神経難病・筋萎縮性側索硬化症の原因に 蛋白質分解異常が関与する可能性 ー遺伝子改変マウスでの知見からー 2013年1月9日(水) 説明者 和歌山県立医科大学 神経内科学講座 教授 伊東 秀文 Journal of Biological Chemistry 287(51):42984-94, Dec 14, 2012 責任著者 ： 伊東秀文・高橋良輔 今回の発表のポイント • 今回我々の開発したマウスが、孤発性筋萎 縮性側索硬化症(ALS)に類似した運動機能 異常・病理所見を世界で初めて示したこと • ALSで蛋白質分解系の障害の関与が示唆さ れていたが、これが原因になり得ることを動 物で初めて示したこと • このマウスモデルを用いて、ALS病態機序の 解明・治療法の開発が期待できること その他の学術的な意義 • ALSにおいて、オートファジー・リソソーム系で はなく、ユビキチン・プロテアソーム系が主因 となることを示したこと • これまでALSモデルマウスとして用いられて いた変異SOD1マウスでの限定的なアプロー チからの脱却 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) Jean-Martin Charcot (1825 - 1893) 1869年にALSを医学論文に記載 Lou Gehrig (1903-1941) Babe Ruth (1895-1948) 紀伊 ALS（牟婁病） 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 脊髄の横断像 側索 前角 運動ニューロンが選択的に変性する 孤発性筋萎縮性側索硬化症 (SALS) スケイン様封入体(SLIs) TDP-43免疫染色 円形硝子封入体(RHIs) TDP-43免疫染色 多くの神経変性疾患では異常な蛋白質の蓄積が認められる ポリグルタミン病 パーキンソン病 ALS アルツハイマー病 異常な蛋白質の蓄積 神経変性・神経細胞死 プリオン病 タンパク分解機構異常を中心とした 神経変性メカニズム仮説 タンパク質分解系の障害 異常タンパク質の蓄積 神経細胞の機能障害 神経変性 神経細胞死 主な蛋白質分解経路 ユビキチン・プロテアソーム系 オートファジー・リソソーム系 ユビキチン・プロテアソーム系 ユビキチン E2 E3 蛋白質 プロテアソーム オートファジー・リソソーム系 リソソーム オートファゴソーム オートリソソーム ユビキチン・プロテアソーム系を障害するために プロテアソーム機能に必須である Rpt3タンパクを欠失させた Rpt3 オートファジー・リソソーム系を障害するために オートファジーに必須な蛋白質である Atg7タンパクを欠失させた Atg8/LC3 Atg4 Atg5 LC3 Atg12 Gly E1 Atg3 PE Atg10 Atg7 E2 E2 LC3 Atg5 Atg12 LC3 脊髄の運動ニューロンでのみ障害が起こるように 目標の場所だけで遺伝子を欠損させるシステムである Cre-loxPシステムを利用した AL H A AL A H Wild Type Rpt3 AL A H AL A H A NEO R1 AL A H F1 AL H A Targeted Rpt3 Floxed Rpt3 AL H A AL H A R2 プロテアソーム障害マウス (Rpt3-CKO) Cre酵素 Knockout Rpt3 1Kb Cre酵素を目標の場所だけで発現するように設定 loxP 配列 loxP 配列 欠損予定の遺伝子 (Komatsu M, et al., J Cell Biol. 2005) オートファジー障害マウス (Atg7-CKO) loxP 配列 運動ニューロンのみで Cre酵素が発現するマウスを使用した VAChT (vesicular acetylcholine transporter) Cre マウス このマウスは運動ニューロンのみでCre酵素を発現する (Misawa et al. 2003) プロテアソーム障害マウス Rpt3-CKO の結果 プロテアソーム障害マウス(Rpt3-CKO)は 8 週齢以降に筋力低下の症状である振戦（ふるえ）様症状を示 し、尻尾吊り下げ時の下肢伸展反射が低下した 体重差 ＊ 体重 (g) ＊＊ 対照マウス Rpt3-CKO 週齢 §§＊ §＊ § ＊ ＊§ プロテアソーム障害マウスは運動機能が低下した Rpt3-CKO 対照マウス プロテアソーム障害マウスは運動機能が低下した Rpt3-CKO 対照マウス プロテアソーム障害マウスは運動機能が低下した 握力測定 ロタロッドテスト § § ロタロッドテスト (秒) * * § * * § * * * * § § § § § § § § §§ §§ § 握力 (g) § § ＊ § § 前肢 § 週齢 * § § § § * 握力 (g) * § * ＊ § 後肢 週齢 * * § § プロテアソーム障害マウスは 運動ニューロン数が進行性に減少した § § 対照マウス § § NS Rpt3-CKO 運 動 ニ ュ ー ロ ン 数 6 12 40 6 12 40 週齢 週齢 Scale bar 30μm 対照マウス Rpt3-CKO ALS患者 Rpt3-CKO マウス プロテアソーム障害マウスは 運動ニューロンにALS類似の神経細胞変性を認めた 中心性色素融解 好塩基性封入体 Scale bar 10μm Ubiquilin2 Optineurin FUS TDP-43 プロテアソーム障害マウスは 運動ニューロンにALS類似の神経細胞変性を認めた 対照マウス 6 Rpt3 CKO マウス 6 週齢 12 ALS患者 オートファジー障害マウス Atg7-CKO の結果 オートファジー障害マウス(Atg7-CKO)の 運動ニューロン数や運動機能は マウスの寿命である2年齢まで変化がなかった 対照マウス Atg7-CKO ヘマトキシリン＆エオジン染色 Atg7CKOマウスにおける 凝集体 Atg7 CKO 対照マウス オートファジー障害マウスの運動ニューロンは 細胞内に大きな封入体が形成されるが 細胞死は認めなかった 電子顕微鏡写真 Atg7 CKO 対照マウス Atg7-CKOマウスの封入体では 孤発性ALSで出現する代表的蛋白質は陰性であった P62, Nbr1 オートファジーで 分解される蛋白質 Ubiquitin TDP-43 FUS p62 Nbr1 Atg7 CKO 対照マウス H&E Optineurin Ubiquilin2 発見のまとめ 運動ニューロンのみに蛋白質分解機構を障害させたマウ スを作製し解析を行ったところ、プロテアソーム障害マウス にALSに類似した運動機能異常や病理所見が認められた。 プロテアソーム障害マウス ・運動機能異常 ・運動ニューロン死 ・ALS様病理所見 ALSに類似した症候 オートファジー障害マウス ・運動機能に異常なし ・運動ニューロン死を認めない ・ オートファジー障害に関連す る病理所見のみ ALSとは異なる所見 今後の展開 プロテアソーム障害マウスのより詳細な解析を行い ALSの発症機序を解明する プロテアソーム障害マウスの中で何が起こっているか 蛋白質やRNAなどの挙動変化を追い ALS患者のデータと比較して病因となる分子を同定する 今後の展開 プロテアソーム障害マウスを用いて治療法の開発を行う ロタロッドテスト ロタロッドテスト (秒) § § * * § * * § * * * 薬剤の投与 週齢 ・運動機能の保持や、病理変化の抑制・改善が認められる 既存薬の探索や新規薬の開発に対する動物モデル 今回の研究成果発表については、原著論文に記載ある通り 以下の共同研究機関と共に研究を行い成果を得たことを記す。 （原著論文は現在 http://www.jbc.org/content/early/2012/10/24/jbc.M112.417600.full.pdf より取得可能） ・京都大学 ・滋賀医科大学 ・新潟大学 ・慶応大学 ・順天堂大学 ・東京都医学総合研究所 ・JST-CREST 問い合わせ先 和歌山県立医科大学 （伊東秀文） 電話：073-441-0654 FAX ：073-447-9488 e-mail: [email protected]
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