GC Technical Note ８9 GC/MSによる微生物培養液の成分分析 GL Sciences Inc. トリメチルシリル(trimethylsilyl, TMS)誘導体化を用いたGC/MSによるメタボロミクスは，アミノ酸，有機酸，糖などの親水性低分子成分を幅広く測定できる方法として広く利用されています。今回はその手法を用いて微生物培養液の成分分析を行いましたので報告いたします。網羅的に分析することで、培地成分だけではなく、微生物により生産された成分の検出も可能になります。化合物のピーク同定は、GCテクニカルノートNo.81でご紹介いたしましたInertCap 5MS/NPのメタボロミクスにおけるGC/MS代謝物ライブラリーの保持指標とマススペクトルを用いて行っています。試料と前処理の手順成分 Glucose Peptone Yeast extract 試料は酵母の培養に使用される半合成培地のYPD 培地を用いました。 YPD培地の組成と濃度は右表のとおりで、グルコース、ペプトン、酵母エキスを調製します。前処理方法を下のフローに示しました。濃度 20 g/L 20 g/L 10 g/L 試料100 μL 900 μL メタノール/水/クロロホルム(5/2/2, v/v/v) 内標準物質混合遠心分離(16000 g, 4 ºC, 5 min) 上澄み液 600 μLを別のマイクロチューブに採取遠心濃縮(Room Temp., 60 min) 凍結乾燥(Over night) 100 μL メトキシアミン塩酸塩(20 mg/mL, ピリジン溶液) 振とう(30 ºC, 90 min) 50 μL MSTFA (Cat.No. 1022-11061) 振とう(37 ºC, 30 min) バイアルに移す GC/MS サンプル量が少ないので、インサート一体型バイアルを使用すると便利です。 MSTFA(Cat.No. 1022-11061)は1 gのアンプル封入(10本入り)になっています。アンプルには切れ込みが入っているので、カッターを使用せずそのまま手であけることが可能です。また、一般的に、シリル化は水の存在により反応が進みづらい場合がありますので、使い切りをお勧めします。インサート一体型バイアル Cat.No. 1030-51028 セプタム一体型キャップ Cat.No. 1030-51227 バックナンバーやアプリケーション検索はこちらから・・・ http://www.gls.co.jp/gc.html GL Sciences GC Technical Note GC/MS測定 GC/MS測定条件と得られたクロマトグラムを下に示します。測定条件装置キャピラリーカラム試料導入法気化室温度カラムオーブン温度キリヤガキャリヤーガスセプタムパージ流量スプリット比インターフェイス温度イオン源温度測定モド測定モード試料導入量 : GC-MS : InertCap 5MS/NP 0.25 mm I.D. × 30 m df = 0.25 µm (Cat.No. 1010-18642) : スプリット 75 kPa 圧力一定 : 230 ºC : 80 ºC(2 min) - 15 ºC /min - 330 ºC(13 min) : ヘリウムリウム : 5 mL/min : 25:1 : 250 ºC : 200 ºC : Scan S m/z / = 85～500 85 500 ピーク同定は保持指標とマススペクトルを利用しており、InertCapの代謝 : 1 μL 物ライブラリー(GCテクニカルノートNo.81)とNISTを用いて行っています。カラムへ導入した成分がカラムの試料負荷容量を超えるときは、サンプルを希釈するなど試料導入量をご検討ください。 (x10,000,000) 2.0 TIC 53 48 52 55 20,21 1.5 37 14,15 13 4 31,32 31 32 33,34,35 25 1.0 17,18 9 0 0 0.0 5.0 23 56 6.0 8 11 10 1216 7.0 19 22 24 26 28 23 8.0 57 27 40 7 49 38,39 0.5 1 68 51 54 9.0 2930 10.0 36 11.0 50 41(I.S.) 45 4647 43 42 44 12.0 13.0 56 59 61 58 14.0 63 60 64 62 15.0 16.0 65 17.0 66 18.0 67 19.0 20.0 GL Sciences GC Technical Note Peak No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Compound_Name * R.T.(min) Peak No. Lactic acid_0_2 5.130 35 Glycolic acid_0_2 5.293 36 Valine_0_1 5.423 37 Alanine_0_2 5.645 38 Glycine_0_2 5.827 39 Oxalic acid_0_2 5.953 40 Leucine_0_1 6.233 41 Isoleucine_0_1 6.485 42 Valine_0_2 6.975 43 Urea_0_2 7.123 44 Serine_0_2 7.398 45 2-Aminoethanol_0_3 7.540 46 Leucine_0_2 7.582 47 Phosphoric acid_0_3 7.605 48 Glycerol_0_3 7.608 49 Nicotinic acid_0_1 7.767 50 Threonine_0_2 7.813 51 Isoleucine_0_2 7.820 52 Proline_0_2 7.865 53 Succinic acid_0_2 7.967 54 Glycine_0_3 7.972 55 Glyceric acid_0_3 8.202 56 Uracil_0_2 8.263 57 Fumaric acid_0_2 8.282 58 Serine_0_3 8.505 59 Alanine_0_3 8.522 60 Threonine_0_3 8.783 61 Thymine_0_2 8.900 62 Nicotinamide_0_1 9.593 63 Malic acid_0_3 9.712 64 Methionine_0_2 10.008 65 Aspartic acid_0_3 10.010 66 Hydroxyproline_0_3 10.042 67 Pyroglutamic acid_0_2 10.043 68 Compound_Name * R.T.(min) 4-Aminobutyric acid_0_3 10.052 Alanylalanine_0_2 10.732 Glutamic acid_0_3 10.865 Pipecolic acid_0_2 10.970 Phenylalanine_0_2 10.975 Asparagine_0_3 11.308 Ribitol_0_5 11.853 Putrescine_0_4 11.908 Unknown_Sugar phosphate like 12.077 o-Phosphoethanolamine_0_4 12.257 Hypoxanthine_0_2 12.383 Isocitric acid_0_3 + Citric acid_0_3 12.522 Methionine sulfoxide 12.797 13.015 Unknown_Sugar like Unknown_Sugar like 13.087 Unknown_Sugar like 13.145 Glucose_1_5 13.254 Histidine_0_3 13.285 Lysine_0_4 13.295 Glucose_1_5 13.388 Tyrosine_0_3 13.415 13.582 Unknown_Sugar like Unknown_Sugar like 13.703 Xanthine_0_3 13.953 14.083 Unknown_Sugar like Hydroxylysine 14.385 Inositol_0_6 14.587 Guanine_0_3 14.662 Tryptophan__0_3 15.335 Uridine_0_4 16.680 Inosine 17.377 Adenosine 17.720 Guanosine 18.437 Trehalose 18.488 * Compound Name_メトキシ基の数_TMSの数培養液の種類・試料量によっては誘導体化が進みづらい場合があります。その場合は、試料を希釈してご検討ください。今回の試料は大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻福崎英一郎先生、馬場健史先生からご提供いただきました。 GL Sciences GC Technical Note 化合物の同定には、ピークの自動同定が可能なAIoutput*を利用することもできます。 AIoutput とAIoutputで利用できるInertCap 5MS/NPのライブラリー(保持指標とマススペクトル情報を含む)は下記のリンクからダウンロード出来ます。保持指標の算出には炭化水素混合試料を用いると便利です。 (http://prime.psc.riken.jp/) *AIoutputは自動ピーク同定から多変量解析までをサポートしているフリーのソフトウェアです。製品名: 炭化水素混合試料 C9～C40 in n-Hexane 容量: 1 mL 成分及び濃度: 各50 μg/mL ※C10,C20,C30,C40は各100 μg/mL 荷姿: アンプル付属品: バイアル(1アンプルにつき1本, アンプル開封後の保管にご使用ください。) C20 C10 測定条件装置 : GC-FID キャピラリーカラム : InertCap 5MS/NP 0.25 mm I.D.×30 m, df = 0.25 μm 試料導入法 : Split 120 kPa 気化室温度 : 230ºC オーブン温度 : 100 ºC(2 min) – 20 ºC/min – 330 ºC(17 min hold) キャリヤーガス : ヘリウムスプリット流量 : 25 mL/min 検出器温度 : 330 ºC 試料導入量 : 1 μL C30 C40 0 10 30 (min) 20 製品名炭化水素混合試料 C9～C40 in C6 [冷蔵] Cat.No. 容量 1 mL 1021-58321 1 mL ×5 1021-58325 ジーエルサイエンスでは、分析ノウハウときめこまやかなフォローもお付けしたシステム提案を行っております。お近くの営業所やカスタマーサポートセンターまでお気軽にお問い合わせください。データに起因し、直接的または間接的に生じたいかなる損害に対しましても、当社が責任を負うものではありません。また、記載事項につきましては、予告無しに改訂する場合がありますので、あらかじめご了承ください。ホームページはこちらから・・・ http://www.gls.co.jp/gc.html 〒163-1130 東京都新宿区西新宿6丁目22番1号新宿スクエアタワー30F TEL.03(5323)6611 FAX.03(5323)6622 TEL.03(5323)6611 TEL.06(6357)5060 TEL.045(985)7900 TEL.024(534)2191 TEL.029(858)3700 TEL.043(248)2441 TEL.048(667)1611 TEL.052(931)1761 TEL.082(233)1101 TEL.092(738)6633 F A X. 0 3 ( 5 3 2 3 ) 6 6 2 2 F A X. 0 6 ( 6 3 5 7 ) 4 5 8 0 F A X. 0 4 5 ( 9 8 5 ) 7 9 0 1 F A X. 0 2 4 ( 5 3 6 ) 1 5 1 8 F A X. 0 2 9 ( 8 5 8 ) 3 7 8 0 F A X. 0 4 3 ( 2 4 8 ) 2 4 8 5 F A X. 0 4 8 ( 6 6 7 ) 1 6 5 6 F A X. 0 5 2 ( 9 3 1 ) 1 8 1 4 F A X. 0 8 2 ( 2 3 3 ) 1 1 1 0 F A X. 0 9 2 ( 7 3 8 ) 6 6 3 6 ｶｽﾀﾏｰｻﾎﾟｰﾄｾﾝﾀｰ T E L . 0 4 ( 2 9 3 4 ) 1 1 0 0 F A X. 0 4 ( 2 9 3 4 ) 3 3 6 1 東大横東筑千北名広九京営業阪支浜支北営業波営業葉営業関東営業古屋営業島営業州営業部店店所所所所所所所ジーエルサイエンス GC テクニカルノート