lezione 10

Mappatura fisica
Prof. Mario Ventura
Capitoli 8 + 14 + Appunti
Tipi di mappe: mappe fisiche e genetiche
  Mappe fisiche: localizza i geni (o marcatori) lungo i cromosomi
usando misurazioni che sono il riflesso di distanza fisica. Si distingue a
bassa ed alta risoluzione
  Mappe genetiche: si basano sulla frequenza di ricombinazione fra
locus identificati attraverso marcatori (analisi di linkage). Possono
essere di varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale,
fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA.
 
Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma
corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere
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Mappatura fisica
La mappatura fisica comprende una varieta’ di modi diversi, ciascuno dei
quali usa diverse unita’ di misura e fornisce diversi livelli di risoluzione,
che vanno dall’intero cromosoma alla singola coppia di basi.
Esistono diversi tipi:
-  mappatura per trasferimento di cromosomi
-  mappatura mediante ibridazione in situ
Mappatura significa localizzare una sequenza di DNA sui cromosomi
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Sistemi di isolamento del DNA cromosomico
miscela di cromosomi trattati
con fluorocromo
Spesso puo’ essere importante isolare uno o
piu’ cromosomi dal resto e per questo
possono essere utilizzati due approcci:
- Flow Sorting
- Costruzione di ibridi somatici
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selezioni la lunghezza
d’onda di interesse
(selezionante)
Come usare i cromosomi sortati per fare la mappatura?
Avendo i cromosomi tutti isolati in provette e’ possibile usare tutti gli
approcci gia’ noti per trovare la localizzazione di una regione specifica.
-  PCR con primer disegnati sulla sequenza da studiare
-  slot blot o dot blot con probe (come lo crei?) sul DNA genomico di ogni
provetta fissato su filtro di nitrocellulosa
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Un altro di stema di mappatura usa gli ibridi cellulari:
cosa sono? come si fanno?
Gli ibridi sono cellule che contengono patrimoni genetici diversi tra loro. Nel caso specifico
HSA e topo. Le cellule vengono fuse e il sistema ritiene tutti i cromosomi di topo e qualche
o un cromosoma umano. Si distinguono in:
Ibridi cromosomici (Usati anche come WCP)
se ritengono piu’ cromosomi umani o parti di essi a causa di fenomeni di rottura che si
realizzano casualmente
Ibridi monocromosici (Usati anche come WCP)
se ritengono un solo cromosoma umano. Si possono ottenere:
1.
da ibridi (a seguito di eliminazioni successive del vari cromosomi di uomo)
2.
da preparati FACS messi in formazione di ibrido
Ibridi cromosomici da radiazione (Usati anche come PCP)
-  se ritengono frammenti di uno o piu’ cromosomi. Si ottengono per irradiazione degli ibrdi
precedenti e successiva ulteriore fusione
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Sistema di selezione per ibridi cellulari
Hypoxantyne Aminotperin Tymidine
TK HPRT+
PEG
HPRT TK+
HAT
Nel sistema HAT
solo le cellule
TK+ e HPRT+
sopravvivono
In humans: HPRT on chr. Xq26; TK on chr. 17q25
altri sistemi di selezione:
- ouabaina;
- alanosina-adenina
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IBRIDI DA RADIAZIONE
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Prima di utilizzare gli ibridi per fare la mappatura e’ NECESSARIO e
FONDAMENTALE procedere con la caratterizzazione degli ibridi:
Capire cioe’ quali sono i cromosomi che casualmente sono stati
trattenuti dal processo di formazione dell’ibrido stesso.
Caratterizzazione di ibridi
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Caratterizzazione di ibridi: grossolana
Il DNA dell’ibrido viene estratto e sottoposto ad ALU-PCR. Questo passaggio e’
fondamentale per aumentare la rappresentativita’ del DNA umano vs il DNA murino (non ci
sono sequenze ALU). La ALU-PCR utilizza primer disegnati sulle sequenze Alu ma con
orientamento esterno alle sequenze stesse, per avere una amplificazione di sequenze interAlu.
Successivamente eseguo una FISH SU METAFASI UMANE dei prodotti di ALU-PCR
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WCP cromosoma 17
Prodotti Alu-PCR
di un ibrido
monocromosomico
ibridati su metafasi
umane normali
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Caratterizzazione dell’ibrido HY #240
mediante FISH l’indicazione e’ grossolona, motivo per cui si procede con una
caratterizzaione fisica mediante STS (importante per la caratterizzazione
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degli ibridi da radiazione!!!).
IBRIDI DA RADIAZIONE
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Pannello ibridi da radiazione chr4
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Painting cromosomica parziale (2p)
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Ogni STS e’ mappato e localizzato precisamente nel genoma umano.
Scegliendo opportunamente vari STS (ausilio di programmi
bioinformatici e database) e’ possibile testare per contenuto di STS le
varie linee ibride ottenute
Caratterizzazione mediante STS di un pannello del cromosoma 5
STS
RH
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Uso degli ibridi in mappatura fisica
lane 4:Human control
lane 3:CHO control
lane 2:Positive hybrid
lane 1:Negative hybrid
Southern di
genomico di
ibridi
Ovviamente posso usare anche la PCR per avere la stessa risposta!!!
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Mappatura del gene AQP8
Human
CHO
Positive hybrids
Negative hybrids
IBRIDI
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Mappatura del gene AQP8
Il gene e’ localizzato su quel cromosoma che e’ sempre presente sugli ibridi risultati
positivi e sempre assente sugli ibridi risultati negativi. Nell’esempio iol gene e’
localizzato nel cromosoma 16
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cromosoma
sul vetrino
sintesi di una sonda complementare
marcata con un fluorocromo
FISH
denaturazione
doppia elica
di DNA
AT CGGT AT CCT A
T A GG C A T A G G A T
AT CGGT AT CCT A
T A GG C A T A G G A T
AT CGGT AT CCT A
T A GG C A T A G G A T
A
ibridazione della sonda sui
cromosomi denaturati
sul vetrino
denaturazione
AT CGGT AT CCT A
T A GG C A T A G G A T
T A GG C A T A G G A T
AT CGGT AT CCT A
T A GG C A T A G G A T
osservazione
del vetrino
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FISH
Per la FISH si possono utilizzare:
1.  Sonde puntiformi (fosmidi, cosmidi, BAC, PAC o YAC)
2.  Sonde ottenute da ibridi (librerie totali e parziali) che colorano
interamente o parzialmente i cromosomi
2.
1.
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FISH: mappatura fisica ad alta e bassa risoluzione
la risoluzione (la distanza minore per cui due sonde ibridate contemporaneamente possono
essere visualizzate comeentita’ separate) di tale tecnica dipende dal materiale target (sempre
cromosomi) che si utilizzano:
cromosomi metafasici (FISH classica)
allungati con citocentrifuga (Stretched FISH)
nuclei interfasici (FISH in interfase)
fibre di cromatina (Fiber FISH)
800 kb - 1.5 Mb
1.5 - 2.0 Mb
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50 - 500 kb
<5 - 700 kb 22
Costruzione di Contigui di cloni
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Costruzione di contigui: restriction vs STS mapping
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Costruzione di contigui
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Costruzione di un contiguo partendo da un
locus genomico
1. Costruzione di un STS per il locus genomico  Costruzione di una sonda specifica
2. Utilizzo sonda per screening su libreria di BAC  Cloni positivi
3. BAC End sequencing  BAC ENds mapping (contro un genoma di riferimento)
4. Costruzione STS dalle ends piu’ lontane dal punto di partenza  Costruzione di una sonda specifica
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Costruzione di contigui: BAC Ends mapping
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Costruzione di contigui: BAC Ends mapping
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Costruzione di contigui: BAC Ends mapping
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Sequenziamento del genoma umano: Analisi della
struttura dei genomi e progetti genomici
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