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APS250-P ITA

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Pathatrix® AUTO
Salmonella spp. 5 pooling Protocol linked to Selective
Agar Plate/R.A.P.I.D.® LT PCR/BAX® PCR
Codice: APS250-P
TRADOTTO DA ORIGINALE VERSIONE 1.0 2010
1.0
1.1
Preparazione del Campione
Preparare una diluizione 1:10 del campione alimentare in un’appropriata busta stomacher bag, utilizzando un
terreno di arricchimento pre-riscaldato (37±1ºC). Tipicamente, 25-325 g di campione alimentare sono aggiunti
a 225-2925 ml di terreno di arricchimento pre-riscaldato.
Attenzione: è fondamentale che il terreno per l’arricchimento venga riscaldato a 37°C prima dell’aggiunta del
campione alimentare. Per prevenire un raffreddamento tutti i campioni devono essere immediatamente posti in un
incubatore a 37ºC.
Alcune matrici alimentari e tamponi/spugne, che possono contenere un background di flora, potrebbero
trarre beneficio da una strategia di arricchimento alternativa (vedere Appendice A).
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Omogeneizzare il campione manualmente; ad esempio 10-15 secondi di massaggio tra le dita per disperdere
eventuali grumi (Narang & Cray, Food Protection Trends, 2006, 26, p.14-19).
Incubare a 37±1ºC per un minimo di 16 ore.
Pool di Campioni
Posizionare il recipiente del campione e di eluizione nel Tube Rack.
Rimuovere parzialmente i coperchi da entrambi i recipienti, in modo da creare un’apertura che permetta di dispensare
il campione e il wash buffer nei recipienti.
Preparare un pool di campioni unendo 5 aliquote da 10 ml di campioni diversi pre-arricchiti (vedere Figura 1). Se
il campione è altamente particolato e/o contiene un alto contenuto di grassi, si consiglia l’uso del sistema Filta-foam
(Matrix MicroScience, Codice Prodotto: PFF) e i pooling syringes and straws (Matrix MicroScience, Codice Prodotto:
Pool-5-10ML). Alternativamente, possono essere utilizzate le buste sterili semplici Seward con filtri interni (Seward,
Codice Prodotto: 6041/STR).
Fino alla conferma del risultato del test, conservare i campioni individuali arricchiti a 2 – 8 °C per ulteriori analisi. Non
conservare per più di 72 ore.
Caricamento del Campione e del Consumabile
Riempire il recipiente di eluizione con 35 ml di PBS (fino alla linea).
Chiudere saldamente i coperchi del recipiente del campione e di eluizione.
Aggiungere 50 μl di sfere nel beccuccio del recipiente del campione (vedere Figura 2).
Rimuovere il kit in plastica dalla busta e orientarlo con la valvola a pistone verso sinistra. Collegare la valvola
fermamente al coperchio del recipiente del campione e di eluizione (vedere Figura 3).
Sollevare entrambi i recipienti con il kit collegato.
Posizionare i recipienti nella cassetta spingendoli fermamente nella loro collocazione. Successivamente inserire nella
cassetta il resto del kit; assicurarsi che la valvola, la fase e la siringa siano mantenute saldamente all’interno della
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cassetta (vedere Figura 4).
Far scorrere il magnete nella posizione di chiusura. Successivamente premere il pulsante di rilascio del magnete
(vedere Figura 4) sul lato della cassetta per verificare che il kit sia stato posizionato correttamente e che i magneti
possano liberamente svincolarsi dalla fase.
Rimettere il magnete nella posizione di chiusura.
Inserire la cassetta nello strumento Pathatrix® AUTO fino alla corretta posizione di chiusura.
Premere il bottone numerato sopra l’appropriata cassetta per iniziare la corsa. Il LED associato si illuminerà in verde
per indicare l’inizio della corsa.
Recupero del Campione
Alla fine della corsa il LED si illuminerà alternativamente in rosso e in verde.
Premere il bottone sopra l’appropriata cassetta per iniziare lo step di drenaggio (circa 1 minuto).
Quando lo step di drenaggio è completato e il LED si illumina in rosso, rimuovere la cassetta estraendola dallo
strumento.
Rimuovere la siringa dalla cassetta e con cautela rimuovere il resto del kit iniziando dalle componenti posizionate in
alto. Tenere fermamente i recipienti in modo da evitare eventuali sversamenti.
Posizionare entrambi i recipienti nel Tube Rack. Rimuovere il coperchio dal recipiente di eluizione e rimuovere il resto
del consumabile, incluso il recipiente del campione.
Posizionare il coperchio di ricambio (fornito nel kit consumabile) sul recipiente di eluizione per un minuto in modo
da permettere la cattura delle sfere.
Senza rimuovere il recipiente di eluizione dal rack, rimuovere tutto liquido in esso contenuto senza toccare le sfere
catturate.
Aggiungere 100 μl di PBS nel recipiente di eluizione e risospendere le sfere.
Un’aliquota della sospensione delle sfere di Pathatrix® può essere analizzata utilizzando il metodo di rilevazione
dell’agente patogeno scelto dall’operatore.
La sospensione di sfere deve essere conservata per successive analisi necessarie.
PCR & Piastramento Diretto - Le sfere devono essere conservate LONTANE dal Magnatic Capture Rack alla
temperatura di 2 – 8°C fino ad un massimo di 24 ore.
Solo PCR – Le sfere conservate per più di 24 ore possono essere congelate per un periodo massimo di un mese
dalla data di congelamento.
Rilevamento
A - Piastramento Diretto
1. Strisciare 10 μl della sospensione delle sfere sulla piastre selettive con terreno XLD, BGA e/o Hektoen Agar gia
solidificate.
Nota: Consigliamo di strisciare il campione per generare colonie single, al posto di diffonderlo.
2. Lasciare asciugare le piastre per circa 10 minuti, successivamente invertirle e incubare alla temperatura richiesta
per 18-24 ore.
3. Un risultato presunto positivo è definito come l’isolamento di colonie tipiche, sospette, o atipiche di Salmonella
spp. sulle piastre utilizzate.
4. Un presunto positivo isolato deve essere successivamente confermato dall’utilizzo di subcolture e appropriati test
biochimici e sierologici, come esposto dettagliatamente in MLG4.04 per campioni di prosciutto cotto o in FDA BAM
(capitolo 5, sezione D e E) per pomodori e cioccolato.
5. Se si ottiene un risultato negativo, si può evitare l’arricchimento del campione overnight ed un suo ulteriore
test.
6. Se si ottiene un risultato positivo da un pool di campioni, l’arricchimento del campione overnight può essere
ritestato per permettere l’identificazione del campione individuale del pool che ha prodotto il risultato positivo.
7. I campioni individuali che devono essere ri-analizzati devono essere riscaldati a 37±1°C prima di prelevare 10 ml
e trasferirli nel recipiente del campione. I campioni individuali devono essere ritestati immediatamente ripetendo gli
step dal 3.1 al 5.0-A (punto 3) precedentemente descritti.
B – Protocollo BAX® PCR
È importante – e responsabilità dell’operatore – seguire le istruzioni e il manuale dello strumento per le
informazioni riguardanti la corretta impostazione e funzionamento del sistema BAX® PCR.
1. Pipettare 25 μl della sospensione di sfere Pathatrix® nel tubo di lisi BAX e procedere secondo la procedura di lisi
BAX standard.
2. Una volta completato lo step di lisi, posizionare immediatamente il rack e i tubi sulla piastra magnetica per la
cattura (fornita) per almeno un minuto, questo permette alle sfere Pathatrix® di accumularsi sul fondo del tubo.
3. Il DNA target, se presente, sarà contenuto nel surnatante privo di sfere. Trasferirlo nel tubo di reazione BAX PCR
e procedere secondo le istruzioni operative DUPONT Qualicon.
4. I campioni individuali che devono essere rianalizzati devono essere riscaldati a 37±1°C prima di prelevare 10 ml
e trasferirli nel recipiente del campione. I campioni individuali devono essere ritestati immediatamente ripetendo gli
step dal 3.1 al 5.0-B (punto 3) precedentemente descritti.
Se si ottiene un risultato positivo durante la PCR, un’aliquota delle sfere Pathatrix® può essere piastrata seguendo gli
step dal 5.0-A (punto 1) al 5.0-A (punto 3).
C – Protocollo R.A.P.I.D.® LT PCR
È importante – e responsabilità dell’operatore – seguire le istruzioni e il manuale dello strumento per le
informazioni riguardanti la corretta impostazione e funzionamento del sistema R.A.P.I.D.® LT PCR.
1. Aggiungere 25 μl delle sfere Pathatrix® risospese nel “Blue Capped Bead Tube” e agitare con il “Disruptor Genie”
(equipaggiato con l’accessorio Turbo mix) per 5 minuti con l’impostazione più alta.
2. Una volta terminato lo step di lisi, posizionare immediatamente il Bead Tube su Magnetic Capture Rack fornito
(Matrix MicroScience, codice prodotto: MAGNETIC-RACK).
3. Attendere almeno un minuto per permettere alle sfere di essere catturate sul fondo del tubo producendo un
surnatante privo di sfere.
4. Pipettare 10 μl del Reconstitution Buffer nella vial del test “sconosciuto”.
5. Pipettare 10 μl del surnatante nella vial del test “sconosciuto” . Miscelare con cura per risospendere il pellet.
Prestare attenzione a non trasferire alcuna sfera nella vial per la PCR.
6. Trasferire 18 μl della sospensione reagente/campione nella parte superiore di un capillare in vetro per PCR .
Utilizzando il “Capping Tool“ fornito, posizionare il tappo sul capillare e spingere fermamente.
7. I campioni individuali che devono essere rianalizzati devono essere riscaldati a 37±1°C prima di prelevare 10 ml
e trasferirli nel recipiente del campione. I campioni individuali devono essere ritestati immediatamente ripetendo gli
step dal 3.1 al 5.0-C (punto 6) precedentemente descritti.
Se si ottiene un risultato positivo durante la PCR, un’aliquota delle sfere Pathatrix® può essere piastrata seguendo gli
step dal 5.0-A (punto 1) al 5.0-A (punto 3).
6.0
Interpretazione dei Risultati del Test & Classificazione
Pathatrix® AUTO “5” pooling test è un metodo progettato per rilevare la presenza/assenza di Salmonella spp. in
matrici alimentari. Utilizzando una tecnica di piastratura convenzionale, i presunti positivi (per esempio la presenza
di colonie “tipiche”) possono essere segnalati circa 40 ore prima della conferma.
Una volta confermati i risultati sono riportati come segue:
Salmonella spp.
rilevato in 25 – 325 g (matrici del campione)
Salmonella spp.
NON rilevato in 25 – 325 g (matrici del campione)
Fig1: Schema della strategia Pathatrix® 5 Pooling
Fig3: Attaccare il Kit Fase di Cattura
Fig2: Aggiunta delle sfere
Fig4: Caricare il Consumabile Pathatrix® nella Cassetta
APPENDICE A
Strumento Pathatrix® AUTO
Lo strumento Pathatrix® AUTO ha cinque posizioni di corsa indipendenti (con le associate cassette), un singolo display
centralizzato contenuto all’interno di un blocco di controllo (dotato di pulsanti di controllo separati) e indicatori LED per ogni
cassetta.
Le seguenti parti addizionali dello strumento sono inclusi con ogni strumento Pathatrix® AUTO:
Codice Prodotto
Descrizione
A-TUBE-HOLD
1 x Tube Holder
A-CART-HOLD
1 x Cartridge Holder
A-TUBE-RACK
1 x Tube Rack
Accessori Opzionali (non essenziali):
A-CART-RACK
Cartridge Rack
Test Kit Monouso
Il kit Pathatrix® AUTO Salmonella spp. 5 pooling test (Codice Prodotto: APS250-P) contiene:
50 x Pre-sterilized Sample & Elution Tube packs
50 x Pre-sterilized Capture Phase packs
50 x Pre-sterilized Flat Cap lids
50 x 50 µl dosi di anticorpo anti-Salmonella coattato alle sfere paramagnetiche
Sfere Cationiche
Le sfere paramagnetiche coattate con l’anticorpo sono fornite in un formato standard di 50 test/vial (2.5 ml di volume totale
= 50 μl per test). Sono trasportate a temperatura ambiente, alla consegna devono essere conservate a 4°C. Le sfere hanno
una durata di conservazione di 6 mesi e sono etichettate con una data di scadenza.
Molto importante: Mai congelare la sospensione di sfere Pathatrix®. Le sfere che sono soggette a
temperature di congelamento possono risultare inattive.
Strumenti Addizionali e Terreni Richiesti (non forniti come parti del kit)
Strumenti
Incubatore 37.0 ± 1.0ºC, 42.0 ±1.0ºC
Bilancia elettronica: capacità 500 g, sensibilità 0.1 g
Pipette 1-5 ml, 20-200 μl, 2-20 μl
Buste stomacher bags sterili
Puntali per pipette sterili e monouso
Loops da 10 µl sterili e monouso
Terreni e Soluzioni
I terreni e le soluzioni devono essere forniti da un produttore idoneo (per esempio Oxoid, Difco, Merck, etc) in forma
disidratata e devono essere preparati secondo le istruzioni del fornitore in modo da ottenere terreni e soluzioni adatti,
verificati da appropriati controlli CQ.
Terreno
Buffered Peptone Water
Tetrathionate (TT) Broth Base
XLD Agar
Brilliant Green Agar (Modificato)
Oxoid Code
CM0509
CM0029
CM0469
CM0329
Tampone Fosfato Salino (PBS)
(1 x concentrato in polvere; Fisher codice prodotto BPE661-10)
Componenti
cloruro di sodio 137mM CAS 7647-14-5
sodio fosfato dibasico 10mM CAS 7558-79-4
cloruro di potassio 2.7mM CAS 7447-40-7
Specifiche del Prodotto
pH di una soluzione 1x @ 25°C 7.3 - 7.5
DNasi
Non rilevato
RNasi
Non rilevato
Proteasi
Non rilevato
(Ogni bottiglia contiene 98.9 g per la ricostituzione in 10 L d’acqua)
Raccomandazioni Specifiche per un Elevato Background di Micro-flora
Per alcuni gruppi di alimenti, in particolare dove è presente un elevato background di micro-flora, i risultati del test per
Salmonella possono essere migliorati dall’utilizzo del terreno Tetrathionate (TT) broth invece del Buffered Peptone Water.
Attraverso questo metodo i livelli della contaminazione di background nelle piastre agar possono essere ridotti.
Esempi di gruppi alimentari che possono beneficiare dall’uso del TT broth sono: carne cruda, ortaggi crudi, insalate/frutta e
piatti pronti.
Informazioni TT broth
Materiali
Il terreno Tetrathionate broth base è disponibile in un formato da 500g della Oxid (codice CM29) (polvere “Lab-Lemco” 0.9
g/L: Peptone 4.5 g/L; estratto di lievito 1.8 g/L; cloruro di sodio 4.5 g/L; carbonato di calcio 25.0 g/L; sodio tiosolfato 40.7
g/L).
Soluzione iodica (aggiunta dopo la preparazione e la bollitura del TT broth base): iodio 6 g; ioduro di potassio 5 g; acqua
distillata 20 ml. Questa soluzione deve essere preparata in anticipo per permettere allo iodio di sciogliersi.
Istruzioni per l’uso
Aggiungere 77g di TT base ad 1 litro di acqua distillata e portare ad ebollizione. Portare sotto i 45°C e aggiungere 20 ml di
soluzione iodica, miscelare con cura.
Una volta bollito, il terreno preparato può essere conservato a 4°C per diverse settimane,;ma una volta aggiunto lo iodio
deve essere utilizzato in giornata e ogni eccesso deve essere eliminato.
APPENDICE B
Finalità d’Uso
Pathatrix® AUTO Salmonella spp. 5 pooling test è un prodotto destinato a utenti qualificati, permette di determinare la
presenza/assenza di Salmonella spp. in campioni alimentari. A titolo di esempio – ma non in modo esclusivo – è destinato
ai produttori alimentari, ai rivenditori, ai laboratori di microbiologia, etc.
Applicabilità
Pathatrix® AUTO Salmonella spp. 5 pooling test (approvato dall’AOAC-RI) è stato sviluppato per analizzare campioni
alimentari come prosciutto cotto, cioccolato e polpa di pomodoro. Il test è stato progettato per lavorare insieme al test
Pathatrix® standard per pool di campioni (un campione alimentare standard di 25 g, incubato con 225 ml di terreno, viene
arricchito per 24 ore a 37°C). 10 ml sono poi combinati con altri 4 campioni di 10 ml, a formare un pool di campioni da 50
ml, questo è poi sottoposto ad un ciclo standard Pathatrix® AUTO della durata di 15 minuti.
Limite di Rilevamento
Pathatrix® AUTO Salmonella spp. 5 pooling test è un metodo che determina la presenza/assenza del patogeno, è basato sul
rilevamento di 1-10 cfu (colonie che formano unità)/25-325 g di campione alimentare.
Il limite del test Pathatrix® Salmonella spp. 10 pooling test è dato dall’abilità dell’organismo target di riprodursi nel terreno
di arricchimento, di essere catturato dalle sfere di Pathatrix® e successivamente di essere isolato su una piastra selettiva.
L’assenza del target può essere dovuto alla sua non-presenza o all’incapacità dell’organismo di riprodursi adeguatamente
nel terreno per l’arricchimento (con la sua mancata crescita sulla piastra selettiva), questo può essere dovuto ad una flora
competitiva, a lesioni sub-letali, a inibitori, etc.
Protocollo di campionamento
La dimensione del campione alimentare standard utilizzato con il sistema Pathatrix® AUTO è di 25 g di cibo diluito in 225
ml di terreno di crescita. Si consiglia che i sub-campioni prelevati per le analisi siano processati immediatamente o, se è
richiesta una loro conservazione, che siano mantenuti a 4°C prima dell’analisi. Il campione arricchito rimanente deve essere
conservato fino a che non si ottenga, e si confermi, il risultato del test.
Preucazioni di Sicurezza
I campioni arricchiti potrebbero essere contaminati con organismi patogeni infettivi per l’uomo, per questo tutti i rifiuti
devono essere trattati come bio-pericolosi. Devono essere maneggiati e smaltiti utilizzando le pratiche di sicurezza di
laboratorio in conformità e in rispetto delle leggi locali, statali e federali.
L’operatore deve essere consapevole che tutti i terreni e tutte le soluzioni utilizzate possono essere bio-pericolosi, per questo
motivo devono essere trattati e smaltiti di conseguenza.
Si consiglia di far eseguire il test solo al personale qualificato/formato, e che siano rispettati tutti gli standard e
tutte le linee guida operative che riguardano la posizione in cui le prove devono essere svolte.
Utilizzare sempre tecniche asettiche e le buone pratiche di laboratorio. Indossare una maschera ogni volta che si prelevano
polveri. Prestare attenzione alla bollitura dell’agar prima della sterilizzazione in autoclave, e indossare dei guanti resistenti
al calore quando si maneggiano contenitori di liquidi caldi. Prestare attenzione quando si maneggiano piastre e recipienti
che possono contenere microrganismi; evitare la formazione di esalazioni in quanto possono essere presenti organismi
patogeni.
Salmonella spp. è un organismo che appartiene al Gruppo 2 (escluso S. typhi e S. paratyphi, che appartengono al Gruppo
3). Bisogna prestare attenzione quando si maneggiano campioni che possono contenere la salmonella. Il personale di
laboratorio deve essere adeguatamente formato a maneggiare agenti patogeni, prima di analizzare campioni per Salmonella
spp. I rifiuti devono essere smaltiti in conformità con la legislazione locale e nazionale.
DS_ed0/1011/APS250-P ITA_446
Distribuito in esclusiva da:
EuroClone S.p.A.
Via Figino 20/22, 20016 Pero (MI) - Italy
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