RITEバイオ研究グループ Molecular Microbiology and Biotechnology Group グループリーダー代行乾将行 Acting Group Leader Dr. Masayuki Inui グループ員 46 名（博士号取得者 20 名） Group members 46 Researchers (20 Ph.D.s) ■研究目的バイオマス有効利用技術の開発 Research Purpose : Technology development of effective utilization of biomass 微生物が持つ優れた物質変換機能を利用した、非可食バイオマスを原料とするバイオリファイナリーの早期実現を目指した技術開発 ;LJOUVSVN`KL]LSVWTLU[VMIPVYLÄULY`MYVTUVUMVVKIPVTHZZ[VHJOPL]LP[ZLHYS`YLHSPaH[PVUI`\ZPUN microbial substance conversion ability. ■主要技術開発項目 Research Areas １．バイオリファイナリー基盤研究（RITE バイオプロセスの新展開） )HZPJYLZLHYJOVUIPVYLÄULY` ・芳香族化合物の生産技術開発 Production technology development of aromatics ・次世代バイオ燃料生産：ブタノール、バイオジェット燃料 Production technology development of next generation biofuels; butanol, biojet fuels etc. ・ミューテーター高速育種法による阻害物質耐性株の創製 Development of tolerance strains to high cellular inhibition chemicals ２．バイオリファイナリー製品の工業化推進 0UK\Z[YPHSPaH[PVUVMIPVYLÄULY`WYVK\J[Z ・グリーンフェノール開発株式会社の設立（GP サンプルの早期提供） Establishment of Green Phenol Development Co., Ltd. to provide green phenol ・Green Earth Institute 株式会社による工業化推進（セルロースエタノール、アラニン） 0UK\Z[YPHSPaH[PVUVMIPVYLÄULY`WYVK\J[ZI`.YLLU,HY[O0UZ[P[\[L*V3[K[VWYV]PKLNYLLUJOLTPJHSZ ■重点分野 Field of Focus Challenge to the production of high cellular inhibition chemicals Problem of growth dependent fermentation Growth inhibition by products Low productivity 䠄low production rate, low concentration䠅 Practical use is difficult RITE-Bioprocess (Growth-Arrested Bioprocess) High cellular inhibition chemicals Non-food Biomass pretreatment saccharification Mixed sugars 䠄C6&C5䠅䞉Aromatics 䠄phenol etc.䠅䞉Alcohols 䠄butanol etc.䠅 Advantage 䕔Coryneform bacteria have high tolerance to aromatics, alcohols etc. of our process 䕔Compared to conventional fermentation, Growth-Arrested Bioprocess is less susceptible to chemical inhibitors. バイオブタノール/バイオジェット燃料技術開発 R&D for biobutanol production for bio-jet fuel ■研究の背景 Research background 航空機からの CO2 排出量削減のためバイオ燃料での営業運行が始まっている。ブタノールは容易にジェット燃料に転換できるため、バイオジェット燃料素材として注目されている。 Biobutanol is attractive as a bio-jet fuel ingredient due to its easy convertibility into jet fuels. CO2 emission million ton Non-food biomass Route change, Ground capital improvement etc. 4000 Efficiency improvement of aircraft bioprocess Isobutanol 3000 OH Butanol n-butanol Cap on CO2 emission from 2020 2000 OH Dehydration, oligomerization H2/catalyst 1000 Biofuels & CO2 emission trading （ca.1.2 billion ton） 0 2005 10 20 25 30 40 Bio-jet fuel 50 source: ICAO, Nikkei shimbun ブタノールからのバイオジェット燃料製造国際航空のCO 排出量対策 2 Mitigation of CO2 emissions by the aviation industry Bio-jet fuel production from biobutanol ■バイオ研究グループの取り組み R&D for biobutanol production in our group ・技術組合を設立して NEDO 戦略的次世代バイオマスエネルギー利用技術開発事業（H22 ∼ H25 年）でイソブタノール製造技術開発を実施。 NEDO isobutanol project (2010-2013) was carried out by a technology association established with RITE and Sumitomo Bakelite Co.,Ltd. ・METI「日米等エネルギー環境技術研究・標準化協力事業（H25 ∼ H26 年）で n-ブタノール製造技術開発を実施中。 METI project of n-butanol production technology development (2013-2014) has been carried out by RITE. Growth-arrested Bioprocess Dehydration, oligomerization Hydrogenation Mixed sugars 菌体膜分離 Membrane separation Non-food Biomass バイオジェット燃料 Bio-jet fuels Butanol recovery & purification ■研究成果：Isobutanol 䝁䝸䝛ᆺ⣽⳦䛻䛚䛡䜛䜲䝋䝤䝍䝜䞊䝹⏕ྜᡂ⤒㊰ Sugars 2NAD+ 2NADH Phosphoenolpyruvate Lactate pyruvate Succinate ๪⏕⤒㊰䛾㐽᩿ Acetate 䝤䝍䝜䞊䝹⏕ྜᡂ⣔㑇ఏᏊ䛾㧗Ⓨ⌧ Pyruvate + Pyruvate 䝁䝸䝛ᆺ⣽⳦⏤᮶ 㓝⣲㑇ఏᏊ 䠄䝞䝸䞁⤒㊰䠅・増殖非依存型バイオプロセスにより世界最高の生産速度を達成。 The highest production rate in the world were achieved by our process. 䝣䜱䞊䝗䝞䝑䜽㜼ᐖ䛾ゎ㝖䐟 Acetohydroxyacid synthase䠄AHAS䠅 Acetolactate NADH NAD+ 䐠 Acetohydroxyacid isomeroreductase䠄AHAIR䠅 ⣽⬊ෆ㓟໬㑏ඖ 䝞䝷䞁䝇䛾ㄪᩚ 2,3-Dihydroxyisovalerate 䐡 Dihydroxyacid dehydratase䠄DH䠅 D-Pantothenate 2-Ketoisovalerate ௚ᚤ⏕≀ 㓝⣲㑇ఏᏊ L-Valine 䐢 2-ketoacid decarboxylase䠄KDC䠅 L-Leucine 㧗ᇶ㉁≉␗ᛶ㓝⣲㑇ఏᏊ䛾 ᥈⣴䞉ᨵⰋ Isobutyraldehyde NADH NAD+ 䐣 Isobutanol dehydrogenase䠄IDH䠅 Isobutanol Introduction of isobutanol synthetic genes into coryneform bacterium ■研究成果：n-butanol コリネ型細菌への直鎖ブタノール代謝系の導入特許: JP5252940 乳酸ピルビン酸酢酸アセチル-CoA アセトアセチル-CoA 3-ヒドロキシブチリル-CoA クロトニル-CoA 酪酸ブチリル-CoA ブチルアルデヒド直鎖-ブタノール Introduction of n-butanol synthetic genes into coryneform bacterium ・高濃度耐性宿主株（コリネ型細菌）の創製と実糖化液からの 70% モル収率を目指して研究開発実施中 Development of n-butanol tolerance strain to achieve 70% mole yield from a biomass derived mixed sugar. グリーンフェノール製造技術開発 Development of bioprocess for production of green-phenol ■研究の背景 Background 工業原料として重要なフェノールのグリーン化は困難とされてきたが、 RITE と住友ベークライト㈱は、グリーンフェノール製造技術を世界で初めて確立し、早期実用化に向けた取り組みを進めている。 7OLUVSPZHUPTWVY[HU[TH[LYPHSMVYJOLTPJHSPUK\Z[YÒV^L]LYP[OHZILLUKPMÄJ\S[[VWYVK\JLMYVTIPVTHZZ90;,HUK :\TP[VTV)HRLSP[L*V3;+LZ[HISPZOLKH[LJOUVSVN`VMNYLLUWOLUVSWYVK\J[PVUMYVTIPVTHZZMVY[OLÄYZ[[PTLHUK^L HYLHK]HUJPUNLHYS`\[PSPaH[PVU 䜾䝸䞊䞁䝣䜵䝜䞊䝹⏕⏘ἲ䛾ẚ㍑ ⌧ᅾ䛾ᕤᴗⓗ䝣䜵䝜䞊䝹⏕⏘ἲ䠄䜽䝯䞁ἲ䠅 O ‫ۅ‬ 䜰䝉䝖䞁 H3C䠉C䠉CH3 䠇 CH3 ୕ẁ┠ | OH C䠉O䠉OH | H2SO4 CH3 䠄60-90Υ䠅䝥䝻䝢䝺䞁 H2C䠙CH䠉CH3 䠇 CH3 ஧ẁ┠ | CH | O2 CH3 䠄80-130Υ䠅 ୍ẁ┠ ཎἜ HCl, AlCl3 䠄200-250Υ䠅䞉᥋ゐᨵ㉁ἲ 䞉䝘䝣䝃ศゎ䞉ᢳฟἲ 䝧䞁䝊䞁䜽䝯䞁䡴䢎䢙䢆䡮䢀䢚䢗䢆䢛䡬䡱䡳䡷䡮䢀䢚䝣䜵䝜䞊䝹䜾䝸䞊䞁䝣䜵䝜䞊䝹⏕⏘ἲ 㠀ྍ㣗䝞䜲䜸䝬䝇䠄䝉䝹䝻䞊䝇䠅 CH2OH O HOH2C OH ⢾໬ HO OH OH O OH OH HOH2C OH O ቑṪ㠀౫Ꮡᆺ 䝞䜲䜸䝥䝻䝉䝇 OH OH OH 䝣䜵䝜䞊䝹 OH 30-33Υ C6⢾㢮䠄䜾䝹䝁䞊䝇➼䠅 C5⢾㢮䠄䜻䝅䝻䞊䝇䚸䜰䝷䝡䝜䞊䝇䠅 Comparison of chemical and biological production process of phenol. ■2段工程法によるグリーンフェノール生産技術 .YLLUWOLUVSWYVK\J[PVU[LJOUVSVNÌ`H[^VZ[LWWYVJLZZ バイオプロセスによるフェノール生産の最大の障害は、フェノールが有する強い細胞毒性である。そこで中間体（4-ヒドロキシベンゾエート）を経由する「2 段工程法」を開発した。 7YVISLTVMNYLLUWOLUVSWYVK\J[PVUPZPUOPIP[PVUI`WOLUVSVMTPJYVIPHSJLSSZ;OLYLMVYL^LKL]LSVWLKH[^VZ[LWWYVJLZZ I`^H`VMO`KYV_ÌLUaVH[L[VWYL]LU[[OLPUOPIP[PVU 㠀ྍ㣗䝞䜲䜸䝬䝇 ๓ฎ⌮ ⢾໬ ➨1ẁᕤ⛬ ➨2ẁᕤ⛬ ቑṪ㠀౫Ꮡᆺ䝥䝻䝉䝇 One step ⳦య㓝⣲཯ᛂ 4-䝠䝗䝻䜻䝅䝧䞁䝌䜶䞊䝖䠄4HBA䠅 ΰྜ⢾ 䠄C6,C5⢾䠅 4-䝠䝗䝻䜻䝅䝧䞁䝌䜶䞊䝖䠄4HBA䠅䝣䜵䝜䞊䝹 ᅇ཰䞉⢭〇 A two-step process for production of green-phenol. 1st step: efficient production of 4HBA from glucose, and 2nd step: quantitative conversion of 4HBA to phenol ■グリーンフェノール開発株式会社（GPD社）を設立 ,Z[HISPZOTLU[VM.YLLUWOLUVSKL]LSVWTLU[*V3[K RITE と住友ベークライト㈱が共同で設立したグリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合を組織変更して平成 26 年 5 月に設立。 .YLLUWOLUVSKL]LSVWTLU[*V3[K^HZLZ[HISPZOLKPUMVYPUK\Z[YPHSPaH[PVUVMNYLLUWOLUVSI`90;,HUK:\TP[VTV )HRLSP[L*V3[K ■GPD社の事業内容 )\ZPULZZVM.YLLUWOLUVSKL]LSVWTLU[*V3[K NEDO 事業を受託し（H26.5 ∼ 27.3）千葉県かずさアカデミアパークに試験装置を設置して 2015 年のグリーンフェノールサンプル出荷を目指す。 >P[OZ\WWVY[MYVT5,+6HILUJOZJHSLWSHU[PZILPUNJVUZ[Y\J[LKH[2Ha\ZH(JHKLTPH7HYRPU*OPIHWYLMLJ[\YLHUK[OL WYVK\J[PVUVMNYLLUWOLUVS^PSSZ[HY[PU グリーンフェノール樹脂特性自動車部品におけるフェノール樹脂の利用 700 数平均分子量Mn (-) 石油由来フェノール 650 グリーンフェノール 600 成形材料 550 （駆動・電装部品、キャップ部品等） 500 450 400 0 Green phenol (Monomer) 1 2 3 4 反応時間（hr） Fig.ノボラック型樹脂における石油由来フェノールとの重合性の比較（反応条件：弊社基本条件）グリーンフェノールは石油由来フェノールと同等の重合性能 Properties of green-phenol sample 鋳物用型材（バインダー樹脂）タイヤ用添加剤（ゴム強化剤等）摩擦材（ブレーキ・クラッチ用バインダー樹脂） Phenol resins for automobile parts 芳香族化合物製造技術開発 R&D of aromatic compounds production ■研究の背景 Background 芳香族化合物のグリーン化は芳香族化合物の細胞毒性のため困難とされてきた。コリネ型細菌と本細菌を利用した増殖非依存型バイオプロセスは、芳香族化合物への耐性が高く、優れた生産法として注目されている。 7YVK\J[PVUVMHYVTH[PJJVTWV\UKZMYVTIPVTHZZOHZILLUKPMÄJ\S[K\L[V[OLPYOPNOJ`[V[V_PJLMMLJ[ZVUTPJYVIPHSJLSSZ *VYÙLMVYTIHJ[LYPHHUK.YV^[O(YYLZ[LK)PVWYVJLZZOH]LOPNO[VSLYHUJL[VHYVTH[PJJVTWV\UKZHUK[OLWYVJLZZ H[[YHJ[ZH[[LU[PVUHZLMÄJPLU[WYVK\J[PVUWYVJLZZVMHYVTH[PJJVTWV\UKZ 増殖非依存型バイオプロセスにおける糖消費微生物増殖に対するフェノールの影響 Effect of phenol on the sugar consumption of Growth-Arrested Bioprocess Corynebacteriumglutamicum R + Phenol 10 Cell concentration（OD610） Glucose concentration （mM） Effect of phenol on the growth ofbacteria 0% 0.16% 1 0.20% 0.24% 0.1 0.32% 0.01 Escherichia coli JM109 10 + Phenol 0% 1 0.16% 0.20% 0.1 Corynebacteriumglutamicum R 400 300 + Phenol 0% 0.24% 200 0.38% 0.46% 100 0 0 0.01 10 + Phenol 1 0.10% 0.20% Coryneform bacteria and Growth-Arrested Bioprocess are effective for the production of aromatics. 0.01 0 5 10 Time（h） 30 コリネ型細菌と増殖非依存型バイオプロセスは、高細胞阻害物質の生産に優位 0% 0.1 20 Time （h） Pseudomonas putida S12 10 （solvent resistance） 15 ■バイオ研究グループの取り組み R&D of aromatics production in our group ・芳香族化合物生産に対するコリネ型細菌と増殖非依存型バイオプロセスの優位性を生かした芳香族化合物生産技術の開発推進。 +L]LSVWTLU[VM[LJOUVSVN`MVY[OLWYVK\J[PVUVMHYVTH[PJJVTWV\UKZI`\ZPUNV\YHK]HUJLKIPVWYVJLZZ .YV^[O(YYLZ[LK)PVWYVJLZZ コリネ型細菌での芳香族化合物生合成経路 Glucose 4-HBA: 4-hydorxybenzoic acid 4-ABA: 4-aminobenzoic acid PTS CA: trans-cinnamic acid FA: ferulic acid 4-HCA: 4-hydroxycinnamic acid (p-coumarate) 4-HS: 4-hydroxystylene 3,4-CHD: S, S-3,4-dihydroxy-3,4EM pathway dihydrobenzoic acid G-6-P 2,3-CHD: S, S-2,3-dihydroxy-2,3dihydrobenzoic acid F-6-P CHA: chorismate ANT: anthranilate F-1,6-P2 (2-aminobenzoate) PPY: phenylpyruvate 4-HPE: 4-hydroxyphenylethanol GAP DHAP 4-HPPA: 4-hydroxyphenylpyruvate NAD+ GAPDH 4-HPAAL: 4-hydroxyphenylacetaldehyde NADH 4-HA: 4-hydroxyaniline PGP 4-CAL: 4-coumaryl alcohol PAAL: phenylacetaldehyde PEP PYR PYR CH2OH HOCH2 O OH O OH Xylose NADP+ NADPH Catechol 6-3Glucono -lactone Phe CA 4-HCA Styrene araD Ribu53 Xlu53 Sed-7-P Ery-4-P DAHP DHQ Gallate DHS ANT PPY PAAL 2-Phenyl2-Hydroxyethanol phenylacetate araB Ribulose-5P NADPH CO2 Quinate Isochorismate Phenylacetate araA Ribulose GAP Catechol Aniline Phenyllactate OH OH Arabinose xylB 6-3Gluconate Rib53 Pyrogallol Salicylate O OH HOCH2 xylA Xylulose F-6-P F-6-P GAP Trp 4-HS PP pathway NADP+ Pyruvate Gentisate Arabinose Pentose transporter OH OH PEP 3,4-CHD, 2,3-CHD Xylose OH OH OH Catechol cis, cismuconate PCA Shikimate 4-Hydroxyphenylacetate Tyramine Chorismate 4-HPPA Tyr Phenol 4-HCA 4-HBA Phenol PCA 4-ABA Aniline Catechol Phenyl-acetate p-Cresol 4-HPAAL 4-Hydroxyphenyllactate 4-Hydroxyphenylethanol Caffeic acid Homogentisate 4-Hydroxyphenylacetate p-Cresol 4-Vinylcatechol 4-HS Gentisate Ferulic acid 4-Vinylguaiacol 4-Hydroxyphenylethanol Biosynthetic pathway for various aromatic compounds in Corynebacterium glutamicum ■研究成果：シキミ酸の生産 Shikimic acid production C7H10O5 シキミ酸・インフルエンザ治療薬タミフル（oseltamivir）の原料として需要が高いシキミ酸の高収率生産に成功。 >LZ\JJLLKPUOPNOS`LMÄJPLU[WYVK\J[PVUVMZOPRPTPJHJPK HZWYLJ\YZVYVMHU[PPUÅ\LUaHKY\N;HTPÅ\VZLS[HTP]PY