A-B
2C-D
2E-F
2G-H
3A-B
3C-D
B0
Bianco
Calibrator 1*
Calibrator 2*
Calibrator 3*
Calibrator 4*
Calibrator 5*
Campione 1
Campione 2
Campione 3
2.104
0.121
1.433
1.074
0.740
0.488
0.367
1.211
0.914
0.758
5.7
68.1
51.0
35.2
23.2
17.4
57.6
43.4
36.0
0.9
1.7
2.5
37
70
103
*Concentrazione indicata sull’etichetta della fiala.
9
Esempio di curva di calibrazione
La curva qui mostrata è una curva di calibrazione tipica. Non usare questa curva per determinare
i risultati delle analisi reali.
80.00 70.00 60.00 %B0
50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 0.10 1.00 oxLDL (U/L)
10.00 LIMITI DELLA PROCEDURA
Come tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non deve essere basata sui risultati
di un singolo test, ma dovrebbe essere effettuata dal medico in seguito alla valutazione di tutti
i risultati clinici.
I campioni lipemici, itterici o emolizzati non interferiscono con l’analisi.
VALORI PREVISTI
La buona pratica prevede che ogni laboratorio stabilisca il proprio intervallo di valori previsti.
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CARATTERISTICHE DEL RENDIMENTO
Limite di rilevabilità
Il limite di rilevabilità è ≤ 0.3 U/L, calcolato come due deviazioni standard sotto il legame
massimo a inibizione zero (B0).
Recupero
Il recupero all’aggiunta è 93 – 115% (il valore medio è 101%).
Il recupero alla diluizione è 85 – 116% (valore medio 101%).
Precisione
La precisione è stata calcolata da tre campioni analizzati in 2-4 repliche in 21 momenti diversi.
Valore ottenuto
% Coefficiente di variazione
Campione
U/L
durante
tra
totale
1
2
3
39
82
128
6.7
4.8
6.1
6.9
4.5
7.0
9.6
6.5
9.3
CALIBRAZIONE
Ad oggi non è disponibile alcun riferimento internazionale. Mercodia Oxidized LDL Competitive
ELISA è calibrato in unità relative arbitrarie contro uno standard di riferimento interno.
GARANZIA
I dati sul rendimento presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasi
cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB può avere effetti
sui risultati, in tale caso Mercodia rinuncia a tutte le garanzie espresse, implicite o legali, inclusa
la garanzia implicita di commerciabilità o idoneità per l’uso.
Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati, in tal caso, non saranno responsabili dei danni
indiretti o consequenziali.
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RIFERIMENTI
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X-O Graf Tryckeri AB
SOMMARIO DEL PROTOCOLLO
Mercodia Oxidized LDL Competitive ELISA
Aggiungere Calibrator 0 per B0
Aggiungere Calibrator 0 per bianco
50 µL
100 µL
Aggiungere Calibrators, controlli e campioni
50 µL
Aggiungere soluzione antibody 1X a tutti i
pozzetti eccetto il bianco
50 µL
Incubare
2 ore a 18-25ºC in agitatore di piastre
Lavare piastra con soluzione wash buffer 1X
6 volte
Aggiungere soluzione enzyme conjugate 1X a
tutti i pozzetti
100 µL
Incubare
1 ora a 18-25 ºC in agitatore di piastre
Lavare piastra con soluzione wash buffer 1X
6 volte
Aggiungere Substrate TMB
200 µL
Incubare
15 minuti
Aggiungere Stop Solution
Misurare A450
50 µL
Agitare per 5 secondi per garantire la
miscelazione
Valutare i risultati
31-3146
Versione 7.0

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