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conservazione ex situ

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CREAZIONE DELLA BANCA DEL GERMOPLASMA DELLA
VALLE D‘AOSTA, CON IL SUPPORTO DELLA
CARATTERIZZAZIONE GENETICA DI SPECIE VEGETALI
DI INTERESSE REGIONALE
RICERCATORE TEAM LEADER: FABIO GUGLIELMO
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
INTRODUZIONE:
DEFINIZIONE E FINALITÀ BANCA DEL GERMOPLASMA
Struttura per la conservazione ex situ
a lungo termine di specie vegetali
Crioconservazione di materiale in
grado di dare origine a nuovi individui
Reintroduzione e recupero di habitat
Ricerca biologia – ecologia specie
Risposta attiva a perdita di
biodiversità
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
INTRODUZIONE
LEGISLAZIONE CONSERVAZIONE SPECIE – PANORAMA
NAZIONALE ED INTERNAZIONALE
Piano Nazionale sulla
Biodiversità (DM 97/568)
A livello mondiale:
• 1700 Banche del germoplasma
• Millenium Seed Bank dei Kew Gardens di Londra
• Numerose reti internazionali (ENSCONET)
A livello italiano:
• 20 banche (fino al 2014 non presente in VDA)
• Rete nazionale (RIBES)
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
INTRODUZIONE
FASI OPERATIVE BANCA DEL GERMOPLASMA
Pianificazione e
Raccolta
Preparazione
Conservazione
Verifica
• Sopralluogo stazioni prelievo e raccolta dati
• Selezione popolazioni da campionare
• Campionamento semi maturi (<20% semi disponibili)
• Pulizia e controllo maturità semi
• Test germinabilità iniziale
• Deidratazione (15-20% UR – 15-20°C)
• Impacchettamento
• Crioconservazione (-20°C): collezione di base e collezione attiva
• Verifica germinabilità iniziale
• Verifica vitalità lotti
• Rigenerazione e duplicazione
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
INTRODUZIONE
PIANIFICAZIONE E RACCOLTA: PUNTI CRITICI
Individuazione e
identificazione specie
su base morfologica
Piante ad uno stadio giovanile
DNA barcoding
Plasticità fenotipica
Specie criptiche
Strategia di
campionamento
Biologia specie
Più popolazionipiù individui
Campioni non
rappresentativi delle
risorse genetiche
disponibili
DNA genotyping
Accessioni ridondanti
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
INTRODUZIONE
DNA BARCODING
Hebert et al. 2003: strumento di identificazione specifica
Analisi di una corta porzione di DNA con bassa variabilità
intraspecifica ed alta variabilità interspecifica
Etichetta per l’identificazione
Strumento rapido, accurato ed automatizzabile
Universale
Qualità della sequenza
Potere di discriminazione
Animali: marker mitocondriale CO1
Piante: combinazione di due marker plastidiali (CBOL 2009) + altri
marker supplementari
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
INTRODUZIONE
DNA GENOTYPING
Strumento di identificazione sub-specifica
Analisi di porzioni ipervariabili
Loci microsatellite o SSR (Simple Sequence Repeats):
• motivi ripetuti in tandem (1-6 nucleotidi);
• porzioni fiancheggianti relativamente conservate
Analisi della lunghezza dei loci (o N. repeats)
=
Locus (act):
A: 20 repeats
≠
B: 22 repeats
Tecnologia Next Generation Sequencing:
individuazione loci STR più semplice e meno costosa
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
OBIETTIVI
Valutare l’efficienza di differenti DNA barcode per
l’identificazione di specie vegetali spontanee da
conservare ex situ
Valutare la diversità genetica intra e inter popolazioni
di alcune delle specie vegetali da conservare ex situ
tramite marker SSR
Prove preliminari per l’allestimento della banca del
germoplasma vegetale della Valle d’Aosta
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
SELEZIONE DELLE SPECIE VEGETALI
Criterio di rarità e vulnerabilità
LR 45 del 07/12/2009 (All. A)
Lista Rossa e Nera della flora vascolare
della Valle d’Aosta (Poggio et al. 2010)
Libro Rosso delle Piante d’Italia (Conti
et al. 1992)
Direttiva 92/43/CEE «Habitat»
Convenzione di Berna (1979)
Convenzione di Washington (1973)
23 specie
DNA Barcoding e prove di
conservazione ex situ
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
SELEZIONE DELLE SPECIE VEGETALI
5 specie
DNA Genotyping
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
INDIVIDUAZIONE STAZIONI DI PRELIEVO E CAMPIONAMENTI
Dati bibliografici, Database FLORA
Coordinate UTM di ciascuna stazione
47 stazioni
18 comuni
Procedura operativa standard
Campionatori:
Laura Poggio
Claretta Christille
Isabella Vanacore Falco
Nicola Gérard
Pierluigi Guglielmo
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
INDIVIDUAZIONE STAZIONI DI PRELIEVO E CAMPIONAMENTI
Almeno 3 individui a stazione
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
ESTRAZIONE DEL DNA
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
PROVE DNA BARCODING: MARKER SAGGIATI
1. rbcL (600 bp): RUBISCO
Marker plastidiali
Facilmente amplificabile e
sequenziabile
Qualità sequenze elevata
Basso potere discriminatorio
2. matK (900 bp): Maturasi K
Elevato potere discriminatorio
Qualità sequenze elevata
Non sempre amplificabile
3. trnH-psbA (300 - 1100 bp):
Spaziatore intergenico
Elevato potere discriminatorio
Qualità sequenze bassa
Difficile allineamento
4. ITS (500 - 900 bp): Spaziatori
interni trascritti
Marker nucleare
Elevato potere discriminatorio
Possibilità copie paraloghe
Possibilità contaminazione fungina
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
PROVE DNA BARCODING: FASI OPERATIVE
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Elettroforesi su gel di agarosio
Purificazione prodotti PCR
Cycle sequencing
Purificazione prodotti
Elettroforesi a capillari
Editing sequenze
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
PROVE DNA BARCODING: VALUTAZIONE EFFICIENZA
Prodotti PCR su gel dopo elettroforesi
Qualità amplificazione PCR
Barcode universale?
Elettroferogramma forward e reverse
Qualità della sequenza
Barcode accurato?
Efficienza di discriminazione
Barcode specifico?
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
PROVE DNA GENOTYPING: MARCATORI STR TRAMITE NGS
200 Mbp di sequenze a specie
Ricerca 30 loci STR e
disegno primer
Selezione 10-15 loci STR
polimorfici
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
PROVE DNA GENOTYPING – STRATEGIA DI CAMPIONAMENTO
A
B
C
4
4
Analisi loci SSR
A
B
4
4
A
B
4
4
A
B
4
4
C
Pochi individui in
tutte le popolazioni
C
Tanti individui da
una popolazione
C
Tanti individui da
tutte le popolazioni
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
MATERIALI
E METODI
PROVE DI CONSERVAZIONE EX SITU
Prove preliminari di conservazione ex situ
Allestimento banca
Campionamenti (<20% semi disponibili)
Pulizia semi (setacci, pennelli,
stereomicroscopio)
Prove deidratazione (3,5%-6,5% UR)
Impacchettamento e crioconservazione
Prove di germinazione iniziale
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
RISULTATI
CAMPIONAMENTI
Specie vegetale
Aethionema thomasianum
Anemone narcissiflora
Astragalus alopecurus
Carex atrofusca
Carex otrubae
Cladium mariscus
Coincya richeri
Cypripedium calceolus
Dactylorhiza cruenta
Epipactis palustris
Fritillaria orientalis
Gladiolus palustris
Iris sibirica
Matteuccia struthiopteris
Potentilla multifida
Potentilla palustris
Potentilla pensylvanica
Salvia aethiopis
Schoenus ferrugineus
Trifolium saxatile
Typha minima
Utricularia australis
Veronica allionii
Alyssum montanum
Astragalus onobrychis
Astragalus sp.
Epipactis atrorubens
Tulipa australis
Utricularia minor
Totale
Campioni raccolti
26
5
15
3
0
3
6
16
6
56
0
0
0
0
3
4
25
5
6
3
3
9
3
6
7
3
2
2
1
218
Stazioni indagate
3
1
4
1
0
1
2
3
2
6
2
2
2
0
2
1
3
1
2
1
1
3
1
2
1
1
1
1
1
51
Specie non più ritrovate…
estinte in VDA?
Banca del germoplasma
Specie ritrovate!!!
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
RISULTATI
PROVE DNA BARCODING
Estrazione DNA:
PCR:
155 campioni
155 (rbcL e matK)
21 specie
79 (trnH-psbA e ITS)
Sequenziamento:
456 sequenze
Qualità amplificazione PCR
S. aethiopis: problemi di estrazione
160
155 153
155 154
rbcL-matK~ 99%
140
U. australis
C. atrofusca
120
100
79
80
71
C. mariscus
S. ferrugineus
79
trnH-ITS~ 90-91%
72
40
Campioni sottoposti
a PCR
20
Esito positivo
60
0
rbcL
matK
trnH-psbA
ITS
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
RISULTATI
PROVE DNA BARCODING
Qualità sequenze
60
53 53
54 54
49
37
40
rbcL-matK~ 100%
47 45
50
30
20
Campioni
sottoposti a PCR
ITS~ 96%
Sequenza ok
trnH-ITS~ 76%
10
0
rbcL
matK
trnH-psbA
ITS
trnH-psbA: problema mononucleotide repeats
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
RISULTATI
PROVE DNA BARCODING
Efficienza discriminazione
Dati preliminari
matK
E. atrorubens
E. palustris
rbcL
E. atrorubens
E. palustris
NO variabilità!
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
RISULTATI
PROVE DNA GENOTYPING
E
PROVE
DI CONSERVAZIONE EX SITU
Allestimento librerie genomiche
Allestimento Banca del germoplasma e campionamenti
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
PROSPETTIVE
RICERCHE COMPLEMENTARI E/O PARALLELE
Specie selezionate
DNA Barcoding campioni
erbario MRSN
Briofite (specie
protette)
Progetto tirocinio: Prove di DNA barcoding e di conservazione ex siti di
Leontopodium alpinum
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
GRAZIE
PER L’ATTENZIONE
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