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BCA Protein Assay Reagent 日本語マニュアル

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Pierce BCA Protein Assay Kit
このインストラクションは英語版インストラクションを元にした日本語版です。内容は最新の英語
版インストラクションとは異なることがあります。詳細に関しては最新の英語版インストラクション
(www.thermoscientific.com/pierce)をご確認ください。
23225
23227
製品コード
説明
23225
Pierce BCA Protein Assay Kit, テストチューブ法で 500 回分またはマイクロプレート法で
5000 回分
23227
Pierce BCA Protein Assay Kit, テストチューブ法で 250 回分またはマイクロプレート法で
2500 回分
キット内容:
BCA Reagent A, 1000mL(製品コード 23225 の場合)または 500mL(製品コード 23227 の
場 合 ) , containing sodium carbonate, sodium bicarbonate, bicinchoninic acid and
sodium tartrate in 0.1M sodium hydroxide
BCA Reagent B, 25mL, containing 4% cupric sulfate
Albumin Standard Ampules, 2mg/mL, 10 × 1mL ampules, containing bovine serum
albumin (BSA) at 2mg/mL in 0.9% saline and 0.05% sodium azide
保管温度: 室温
Note: 輸送中または保管中の温度低下により Reagent A や Reagent B に析出がみられた
場合は、加温しながら緩やかに撹拌して析出物を溶かしてください。保管中に変色や微生物
のコンタミネーションが認められた場合は使用せず廃棄してください。
目次
概要
.........................................................................................................................................
スタンダードと Working Reagent(WR)の調製
1
.................................................................
2
テストチューブ法の手順(サンプル:WR = 1:20)
.............................................................
4
マイクロプレート法の手順(サンプル:WR = 1:8)
............................................................
5
...........................................................................................................
6
補足情報 ...................................................................................................................................
7
トラブルシューティング
Thermo Scientific 関連製品
.................................................................................................... 10
文献 .......................................................................................................................................... 10
1
概要
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay は、ビシンコニン酸(bicinchoninic acid, BCA)を利用した比色
法に基づく総タンパク質定量法です。2 価の銅イオン(Cu2+)がアルカリ条件下でタンパク質により 1 価の銅イオ
ン(Cu+)に還元されると、反応液中に存在する BCA 2 分子と 1 価の銅イオン(Cu+) 1 分子がキレート錯体を
形成し紫色を呈色します 1。この水溶性の複合体は 562nm に強い吸収を示し、広範囲のタンパク質濃度域
(20-2000µg/mL)において、タンパク質濃度にほぼ直線的に比例して吸光度が上昇します。なお、BCA 法はエ
ンドポイントアッセイではないため、プロトコルに記載された時間インキュベーションした後も発色反応は継続し
ますが、その発色反応は遅く、サンプル間の誤差は通常許容できるレベルに抑えることができます。
発色反応には、タンパク質の分子構造、ペプチド結合の数、特定のアミノ酸(システイン、シスチン、トリプトファ
ン、チロシン)が関与することが報告されていますが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、タンパク質を用
いた実験から、タンパク質全体としての発色強度は個々のアミノ酸の発色強度データ値の総和とは相関がない
ことが示唆されています 2。サンプル中の総タンパク質濃度は、BSA(ウシ血清アルブミン)のようなタンパク質
スタンダードの濃度に対して相対的に測定します。具体的には濃度が分かっているスタンダードの希釈系列と
サンプルのそれぞれについて、BCA 発色反応を行い、スタンダードの吸光度から得られる検量線を元にして
目的サンプルのタンパク質濃度を相対的に決定します。目的タンパク質の濃度をなるべく正確に測定する必要
がある場合は、目的タンパク質と近い性質のスタンダードを用いて測定することをおすすめします。例えば免疫
グロブリンサンプルの濃度測定を行う場合は BGG(ウシγグロブリン)がスタンダードとしてよく利用されます。
アッセイ手順として 2 つの方法があります。1つはテストチューブ法です。サンプル容量が 0.1mL と多くなります
が、サンプル対 Working Reagent(BCA Reagent A および B を混合して調製した試薬)を 1:20 の容量比で使
用できるためサンプル中の阻害因子の影響をある程度抑えることができます。もう1つはマイクロプレート法で
す。操作が容易でサンプル容量は少なくて済む(10-25µL)半面、サンプル対 Working Reagent の容量比が
1:8 のためテストチューブ法に比べるとサンプル中の阻害因子の影響を受けやすくなります。
スタンダードと Working Reagent(WR)の調製
A. アルブミン(BSA)スタンダードセットの調製
表 1 の調製ガイドに従い、Alubmin Standard (BSA)アンプルから順次希釈してスタンダードの系列希釈セット
を調製します。希釈液には、可能であればサンプルと同じ溶媒を使用することをおすすめします。Albumin
Standard(2mg/mL, 1mL)のアンプルには、表 1 のスタンダードセットの調製に充分な量が入っています。また
表 1 に従うと、各濃度でそれぞれ少なくとも 3 回ずつ(triplicate で)BCA Protein Assay に使用できる量のスタ
ンダードが調製できます。
2
表1. スタンダードセット調製ガイド
スタンダード テストチューブ法とマイクロプレート法のための希釈スキーム
(測定レンジ 20-2,000µg/mL)
チューブ
A
B
C
D
E
F
G
H
I
チューブ
A
B
C
D
E
F
希釈液の容量
希釈前 BSA 溶液の容量
(µL)
(µL)
0
アンプル 300
125
アンプル 375
325
アンプル 325
175
チューブ B 175
325
チューブ C 325
325
チューブ E 325
325
チューブ F 325
400
チューブ G 100
400
0
エンハンスド テストチューブ法のための希釈スキーム
(測定レンジ 5-250µg/mL)
希釈液の容量
(µL)
700
400
450
400
400
400
希釈前 BSA 溶液の容量
(µL)
アンプル 100
チューブ A 400
チューブ B 300
チューブ C 400
チューブ D 100
0
BSA 溶液の終濃度
(µg/mL)
2000
1500
1000
750
500
250
125
25
0 = ブランク
BSA 溶液の終濃度
(µg/mL)
250
125
50
25
5
0 = ブランク
B. BCA Working Reagent (WR)の調製
1. 次の式に従って WR の必要量を計算します。
[スタンダードの数 + 測定サンプルの数] × [反復回数(replicate 数)]
× [1 回あたりの WR 量] = WR
の必要量
例:[スタンダード 9 点 + サンプル 3 個] × [2 回(duplicate)] × [2mL] = 48mL
Note: この例ではテストチューブ法を想定しているため 1 回あたりに必要な WR 量は 2mL です。マイクロプ
レート法の場合 1 回あたりに必要な WR の量は 200µL です。
2. 50 容量の BCA Reagent A に対して 1 容量の Reagent B を混合します(Reagent A:B = 50:1)。上記の例
では 48mL 必要なので、少し余裕をみて 50mL の Reagent A と 1mL の Reagent B を混合して 51mL を調
製します。
Note: Reagent A に Reagent B を混合すると濁りを生じますが、撹拌して混合すると濁りは消えて透明な緑
色の溶液になります。WR はアッセイ回数に合わせて充分量調製してください。調製した WR は密閉して保
存すれば室温で数日間安定です。
3
実験手順の概要(スタンダード テストチューブ法の場合)
テストチューブ法の手順(サンプル:WR = 1:20)
1. スタンダードとサンプルをそれぞれ 0.1mL ずつチューブ(2.5mL 以上のプラスチックチューブ)に添加しま
す。
2. 各チューブに WR を 2.0mL ずつ添加します。
3. チューブを蓋して次の条件でインキュベーションします。

スタンダードプロトコル:
37℃、30 分(測定レンジ = 20-2000µg/mL)

RT(室温)プロトコル:
室温、2 時間(測定レンジ = 20-2000µg/mL)

エンハンスド プロトコル:
60℃、30 分(測定レンジ = 5-250µg/mL)
Note:

インキュベーションの時間を長くする、または温度を上げると 562nm での吸光度測定値が上昇し測定
レンジが狭くなります。

液槽インキュベーターを用いて 37℃(スタンダード プロトコルの場合)または 60℃(エンハンスド プロト
コルの場合)で反応させてください。気相のインキュベーターを用いた場合、温度ムラにより測定誤差を
生じることがあります。
4. チューブを室温に戻します。
5. 分光光度計の波長を 562nm にセットし、水を入れたキュベットを測定しゼロ点を合わせます。続いてスタン
ダードやサンプルの吸光度を測定します。測定は基本的に 10 分以内に終了してください。
Note: BCA アッセイはエンドポイントアッセイではないため、室温に戻した後も反応は進みます。しかし、室
温以下では発色反応は遅いため、全てのチューブについて 562nm での吸光度測定を 10 分以内に行えば
誤差は許容できるレベルに抑えることができます。
6. 全てのスタンダードとサンプルについて、562nm での吸光度からブランクの平均吸光度を差し引きます。
7. スタンダードセットの各濃度に対してブランク補正後の平均吸光度をプロットし、検量線を作成します。検量
線を用いてサンプルの総タンパク質濃度を算出します。
4
マイクロプレート法の手順(サンプル:WR = 1:8)
1. スタンダードとサンプルをそれぞれ 25µL ずつマイクロプレート(Thermo Scientific Pierce 96-Well Plates
(製品コード 15041)など)のウェルに添加します(測定レンジ = 20-2000µg/mL)。
Note:サンプル量が少ない場合はスタンダードとサンプルの使用液量を 10µL にすることができますが、サ
ンプル(およびスタンダード)と WR の混合比はサンプル:WR = 1:20 にする必要があり、また測定レンジは
125-2000µg/mL となります。
2. 各ウェルに WR を 200 µL ずつ添加し、プレートシェーカー上で 30 秒間よく撹拌します。
3. プレートにカバーをかぶせ、37℃で 30 分間インキュベートします。
4. プレートを室温に戻し、プレートリーダーを用いて 562nm で吸光度を測定します。
Note:

測定波長は 540-590nm の範囲で可能です(ただし 562nm から遠ざかるほど測定精度が低くなりま
す)。

プレートリーダーを用いた場合、測定溶液中の光の透過距離は分光光度計でキュベットを用いた場合
に比べて短くなります。測定レンジをスタンダード テストチューブ法と同じ条件にするため、マイクロプ
レート法では WR に対するサンプル液量の比率が大きくなります。

インキュベーション時間を長くする、もしくは WR に対するサンプル液量の比率を大きくすると、562nm
での吸光度測定値が上昇し測定レンジが狭くなります。
5. 全てのスタンダードとサンプルについて、562nm での吸光度からブランクの平均吸光度を差し引きます。
6. スタンダードセットの各濃度に対してブランク補正後の平均吸光度をプロットし、検量線を作成します。検量
線を用いてサンプルの総タンパク質濃度を算出します。
Note: マイクロプレートリーダーのカーブフィッティングアルゴリズムを利用する場合は、4-パラメーター
(quadratic)または best-fit curve を適用することによりリニア―フィットと比べてより適切な結果が得られま
す。検量線を手書きで作成する場合は、無理に全ての点に近い直線を引くよりもプロットした点と点を線で
つなぐ方法をおすすめします。
5
トラブルシューティング
問題
発色が見られない
考えられる原因
対策
サンプル中に銅イオンの
透 析 、 ゲ ル ろ 過 、 ま た は Compat-Able Protein
キレート剤が含まれている
Assay Preparation Reagent Set ( 製 品 コ ー ド
23215)を用いて阻害成分を除去する、
サンプルを希釈して影響を抑制する、
WR における銅イオンの濃度を増加させる(例:
Reagent A:B = 50:2 で使用)
ブランクは問題ない
強酸または強塩基性のバ
透析またはゲルろ過によりバッファー置換を行う
が、スタンダードとサン
ッファーにより WR の pH
か、サンプルを希釈する
プルの発色が期待され
が大きくずれている
るより弱い
測定波長が間違っている
562nm で吸光度測定する
サンプルの発色が期待
タンパク質濃度が高すぎ
サンプルを希釈する
されるより強い
る
サンプル中に脂質やリポ
サンプルへの 2% SDS の添加により脂質による阻
タンパク質が含まれている
害を抑制できる場合がある 3
Compat-Able
Protein
Assay
Preparation
Reagent Set(製品コード 23215)を用いて阻害成
分を除去する
ブランクを含む全ての
バッファー中に還元剤が
透 析 ま た は Compat-Able Protein Assay
チューブで紫色に発色
含まれている
Preparation Reagent Set(製品コード 23215)を
する
バッファー中にチオールが
用いて阻害成分を除去する、
含まれている
サンプルを希釈して影響を抑制する
バッファー中に生体アミン
(カテコールアミン)が含ま
れている
562 nm の波長で測定
分光光度計やプレートリー
540nm から 590nm の範囲で測定する
できない
ダーが 562 nm での測定
(562nm から離れるほど測定精度が低くなる)
に対応していない
A. 阻害成分
還元性物質、キレート剤、強酸または強塩基は BCA アッセイを阻害することが知られています。通常、これら
の成分は低濃度でもアッセイを阻害することが知られているため、少なくとも次の成分はサンプル中に含まれ
ないようにしてください。
アスコルビン酸
EGTA
鉄
低純度ショ糖
カテコールアミン
低純度グリセロール
脂質
トリプトファン
クレアチン
過酸化水素
メリビオース
チロシン
システイン
ヒドラジド
フェノールレッド
尿酸
他の成分でも BCA アッセイが阻害されますが、多くの場合、ある濃度(共存許容濃度)以下ではアッセイにほと
んど影響がありません。スタンダード テストチューブ法を用いた BCA アッセイにおける各種成分の共存許容濃
6
度は表 2 にまとめています(本取扱説明書の 9 ページ参照)。表 2 に記載の成分濃度は、スタンダード テスト
チューブ法において、その成分を含まない条件と比べてタンパク質の測定濃度の誤差が 10%以下に抑えられ
る成分濃度です。サンプルと Working Reagent(WR)の混合比がサンプル:WR = 1:8 のマイクロプレート法に
おいては、各成分の共存許容濃度が表 2 に記載の濃度より低くなる場合があります。また、表 2 に記載の濃度
はあくまで各成分が単独で存在する場合の共存許容濃度です。他の成分が混合されると、個々の成分濃度が
表 2 に記載の濃度以下であっても BCA アッセイが阻害されることがあります。
B. 阻害成分の影響を抑える方法
BCA アッセイを阻害する成分が含まれる場合には、次のいずれかの方法を検討します。

透析またはゲルろ過により阻害成分を除去します。

サンプルを希釈して阻害成分の影響を抑えます。サンプルのタンパク質濃度が高く、希釈後もタンパク質
濃度が測定レンジ内にある場合に有効です。

アセトンやトリクロロ酢酸(TCA)を用いてサンプル中のタンパク質を沈殿させた後、遠心上清に回収され
る阻害成分を除去し、遠心ペレットを水または BCA Working Reagent で溶解します 4。詳細な方法はウェ
ブサイト(www.thermoscientific.com/pierce)の Technical Resources に掲載している Tech Tip #8 をご
覧ください。または Compat-Able Protein Assay Preparation Reagent Set(製品コード 23215)を使用し
て阻害成分を除去してください。

Working Reagent(WR)中の銅イオン濃度を高めてサンプル中の銅イオンキレート剤の影響を抑えます
(例:Reagent A:B = 50:2 または 50:3 で使用)。
補足情報
A. ウェブサイト(www.thermoscientific.com/pierce)に掲載している情報
 Tech Tip #8: Eliminate interfering substances from samples for BCA Protein Assay
B. BCA アッセイ以外の総タンパク質定量試薬
還元剤や金属キレート剤による阻害を抑えることができない場合には、Pierce 660nm Protein Assay Kit(製
品コード 22662)または Thermo Scientific Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit(製品コード 23236)を検
討してください。
C. ガラス器具の再使用と洗浄
ガラス器具を再使用する場合は、よく洗浄した後に必ず超純水でリンスしたガラス器具を使用してください。
D. BCA 発色反応のタンパク質間差
通常、総タンパク質定量法ではタンパク質の種類が異なると発色のばらつきを生じます。ばらつきは、アミノ酸
配列、pI、構造、側鎖、補欠分子族が関係しています。多くのタンパク質定量法でウシ血清アルブミンかイムノ
グロブリンがスタンダードとして利用されます。図 1 は BCA Protein Assay における BSA(Bovine Serum
Albumin)と BGG(Bovine Gamma Globulin)の検量線です。より正確な測定が必要な場合、可能であれば、
測定したいタンパク質の精製標品をスタンダードとして使用することをおすすめします。表 3 には BCA Protein
Assay を用いた場合のタンパク質間のばらつきを表しています。各タンパク質は 1000µg/mL に調製して BCA
スタンダード テストチューブ法(37℃、30 分インキュベーション)に基づいて吸光度測定し、その平均値を BSA
の平均吸光度に対する比で表わしています。
7
図 1. スタンダード テストチューブ法(37℃、30 分インキュベーション)による BSA と BGG の検量線
表 3. タンパク質間差
各タンパク質の BSA に対する吸光度(562nm)の比を記載しました。アッセイにはスタンダード テストチューブ
法を使用しました。
比の定義 =
(各タンパク質の平均吸光度)/(BSA の平均吸光度)
タンパク質
Albumin, bovine serum
Aldolase, rabbit muscle
α-Chymotrypsinogen, bovine
Cytochrome C, horse heart
Gamma globulin, bovine
IgG, bovine
IgG, human
IgG, mouse
IgG, rabbit
IgG, sheep
Insulin, bovine pancreas
Myoglobin, horse heart
Ovalbumin
Transferrin, human
標準偏差
変動係数
8
比
1.00
0.85
1.14
0.83
1.11
1.21
1.09
1.18
1.12
1.17
1.08
0.74
0.93
0.89
1.02
0.15
14.7%
表 4. Pierce BCA Protein Assay(スタンダード テストチューブ法)における成分共存許容濃度§
成分
共存
成分
共存
許容濃度
許容濃度
塩/バッファー
界面活性剤**
ACES, pH 7.8
25mM
Brij-35
5.0%
Ammonium sulfate
1.5M
Brij-56, Brij-58
1.0%
Asparagine
1mM
CHAPS, CHAPSO
5.0%
Bicine, pH 8.4
20mM
Deoxycholic acid
5.0%
Bis-Tris, pH 6.5
33mM
Octyl β-glucoside
5.0%
Borate (50mM), pH 8.5 (# 28384)
undiluted
Nonidet P-40 (NP-40)
5.0%
B-PER Reagent (#78248)
undiluted
Octyl β-thioglucopyranoside
5.0%
Calcium chloride in TBS, pH 7.2
10mM
SDS
5.0%
Na-Carbonate/Na-Bicarbonate
undiluted
Span 20
1.0%
Triton X-100
5.0%
(0.2M), pH 9.4 (# 28382)
Cesium bicarbonate
100mM
Triton X-114, X-305, X-405
1.0%
CHES, pH 9.0
100mM
Tween-20, Tween-60, Tween-80
5.0%
Na-Citrate (0.6M), Na-Carbonate 1:8 dilution*
Zwittergent 3-14
1.0%
(0.1M), pH 9.0 (# 28388)
キレート剤
Na-Citrate (0.6M), MOPS (0.1M), 1:8 dilution*
EDTA
10mM
EGTA
-------pH 7.5 (#28386)
Cobalt chloride in TBS, pH 7.2
0.8mM
Sodium citrate
200mM
EPPS, pH 8.0
100mM
還元剤/チオール含有剤
Ferric chloride in TBS, pH 7.2
10mM
N-acetylglucosamine in PBS, pH 10mM
7.2
Glycine•HCl, pH 2.8
100mM
Ascorbic acid
-------Guanidine•HCl
4M
Cysteine
-------HEPES, pH 7.5
100mM
Dithioerythritol (DTE)
1mM
Imidazole, pH 7.0
50mM
Dithiothreitol (DTT)
1mM
MES, pH 6.1
100mM
Glucose
10mM
MES (0.1M), NaCl (0.9%), pH 4.7 undiluted
Melibiose
-------2-Mercaptoethanol
0.01%
(#28390)
MOPS, pH 7.2
100mM
Potassium thiocyanate
3.0M
Modified Dulbecco’s PBS, pH 7.4 undiluted
Thimerosal
0.01%
(#28374)
その他の成分および溶媒
Nickel chloride in TBS, pH 7.2
10mM
Acetone
10%
PBS; Phosphate (0.1M), NaCl undiluted
Acetonitrile
10%
Aprotinin
10mg/L
(0.15M), pH 7.2 (# 28372)
PIPES, pH 6.8
100mM
DMF, DMSO
10%
RIPA lysis buffer; 50mM Tris, undiluted
DMSO
10%
Ethanol
10%
150mM NaCl, 0.5% DOC, 1%
Glycerol (Fresh)
10%
NP-40, 0.1% SDS, pH 8.0
Sodium acetate, pH 4.8
200mM
Hydrazides
-------Sodium azide
0.2%
Hydrides (Na2BH4 or NaCNBH3)
-------Sodium bicarbonate
100mM
Hydrochloric Acid
100mM
Sodium chloride
1M
Leupeptin
10mg/L
Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4
200mM
§
より詳細なリストはウェブサイト
Sodium phosphate
100mM
(www.thermoscientific.com/pierce)の Technical
Tricine, pH 8.0
25mM
Resources に掲載している Tech Tip #68 を参照し
Triethanolamine, pH 7.8
25mM
てください。
Tris
250mM
* 超純水で希釈
TBS; Tris (25mM), NaCl (0.15M), undiluted
** 高純度で過酸化物の少ない Thermo Scientific
pH 7.6 (# 28376)
Surfact-Amp 製品を使用
Tris (25mM), Glycine (192mM), pH 1:3 dilution*
--- は少量でも適合しないことを示します。
8.0 (# 28380)
9
Thermo Scientific 関連製品
15041
Pierce 96-Well Plates, 100/pkg
15075
Reagent Reservoirs, 200/pkg
15036
Sealing Tape for 96-Well Plates, 100/pkg
23209
Albumin Standard Ampules, 2mg/mL, 10 × 1mL ampules, containing bovine serum albumin
(BSA)
23208
Pre-Diluted Protein Assay Standards: Bovine Serum Albumin (BSA) Set, 7 × 3.5mL
23212
Bovine Gamma Globulin Standard, 2mg/mL, 10 × 1mL ampules
23213
Pre-Diluted Protein Assay Standards, (BGG) Set, 7 × 3.5mL aliquots
23235
Pierce Micro BCA Protein Assay Kit, working range of 0.5-20μg/mL
23236
Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, working range of 1-1500μg/mL
23215
Compat-Able Protein Assay Preparation Reagent Set
23250
Pierce BCA Protein Assay Kit−Reducing Agent Compatible
引用文献
1.
Smith, P.K., et al. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem
150:76-85.
2.
Wiechelman, K., et al. (1988). Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: Identification of
the groups responsible for color formation. Anal Biochem 175:231-7.
3.
Kessler, R. and Fanestil, D. (1986). Interference by lipids in the determination of protein using
bicinchoninic acid. Anal Biochem 159:138-42.
4.
Brown, R., et al. (1989). Protein measurement using bicinchoninic acid: elimination of interfering
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文献
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Prozialeck, W.C., et al. (2002). Chlamydia trachomatis disrupts N-cadherin-dependent cell-cell junctions
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Roberts, K.P., et al. (2002). A comparative analysis of expression and processing of the rat epididymal
fluid and sperm-bound forms of proteins D and E. Biology of Reproduction 67:525-33.
最新の英語版インストラクションは www.thermoscientific.com/pierce にてご覧いただけます。
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BCA Protein Assay Kit / 201405
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