Ess. Deriv. Agr., 74, 97 - 106 (2004).

ESSENZE DERIVATI AGRUMARI
Ess. Deriv. Agr., 74, 97 - 106 (2004)
Pubblicato dalla Stazione Sperimentale per l’Industria delle Essenze e dei Derivati dagli Agrumi (www.ssea.it)
97
Sintesi di diidrocalconi ad elevata solubilità in acqua da
precursori flavonici estratti da pastazzo di bergamotto
Castrese Esposito1 , Domenico Cautela1, Luigi De Masi1 , Francesco Siano1 ,
Domenico Castaldo1*, Luigi Servillo2
1 Stazione Sperimentale per l’Industria delle Essenze e dei Derivati dagli Agrumi, Via Gen. Tommasini, 2 - 89127 Reggio Calabria, Italy
2 Dipartimento di Biochimica e Biofisica "F. Cedrangolo", Seconda Università di Napoli, Via Costantinopoli, 16 - 80138 Napoli, Italy
RIASSUNTO
ABSTRACT
Un derivato glicosilato della neoesperidina diidrocalcone, l'1- (4- ((2- O[6- desossi- - L- mannopiranosil]- 6- O- [- D- glucopiranosil]- - Dglucopiranosil)ossi)- 2,6- diidrossifenil)- 3- [3- idrossi- 4- metossifenil]1- propanone, è stato preparato isolando composti precursori da una
miscela di flavonoidi ottenuta per estrazione da bucce esauste della lavorazione di bergamotto (pastazzo). A partire dalla neoesperidina contenuta
nell'estratto, è stato preparato il 4'- metossi- 3',5- di- O- acetil- flavanone7- [2- O- (2,3,4- tri- O- acetil- 6- desossi- - L- mannopiranosil)- 3,4- diO- acetil- - D- glucopiranoside], che fungeva da glicosil accettore, con
una reazione di glicosidazione che impiegava il 2,3,4,6- tetra- O- acetil- D- glucopiranosil bromuro come glicosil donatore. Il prodotto di glicosidazione ottenuto, l'1- (4- ((2- O- [6- desossi- - L- mannopiranosil]6- O- [- D- glucopiranosil]- - D- glucopiranosil)ossi)- 2,6- diidrossifenil)- 3- [3- idrossi- 4- metossifenil]- 1- propanone, è stato purificato e
successivamente caratterizzato mediante cromatografia su strato sottile
(TLC), cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC), risonanza
magnetica nucleare (1H NMR) e spettroscopia di massa con elettrospray
(ESI- MS). Abbiamo dimostrato che la reazione avviene con buone rese
e può essere utilmente impiegata per la preparazione di sostanze edulcoranti, di discreta solubilità in acqua e di notevole interesse economico, a
partire da materie prime di scarto.
A Glycosylated derivated of the neohesperidin dihydrochalcone, the 1(4- ((2- O- [6- deoxy- - L- mannopyranosyl]- 6- O- [- D- glucopyranosyl]- - D- glucopyranosyl)oxy)- 2,6- dihydroxyphenyl)- 3- [3hydroxy- 4- methoxyphenyl]- 1- propanone, was prepared by precursory
isolations of flavonoid obtained from extraction of exhausted peels of the
workmanship of Citrus bergamia. From the neohesperidin contained in
the extract was prepared the 4'- metoxy- 3',5- di- O- acetilflavanone- 7[2- O- (2,3,4- tri- O- acetyl- 6- deoxy- - L- mannopyranosyl)- 3,4- diO- acetyl- - D- glucopyranosyde], that was used as acceptor, with a reaction of glycosylations that employed the 2,3,4,6- tetra- O- acetyl- - Dglucopyranosyl bromide as donor. Glycosylations product, the 1- (4- ((2O- [6- deoxy- - L- mannopyranosyl]- 6- O- [- D- glucopyranosyl]-D- glucopyranosyl)oxy)- 2,6- dihydroxyphenyl)- 3- [3- hydroxy- 4methoxyphenyl]- 1- propanone, was purified and subsequently characterized by thin layer chromatography (TLC), high pressure liquid chromatography (HPLC), nuclear magnetic resonance ( 1H NMR) and elettrospray mass spectrometry (ESI- MS). We showed that the reaction proceeds in high yields. It can also be usefully employed for the preparation
of edulcorant substances, of discreet solubility in water and notable economic interest, beginning from exhausted peels.
Parole chiavi: Flavonoidi, Neoesperidina, Neoesperidina diidrocalcone,
sintesi oligosaccaridica
Keywords: Flavonoid, Neohesperidin, Neohesperidin dihydrochalcone,
Oligosaccharides synthesis
INTRODUZIONE
I flavonoidi (C6-C3-C6) costituiscono una delle
più diffuse classi di composti fenolici delle piante
superiori. La struttura chimica di questi composti,
presenti in tutte le parti della pianta, è basata su uno
scheletro C15 con un anello cromonico legato ad un
secondo anello aromatico (B) in posizione 2, 3 o 4
(fig. 1, a). In alcuni casi l'anello eterociclico (C) può
presentarsi in una forma isomerica aperta (calconi)
oppure viene sostituito da un anello a 5 atomi di carbonio (auroni). I vari sottogruppi di flavonoidi vengono classificati in base allo stato di ossidazione dell'anello eterociclico C ed alla posizione dell'anello B.
*
Author for correspondance:
e-mail: [email protected]
I flavanoni, flavoni, flavonoli ed antocianine hanno
l'anello B in posizione 2 sull'anello eterociclico, negli
isoflavonoidi l'anello B è in posizione 3 mentre nelle
4-fenilcumarine (neoflavonoidi) l'anello B è in posizione 4. Esistono infine delle strutture oligomeriche
quali i biflavonoidi (C6-C3-C6)2, come l'amentoflavone e la ginkgetina, e le proantocianidine (C6-C3C6)n. Normalmente i flavonoidi si ritrovano in natura in forma glicosilata, con vari tipi di residui oligosaccaridici legati ai gruppi ossidrilici. I residui oligosaccaridici, a loro volta, possono essere legati ad un
sostituente acilico, quali malonato, p-cumarato, caffeato e ferulato. Inoltre i flavoni, a differenza di altri
tipi di flavonoidi, possono formare dei C-glicosidi
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1
8
O
2'
2
7
A
1'
C
6
OH
3'
4'
B
3
O
OH
6'
OH
O
OMe
H
4
5
O
HO
HO
OH O
5'
O
HO
a
b
OH
OH
OH
HO
HO
O
O
O
O
OH
HO
HO
H
H
OH
OH O
O
O
H
O
HO
O
OH
O
OMe
OH O
O
HO
OH
OH
c
OH
OH
d
Figura 1- (a) Struttura base dei flavonoidi; (b) Neoesperidina diidrocalcone;
(c) Naringina; (d) Neoesperidina
impegnando le posizioni 6 ed 8 dello scheletro base.
Attualmente sono state identificate in natura diverse
migliaia di strutture fenoliche ma i flavonoidi sono
tra quelle numericamente più consistenti. Sono stati
identificati oltre 4000 glicosidi e più di 1800 agliconi
appartenenti a questa classe nella quale si fanno rientrare 13 tipi di flavonoidi in sensu strictu ed almeno
10 tipi di isoflavonoidi. Questa grande varietà di
strutture riflette un'altrettanto grande diversificazione
delle loro funzioni. Tali composti possono infatti fungere da pigmenti, da antibiotici, da schermo nei confronti delle radiazioni UV, da repellenti per gli insetti
e da segnali nelle interazioni pianta-microrganismi e
pianta-pianta (allelopatia). Presentando un così
ampio spettro di attività biologica non sorprende il
fatto che i flavonoidi siano oggetto di un forte interesse applicativo per l'industria farmaceutica ed agroalimentare. Oggi, infatti, esiste una crescente tendenza
ad esplorare l'uso di miscele di dolcificanti negli alimenti per produrre un profilo di dolcezza che si avvicini a quello del saccarosio, per mascherare il grado
di amarezza, per aumentare la stabilità e per ridurre la
quantità giornaliera di un particolare dolcificante. In
particolar modo, negli ultimi anni, un notevole interesse è stato suscitato da un flavonoide glicosidico, la
neoesperidina diidrocalcone (NeDHC) (fig. 1, b).
Essa si ottiene per idrogenazione catalitica della
neoesperidina estratta da arance amare (Citrus aurantium) (Houjiu et al., 1991), e per sintesi chimica dalla
naringina estratta dal pompelmo (Citrus paradisii)
(Horowitz & Gentili., 1969; Calvarano et al., 1991)
(fig. 1, c-d). La NeDHC possiede un potere edulcorante 1800 volte superiore a quello del saccarosio, ma
ha un potere calorico notevolmente più basso.
Recenti studi hanno dimostrato che la neoesperidina
diidrocalcone, se usata in basse concentrazioni ed in
combinazione con altri dolcificanti, come ad esempio
saccarinato e ciclammato sodico, può effettivamente
produrre vantaggi tecnologici in termini di dolcezza,
dare un impatto positivo sulla qualità e aumentare l'aromaticità di prodotti alimentari (Benavente et al.,
1997). L'interesse rivolto a questo prodotto, inoltre, è
considerevolmente accresciuto dalla possibilità di
estrarre neoesperidina e naringina da fonti naturali a
basso costo, quali ad esempio bucce esauste ottenute
come sottoprodotto nella lavorazione degli agrumi.
Semplici processi estrattivi e purificativi sono stati
infatti messi a punto da Higby (1944, 1946, 1947),
Bayer (1948) e da Hendrickson & Kesterson (1955).
Questi metodi si basano su un trattamento alcalino
delle bucce di agrumi ed una successiva precipitazione dei flavonoidi da soluzione acida. Spesso si rende
necessario uno step di ricristallizazione per incrementare la purezza del prodotto ottenuto. Inoltre, al
fine di evitare nella fase di precipitazione la formazione di gel, dovuto alla presenza di pectina nell'estratto, sono state adoperate miscele di basi: Ca(OH)2
e NaOH (Sanchez, 1986). Sono state messe a punto
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OH
O
HO
HO
O
OH
O
HO
HO
O
OH
O
OH
OH
O
OMe
O
HO
6G- -glucopiranosil neoesperidosio
OH
OH
Figura 2- 1- (4- ((2- O- [6- desossi- - L- mannopiranosil]- 6- O- [- D- glucopiranosil]- D- glucopiranosil)ossi)- 2,6- diidrossifenil)- 3- [3- idrossi- 4- metossifenil]- 1propanone
metodiche che prevedono una iniziale idrolisi acida
delle pectine presenti, a cui fa seguito una fase estrattiva alcalina (Lo Curto et al., 1992). Sono anche state
impiegate con successo tecniche che prevedono l'uso
di una preparazione enzimatica da Aspergillus niger
per una iniziale degradazione delle pectine, a cui fa
seguito una fase di estrazione alcalina (Inaba et al.,
1993). Inoltre sono state adoperate metodiche per
recuperare i flavonoidi da acque di scarto nella lavorazione di agrumi mediante l'impiego di resine del
tipo stirene-divinil-benzene (Ericson et al., 1990;
Doner et al., 1993; Calvarano et al., 1996).
Pur presentando una estesa potenzialità applicativa
e un così ampio insieme di vantaggi tecnologici l'utilizzo della neoesperidina diidrocalcone risulta tuttavia fortemente limitato dalla bassa solubilità in acqua
di circa 0.4-0.5 mg/L. In questi ultimi anni sono stati
pubblicati diversi lavori che hanno presentato metodi
per incrementare la solubilità della NeDHC. In tal
senso sono state usate con successo reazioni di glicosidazione da Fukanga et al. (1989), Suzuki & Suzuki
(1991), Ohtani et al. (1991) e da Ming Li et al.
(2003). I prodotti ottenuti hanno mostrato di possedere maggiori solubilità in acqua, mantenendo la capacità edulcorante della stessa neoesperidina diidrocalcone. Reazioni di transglicosilazione di vari flavonoidi, incluso neoesperidina e naringina, sono state
anche impiegate mediante reazione con ciclomaltodestrine operata da glucano-transferasi o da maltotriosi, con l'ausilio di - amilasi provenienti da alcune specie di Bacillus (Kometani et al., 1996; So Jin et
al., 1999).
Nel presente lavoro è stata sviluppata una nuova
metodica che ha consentito, a partire da una miscela
di flavonoidi, ottenuta per estrazione delle bucce
esauste di bergamotto, di ottenere un derivato glicosilato della neoesperidina diidrocalcone, 1- (4- ((2O- [6- desossi- - L- mannopiranosil]- 6- O- [- Dglucopiranosil]- - D- glucopiranosil)ossi)- 2,6- diidrossifenil)- 3- [3- idrossi- 4- metossifenil]- 1- propanone (il 6G- - glucopiranosil neoesperidosio) (fig.
2). Questo composto presenta una maggiore solubilità in acqua e un grado di dolcezza uguale a quello
della stessa neoesperidina diidrocalcone (So Jin et
al., 1999).
MATERIALI E METODI
Reagenti
Per l'estrazione dei flavonoidi è stato impiegato un
cubettato di 1 cm3 di bucce esauste di bergamotto
provenienti dalla lavorazione della campagna agrumaria 2002- 2003.
Neoesperidina, neoesperidina diidrocalcone, naringina e neoeriocitrina sono stati acquistati dalla
Sigma-Aldrich. Etanolo, acetone e metanolo sono
stati reperiti dalla J.T.Baker. Cloroformio deuterato e
carta per filtrazione della grammatura di 75±5 g/m2
sono stati acquistati dalla Carlo Erba Reagents.
Piridina, anidride acetica, acido bromidrico al 33% in
acido acetico, toluene, triflato d'argento, trifenilmetilcloruro, diclorometano, acido acetico, iodio e gel di
silice sono stati forniti dalla Fluka.
1H-
NMR
Gli spettri 1H- NMR sono stati acquisiti in cloroformio deuterato con uno spettrometro da 100 MHz
della Bruker mod. AM 400 equipaggiato con un
reverse probe, operante in FT (Fourier Trasformate) a
30°C. I valori di chemical shift sono riportati in ppm
100
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usando come riferimento tetrametilsilano (TMS).
ESI- MS
Gli spettri ESI- MS sono stati ottenuti per iniezione
diretta dei campioni dissolti in acetonitrile in uno
spettrometro di massa della Waters ZQ™ a singolo
quadrupolo, operante in positive ion mode, equipaggiato con un electrospray ion source della Waters, con
scansione da m/z 200 a 2000. L'introduzione dei
campioni nella sorgente ESI è stata ottenuta con un
sistema syringe- pomp ad un flusso di 2 L/minuto.
Analisi HPLC
L'analisi HPLC dei flavonoidi è stata effettuata
mediante un cromatografo liquido capillare modello
Surveyor (ThermoFinnigan) equipaggiato con un
detector UV/VIS regolato a 287 nm. Il campione (5
L) era iniettato mediante un loop calibro in una
colonna RP- C18, 5 m, 150X3mm della
Phenomenex, equilibrata con 5mM di KH2PO4 a pH
3.05. Il gradiente utilizzato (con flusso costante di
600 L/minuto) era il seguente: 0- 3 minuti, 100% di
KH2PO4 5mM pH 3.05; 3- 38 minuti, 48% KH2PO4
5mM pH 3.05- 52% CH3CN:H2O:KH2PO4 (70:26:4
v/v/v) + 100 L di H3PO4 all'87% (usando un gradiente lineare); 38-48 minuti, 100% CH3CN:H2O:KH2PO4
(70:26:4 v/v/v) + 100 L di H3PO4 all'87%; 48-60
minuti, 100% di KH2PO4 5mM pH 3.05.
Preparazione standard per analisi HPLC
Le soluzioni degli standard erano preparate in
accordo con quanto riportato nel metodo IFU Nr. 58,
1991. A tal fine 50 mg di neoesperidina, naringina e
neoeriocitrina erano pesati accuratamente e posti in
un matraccio da 50 mL. Si aggiungevano 10 mL di
N,N- dimetilformammide e 10 mL di ammonio ossalato 0.25 M. La soluzione era agitata fina a completa
dissoluzione degli standard e portata a volume con
acqua. Da questa soluzione mediante diluizione con
acqua venivano preparate cinque soluzioni di standard con le seguenti concentrazioni: 10 mg/L; 25
mg/L; 50 mg/L; 75 mg/L; 100 mg/L.
Analisi TLC
Le analisi cromatografiche su strato sottile sono
state effettuate con lastrine di gel di silice 60 F256 di
10 cm di lunghezza e 4 cm di larghezza, acquistate
dalla Merck. Le lastrine sono state eluite con le
miscele di solventi indicate nelle procedure di seguito riportate, e sviluppate riscaldando a 120°C le
lastrine precedentemente spruzzate con una soluzione
di acido solforico al 5% in etanolo.
Estrazione e precipitazione dei flavonoidi
500 g di pastazzo omogeneizzato, mediante frullatura, sono stati estratti sotto agitazione per 4 ore con
750 mL di uno dei tre solventi: etanolo 70%, metanolo o acetone. L'estratto era centrifugato a 16000 g per
10 minuti a 10°C, filtrato su carta e portato a secco
mediante rotavapor. Gli estratti in acetone ed in etanolo erano dissolti in 200 mL di metanolo al fine di
eliminare i polisaccaridi presenti (in particolar modo
gli acidi poli- galatturonici) che potrebbero interferire nella successiva fase di precipitazione. La soluzione era successivamente centrifugata a 16000 g per 10
minuti a 10°C e quindi filtrata su carta. La fase organica era quindi allontanata sotto vuoto mediante rotavapor. Per la precipitazione dei flavonoidi il prodotto
secco relativo a ciascuno dei tre estratti era dissolto in
200 mL di acqua. Il pH risultante era pari a 2.5. Si
lasciava riposare la soluzione a temperatura ambiente per circa 4 ore. La soluzione veniva filtrata su carta
ed il precipitato di flavonoidi recuperato con metanolo era portato a volume in un matraccio da 100 mL
per la successiva analisi HPLC.
Sulla polpa di pastazzo recuperata dopo la prima
estrazione è stata inoltre verificata l'efficienza dei tre
solventi adoperati ripetendo il processo estrattivo,
con la medesima procedura impiegata nella prima
estrazione, ma utilizzando un volume di solvente
estraente pari a 500 mL.
Preparazione del 2,3,4,6- tetra- O- acetil- - Dglucopiranosil bromuro
9 mg (0.05 mmol) di - D- glucopiranosio sono
stati acetilati con 300 µL di anidride acetica e 100 µL
di piridina per 20 minuti a 100°C. Il solvente era
allontanato sotto flusso di azoto ed il prodotto acetilato era dissolto in 500 L di CHCl3 ed estratto tre
volte con H2O. La fase organica era allontanata sotto
flusso di azoto ed il prodotto acetilato veniva codistillato con toluene al fine di eliminare le tracce di
acqua presenti. Per la bromurazione della posizione
anomerica il glucosio pentacetilato anidro ottenuto
era sciolto in 100 µL di acido acetito e 100 µL di anidride acetica con 1.5 mL di HBr (HBr al 33% in
AcOH) e lasciato a temperatura ambiente per 20
minuti. La reazione era seguita tramite TLC (eluente
acetato di etile/cicloesano, 1:1 v/v). Il prodotto ottenuto (schema 1) era quindi estratto una sola volta con
CHCl3 ed una soluzione al 10% di tiosolfato di sodio
(al fine di eliminare tracce di bromo) ed altre due
volte con H2O. La fase organica era quindi anidrificata con sodio solfato, filtrata su celite, portata a
secco con un flusso di azoto e tenuta sotto vuoto per
un'ora. Il prodotto anidro risultava pesare 20 mg
(0.049 mmol) con una resa del 97.5%.
Preparazione del 4'- metossi- 3',5- di- O- acetilflavanone- 7- [2- O- (2,3,4- tri- O- acetil- 6- desossi- - L- mannopiranosil)- 3,4- di- O- acetil- - Dglucopiranoside]
74 mg (0.12 mmol) di neoesperidina e 67 mg (0.11
mmol) di naringina, ottenuti nel processo estrattivo
con acetone, dopo essere stati anidrificati codistillandoli con toluene, sono stati dissolti in 2 mL di piridi-
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Schema 1- Preparazione del 2,3,4,6- tetra- O- acetil- - D- glucopiranosil bromuro
OAc
OH
O
O
AcO
HO
Py/AC2O
HO
AcO
OAc
OH
OAc
OH
-D-Glucosio pentacetilato
-D-Glucosio
OAc
O
AcO
Br
AcO
OAc
2,3,4,6-tetra-O-acetil--D-glucopiranosil bromuro
na, portati a 100°C e fatti reagire con trifenilclorometano (TrCl) aggiungendo 120 mg (0.43 mmol) di reattivo ogni 30 minuti fino ad un totale di 600 mg (2.15
mmol). La reazione era monitorata mediante TLC
(eluente CHCl3/MeOH, 45:5 v/v). A reazione completa gli ossidrili rimasti liberi sono stati acetilati
aggiungendo 1.5 mL di anidride acetica per 20 minuti. La reazione veniva seguita mediante TLC (eluente
acetato di etile/etere di petrolio, 6:4 v/v). Il solvente
era allontanato sotto flusso di azoto ed il prodotto
secco estratto tre volte con CHCl3/H2O. La fase orga-
nica era quindi allontanata sotto vuoto con rotavapor
ed il prodotto ottenuto controllato mediante spettro
1H- NMR (fig. 3). Per la rimozione selettiva del gruppo tritilico il prodotto ottenuto è stato trattato con I2
all'1% in MeOH a 60°C per un'ora. La reazione era
monitorata tramite TLC (eluente acetato di etile/etere
di petrolio, 1:1 v/v). Il prodotto ottenuto è stato quindi portato a secco mediante rotavapor, ripreso con 5
mL di acetato di etile ed estratto una volta con 2 mL
di una soluzione al 10% di tiosolfato di sodio ed altre
due volte solo con H2O. Il prodotto ottenuto (schema
Figura 3- Spettro 1 H NMR della Neoesperidina
tritilata/acetilata
Figura 4- Spettro 1 H NMR del glicosil accettore
neoesperidinico
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Schema 2- Preparazione del glicosil accettore neoesperidinico
OH
O
O
HO
HO
O
OH
O
O
HO
HO
O
O
OMe
OH O
100°C
OH
OH
OH
O
O
O
OAc
O
AcO
AcO
O
OMe
O
O
OH O
O
AcO
Glicosil accettore
I2(1%)\MeOH
60°C
2) è stato purificato mediante una colonna cromatografia su gel di silice (20 cm x 1.5 cm impaccata con
6 g di silice) raccogliendo frazioni da 15 mL e usando come eluente le miscele riportate in tabella 1. Le
frazioni eluite erano controllate mediante TLC
(eluente acetato d'etile/etere di petrolio, 6:4 v/v). Le
frazioni 5- 8, contenenti il glicosil accettore neoesperidinico richiesto, venivano recuperate e il controllo,
effettuato mediante spettro 1H- NMR (fig. 4), rappresentava il 90% del prodotto iniziale.
Preparazione dell'1- (4- ((2- O- [6- desossi- - LTabella 1- Composizione degli eluenti cromatografici
impiegati per la separazione del glicosil accettore
su colonna (vedi schema 2)
1- 4
5- 9
10- 21
22- 25
26
Eluenti
Acetato d'etile/etere di petrolio 4:6
Acetato d'etile/etere di petrolio 1:1
Acetato d'etile/etere di petrolio 6:4
Acetato d'etile/etere di petrolio 7:3
Acetato di etile
O
OAc
O
OMe
OAc O
OAc
OAc
Frazioni
OMe
O
HO
OH
OH
AcO
AcO
OH
OH O
TrCl\Py
Neoesperidina
O
HO
O
O
O
AcO
OAc
OAc
mannopiranosil]- 6- O- [- D- glucopiranosil]- D- glucopiranosil)ossi)- 2,6- diidrossifenil)- 3- [3idrossi- 4- metossifenil]- 1- propanone
In un pallone sono stati codistillati con toluene 19
mg (0.047 mmol) di acetobromo- - D- glucopiranosio e 32 mg (0.034 mmol) dell'accettore neoesperidinico preparato come riportato in precedenza. 12 mg
(0.047 mmol) di argento triflato (AgOfT) sono stati
codistillati con toluene in un secondo pallone. I due
palloni sono tenuti sotto vuoto per un'ora.
Successivamente sono stati aggiunti in ogni pallone
due setacci molecolari da 4 Angstrom, precedentemente attivati over night con argon. Si aggiungevano
quindi 0.4 mL di CH2Cl2 in ciascun pallone. Il pallone contenente il sale d'argento veniva posto in un
bagno di acetone refrigerato a - 20°C e tramite una
canula vi si trasferivano il donatore e l'accettore.
Questo al fine di evitare problemi relativi all'insolubilità del sale d'argento in CH2Cl2. La reazione monitorata tramite TLC (eluente acetato di etile/etere di
petrolio, 6:4 v/v) ha evidenziato la presenza di due
prodotti. Si è quindi proceduto alla loro separazione
mediante una cromatografia semipreparativa su lastra
di silice (eluenti acetato di etile/etere di petrolio,
65:35 v/v) ed ad una loro analisi mediante massaelettrospray.
Dall'analisi dello spettro di massa (fig. 5) relativo al
C. ESPOSITO ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 97 - 106 (2004)
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Schema 3- Reazione di glicosidazione
OAc
OH
O
O
AcO
AcO
AcO
AcO
Br
OAc
O
+
OAc
O
O
OMe
OAc O
O
AcO
2,3,4,6-tetra-O-acetil--D -Glucopiranosilbromuro
Glicosil accettore
OAc
OAc
OAc
O
AcO
AcO
AcO
O
O
AcO
AcO
O
OAc
O
O
OMe
OAc O
6G- -Glucosil Neoesperidosio
Mol. Wt.: 1235,10
O
AcO
OAc
OAc
Schema 4- Formazione ortoestere
OH
OAc
O
AcO
AcO
O
C+ O
O
AcO
AcO
O
+
O
OAc
O
OMe
OAc O
H3 C
O
AcO
OAc
OAc
OH
O
AcO
AcO
O
O
O CH3
O
AcO
AcO
O
O
O
OMe
OAc O
O
AcO
Ortoestere
OAc
OAc
OAc
104
C. ESPOSITO ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 97 - 106 (2004)
1235+Na
Figura 5- Spettro di massa del 6G--D-neoesperidosio
prodotto con Rf minore si è potuto constatare che
esso rappresenta il prodotto di accoppiamento desiderato (schema 3) ottenuto con una resa dell'80%.
Abbiamo poi dimostrato che il prodotto con Rf maggiore è dovuto alla formazione di un ortoestere (schema 4), che in seguito alla cromatografia su silice si è
degradato generando glucosio tetra acetilato e l’accettore riarrangiato. Tuttavia l'apertura dell'ortoestere
su silice può essere evitata aggiungendo piridina nell'eluente cromatografico.
Il prodotto di accoppiamento è stato infine deacetilato con sodio metallico in metanolo.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Nello schema 5 è riportato lo schema generale dell'intera procedura per l'ottenimento dell'1- (4- ((2- O[6- desossi- - L- mannopiranosil]- 6- O- [- D- glucopiranosil]- - D- glucopiranosil)ossi)- 2,6- diidrossifenil)- 3- [3- idrossi- 4- metossifenil]- 1- propanone. L'analisi quali- quantitativa dei flavonoidi estratti
è stata effettuata mediante cromatografia HPLC, per
confronto dei tempi di ritenzione e per integrazione
dell'area dei picchi cromatografici dei campioni e dei
rispettivi standard. I flavonoidi più rappresentativi
presenti negli estratti sono risultati essere: neoeriocitrina, neoesperidina e naringina (fig. 6). Dalla tabella
2 l'acetone risulta essere il solvente più efficiente nell'estrazione della componente flavonica dal pastazzo.
Con l'acetone infatti si ottengono i migliori risultati
sia in termini di potere estrattivo e quantità assoluta
di flavonoidi estratti (vedi fig. 6) che di efficienza
estrattiva e quantità residua di flavonoidi nella matri-
Figura 6- Profilo HPLC dei flavonoidi estratti da pastazzo di
bergamotto
ce estratta (vedi tabella 2). Va rilevato che, a differenza dei metodi comunemente adoperati per l'estrazione dei flavonoidi, con l'impiego di un solvente
organico si hanno notevoli vantaggi nell'estrarre i flavonoidi da una matrice complessa qual è il pastazzo.
Innanzitutto la precipitazione può essere ottenuta con
l'aggiunta di sola acqua. Infatti in queste condizioni
il pH dell'estratto dissolto in acqua, dopo l'allontanamento del solvente usato per l'estrazione, risulta nettamente acido (pH circa 2.5). Inoltre i tempi di estrazione e di lavorazione risultano notevolmente ridotti.
Ad esempio con i metodi di estrazione alcalina sono
necessarie circa 48 ore per la sola precipitazione dei
flavonoidi mentre per la metodica qui riportata sono
richieste appena quattro ore. In più, fatto non trascurabile, vi è la possibilità di evitare il trattamento alcaTabella. 2 - Quantità assolute di neoesperidina e naringina
estratte da 500 g di pastazzo di bergamotto
Neoesperidina
I estratto (mg)
Acetone
EtOH 70%
MeOH
74.2
17.1
23.3
Naringina
I estratto (mg)
Acetone
EtOH 70%
MeOH
67.2
14.1
20.5
II estratto (mg)
10.1
16.2
14.4
II estratto (mg)
8.1
13.5
11.2
C. ESPOSITO ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 97 - 106 (2004)
105
Schema 5- Fasi del processo di estrazione, sintesi e caratterizzazione del 6G- - glucopiranosil neoesperidosio
Cubettato di pastazzo
Omogeneizzazione
Estrazione con solvente
Precipitazione flavonoidi
(pH 2.5)
OH
HO
HO
O
O
H
OH
OMe
OH O
O
HO
Analisi HPLC
dei flavonoidi
estratti
O
O
Neoesperidina
Sintesi organica
di oligosaccaridi
OAc
O
AcO
AcO
OAc
O
O
AcO
AcO
O
OH
OH
O
OAc
O
OMe
OAc O
6 G-  -glucosil neoesperidosio peracetilato
O
AcO
OAc
OAc
lino richiesto dai metodi tradizionali per eliminare le
pectine in quanto queste sono rapidamente precipitate lavando gli estratti, previamente seccati, con metanolo. Infine, la miscela di flavonoidi ottenuta dagli
estratti può essere adoperata direttamente per l'ottenimento del glicosil- accettore necessario nella successiva reazione di glicosidazione per l'ottenimento del
6G-- glucosil neoesperidosio.
Per tale reazione si è scelto di utilizzare come donatore il 2,3,4,6- tetra- O- acetil-- D- glucopiranosilbromuro tetracetilato. La scelta di tale glicosil- donatore si deve principalmente alla sua semplicità di preparazione. Infatti è possibile preparare questo donatore sia partendo da - D- glucosio tal quale che da
glucosio pentacetilato, due prodotti commerciali ottenibili a basso costo. E' da sottolineare che l'utilizzo di
- D- glucosio non è conveniente poiché con esso si
avrebbero eguali risultati in termini di resa presentando però un costo commerciale maggiore. Per l'introduzione del bromuro in posizione anomerica è
stato sufficiente trattare il glucosio pentacetilato con
acido bromidrico a temperatura ambiente (schema 1).
Va comunque tenuta in considerazione la possibilità
di poter utilizzare donatori di differente natura. In tal
senso infatti potrebbe essere interessante utilizzare
l'- 1- I- lattosio peracetilato (disaccaride costituito
da glucosio e galattosio). Ciò porterebbe all'introduzione di un disaccaride sul residuo esperidinico che
potrebbe avere una solubilità fino a 250 volte maggiore della neoesperidina diidrocalcone nonché un
grado di amarezza 10 volte più basso della neoesperidina (So Jin et al., 1999). Tale prodotto non è disponibile commercialmente ma la sua preparazione
non presenta notevoli problemi. Infatti per l'ottenimento dell'- 1- I- lattosio è sufficiente trattare con
trietilsilano (Et3SiH) e I2 il lattosio peracetilato.
La scelta del glicosil accettore, invece, è stata condizionata dalla necessità di generare un legame di
tipo 1- 6 glicosidico. A tal fine è stato necessario
lasciare libero nella reazione di glicosilazione l'ossi-
106
C. ESPOSITO ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 74, 97 - 106 (2004)
drile primario della neoesperidina, quello sul carbonio 6 del glucopiranosio (schema 2). Quindi, traendo
vantaggio dal fatto che esso è l'unico ossidrile primario, è stato possibile introdurre su tale posizione stereoselettivamente un gruppo trifenilmetilico (Sunil et
al., 1979). La reazione è stata controllata mediante
uno spettro 1H- NMR (fig. 3). Da esso è stato possibile rilevare la presenza del tritile dai segnali aromatici da 7.2 a 7.6 ppm, dovuti alla presenza di gruppi
benzenici del tritile. Tale gruppo può essere rimosso
rapidamente in presenza dei gruppi acetilici da noi
impiegati per la protezione degli altri ossidrili. Infatti
il gruppo tritifenilmetilico è stato rapidamente rimosso, rendendo quindi di nuovo libero l'ossidrile primario, necessario nella reazione di glicosilazione, trattando la neoesperidina con I2 all'1% in MeOH (Jan
et al., 1998). Il prodotto ottenuto è stato controllato
mediante uno spettro 1H- NMR (fig. 4) che ha evidenziato la scomparsa dei segnali aromatici del tritile
da 7.2 a 7.6 ppm. E' da rilevare che con tali condizio-
ni è stato possibile evitare la migrazione degli acetili
sull'ossidrile primario. Questi gruppi infatti nelle
condizioni blandamente acide comunemente impiegate per la rimozione dei gruppi tritilici hanno la tendenza a migrare (Jan et al., 1998).
La reazione di glicosidazione è stata infine effettuata in CH2Cl2 a - 20°C usando come catalizzatore
argento triflato (AgOfT). Operando in queste condizioni si genera un legame - 1,6 glicosidico (schema
3). Il conformero  si origina grazie all'assistenza
anchimerica dell'acetile in posizione 2 del donatore
che impedisce anche la formazione del prodotto a
configurazione . Poiché però il gruppo acetilico è un
gruppo partecipante esso favorisce l'uscita del bromuro generando un ortoestere (schema 4), in misura
del 10% rispetto al prodotto principale. Infine il prodotto di accoppiamento è stato deacetilato con sodio
metallico in metanolo per formare l'1- (4- ((2- O- [6desossi- - L- mannopiranosil]- 6- O- [- D- glucopiranosil])- - D- glucopiranosil)ossi)- 2,6- diidrossi-
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