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CTD 第 2 部 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.1 緒言 MSD 株式

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CTD 第 2 部
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.1 緒言
MSD 株式会社
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.1 緒言
目次
頁
図一覧............................................................................................................................................................. 2
略号及び用語の定義..................................................................................................................................... 3
2.6.1 緒言............................................................................................................................................. 4
2.6.1 緒言
- 1
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.1 緒言
図一覧
頁
図2.6.1: 1
バニプレビルの化学構造..................................................................................................... 4
2.6.1 緒言
- 2
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.1 緒言
略号及び用語の定義
略語
バニプレビル
AIDS
HCV
HIV
Vaniprevir
Acquired immune deficiency syndrome
Hepatitis C virus
Human immunodeficiency virus
定義
IRF-3
NS3/4A
PEG-IFN
RNA
Interferon regulatory factor-3
Non-structural (protein) 3/4A
Pegylated interferon
Ribonucleic acid
開発番号:MK-7009、
エイズ、後天性免疫不全症候群
C 型肝炎ウイルス
ヒト免疫不全ウイルス、エイズ・ウイル
ス
インターフェロン調節因子-3
非構造(蛋白質)3/4A
ペグインターフェロン
リボ核酸
2.6.1 緒言
- 3
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.1 緒言
2.6.1
緒言
バニプレビル(MK-7009、
)は、C 型肝炎ウイルス(HCV)感染治療のため創製し
た経口抗ウイルス薬であり、HCV の非構造蛋白質3/4A(NS3/4A)プロテアーゼに可逆性に結合
する大環状ペプチド構造を有する阻害薬である。その化学構造式を[図2.6.1: 1]に示す。
図 2.6.1: 1
バニプレビルの化学構造
(5R,7S,10S)-10-(1,1-Dimethylethyl)-N-{(1R,2R)-1-[N-(cyclopropanesulfonyl)carbamoyl]-2-ethylcyclopropyl
}-15,15-dimethyl-3,9,12-trioxo-2,3,5,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17,18,19-hexadecahydro-2,23:5,8-dimethano-1
H-benzo[n][1,10,3,6,12]dioxatriazacyclohenicosine-7-carboxamide
NS3/4A 蛋白質は、前駆体ポリ蛋白質から構造蛋白質と非構造蛋白質への切断を触媒するセリ
ンプロテアーゼ活性、並びに RNA ヘリカーゼ活性の両方を有しており、いずれの活性も HCV の
複製に不可欠である。In vitro の解析では、NS4A 補助因子の存在下でのみ、NS3プロテアーゼの
顕著な活性が認められている。N 末端に NS4A ペプチドが結合した完全長 NS3の結晶構造解析か
ら、
その構造はプロテアーゼ活性とヘリカーゼ活性に対応した2つの球状ドメインが短いリンカー
鎖で結合していることが明らかにされている。さらに、NS3/4A のプロテアーゼ活性は、前駆体
ポリ蛋白質のプロセシングを行う役割に加えて、細胞内のウイルス感染防御機構活性化に重要な
インターフェロン調節因子-3(IRF-3)経路を介したシグナル伝達を阻害することにより、ウイル
スに対する自然免疫の阻害にも関与するとされている。したがって、NS3/4A の活性を阻害する
ことにより、ウイルスの前駆体ポリ蛋白質プロセシングが阻害されるのみならず、細胞性自然免
疫応答が速やかに回復する可能性も示唆されている[資料4.3: 4] [資料4.3: 5]。
ウイルスのポリメラーゼやプロテアーゼが治療薬の標的分子として有望視された理由は、これ
らの分子を阻害することによりウイルスの RNA 鎖合成を特異的に阻害し、それによって増殖に
必要なウイルスゲノム RNA の生成を阻止できるためである。既承認の抗ウイルス薬のうち、ウ
イルスのプロテアーゼを標的としたものは比較的少なく、大部分はヒト免疫不全ウイルス(HIV)
/後天性免疫不全症候群(AIDS)の治療に現在用いられているような各種 HIV 逆転写酵素阻害剤
2.6.1 緒言
- 4
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.1 緒言
など、ウイルスのポリメラーゼを直接標的とするものである。非 A/非 B 型ウイルス性肝炎の原因
物質として HCV が特定されたのは比較的最近であり[資料4.3: 6]、その後まもなく、NS3プロテア
ーゼの結晶構造が明らかにされた[資料4.3: 7]。従って有望な治療標的として NS3/4A が最初に提
案されたのは、NS3/4A の同定とほぼ同時期ではあったが[資料4.3: 8]、HCV プロテアーゼに特異
的な抗ウイルス薬の開発にはずみがついたのは、NS3/4A 組換え蛋白質が利用できるようになっ
たことと HIV プロテアーゼ阻害剤により HIV 感染の蔓延を抑えることに成功したことによる。
近年、NS3/4A プロテアーゼを標的とした共有結合性で緩徐な可逆的結合を示す阻害剤や非共
有結合性で可逆的結合を示す阻害剤が複数開発されている。米国及び欧州では共有結合性で緩徐
な可逆的結合を示す阻害剤であるボセプレビル及びテラプレビルの2種類が HCV 感染症治療薬と
して承認されているが、日本で既承認の薬剤はテラプレビルのみである。非共有結合性の阻害薬
の探索は、酵素切断により生成された N 末端由来産物で NS3/4A プロテアーゼがフィードバック
抑制を受けるという知見により、促されることになった。その探索により見いだされた非切断性
の大環状構造を有する類縁化合物からなる阻害薬群は、標的分子に対して高い選択性と可逆的な
結合を示すペプチド構造の化合物であり、バニプレビルもその一つである。
バニプレビルには、エラスターゼやトリプシン等その他のセリンプロテアーゼよりも NS3/4A
プロテアーゼへの優れた選択性が認められるが、キモトリプシンへの弱い阻害活性もみられる。
また、HCV genotype 1a 及び1b 由来の NS3/4A プロテアーゼ活性と、それら genotype のレプリコ
ンのウイルス複製への阻害がみられる。さらに、HCV 感染チンパンジーへの投与により、血漿中
ウイルス RNA レベルの速やかかつ顕著な低下がみられている。
一連の臨床試験の結果から、ペグインターフェロン(PEG-IFN)α-2b とリバビリンの併用下で
の慢性 HCV 患者に推奨されるバニプレビルの臨床用法・用量は、1回300 mg を1日2回、24週間経
口投与である。
慢性 HCV 感染症の治療薬としてバニプレビルを開発する裏付けとなった薬理、薬物動態及び
毒性試験結果を、以降に示すモジュール2.6の各項に要約した。これらに示すバニプレビルの非臨
床プロファイルが、慢性 HCV 患者において本薬を至適曝露量で臨床使用する裏付けとなった。
引用文献
[資料4.3: 4]
Goudreau N, Llinàs-Brunet M. The therapeutic potential of NS3 protease inhibitors in
HCV infection. Expert Opin Investig Drugs 2005;14(9):1129-44.
[資料4.3: 5]
De Francesco R, Tomei L, Altamura S, Summa V, Migliaccio G. Approaching a new era
for hepatitis C virus therapy: inhibitors of the NS3-4A serine protease and the NS5B
RNA-dependent RNA polymerase. Antiviral Res 2003;58:1-16.
[資料4.3: 7]
Kim JL, Morgenstern KA, Lin C, Fox T, Dwyer MD, Landro JA, et al. Crystal structure
2.6.1 緒言
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-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.1 緒言
of the hepatitis C virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor
peptide. Cell 1996;87:343-55.
[資料4.3: 6]
Choo Q-L, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a
cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science
1989;244:359-62.
[資料4.3: 8]
Bartenschlager R, Ahlborn-Laake L, Mous J, Jacobsen H. Nonstructural protein 3 of the
hepatitis C virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and
NS4/5 junctions. J Virol 1993;67(7):3835-44.
2.6.1 緒言
- 6
-
CTD 第 2 部
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
MSD 株式会社
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
目次
頁
表一覧............................................................................................................................................................. 2
図一覧............................................................................................................................................................. 3
略号及び用語の定義..................................................................................................................................... 4
2.6.2.1
まとめ................................................................................................................................. 5
2.6.2.2
効力を裏付ける試験......................................................................................................... 6
2.6.2.2.1
In Vitro 試験................................................................................................................ 6
2.6.2.2.1.1
In Vitro での活性................................................................................................ 6
2.6.2.2.1.1.1
HCV NS3/4A プロテアーゼに対する阻害活性...................................... 6
2.6.2.2.1.1.2
HCV レプリコンアッセイでのサブゲノム複製阻害............................ 8
2.6.2.2.1.2
In Vitro 耐性型分析............................................................................................ 9
2.6.2.2.1.3
In Vitro 併用試験.............................................................................................. 18
2.6.2.2.2
In Vivo 試験............................................................................................................... 20
2.6.2.2.2.1
HCV 感染チンパンジーでの有効性.............................................................. 20
2.6.2.2.2.2
HCV 感染チンパンジーでの他剤との薬力学的薬物相互作用の評価...... 22
2.6.2.3
副次的薬理試験............................................................................................................... 25
2.6.2.3.1
In Vitro 試験.............................................................................................................. 25
2.6.2.3.1.1
2.6.2.4
非標的分子における活性(受容体、イオンチャネル及び酵素) ........... 25
安全性薬理試験............................................................................................................... 26
2.6.2.4.1
hERG 電流に対する影響........................................................................................ 26
2.6.2.4.2
経口投与による心血管系テレメトリー試験 ....................................................... 27
2.6.2.4.3
麻酔イヌにおける心血管系機能 ........................................................................... 27
2.6.2.4.4
ラットへの経口投与による呼吸系試験 ............................................................... 27
2.6.2.4.5
ラットへの経口投与による機能観察総合評価試験 ........................................... 27
2.6.2.4.6
覚醒マウスにおける中枢神経系機能 ................................................................... 28
2.6.2.5
薬力学的薬物相互作用試験........................................................................................... 28
2.6.2.6
考察及び結論................................................................................................................... 28
2.6.2.7
引用文献........................................................................................................................... 29
2.6.2 薬理試験の概要文
- 1
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
表一覧
頁
表2.6.2: 1
HCV genotype(gt)の野生型及び変異型酵素に対する酵素阻害活性並びに選択
性(in vitro) ......................................................................................................................... 7
表2.6.2: 2
バニプレビルの希釈による酵素阻害活性への影響......................................................... 7
表2.6.2: 3
HCV サブゲノムレプリコン系での阻害活性(HEPREP アッセイ)............................ 8
表2.6.2: 4
HCV サブゲノムレプリコン系での阻害活性(TaqMan アッセイ) ............................. 9
表2.6.2: 5
培養細胞におけるバニプレビルの細胞毒性..................................................................... 9
表2.6.2: 6
バニプレビル耐性コロニー選択の要約........................................................................... 10
表2.6.2: 7
野生型及び変異型レプリコンに対するバニプレビルの阻害活性: HCV レプリ
コンアッセイ....................................................................................................................... 12
表2.6.2: 8
バニプレビルの阻害活性に対する耐性変異の影響:酵素アッセイ........................... 14
表2.6.2: 9
各種プロテアーゼ変異型に対するバニプレビルの酵素阻害活性:NS3/4A 発現ア
ッセイ................................................................................................................................... 15
表2.6.2: 10
患者分離 NS3/4A に対するバニプレビルの活性:NS3/4A 発現アッセイ.................. 16
表2.6.2: 11
耐性変異による阻害活性の変化:バニプレビル、シメプラビル及びテラプレビ
ルの比較............................................................................................................................... 17
表2.6.2: 12
各種ヒトプロテアーゼに対するバニプレビル及びテラプレビルの In Vitro 活性..... 26
2.6.2 薬理試験の概要文
- 2
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
図一覧
頁
図2.6.2: 1
併用投与:バニプレビル及びインターフェロン α-2b .................................................. 19
図2.6.2: 2
併用投与:バニプレビル及びリバビリン....................................................................... 19
図2.6.2: 3
併用投与:バニプレビル及び MK-0608 .......................................................................... 20
図2.6.2: 4
バニプレビル単独投与による血漿中ウイルス量の変化(慢性 HCV 感染チンパ
ンジー)............................................................................................................................... 21
図2.6.2: 5
バニプレビル及びリバビリン併用投与による血漿中ウイルス量の変化(慢性
HCV 感染チンパンジー) ................................................................................................. 23
図2.6.2: 6
バニプレビル及び MK-0608併用投与による血漿中ウイルス量の変化
(慢性 HCV
感染チンパンジー)........................................................................................................... 24
図2.6.2: 7
バニプレビル及び MK-3281併用投与による血漿中ウイルス量の変化:慢性 HCV
(genotype 1b)感染チンパンジー ................................................................................... 25
図2.6.2: 8
バニプレビル及び MK-3281併用投与による血漿中ウイルス量の変化:慢性 HCV
(genotype 1a)感染チンパンジー ................................................................................... 25
2.6.2 薬理試験の概要文
- 3
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バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
略号及び用語の定義
略語
バニプレビル
CC50
Cmax
DMEM
DMSO
DNA
EC50 又は
FBS
FOB
gt
HCV
HEPES
HEPREP
hERG
IC50
ICH
IFN
Ki
LOD
LOQ
NHS
NK2
NS3/4A
PEG-IFN
QTcf
RNA
RT-PCR
TRF
90
定義
Vaniprevir
50% cytotoxic concentration
Maximum concentration
Dulbecco's Modied Eagle's Medium
Dimethyl sulfoxide
Deoxyribonucleic acid
50% or 90% effective concentration
Fetal bovine/calf serum
Functional observational battery
Genotype
Hepatitis C virus
4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazineEthane
Sulfonic acid
Hepatitis C replication
human ether-a-go-go related gene
50% inhibitory concentration
International Conference on Harmonisation of
Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use
Interferon
Inhibition constant
Limit of detection
Limit of quantitation
Normal human serum
Neurokinin-2
Non-structural (protein) 3/4A
Pegylated interferon
-
Ribonucleic acid
Reverse transcription polymerase chain
reaction
Time-resolved fluorescence
2.6.2 薬理試験の概要文
- 4
-
開発番号:MK-7009、
50%細胞障害濃度
最高薬物濃度
ダルベッコ・フォークト変法イーグル
最小必須培地
ジメチルスルホキシド
デオキシリボ核酸
50%又は90%効果濃度
ウシ胎児血清
機能観察総合評価
遺伝子型
C 型肝炎ウイルス
-
(社内での試験コード)
-
50% 阻害濃度
日米 EU 医薬品規制調和国際会議
インターフェロン
阻害定数
定性的検出限界
定量的検出限界
正常ヒト血漿
ニューロキニン2(受容体)
非構造(蛋白質)3/4A
ペグインターフェロン
Fridericia の QT 補正値
リボ核酸
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
時間分解蛍光
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
2.6.2.1
まとめ
バニプレビル(MK-7009、
)は、C 型肝炎ウイルス(HCV)感染症の経口治療薬と
して開発された、強力かつ特異的な HCV 複製阻害薬である。非臨床薬理試験の一覧を薬理試験
概要表に示す[2.6.3.1 項]。
バニプレビルは HCV 非構造(NS)3/4A プロテアーゼの強力な阻害薬である。HCV NS3/4A の
遺伝子産物は、最初の HCV ポリ蛋白質遺伝子産物を4箇所で特異的に切断するセリンプロテアー
ゼであり、HCV の複製にはこの酵素の活性が不可欠である。大環状構造を有するバニプレビルは、
この酵素に対して可逆的に結合する強力な阻害薬であることが、NS3/4A プロテアーゼ活性を調
べた生化学アッセイ及び細胞を用いた HCV レプリコンアッセイの両アッセイの成績より示され
た[2.6.2.2.1項]。通常みられる多くの HCV genotype に対して本薬の強力な作用が認められたが、
genotype 3a に対しては効力の顕著な低下が認められた。また、他のプロテアーゼ阻害薬の臨床試
験時に得られたプロテアーゼ耐性変異株のいくつかに対して、バニプレビルは阻害活性を維持す
ることが認められた。特に、36位、41位、54位、55位及び80位のアミノ酸変異による耐性に対し、
バニプレビルの活性維持が示された。
HCV(genotype 1)感染チンパンジーへのバニプレビル経口投与により、投与期間中、血漿中
ウイルス量が定量下限未満のレベルまで速やかに減少し、その後、投与中止によりウイルス量の
リバウンドがみられた[2.6.2.2.2項]。
バニプレビルは極めて特異性の高い HCV NS3/4A 阻害薬であり、ヒトキモトリプシン阻害活性
との比較では30,000倍以上の選択性を有している。また、150種類を超える各種酵素や受容体を用
いた結合阻害試験において、Ki 値が10 μM を下回ったものはタキキニン NK2受容体との結合のみ
であり
(IC50 = 2.86 μM)
、これと HCV NS3/4A との選択性には約179,000倍の乖離がみられた[2.6.2.3
項]。
バニプレビルの心血管系、呼吸系及び神経系機能への影響を、in vitro 及び in vivo の安全性薬理
試験で検討した[2.6.2.4項]。バニプレビルによる hERG 電流阻害率は、試験可能な最高濃度である
30 μM でも36%阻害であった。なお、この濃度(30 μM)は、ヒト血漿中でのバニプレビルのフリ
ー体分率(1.7%)[2.6.4.4.4 項]を考慮すると、日本人患者にペグインターフェロン(PEG-IFN)
α-2a、リバビリン及びバニプレビル(臨床推奨用量:300 mg を1日2回投与)を併用投与した際の
バニプレビルの Cmax 値(4.78 μM)[2.7.2.3.1.1項]の、約370倍高い濃度に相当する。また、バニプ
レビルは麻酔イヌに最高10 mg/kg(血漿中濃度:52.4 μM)の静脈内投与、又はテレメトリー埋め
込み覚醒イヌに最高250 mg/kg(投与4時間後の血漿中濃度:20.0 μM)の経口投与により、心血管
系への影響を示さなかった。このときの血漿中濃度は、臨床推奨用量(300 mg を1日2回投与)で
の臨床 Cmax 値(4.78 μM)の、それぞれ約11倍及び約4倍に相当した。バニプレビル100 mg/kg の
経口投与によるマウス中枢神経系機能への影響はみられず、また、最高250 mg/kg 経口投与によ
2.6.2 薬理試験の概要文
- 5
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
るラットの呼吸系及び神経系機能への影響はみられなかった。ラット5週間経口投与毒性試験(TT
#06-9807)でのトキシコキネティクスの結果より[2.6.7.7A 項]、バニプレビル250 mg/kg 投与時の
Cmax 値は約44.8 μM であり、臨床 Cmax 値(4.78 μM)の約9倍に相当した。
2.6.2.2
効力を裏付ける試験
2.6.2.2.1
In Vitro 試験
2.6.2.2.1.1
In Vitro での活性
[資料4.2.1.1.1: PD001]
2.6.2.2.1.1.1
HCV NS3/4A プロテアーゼに対する阻害活性
In vitro でのバニプレビルの特性を評価するため、本薬の活性及び特異性を確認することを目的
に HCV の各種 genotype、並びにレプリコン選択時に高頻度にみられる HCV の各種変異型を並べ
たアッセイパネルを用いて試験した。
方法:
プロテアーゼの酵素阻害アッセイでは、基質ペプチドの酵素分解を測定する時間分解蛍光
(Time-resolved fluorescence:TRF)測定法を用い、化合物の Ki 値又は IC50値を算出した。基質ペ
プチドにはユーロピウムクリプテート修飾(Eu)、アミノ酪酸(Abu)
、切断部位のエステル結合
([COO])及び蛍光消光修飾(QSY7)からなる、Ac-C(Eu)DDMEEAbu[COO]ASK(QSY7)-amide
配列のものを用いた。酵素がエステル結合を切断すると蛍光ユーロピウムクリプテートが消光修
飾から遊離し、これにより増強された蛍光を測定する仕組みである。
本試験では、反応緩衝液(50 mM HEPES[pH7.6]
、150 mM NaCl、15%グリセロール、0.15% Triton
X-100、10 mM DTT)中で、細菌により発現・精製した NS3/4A プロテアーゼ(25~300 pM)を、
バニプレビルと30分間室温でプレインキュベーションした。その後、基質ペプチドを終濃度100
nM で添加して反応を開始させ、室温で60分間インキュベーションした。クエンチング剤(500 mM
MES、pH 5.5、50 mL)の添加により反応を停止させ、蛍光強度を蛍光分光光度計で測定した。
また、バニプレビルの酵素との結合の可逆性を評価した。上述の反応緩衝液中でバニプレビル
と NS3/4A プロテアーゼ(genotype 1b、2 nM)を30分間プレインキュベーションし、次に、希釈
したバニプレビルとさらに30分間再インキュベーションした。プレインキュベーション・再イン
キュベーションのバニプレビル濃度の組み合わせは、ⅰ)溶媒(DMSO)
・溶媒、ⅱ)15 pM(IC50
値とほぼ同じ濃度)
・15 pM、ⅲ)300 pM(IC50値の約20倍濃度)・15 pM、ⅳ)300 pM・300 pM
である。その後、前述の方法で酵素阻害活性を評価し、ⅰ)群の測定値を基に標準化した。
2.6.2 薬理試験の概要文
- 6
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
結果:
多種の genotype に対する活性を評価した本酵素阻害アッセイにおいて、
バニプレビルは NS3/4A
プロテアーゼに可逆的に結合し、その酵素活性を強力に阻害することが示された[表2.6.2: 1]。本
薬は NS3/4A プロテアーゼのうち、genotype 1、4a、5a 及び6a に対する阻害活性は高かったが、
genotype 3a に対する阻害活性は著しく低く、それより軽度であるが genotype 2a 及び 2b に対して
も阻害活性の低下がみられた。プロテアーゼ阻害薬の臨床試験で高頻度に発現が認められた数種
類の主要な耐性変異型に対し、バニプレビルは活性を維持していたが、特定のアミノ酸残基(155
位, 156位及び168位)の変異に対する活性の低下がみられた[資料4.3: 1] [資料4.3: 2] [2.6.3.1 項]。
表 2.6.2: 1
HCV genotype(gt)の野生型及び変異型酵素に対する酵素阻害活
性並びに選択性(in vitro)
酵素
バニプレビル
IC50 ± SD (nM)
0.028 ± 0.003
0.016 ± 0.004
0.540 ± 0.016
1.4 ± 0.10
53 ± 5
0.10 ± 0.02
0.160 ± 0.07
0.07 ± 0.02
9±4
6±1
57 ± 5
101 ± 15
500(31,250倍)
gt 1a
gt 1b
gt 2a
gt 2b
gt 3a
gt 4a
gt 5a
gt 6a
gt 1b R155K
gt 1b A156T
gt 1b A156V
gt 1b D168Y
キモトリプシン(選択性)
[2.6.3.1 項]
In vitro での活性(PD001)
バニプレビルによる酵素との結合には可逆性がみられた[表2.6.2: 2]。濃度300 pM の本薬を
NS3/4A プロテアーゼとプレインキュベーションした後に終濃度15 pM まで20倍希釈して再イン
キュベーションしたところ、15 pM でプレインキュベーションした場合と類似した結果が得られ
た[表2.6.2: 2]。これらいずれの阻害活性も DMSO 溶媒対照群の値と比較して約30%阻害を示した。
他方、プレインキュベーション及び再インキュベーションがともに300 pM であった群の阻害活性
は、DMSO 溶媒対照群の値と比較して、85%阻害を示した。
表 2.6.2: 2
バニプレビルの希釈による酵素阻害活性への影響
バニプレビル濃度
阻害% ± SD*
DMSO → DMSO(溶媒対照)
15 pM → 15 pM
300 pM → 15 pM
300 pM → 300 pM
-2 ± 7
32 ± 2
29 ± 2
85 ± 2
*独立した6回の試験の平均値
[2.6.3.1 項] In vitro での活性(PD001)
2.6.2 薬理試験の概要文
- 7
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
2.6.2.2.1.1.2
HCV レプリコンアッセイでのサブゲノム複製阻害
バニプレビルの活性を、HCV サブゲノムレプリコン系での複製阻害を用いてより詳細に検討し
た。併せて細胞毒性の検討も実施した。
方法:
標識 DNA プローブプロテクションアッセイ[Hepatitis C replication(HEPREP)アッセイ]又は
TaqMan アッセイのいずれかを用いて、HCV サブゲノムレプリコンに対するバニプレビルの阻害
活性を検討した。両アッセイではネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を標的とするプ
ローブを使用した。
バニプレビルをレプリコン細胞と共に10%FBS 添加 DMEM 完全培地中で72時間インキュベー
ションし、サブゲノムレプリコンでの本薬の作用を検討した。インキュベーション後に細胞を溶
解し、RNA を抽出した。HEPREP アッセイは、共にコードされているネオマイシントランスフェ
ラーゼ遺伝子に対する放射標識一本鎖 DNA プローブをレプリコン RNA にハイブリダイズさせ、
一本鎖ヌクレアーゼで分解されなかった DNA を定量する DNA プローブプロテクションアッセイ
である。TaqMan アッセイでも同様の方法を用いるが、共にコードされているネオマイシントラ
ンスフェラーゼ遺伝子に特異的なプライマー及び TaqMan プローブを用いてレプリコン RNA を増
幅した。内因性シクロフィリン A RNA(RNA 量補正用のハウスキーピング遺伝子)で補正し、
最終的にレプリコン RNA 標準液の希釈系列に従い定量した。
細胞毒性は同様のインキュベーションを行って測定し、生細胞数を測定する比色定量分析用試
薬(Cell Titer 96 Aqueous One Solution:Promega 社)を用いて定量した。
結果:
1)
バニプレビルの複製阻害活性:HEPREP アッセイ
HCV レプリコンに対するバニプレビルの作用を、HCV RNA 量を定量する HEREP アッセイに
て評価した。その結果、genotype 1b レプリコンに対する EC50値は3 nM、genotype 2a レプリコン
に対する EC50値は7 nM であった。50%正常ヒト血清(NHS)存在下での活性変化は6倍未満であ
った[表2.6.2: 3]。
表 2.6.2: 3
HCV サブゲノムレプリコン系での阻害活性(HEPREP アッセイ)
HCV 遺伝子型(細胞株)
gt1b (con1)
gt1b (con1) 50% NHS
gt2a (JFH)
[2.6.3.1 項]
2)
EC50 ± SD (µM)
0.003 ± 0.001
0.017 ± 0.005
0.007 ± 0.002
In vitro での活性(PD001)
バニプレビルの複製阻害活性:TaqMan アッセイ
さらに、HCV レプリコンに対するバニプレビルの作用を、共にコードされているネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を標的とするプライマー/プローブを用いた TaqMan アッセイ
2.6.2 薬理試験の概要文
- 8
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
により評価したところ、genotype 1a 及び1b レプリコン細胞株に対する EC90値はそれぞれ4.0 nM
及び3.9 nM であった。相同的な genotype 2a(EC90 = 35.3 nM)レプリコンと、genotype 2b(EC90 =
40~45 nM)又は5a(EC90 = 5.9~157 nM)由来の NS3/4A を genotype 2a レプリコンに組み込んだ
キメラレプリコンに対して、軽度から中等度の活性低下が認められた。なお、genotype 5a の
GU945429配列がコードする E168変異は、AF064490がコードする一般的な D168変異よりも頻度
が低い。また、キメラ genotype 3a レプリコンに対する活性低下が顕著であった(EC90 = 337 nM)
。
40%NHS 存在下での活性変化は7倍未満であった(EC90 = 25.0 nM)[表2.6.2: 4]。
表 2.6.2: 4
HCV サブゲノムレプリコン系での阻害活性(TaqMan アッセイ)
HCV 遺伝子型(細胞株)
gt1a (H77)
gt1b (con1)
gt1b (con1) 40% NHS
gt2a (JFH1)
gt2b (NS3/4A AY232740**):2a
gt2b (NS3/4A AY232732**):2a
EC50 ± SD (nM)*
1.0 ± 0.7
1.9 ± 0.8
5.9 ± 1.4
2.7 ± 2.8
31 ± 11
11.5 ± 0.7
gt3a (NS3/4A GLA***):2a
gt5a (NS3/4A AF 064490**):2a
gt5a (NS3/4A GU 945429**):2a
70 ± 28
1.8 ± 0.6
61 ± 20
EC90 ± SD (nM)*
4.0 ± 2.8
3.9 ± 2.1
25.0 ± 6.1
35.3 ± 11.5
45 ± 9
40 ± 3
337 ± 68.8
5.9 ± 0.6
157 ± 10
*
**
***
3回以上の独立した測定結果の平均値
Genbank アクセッション番号
社内での呼称。NS3 GenBank アクセッション番号 GU045445.1。NS4A GenBank アクセッショ
ン番号 GU945457.1。
[2.6.3.1 項] In vitro での活性(PD001)
3)
バニプレビルの細胞毒性
バニプレビルの細胞毒性を genotype 1b con1 レプリコン細胞株(HB1)及び HeLa 細胞を用いて
検討した。両細胞での50%細胞障害濃度(CC50値)はいずれも25 μM より高かった[表2.6.2: 5]。
表 2.6.2: 5
培養細胞におけるバニプレビルの細胞毒性
CC50 (μM)
58
26
細胞株
Huh-7 gt1b レプリコン(HB1)細胞
HeLa
[2.6.3.1 項]
2.6.2.2.1.2
In vitro での活性(PD001)
In Vitro 耐性型分析
[資料4.2.1.1.1: PD001] [資料4.2.1.1.6: PD007]
HCV 野生型ウイルスに対して強い阻害活性を示す薬物でも、そのスペクトルが狭いために変異
型ウイルスに対する阻害活性に乏しい可能性があることから、バニプレビル耐性についての詳細
な分析を実施した。バニプレビルに対する耐性を評価するため、まず、バニプレビル選択圧下で
出現する変異を同定するためのレプリコンモデルを用いて、耐性型を直接選択した。次に、開発
2.6.2 薬理試験の概要文
- 9
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
中の諸種 HCV プロテアーゼ阻害薬に対する耐性型として in vitro 試験や臨床試験で同定されたア
ミノ酸変異について、酵素アッセイ、レプリコンアッセイ及び発現アッセイで活性を測定するこ
とにより、これら変異に対するバニプレビルの包括的な評価を行った。
方法:
HB1細胞を15 cm 組織培養ディッシュに1~3×103/cm2の密度で播種し、種々の濃度のバニプレ
ビル及び0.8 mg/mL の G418存在下で培養した。選択開始約15日後に阻害薬及び抗生物質に耐性を
示す細胞の小コロニーがみられるようになり、それを単離した。薬物耐性細胞クローンからのレ
プリコン RNA の抽出、RT-PCR 及び PCR 産物の直接的配列決定により、薬物耐性細胞クローン
における HCV レプリコンの配列を決定した。
酵素アッセイは2.6.2.2.1.1.1 項に、レプリコンアッセイは2.6.2.2.1.1.2 項に記載した方法で、そ
れぞれ実施した。
NS3/4A 発現アッセイでは、Huh-7細胞にレポーターとして分泌型アルカリホスファターゼ遺伝
子を NS3/4A 遺伝子と一過性に共発現させた試験系を用いた。このレポーターアッセイ系では、
NS3/4A 切断部位にリンクした小胞体局在配列が切断されると細胞外へ分泌型アルカリホスファ
ターゼが遊離され、これを捕捉することにより NS3/4A プロテアーゼ発現を測定するものである。
結果:
1)
バニプレビルによる耐性コロニーの選択
バニプレビル耐性コロニー選択の結果を[表2.6.2: 6]に纏めた。HCV genotype 1b(con1)レプリ
コン細胞では、20、30、40又は80 nM のバニプレビル濃度で耐性コロニーを選択した。さらに
genotype 2a レプリコン細胞での選択を65又は325 nM の濃度で実施した。
変異はプロテアーゼドメイン全体に散在して認められた。genotype 1b での選択では、D168の変
異が最も多く、特に薬物濃度がより高いときに多くみられた(バニプレビル濃度20 nM 時の選択
結果と、30、40及び80 nM 時の結果との比較)。Genotype 2a 選択においても変異がプロテアーゼ
ドメイン全体にみられ、genotype 1b 選択時と同様な A156又は D168の変異が認められた。
表 2.6.2: 6
HCV 遺伝子型
gt1b
バニプレビル
(nM)
20
gt1b
gt1b
gt1b
gt2a
30
40
80
65
gt2a
325
[2.6.3.1 項]
バニプレビル耐性コロニー選択の要約
変異(独立コロニー数)
F43S (2)、I71T (2)、P89T (1)、A156T (2)、D168E (2)、
D168V (2)、D168Y (4)、変異なし (1)
D168H (2)、D168V (2)、D168Y (7)
S20G (1)、D168E (2)、D168G (2)、D168V (4)、D168Y (2)
Q86R (3)、V163I (1)、D168V (3)、D168Y (8)
A5V (2)、T27I (1)、L67V (1)、P86L (1)、S87T (1)、D168E
(1)、D168Y (1)
I17V (1)、K122R (1)、A156S (2)、V163L (1)、D168E (1)、
E173G (2)、L175F (1)
In vitro 耐性型分析(PD001)
2.6.2 薬理試験の概要文
- 10
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
2)
NS3/4A 変異に対するバニプレビルの活性変化:レプリコンアッセイ
種々プロテアーゼ阻害薬により in vitro 又は臨床試験で高頻度にみられるアミノ酸変異をコー
ドした、遺伝子改変各種 genotype 1a 又は1b レプリコン細胞株(アミノ酸置換クローン株)を用
いて、バニプレビルの複製阻害活性の変化を評価した。その結果、2つの基本的な変異セットの存
在が明らかとなった。第1の変異セットはプロテアーゼ活性サイト内に存在し、R155、A156及び
D168のアミノ酸置換が中心である。D168での変異は大環状構造の阻害薬で通常認められ、また、
開発中の全ての阻害薬では R155及び A156での変異により活性がある程度低下する。第2の変異セ
ットは NS3/4A プロテアーゼの N 末端近傍に存在する V36、Q41及び T54のアミノ酸置換を中心
としたものであり、テラプレビルのような直鎖ペプチド類縁阻害薬の臨床試験でより高頻度に認
められている。本レプリコンアッセイ系におけるバニプレビル耐性型分析の結果を[表2.6.2: 7]に
示す。
2.6.2 薬理試験の概要文
- 11
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
表 2.6.2: 7
野生型及び変異型レプリコンに対するバニプレビルの阻害活性:
HCV レプリコンアッセイ
HCV
遺伝子型
gt1a
gt1b
変異
野生型(H77)
V36A
V36L
V36M
Q41R
T54A
T54S
V55A
V55I
Q80K
Q80R
V107I
R155K
R155T
A156S
V158I
D168A
D168E
D168N
野生型(con1)
V36A
V36L
V36M
Q41L
Q41R
F43S
T54C
T54G
V55A
V55I
Y56F
Y56H
Q80R
Q86R
V107I
R155G
R155K
R155Q
R155W
A156G
A156S
A156T
A156V
EC50± SD
(nM)
0.9 ± 0.6
2.1 ± 1.3
1.3 ± 0.4
1.3 ± 0.9
1.6 ± 0.6
1.0 ± 0.7
1.4 ± 1.0
1.6 ± 0.5
0.5 ± 0.2
1.4 ± 0.8
1.6 ± 0.7
0.7 ± 0.4
>1000
389 ± 115
5.1 ± 3.7
1.0 ± 0.4
>500
39.9 ± 32.1
6.3 ± 4.0
1.9 ± 0.8
9.3 ± 7.3
1.0 ± 0.7
2.7 ± 1.4
0.7 ± 0.5
2.1 ± 0.9
14.6 ± 8.7
6.0 ± 5.6
5.6 ± 4.2
2.1± 1.1
1.7 ± 0.6
0.8 ± 0.3
2.0 ± 0.8
1.1 ± 0.4
0.8 ± 0.5
5.9 ± 5.4
267 ± 204
402 ± 194
240 ± 153
363 ± 154
29 ± 16
9.7 ± 3.1
95.8 ± 33.7
588 ± 163
EC50の倍率変化
(野生型との比較)
1
2.3
1.4
1.4
1.8
1.1
1.6
1.8
0.6
1.6
1.8
0.8
>1000
432
5.7
1.1
>500
44.3
7
1
4.9
0.5
1.4
0.4
1.1
7.7
3.2
2.9
1.1
0.9
0.4
1.1
0.6
0.4
3.1
142
212
126
191
15.3
5.1
50
309
EC90± SD
(nM)
3.3 ± 2.4
7.0 ± 5.3
4.7 ± 1.8
4.5 ± 2.3
4.7 ± 1.9
2.5 ± 1.9
4.7 ± 3.6
5.0 ± 0.3
1.4 ± 0.5
4.5 ± 2.2
6.4 ± 2.6
2.2 ± 1.1
>1000
933 ± 138
17.0 ± 9.1
4.1 ± 1.7
>500
193 ± 213
27 ± 19
3.9 ± 2.1
16.6 ± 9.2
2.8 ± 1.0
8.5 ± 3.1
2.2 ± 1.4
5.1 ± 2.0
57.7 ± 33.4
12.4 ± 8.0
18.6 ± 12.5
4.8 ± 2.1
6.8 ± 2.8
3.9 ± 1.8
5.5 ± 1.4
4.2 ± 1.4
3.2 ± 2.0
14.9 ± 12.7
586 ± 360
945 ± 228
649 ± 214
707 ± 187
54 ± 11
50.0 ± 12.8
400 ± 164
4247 ± 123
EC90の倍率変化
(野生型との比較)
1
2.1
1.4
1.4
1.4
0.8
1.4
1.5
0.4
1.4
1.9
0.7
>250
283
5.2
1.2
>125
58
8.2
1
4.3
0.7
2.2
0.6
1.3
14.8
3.2
4.8
1.2
1.7
1.0
1.4
1.1
0.8
3.8
150
242
166
181
13.8
12.8
103
1089
(続く)
2.6.2 薬理試験の概要文
- 12
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
表 2.6.2: 7
野生型及び変異型レプリコンに対するバニプレビルの阻害活性:
HCV レプリコンアッセイ(続き)
HCV
遺伝子型
gt1b
EC50± SD
(nM)
D168A
277 ± 157
D168E
37.0 ± 6.0
D168G
1093 ± 408
D168K
>2000
D168N
5.0 ± 2.8
D168T
>2000
D168V
1160 ± 800
D168Y
491 ± 100
V170A
5.4 ± 2.9
V170T
8.3 ± 6.1
*3回以上の独立した測定結果の平均値
[2.6.3.1 項]
変異
EC50の倍率変化
(野生型との比較)
146
19.5
575
>1000
2.6
>1000
610
258
2.8
4.5
EC90± SD
(nM)
>500
193 ± 82
1715 ± 361
>2000
18.0 ± 12
>2000
>2000
1262 ± 186
28.5 ± 11.5
16.2 ± 11.1
EC90の倍率変化
(野生型との比較)
>125
49.5
440
>250
4.6
>250
>500
324
7.3
4.2
In vitro 耐性型分析(PD001)
155位、156位及び168位のアミノ酸変異により、最も顕著な活性低下が惹起された。しかし、活
性低下の程度は置換されるアミノ酸の種類により異なっていた。例えば、A156T/V 置換は活性に
顕著な影響を及ぼしたが、A156S 置換による活性低下の程度はわずかにすぎなかった。また、
A156T/V 変異はフィットネス(replication fitness)に大きく影響するが、A156S 変異によるウイル
ス複製への影響が限定的であることが知られており、この結果は信頼性のあるものといえる[資料
4.3: 9]。プロテアーゼ N 末端により近い36位、41位、54位、55位又は80位などのアミノ酸残基の
変異による活性低下もわずかであった。これらの変異はすべて、シメプレビルやテラプレビルの
ような他のプロテアーゼ阻害薬の臨床試験で高頻度にみられるものである[資料4.3: 10]。なお、バ
ニプレビルの早期 Phase Ib 及び IIa 試験において HCV リバウンドが認められたか、もしくは無効
であった患者集団から得た塩基配列の解析結果も、本 in vitro 試験の結果と一致が認められ、患者
集団全体でみられた変異の大部分は R155又は D168の各変異であり、N 末端変異の頻度はそれよ
り低かった[2.7.3.5.2項]。
2.6.2 薬理試験の概要文
- 13
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
3)
NS3/4A 変異に対するバニプレビルの活性変化:酵素アッセイ
変異型 NS3/4A 酵素に対するバニプレビルの活性分析を実施した[表2.6.2: 8]。結果はレプリコン
結果と一致するものであり、155位、156位及び168位の変異により中等度から高度の耐性が認めら
れた。また、活性低下の程度は、アミノ酸置換の種類に依存すると考えられた。
表 2.6.2: 8
バニプレビルの阻害活性に対する耐性変異の影響:酵素アッセイ
HCV
遺伝子型
1b (BK)
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1a
1a
2a (JFH)
2a
2a
[2.6.3.1 項]
変異
野生型
V36A
V36L
V36M
R155K
R155Q
A156S
A156T
A156V
D168E
D168V
D168Y
V170A
野生型
R155K
野生型
D168A
D168E
バニプレビル
Ki ± SD (nM)
0.079 ± 0.014
0.164 ± 0.030
0.080 ± 0.010
0.118 ± 0.013
18.9 ± 1.6
47 ± 7
0.200 ± 0.076
15.7 ± 2.5
88.1 ±15.1
0.544 ± 0.117
82 ± 27
120 ± 59.9
0.061 ± 0.019
0.074 ± 0.033
34 ± 4.3
0.904 ± 0.306
150 ± 17
2.8 ± 0.7
In vitro 耐性型分析(PD001)
2.6.2 薬理試験の概要文
- 14
-
倍率変化
(野生型との比較)
1
2.1
1.0
1.5
239
595
2.5
199
>1000
6.9
>1000
>1000
0.8
1
459
1
166
3.1
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
4)
NS3/4A 変異に対するバニプレビルの活性変化:発現アッセイ
HCV genotype 1a 及び1b でみられる諸種変異型パネルを用いて、プロテアーゼ発現アッセイを
実施した[表2.6.2: 9]。本試験では、クローン化した NS3/4A 遺伝子を一過性に発現させ、ホールセ
ルアッセイで細胞内の酵素活性を測定した。その結果、レプリコンアッセイ及び酵素アッセイで
みられたように、R155、A156、D168のアミノ酸残基の変異による酵素阻害活性の低下が最も大
きかった。複数のプロテアーゼ阻害薬の活性が低下する変異として、V36、Q41、F43、Y56の変
異があるが、これらの変異はバニプレビルの酵素阻害活性にほとんど影響を及ぼさなかった。
表 2.6.2: 9
各種プロテアーゼ変異型に対するバニプレビルの酵素阻害活
性:NS3/4A 発現アッセイ
変異
野生型
V36A
V36L
V36M
Q41R
F43S
T54A
T55S
Y56H
R109K
I153V
R155G
R155K
R155M
R155N
R155Q
R155S
R155T
A156N
A156S
A156T
A156V
V163I
D168A
D168E
D168G
D168H
D168V
D168Y
V170I
[2.6.3.1 項]
gt1a 野生型(H77)
gt1a EC50 ± SD
野生型と比較し
(nM)
た倍率変化
4.5 ± 1.8
1
15.7 ± 7.5
3.5
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
1517 ± 171
337
422 ± 101
93.8
149 ± 102
33.1
262 ± 91
58.2
450 ± 533
100
760 ±104
169
290 ± 121
64.4
430 ± 244
95.6
ND
301 ± 232
66.9
1555 ± 744
346
ND
798 ± 390
177
96.7 ± 89.6
21.5
790 ± 95.4
176
1260 ± 607
280
1473 ± 1120
327
1277 ± 375
284
ND
In vitro 耐性型分析(PD007)
gt1b 野生型(con1)
gt1b EC50 ± SD
野生型と比較し
(nM)
た倍率変化
4.1 ± 3.9
1
4.2 ± 1.0
1.0
8.9 ± 9.7
2.2
14.8 ± 10.3
3.6
3.7 ± 0.6
0.9
40.5 ± 6.4
9.9
4.7 ± 2.7
1.1
1.5 ± 0.5
0.3
2.9 ± 0.7
0.7
4.2 ± 2.1
1.0
3.7 ± 4.2
0.9
1543 ± 386
376
450 ± 392
110
130 ± 87.8
32
380 ± 181
93
600 ± 278
146
320 ± 185
78
420 ± 216
102
300 ± 91.7
73
15.0 ± 17.1
3.7
440 ± 191
107
690 ± 200
161
6.1 ± 7.7
1.5
830 ± 340
202
150 ± 79.7
36
660 ± 495
161
550 ± 455
134
450 ± 331
110
1900 ± 303
463
1.6 ± 0.6
0.4
ND:実施せず
自然分離株の NS3/4A に対する活性の範囲を検討するために、genotype 1a 又は1b に感染した患
者由来の血漿から分離した各種 NS3/4A 配列を基に、バニプレビルの発現アッセイを実施した。
2.6.2 薬理試験の概要文
- 15
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
結果を[表2.6.2: 10]に示す。活性の範囲は約10倍(EC50 = 2.9~27 nM)と狭かった。バニプレビル
は臨床でみられる遺伝的に多様な genotype 1の感染に対して有効性を示すことが期待される。
表 2.6.2: 10
[2.6.3.1 項]
5)
患者分離 NS3/4A に対するバニプレビルの活性:NS3/4A 発現アッセイ
NS3/4A 配列
遺伝子型
EC50 ± SD (nM)
con1
H77
ps20
ps30
ps31
ps32
ps33
ps36
ps37
ps38
ps40
ps41
1b
1a
1b
1b
1b
1b
1b
1a
1a
1a
1a
1a
4.1 ± 3.9
4.5 ± 1.8
2.9 ± 1.1
27 ± 1.1
3.4 ± 4.0
3.8 ± 1.8
9.5 ± 0.3
4.9 ± 1.4
6.5 ± 1.9
6.0 ± 2.0
2.9 ± 1.2
19 ± 1.6
In vitro 耐性型分析(PD007)
NS3/4A 変異レプリコンでのバニプレビル、シメプレビル及びテラプレビルの活性比較
HCV レプリコンモデルを用いて、耐性変異に対するバニプレビルの阻害活性を、他の HCV プ
ロテアーゼ阻害薬すなわち既承認のシメプレビル及びテラプレビルと比較した[表2.6.2: 11]。バニ
プレビルやシメプレビルが大環状ペプチド構造の可逆的阻害薬であるのに対して、テラプレビル
は直鎖ペプチド構造の共有結合性阻害薬であり、それぞれの阻害薬の HCV プロテアーゼとの結
合様式は異なっている。このため、両薬剤の活性を(EC90値を基に)直接比較することは不適切
であり、変異による活性変化の倍率を基に両薬剤を比較することが適切と考えられる。そこで、
阻害活性変化の倍率に着目したところ、R155K、A156T 及び A156V のアミノ酸置換体に対して、
全ての阻害薬で著しい阻害活性の低下が認められた。Genotype 1a A156S アミノ酸置換体に対して
バニプレビル及びシメプレビルと比較してテラプレビルで阻害活性低下の変化倍率がより大きく、
他方、D168位の変異に対してはバニプレビル及びシメプレビルの阻害活性低下の変化倍率がテラ
プレビルのそれより大きかった。Q80位の変異に対してバニプレビル及びテラプレビルでは阻害
活性低下の変化倍率にほとんど影響がみられなかったが、シメプレビルでは変化倍率に6~16倍の
変化がみられた。テラプレビルは V36位の変異に対しても、バニプレビル及びシメプレビルと比
較して阻害活性低下の変化倍率がより大きかった。
2.6.2 薬理試験の概要文
- 16
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
表 2.6.2: 11
耐性変異による阻害活性の変化:バニプレビル、シメプレ
ビル及びテラプレビルの比較
HCV
遺伝子型
変異
gt1a
野生型 (H77)
V36L
V36M
Q41R
T54A
T54S
V55A
V55I
Q80K
Q80R
V107I
R155K
R155T
A156S
V158I
D168A
D168E
D168N
野生型 (con1)
V36A
V36L
Q41R
F43S
T54C
T54G
V55A
V55I
Y56F
Y56H
Q80R
V107I
R155G
R155K
R155W
A156S
A156T
A156V
D168A
D168E
D168V
V170T
gt1b
[2.6.3.1 項]
バニプレビル
EC90
EC90の倍率
(nM)
変化(野生
型との比較
3.3
1
4.7
1.4
4.5
1.4
4.7
1.4
2.5
0.8
4.7
1.4
5.0
1.5
1.4
0.4
4.5
1.4
6.4
1.9
2.2
0.7
> 1000
>250
933
283
17.0
5.2
4.1
1.2
> 500
>125
193
58
27
8.2
3.9
1
16.6
4.3
2.8
0.7
5.1
1.3
57.7
14.8
12.4
3.2
18.6
4.8
4.8
1.2
6.8
1.7
3.9
1
5.5
1.4
4.2
1.1
14.9
3.8
586
150
945
242
707
181
50
12.8
400
103
4247
1089
>500
>125
193
49.5
> 2000
> 500
16.2
4.2
シメプレビル
EC90
EC90の倍率
(nM)
変化(野生
型との比較
9.9
1
17
1.7
20
2.0
25
2.5
4.4
1.8
14
1.4
14
1.4
15
1.5
62
6.3
114
11.5
16
1.6
656
66
255
26
4.6
0.5
19
1.9
> 100
> 10
543
55
53
5.4
2.4
1
5.7
2.4
7.0
2.9
6.0
2.5
32
13.3
3.6
1.5
4.7
2.0
2.9
1.2
7.2
3.0
6.2
2.6
90
38
40
16.7
2.8
1.2
60
25
66
28
332
138
0.6
0.3
126
53
735
306
1070
446
151
63
> 2000
> 800
12
5.0
テラプレビル
EC90
EC90の倍率
(nM)
変化(野生
型との比較)
603
1
2955
4.9
6129
10.2
733
1.2
3565
5.9
1229
2.0
1756
2.9
349
0.6
460
0.8
360
0.6
1006
1.7
8894
14.7
13001
22
16321
27
669
1.1
353
0.6
804
1.3
786
1.3
543
1
3375
6.2
1638
3.0
586
1.1
5053
9.3
433
0.8
5040
9.3
2415
4.4
580
1.1
731
1.3
323
0.6
409
0.8
844
1.6
5032
9.3
5711
10.5
409
0.8
17700
33
> 20000
> 35
> 20000
> 35
119
0.2
381
0.7
123
0.2
1099
2.0
In vitro 耐性型分析(PD001)
以上、in vitro での耐性型分析の成績を要約すると、バニプレビルは酵素アッセイ及びレプリコ
ンアッセイの両方で genotype 1a 及び1b に対して阻害活性を示した。また、実際にみられる事が
2.6.2 薬理試験の概要文
- 17
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
推測される天然の genotype 1a 及び1b 遺伝子配列の変異に対するバニプレビルの阻害活性の変動
は小さかった。生化学アッセイ、レプリコンアッセイ及び発現アッセイでは、他のプロテアーゼ
阻害薬で耐性のみられるアミノ酸変異のいくつかに対し、バニプレビルは阻害活性を維持するこ
とが認められた。In vitro でのこれらの耐性に対するバニプレビルの活性プロファイルは、早期の
臨床評価で報告された変異に対する本薬の成績と一致していた。
2.6.2.2.1.3
In Vitro 併用試験
[資料4.2.1.1.1: PD001]
既承認又は開発中の抗 HCV 薬と併用したときの阻害活性を評価することにより、バニプレビ
ルによる相加又は相乗作用を示す可能性、並びに拮抗作用を示さないことを確認した(PD001)
[2.6.3.1 項].
方法:
Genotype 1b サブゲノムレプリコンを用いたレプリコンアッセイにより、バニプレビルを他の
HCV 治療薬であるインターフェロン(IFN)α-2b、リバビリン又は MK-0608(ヌクレオシド系ポ
リメラーゼ阻害薬)と併用した際の、ウイルス RNA 複製に対する阻害活性を検討した。96ウェ
ルプレートを用いたマトリクス法により、バニプレビル単独、もしくはバニプレビルを IFN α-2b、
リバビリン、又は MK-0608と併用し、単独時と併用時の阻害活性を比較した。HEPREP 法により
検出した測定値を、コンピュータソフトウェア MacSynergyTM II で自動解析し、ウイルス RNA 複
製に対する相乗的な阻害活性の可能性を検討した。このソフトウェアは、各薬剤の諸種濃度での
併用時のデータを応答曲面にみたてて3次元モデル化するものである。応答曲面により得られる正
の値は相乗作用の、負の値は拮抗作用の、ゼロ値又はゼロに近い値は相加作用の濃度域を示して
いる[資料4.3: 2]。
結果:
バニプレビルと IFN α-2b、リバビリン、又は MK-0608(ヌクレオシド系ポリメラーゼ阻害薬)
との併用成績を[図2.6.2: 1]、[図2.6.2: 2]及び[図2.6.2: 3]にそれぞれ示した。
バニプレビルと IFN α-2b の併用では、相加作用を示す平面(ゼロ値)を超えたプロットが比較
的少なかったことから、阻害作用は概して相加的であることが示された[図2.6.2: 1]。バニプレビ
ルとリバビリンの併用では、相加作用を示す平面を超えたプロットが多かったことから、阻害作
用は相加から相乗的であることが示された[図2.6.2: 2]。バニプレビルと MK-0608の併用でも、相
加作用を示す平面を超えたプロットが多かったことから、阻害作用は相加から相乗的であること
が示された[図2.6.2: 3]。これらいずれの併用においてもプロットが相加作用を示す平面を下回る
ことがなかったことから、拮抗作用は無いことが示された。
2.6.2 薬理試験の概要文
- 18
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
図 2.6.2: 1
併用投与:バニプレビル及びインターフェロン α-2b
[2.6.3.1 項]
In vitro 併用試験(PD001)
図 2.6.2: 2
[2.6.3.1 項]
併用投与:バニプレビル及びリバビリン
In vitro 併用試験(PD001)
2.6.2 薬理試験の概要文
- 19
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
図 2.6.2: 3
[2.6.3.1 項]
併用投与:バニプレビル及び MK-0608
In vitro 併用試験(PD001)
以上の結果を総合すると、バニプレビルは強力な HCV NS3/4A プロテアーゼ阻害薬であり、且
つ in vitro で IFN α-2b やリバビリン、さらにヌクレオシドアナログの MK-0608との併用時に拮抗
作用を示さないことが明らかになった。得られたデータから、バニプレビルは各遺伝子型の各変
異に対して広い活性をもつ抗 HCV 薬であるとの評価が確認された。
2.6.2.2.2
In Vivo 試験
[資料4.2.1.1.2: PD002] [資料4.2.1.1.3: PD003] [資料4.2.1.1.4: PD004] [資料4.2.1.1.5: PD005]
2.6.2.2.2.1
HCV 感染チンパンジーでの有効性
方法:
慢性 HCV 感染チンパンジー3匹(genotype 1a 感染:2匹、genotype 3a 感染:1匹)にバニプレビ
ルを7日間(5 mg/kg、1日2回)経口投与し、in vivo での本薬の効力を調べた(PD002)[2.6.3.1 項]。
血漿中ウイルス量を RNA 量として HCV TaqMan アッセイ[Roche 社、定量的検出限界(LOQ)
=20 IU/mL]により定量し、より低いウイルス量検出限界を転写介在増幅法(Bayer 社)により求
めた[定性的検出限界(LOD)=10 IU/mL]
。ウイルス量のベースライン値を確定するため、血漿
試料を投与開始の8日前及び1日前に採取し、その後は投与期間中の数日について1回目投与の8時
間後、及び投与終了後の数日について採取した。
2.6.2 薬理試験の概要文
- 20
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
2.6.2.2.2.2
HCV 感染チンパンジーでの他剤との薬力学的薬物相互作用の評価
薬力学的薬物相互作用を in vivo で評価するため、次の3試験を実施した。
1)
併用投与:バニプレビル及びリバビリン
方法:
2匹の慢性 HCV 感染チンパンジー(genotype 1a 感染:1匹、genotype 1b 感染:1匹)を用いた。
まず、バニプレビルを7日間(1 mg/kg、1日2回)経口投与した。長期の休薬期間後、リバビリン
を2週間(1 g、1日1回)経口投与し、次にバニプレビル(1 mg/kg、1日2回投与)とリバビリン(1
g/匹、1日1回投与)を7日間併用経口投与し、最後にリバビリンのみを7日間(1 g、1日1回投与)
経口投与した。
結果:
バニプレビル1 mg/kg の1日2回単独投与によりウイルス量は1/100~1/1000に減少したが、完全
には抑制されず定量下限より数桁高い値を維持していた。投与中止によりウイルス量は速やかに
投与前のレベル(ベースライン)までリバウンドし、長期の休薬期間を通じてそのレベルが維持
された [図2.6.2: 5]。リバビリン単独投与によるウイルス量への影響はみられなかった。しかし、
バニプレビルとリバビリンの併用投与により、本試験の早期で実施したバニプレビル単独投与時
にみられた値とほぼ同じ程度まで、ウイルス量は速やかに減少した。併用投与終了後にウイルス
量のベースラインレベルへの速やかなリバウンドがみられたが、これに対し、リバビリン単独投
与による抑制又は遅延はみられなかった。バニプレビル単独投与によりみられたウイルス量減少
に対して、リバビリンとの併用投与による影響は検出されなかった(PD004)[2.6.3.1 項]。
2.6.2 薬理試験の概要文
- 22
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
図 2.6.2: 5バニプレビル及びリバビリン併用投与による血漿中ウイルス量の変化(慢
性 HCV 感染チンパンジー)
上段(genotype 1b 感染:gt1b と表示)
、下段(genotype 1a 感染:gt1a と表示)の慢性 HCV 感染チンパンジー2匹
、及びバニプレビル(1 mg/kg:1日2回投与)をリ
に、バニプレビル(1 mg/kg:1日2回投与)単独投与(■)
バビリン(1 g:1日1回)と併用投与(▲)した際の血漿中ウイルス量の変化を重ねて表示した。
[2.6.3.1 項] In vivo 試験(PD004)
2)
併用投与:バニプレビル及び MK-0608(ヌクレオシド系 NS5b ポリメラーゼ阻害薬)
方法:
慢性 HCV 感染チンパンジー3匹(genotype 1a 感染)にバニプレビル(5 mg/kg を1日2回投与)
と別途開発中であったヌクレオシドアナログ MK-0608(2 mg/kg を1日1回投与)を37日間併用投
与した。この併用投与終了後にバニプレビルのみをさらに47日間継続投与した(バニプレビルを
合計84日間投与)。試験開始時におけるチンパンジー3匹のウイルス量には3,000~340,000 IU/mL
の幅があった。
結果:
初回併用投与後、
3匹すべてのウイルス量が数日以内に速やかに定量下限未満のレベルまで減少
し、残りの37日間の併用投与期間を通して低値のまま維持された[図2.6.2: 6]。バニプレビルのみ
投与した延長期間中、65日目に1匹目の動物でウイルスのリバウンドがみられた。2匹目の動物で
は、バニプレビル投与期間中のウイルス量は定量下限未満のレベルのまま維持されたが、バニプ
レビル投与中止の3週間後にリバウンドがみられた。
ウイルスのリバウンド後まもなく採取した両
2.6.2 薬理試験の概要文
- 23
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
動物の血漿サンプル中には、
NS3/4A R155K 変異型ウイルスが多くみられた。
残る3匹目の動物は、
試験開始時のウイルス量が3000 IU/mL と最も低かったが、試験後3年以上にわたり血漿サンプル
中にウイルスが検出されず、ウイルスの陰性化が持続してみられた[資料4.3: 3]。
6
5
log IU/mL
4
3
2
1
0
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
170
190
210
230
250
270
Day
図 2.6.2: 6
バニプレビル及び MK-0608 併用投与による血漿中ウイルス量の変化(慢性
HCV 感染チンパンジー)
慢性 HCV 感染チンパンジー(○、△、□:いずれも genotype 1a 感染)3匹に、バニプレビル(5 mg/kg:1日2回
投与)とヌクレオシドアナログ MK-0608(2 mg/kg:1日1回投与)を37日間併用投与し、その後、バニプレ
ビルのみをさらに47日間継続投与した。
[2.6.3.1 項] [資料4.3: 3]
3)
併用投与:バニプレビル及び MK-3281(非ヌクレオシド系 NS5b ポリメラーゼ阻害薬)
方法:
慢性 HCV 感染チンパンジー(genotype 1a 感染:1匹、genotype 1b 感染:1匹)に、別途開発中
であった HCV NS5b 非ヌクレオシド阻害薬 MK-3281(4 mg/kg、1日2回投与)を7日間経口投与し
た。休薬期間後、バニプレビル(1 mg/kg、1日2回投与)を合計7日間経口投与した。さらに休薬
期間の後、バニプレビル(1 mg/kg、1日2回投与)と MK-3281(4 mg/kg、1日2回投与)を合計7
日間併用経口投与した。
結果:
併用投与時の各動物でのウイルス量の減少は、バニプレビル単独投与時でみられた結果と類似
していた。バニプレビルと非ヌクレオシド阻害薬 MK-3281との併用投与において、拮抗作用や望
ましくない薬物間相互作用は認められなかった[図2.6.2: 7][図2.6.2: 8](PD005)[2.6.3.1 項]。
2.6.2 薬理試験の概要文
- 24
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
図 2.6.2: 7
バニプレビル及び MK-3281 併用投与による血漿中ウイルス量の変化:慢
性 HCV(genotype 1b)感染チンパンジー
休薬期間を挟んで、MK-3281(4 mg/kg、1日2回投与)
、バニプレビル(1 mg/kg:1日2回投与)、バニプレビル及び
MK-3281(併用投与)をそれぞれ7日間ずつ処理した。 [2.6.3.1 項] In vivo 試験(PD005)
図 2.6.2: 8
バニプレビル及び MK-3281 併用投与による血漿中ウイルス量の変化:慢
性 HCV(genotype 1a)感染チンパンジー
休薬期間を挟んで、NK-3281(4 mg/kg、1日2回投与)、バニプレビル(1 mg/kg:1日2回投与)、バニプレビル及び
MK-3281(併用投与)をそれぞれ7日間ずつ処理した。[2.6.3.1 項] In vivo 試験(PD005)
2.6.2.3
副次的薬理試験
2.6.2.3.1
2.6.2.3.1.1
In Vitro 試験
非標的分子における活性(受容体、イオンチャネル及び酵素)
[資料4.2.1.1.1: PD001] [資料4.2.1.2.1: PD006]
HCV NS3/4A はセリンプロテアーゼであることから、ヒトセリンプロテアーゼ及び他のプロテ
アーゼによって触媒される反応に対するバニプレビルの阻害活性を測定した。バニプレビルはト
リプシン(IC50 >10 μM)及びエラスターゼ(IC50 >10 μM)と比較して HCV NS3/4A に高い選択性
を示した。本薬はキモトリプシンに対して弱い阻害活性(IC50 = 0.52 μM)を示したが、その活性
は HCV NS3/4A に対する活性と比較して30,000倍以上の選択性がみられた(PD001)[2.6.3.1 項]
[資料4.3: 2]。本薬は多くのカテプシンに対して不活性であった(IC50 >10 μM)
。これらのデータ
2.6.2 薬理試験の概要文
- 25
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
をテラプレビルと比較して示した[表2.6.2: 12]。
表 2.6.2: 12
各種ヒトプロテアーゼに対するバニプレビル及びテラプレビルの In Vitro 活性
バニプレビル IC50 (μM)
0.52
>10
>10
>10
>10
>10
>10
>10
>10
>10
>10
プロテアーゼ
キモトリプシン
トリプシン
カテプシン B
カテプシン F
カテプシン K
カテプシン L
カテプシン S
カテプシン V
キマーゼ
膵臓エラスターゼ1
好中球エラスターゼ2
[2.6.3.1 項]
MerckScreen 系を用いた被験物質
(
テラプレビル IC50 (μM)
3
>10
4.40
>10
0.63
3.50
0.30
1.35
0.03
0.03
8.00
の活性評価(PD006、PT# 1068107)、
(資料4.3:2)
、台湾)で実施した各種酵素及び受容体並びにイオンチャネル結合
置換アッセイにおいて(PD006)[資料4.3: 2] [2.6.3.1 項]、EC50値が10 μM 未満となる阻害活性を
示したのはタキキニン NK2受容体のみであった。タキキニン NK2受容体とのバニプレビル結合置
換の IC50値は2.86 μM であった(選択性:約179,000倍)。試験したその他すべての分子に対するバ
ニプレビル(濃度10 μM)の結合阻害率及び酵素活性阻害率は、いずれも50%未満であった。
2.6.2.4
安全性薬理試験
ICH S7A 及び S7B に従い安全性薬理試験を in vitro 及び in vivo の各試験系で実施し、バニプレ
ビルの心血管系、呼吸系及び中枢神経系(神経行動)に対する影響を評価した。
2.6.2.4.1
hERG 電流に対する影響
[資料4.2.1.3.1: TT 4761]
CHO-K1細胞に異種発現させた hERG チャネルに対するバニプレビル(カリウム塩)の影響を
標準的なホールセル電位固定法を用いて検討した(TT #
-4761)[2.6.3.4 項]。電位を-80 mV か
ら試験電位の+20 mV へステップ状に変化させて電流を誘導し、その後-50 mV にステップ状に変
化させて再分極したところ、バニプレビルは試験可能な最高濃度の30 μM で hERG 電流を36%阻
害した。溶解性の限界及び膜安定性への影響より、当アッセイ条件下では30 μM を超える濃度で
の本薬の検討は不可能であった。この hERG 阻害は、短時間のウォッシュアウトではほとんど不
可逆的であった。
2.6.2 薬理試験の概要文
- 26
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
2.6.2.4.2
経口投与による心血管系テレメトリー試験
[資料4.2.1.3.2: TT 5823]
覚醒ビーグル犬にバニプレビルを単回経口投与し、心血管系に及ぼす影響を検討した(TT
#
-5823)[2.6.3.4 項]。イヌ4匹に15、30及び250 mg/kg の用量のバニプレビル(カリウム塩)又
は溶媒(10%ポリソルベート80水溶液)を、4×4ラテン方格法に従い1週間の投与間隔で単回経口
投与した。投与後約48時間にわたり、テレメトリープローブを介して心拍数、動脈圧(収縮期血
圧、拡張期血圧及び平均血圧)及び心電図パラメータ(PR、QRS、QT 及び QTcf[Fridericia]間
隔)をモニタリングした。投与に関連した心血管系への影響はみられなかった。覚醒イヌにおけ
る心血管系機能についての無作用量は250 mg/kg 以上であり、250 mg/kg の投与4時間後に測定し
たバニプレビルの血漿中濃度は20.0 μM であった。
2.6.2.4.3
麻酔イヌにおける心血管系機能
[資料4.2.1.3.3: TT 5386]
バルビツール酸で麻酔した人工呼吸下の迷走神経切断イヌ3匹を用い、
バニプレビル(フリー体)
が心血管系に及ぼす影響を検討した。バニプレビルは1、3及び10 mg/kg(累積用量)となるよう
にそれぞれ5 mL の溶媒(100%ジメチルスルホキシド[DMSO]
)で調製し、30分間かけて持続的
に静脈内に投与した(各用量を漸増投与)
(TT # -5386)[2.6.3.4 項]。比較のため、別の3匹のイ
ヌに溶媒のみを投与し、同様に測定した。平均動脈圧、心拍数及び大腿動脈血流にはこれらの用
量で影響がみられなかった。また、この用量範囲で心電図の PR、QRS 及び QTc 間隔に投与に関
連する変化はみられなかった。所見はすべて溶媒投与動物でみられたものと一致していた。バニ
プレビルを1、3及び10 mg/kg で静脈内持続投与したときの血漿中薬物濃度は、それぞれ2.7 ± 1.9、
6.0 ± 0.9及び52.4 ± 11.1 μM(平均±標準偏差)であった。
2.6.2.4.4
ラットへの経口投与による呼吸系試験
[資料4.2.1.3.4: TT 5821]
雄 Sprague-Dawley ラット(1群6匹)にバニプレビルを単回経口投与し、全身プレチスモグラフ
ィーを用いて呼吸系に及ぼす影響を検討した(TT # -5821)[2.6.3.4 項]。40、100及び250 mg/kg
のバニプレビル(カリウム塩)又は溶媒(10%ポリソルベート80水溶液)を投与後、6時間にわた
り呼吸数、1回換気量、分時換気量及び PenH(気道抵抗の指標)を測定した。投与に関連した呼
吸機能への影響はみられなかった。覚醒雄ラットの呼吸機能に関する無作用量は250 mg/kg 以上
であった。
2.6.2.4.5
ラットへの経口投与による機能観察総合評価試験
[資料4.2.3.2.4: TT 9807]
5週間反復経口投与毒性試験の試験1日目の初回投与後に機能観察総合評価(FOB)変法を用い
て、神経行動に及ぼす影響を検討した(TT # -9807)[2.6.3.4 項]。雌雄のラット(1群雌雄各5匹)
において、40、100及び250 mg/kg のバニプレビル(カリウム塩)を投与後 Tmax と予測される時点
2.6.2 薬理試験の概要文
- 27
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
(それぞれ約1.5時間、4時間及び6.7時間[6時間40分])又は溶媒(10%ポリソルベート80水溶液)
を投与後約6.7時間の時点に FOB 変法(ホームケージ、ハンドリング及びオープンフィールドで
の観察、刺激反応性、並びに握力、後肢開脚幅、体温及びホットプレート反応潜時の測定)で評
価した。投与に関連する神経行動学的影響はみられなかった。結論として、雌雄ラットの神経系
機能に関する無作用量は250 mg/kg 以上であった。
2.6.2.4.6
覚醒マウスにおける中枢神経系機能
[資料4.2.1.3.5: TT 5299]
覚醒雌マウスに100 mg/kg のバニプレビル(フリー体)を単回経口投与して中枢神経機能に対
する作用を FOB により評価し、得られたデータについて溶媒(0.5%メチルセルロース水溶液)
を投与した5匹のマウスと比較した(TT #
-5299)[2.6.3.4 項]。中枢神経系の評価は投与の0.5、1、
2、5及び24時間後に実施し、体温は投与2時間後に測定した。行動観察所見、自発運動量、神経反
射及び体温調節を含む中枢神経系に対するバニプレビルの影響は、投与後24時間までみられなか
った。
2.6.2.5
薬力学的薬物相互作用試験
[2.6.2.2.2 項]に、慢性 HCV 感染チンパンジーにバニプレビルとヌクレオシドアナログ MK-0608、
リバビリン又は非ヌクレオシド阻害薬 MK-3281を併用投与したときの薬力学について概説した。
バニプレビルの標的である HCV プロテアーゼのヒト相同蛋白は知られていない。さらに、詳
細なプロファイルの検討[2.6.2.3.1.1 項]では非標的分子への作用を示す傾向はほとんどみられな
かった。したがって、更なる薬力学的薬物相互作用試験は実施しなかった。
2.6.2.6
考察及び結論
プロテアーゼ阻害活性を測定する生化学アッセイ及び細胞を用いた HCV レプリコンアッセイ
において、バニプレビルは強力かつ選択的な HCV NS3/4A 阻害作用を示した。バニプレビルは
genotype 1由来の NS3/4A を強力に阻害し、genotype 2由来の NS3/4A に対してはそれよりも弱いも
のの阻害作用を示した。しかし、genotype 3a 由来の NS3/4A に対しては、明らかな阻害活性がみ
られなかった。生化学アッセイ、レプリコンアッセイ及び発現アッセイでみられたように、開発
段階にある他のプロテアーゼ阻害薬に対して耐性を獲得するような多くの変異型に対しても阻害
活性を維持していた。特に、36位、41位、54位、55位及び80位のアミノ酸における多くの耐性変
異型に対して明らかな阻害活性を維持していた。
HCV(genotype 1)感染チンパンジーへのバニプレビル経口投与により、投与期間中、血漿中
ウイルス量が定量下限未満のレベルまで速やかに減少し、その後、投与中止によりウイルス量の
リバウンドがみられた。NS3中の R155K 変異をコードする変異型ウイルスが genotype 1a 感染チ
ンパンジーで検出されたが、投与期間中に野生型及び変異型のいずれのウイルス量も定量下限未
2.6.2 薬理試験の概要文
- 28
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
満のレベルまで減少した。
バニプレビルは特異性の高い HCV NS3/4A 阻害薬であり、ヒトキモトリプシン阻害と比較して
30,000倍以上の選択性を示す。本薬はトリプシン並びに各種カテプシン及びエラスターゼに対し
て不活性であった(IC50 >10 μM)
。150種類を超える各種酵素、受容体及びイオンチャネルを用い
たアッセイにおいて、10 μM で50%以上の阻害/誘導がみられたのはタキキニン NK2受容体への
結合のみであり(IC50 = 2.86 μM)
、これと比較して HCV NS3/4A への選択性は約179,000倍であっ
た。
バニプレビルの心血管系、呼吸系及び中枢神経系機能に及ぼす影響を in vitro 及び in vivo 安全
性薬理試験で評価した。バニプレビルの hERG 電流阻害率は試験可能な(溶解性の限界及び膜安
定性への影響)最高濃度である30 μM で36%と低値であった。なお、日本人患者に臨床推奨用量
(300 mg を1日2回投与)を PEG-IFN α-2b 及びリバビリンと併用投与したときの Cmax 値は4.78 μM
であり[2.7.2.3.1.1項]、ヒト血漿中遊離型分率が1.7%であることに基づくと[2.6.4.4.4 項]、この30
μM の濃度は臨床 Cmax 値の約370倍に相当する。麻酔イヌに10 mg/kg(バニプレビルの血漿中濃度
は52.4 μM)までの用量を静脈内投与したとき、又はテレメトリー埋め込み覚醒イヌに最高
250 mg/kg(投与4時間後におけるバニプレビルの血漿中濃度は20.0 μM)の用量を経口投与したと
き、投与に関連した心血管系への影響はみられなかった。これらの血漿中濃度は臨床推奨用量
(300 mg を1日2回投与)における臨床 Cmax 値のそれぞれ約11倍及び約4倍であった。バニプレビ
ルをマウスに100 mg/kg の用量で投与したとき中枢神経系機能への影響はみられず、またラット
に最高250 mg/kg の用量で投与したとき呼吸系及び神経系機能への影響はみられなかった。ラッ
ト5週間反復経口投与毒性試験(TT # -9807)[2.6.7.7A 項]におけるトキシコキネティクスの結果
に基づくと、ラットに250 mg/kg 投与時の Cmax 値は約44.8 μM であり、臨床 Cmax 値の約9倍であっ
た。
以上の非臨床薬理試験の結果より、バニプレビルは HCV NS3/4A セリンプロテアーゼを選択的
に阻害することにより、強力な HCV の増殖抑制を示すことが確認された。これらバニプレビル
の非臨床薬理試験の結果は、慢性 HCV 患者において本薬を臨床使用する裏付けとなった。
2.6.2.7
引用文献
[資料4.3: 1]
McCauley JA, McIntyre CJ, Rudd MT, Nguyen KT, Romano JJ, Butcher JW, et al.
Discovery of Vaniprevir (MK-7009), A Macrocyclic Hepatitis C Virus NS3/4a
Protease Inhibitor.
[資料4.3: 2]
J Med Chem 2010;53:2443-63.
Liverton NJ, Carroll SS, DiMuzio J, Fandozzi C, Graham DJ, Hazuda D, et al.
MK-7009, A Potent and Selective Inhibitor of Hepatitis C Virus NS3/4A Protease.
Antimicrob Agents Chemother 2010;54(1):305-11.
[資料4.3: 3]
Olsen DB, Davies M-E, Handt L, Koeplinger K, Zhang NR, Ludmerer SW, et al.
2.6.2 薬理試験の概要文
- 29
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.2 薬理試験の概要文
Sustained Viral Response in a Hepatitis C Virus-Infected Chimpanzee via a
Combination of Direct-Acting Antiviral Agents.
Antimicrob Agents Chemother
2011;55(2):937-39.
[資料4.3: 9]
He Y, King MS, Kempf DJ, Lu L, Lim HB, Krishnan P et al.
Relative replication
capacity and selective advantage profiles of protease inhibitor-resistant hepatitis C
virus (HCV) NS3 protease mutants in the HCV genotype 1b replicon system.
Antimicrob Agents Chemother 2008;52:1101-10.
[資料4.3: 10]
Bae A, Sun S-C, Qi X, Chen X, Ku K, Worth A, et al. Susceptibility of treatment-naive
hepatitis C virus (HCV) clinical isolates to HCVprotease inhibitors. Antimicrob
Agents Chemother 2010;54(12):5288-97.
2.6.2 薬理試験の概要文
- 30
-
CTD 第 2 部
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.3 薬理試験概要表
MSD 株式会社
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.3 薬理試験概要表
目次
頁
略号及び用語の定義..................................................................................................................................... 2
2.6.3.1
薬理試験:一覧表............................................................................................................. 3
2.6.3.2
効力を裏付ける試験......................................................................................................... 5
2.6.3.3
副次的薬理試験................................................................................................................. 6
2.6.3.4
安全性薬理試験................................................................................................................. 7
2.6.3 薬理試験概要表
- 1
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.3 薬理試験概要表
略号及び用語の定義
略語
GLP
Good Laboratory Practice
hERG
MDS
MRL F
human ether-a-go-go related gene
Taiwan.
Merck Research Laboratories, Mirabel,
France.
Merck Research Laboratories, Merck Frost,
Montreal, Canada.
Merck Research Laboratories, Tsukuba, Japan.
Merck Research Laboratories, Kenilworth,
New Jersey, U.S.A.
Merck Research Laboratories, West Point,
Pennsylvania, U.S.A.
MRL MF
MRL TJ
MRL US
MRL WP
定義
医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施
の基準
-
-
-
2.6.3 薬理試験概要表
- 2
-
-
MRL つくば研究所
-
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.3 薬理試験概要表
2.6.3.1
被験物質:バニプレビル
薬理試験:一覧表
試験の種類
試験系
投与方法
実施施設
試験番号
記載箇所
組換え酵素
レプリコン細胞株
レプリコン細胞株
組換え酵素
In vitro
MRL US
PD001
[資料4.2.1.1.1: PD001] (評価資料)
In vitro
MRL US
PD001
[資料4.2.1.1.1: PD001] (評価資料)
In Vitro 併用試験
発現アッセイ
レプリコン細胞株
In vitro
In vitro
MRL US
MRL US
PD007
PD001
[資料4.2.1.1.6: PD007] (評価資料)
[資料4.2.1.1.1: PD001] (評価資料)
In Vivo 試験
チンパンジー
経口
MRL WP 及び
PD002
PD003
PD004
PD005
[資料4.2.1.1.2:
[資料4.2.1.1.3:
[資料4.2.1.1.4:
[資料4.2.1.1.5:
In vitro
MRL US
MRL MF
MDS
PD001
[資料4.2.1.1.1: PD001] (評価資料)
PD006
[資料4.2.1.2.1: PD006] (評価資料)
MRL WP
TT #
効力を裏付ける試験
In Vitro での活性
In Vitro 耐性型分析
副次的薬理試験
非標的分子における活性(酵素、 組換え酵素等
受容体及びイオンチャネル)
安全性薬理試験
hERG アッセイ
チャイニーズハム
スター卵巣細胞に
安定発現させた
hERG チャネル
In vitro
2.6.3 薬理試験概要表
- 3
-
-4761
PD002]
PD003]
PD004]
PD005]
[資料4.2.1.3.1: TT
(評価資料)
(評価資料)
(評価資料)
(評価資料)
4761] (参考資料)
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.3 薬理試験概要表
2.6.3.1
被験物質:バニプレビル
薬理試験:一覧表(続き)
試験の種類
試験系
投与方法
実施施設
試験番号
記載箇所
安全性薬理試験(続き)
心血管系への作用 a
イヌ/ビーグル
経口
MRL TJ
MRL F
TT #
-5823
[資料4.2.1.3.2: TT
5823] (評価資料)
イヌ/雑種
(麻酔、迷走神経切
断、人工呼吸)
ラット/
Sprague-Dawley
ラット/
Sprague-Dawley
マウス/CD-1
静脈内
MRL WP
TT #
-5386
[資料4.2.1.3.3: TT
5386] (参考資料)
経口
MRL TJ
TT #
-5821
[資料4.2.1.3.4: TT
5821] (評価資料)
経口
MRL TJ
TT #
-9807
[資料4.2.3.2.4: TT
9807] (評価資料)
経口
MRL WP
TT #
-5299
[資料4.2.1.3.5: TT
5299] (参考資料)
心血管系への作用
呼吸系への作用
a
神経行動への作用
神経行動への作用
a
a
報告書には GLP 遵守陳述書が含まれている。
MRL WP = Merck Research Laboratories, West Point, Pennsylvania, U.S.A.
MRL F = Merck Research Laboratories, Mirabel, France.
MRL TJ = Merck Research Laboratories, Tsukuba, Japan.
MDS =
, Taiwan.
MRL US = Merck Research Laboratories, Kenilworth, New Jersey, U.S.A.
MRL MF = Merck Research Laboratories, Merck Frost, Montreal, Canada.
2.6.3 薬理試験概要表
- 4
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.3 薬理試験概要表
2.6.3.2
効力を裏付ける試験
効力を裏付ける試験の項[2.6.2.2項]を参照のこと。
2.6.3 薬理試験概要表
- 5
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.3 薬理試験概要表
2.6.3.3
副次的薬理試験
副次的薬理試験の項[2.6.2.3項]を参照のこと。
2.6.3 薬理試験概要表
- 6
-
バニプレビル カプセル剤
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.3 薬理試験概要表
2.6.3.4
被験物質:バニプレビル
安全性薬理試験
試験の種類
動物種/系統
hERG 試験
チャイニーズハム
スター卵巣細胞に
安定発現させた
hERG チャネル
イヌ/ビーグル
3、10、30 M
性別及び
動物数/群
N/A
経口
15、30、250 mg/kg
イヌ/雑種
(麻酔、迷走神経
切断、人工呼吸)
ラット/
Sprague-Dawley
静脈内
神経行動への作用
神経行動への作用
心血管系への作用
心血管系への作用
呼吸系への作用
投与量/濃度
a
投与
方法
In vitro
特記すべき所見
GLP 適用
試験可能な最高濃度の
30 M で hERG 電流を36%
阻害した。
不適
雄4
投与に関連した影響なし。
適
1、3、10 mg/kg
(累積投与)
雌2、雄1
投与に関連した影響なし。
不適
経口
40、100、250 mg/kg
雄6
投与に関連した影響なし。
適
ラット/
Sprague-Dawley
経口
40、100、250 mg/kg
雌5、雄5
投与に関連した影響なし。
適
マウス/CD-1
経口
100 mg/kg
雌5
投与に関連した影響なし。
不適
a
b
試験番号
/記載箇所
TT # -4761
[資料4.2.1.3.1:
TT 4761]
TT # -5823
[資料4.2.1.3.2:
TT 5823]
TT # -5386
[資料4.2.1.3.3:
TT 5386]
TT # -5821
[資料4.2.1.3.4:
TT 5821]
TT # -9807
[資料4.2.3.2.4:
TT 9807]
TT # -5299
[資料4.2.1.3.5:
TT 5299]
特にことわりがない限り単回投与。
試験は、GLP の原則を基に、GLP 準拠に重要な多くの事項(標準操作手順書、試験計画書、試験物質及び対照物質の取扱い、訓練、文書化及び保管など)に
適切に従い実施された。
N/A = 該当せず。
b
2.6.3 薬理試験概要表
- 7
-
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