22 APPLICATION BIOPHARMA ドレスデンのTILLING：一塩基多型の大規模検出 Sylke Winkler, Claudia Seidel, Stefan Meissner, Nicola Gscheidel および Michael Brand ドレスデン工科大学（TU Dresden）のバイオテクノロジーセンターおよび遺伝学科、およびドレスデンのマックス-プランク研究所の分子遺伝学研究所（MPI-CBG）（左より） Sylke Winkler, Claudia Seidel, Nicola Gscheidel TILLING（Targeting Induced Local Lesion IN Genomes）法は、突然変異個体における各個体からの関心遺伝子の PCR増幅によって、一塩基多型（SNP）をその検出に引き続いて特定するために開発された強力な逆遺伝学ツールである 1,2 。しかし、遺伝子機能が失われるナンセンス突然変異が同定されることは比較的まれな事象であるので、関心のある遺伝子における推定されたヌル突然変異を発見するために多数の突然変異個体をスクリーニングする必要がある。TILLING法は、主としてPCRの後にPCRフラグメントの制限酵素消化もしくは直接的な配列決定に基づいている。したがって、非常に自動化に適している。MPI CBGでは、 Tecan Genesis RWS 200ワークステーションを選択し全分注ステップを自動化している。我々の現在の装置は、テフロンでコーティングした8個のチップを持つ（384ウエルプレート用）リキッドハンドリングアーム、全試薬の為の水冷式トラフ、分注プラットホームとして利用している冷却キャリヤー、ロボットマニピュレータ（RoMa）アームおよびPCRプレートの供給もとであるホテルから成る。RoMa アームは、デッキ上に設置された4つの384 ウエル用ブロックを持つサーマルサイクラー、冷却分注プラットホームおよび冷却インキュベーターの間でPCRプレートを移送する。PCR装置の電動蓋にあるパッドは、マイクロプレートを密封し、サンプルの交差汚染を予防する。 Tecan Journal 3/2006 変異誘発およびライブラリーの作成スクリーニング法 TILLINGプロジェクトの成功の基本は、非常ゼブラフィッシュ・プロジェクトについては、 Wienholds らによって初めて報告された nested PCR法を用いてスクリーニングを行っている 2 。この方法において、標準化ステップはゲノムDNAの段階ではなくPCRの段階で行われる。これはプロジェクトの初期に、ドレスデンのMPIで吸光プレートリーダーが利用できなかった事に起因する。この場合も同様に、全分注ステップは自動的に行われている。nestedステップの内側のプライマー対は、蛍光色素で標識する為のユニバーサルプライマーの鋳型として、あるいはユニバーサルシークエンスプライマーの直接的な鋳型として利用する為に、ユニバーサルテールを含んでいる。に多数の変異個体のライブラリー作成である。エチルニトロソウレア（ENU）やエタンスルホン酸メチル（EMS）のようなアルキル化変異原は、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエおよび線虫に容易に適用され、処理個体のゲノム全体にランダムに点突然変異を引き起こす。突然変異動物を未処理個体と交配すると、誘発されたSNPは次世代に伝播され、新たに変異を持った個体が多数生まれる。伝統的なTILLINGライブラリーは、数千匹の生きた突然変異動物（ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエ）、あるいは蘇生可能な冷凍個体（線虫）およびそれに対応するゲノムDNAから成る。ゲノムDNAの調製は、すべて96ウエルディーププレート内で行なわれ、希釈し384ウエルプレートに5mlづつ小分け分注される（DNA濃度は約0.2∼1 ng/ml）。プレートは冷凍保存し、PCRに直接用いることができた。テフロンでコーティングしたチップをシステム液で簡単に洗浄することにより、異なるテンプレートを分注する際の交差汚染を防いでいる。最初のPCRは、384ウェルプレートに鋳型ゲノムDNAを含む全量10μlの溶液を入れておくという設定になっている。最初のPCR産物は、あらかじめ次のPCR用のマスターミックスが入っている新しい384ウェルプレートに適量移され、2回目のPCRが行われる。直接シーケンス法によるSNPの検出については、アガロースゲル電気泳動法によって、事前に2回目のPCR産物の質を確認しておく。プライマーおよびdNTPsはエキソヌクレアーゼI/シュリンプアルカリフォスファターゼと共にインキュベーションすることによって脱リン酸化され、除去された。このステップも前述同様に、Genesis 200は全分注ステップを APPLICATION BIOPHARMA 行っている。さらに8つの384ウエル用PCRブロックが利用可能になった為、手動でマイクロプレートを搭載している。我々の現在の処理能力は、アガロースゲル電気泳動法による品質チェックを含めて、1.5日当たり3,072 のサンプルである。ショウジョウバエおよび線虫プロジェクトについては、Colbertら3の報告しているTILLINGプロトコルに従う。最初のPCRを実行後同じように希釈し、2回目のPCRはテールを持った（nestedの）内側のプライマーおよび蛍光標識プライマー（LI-COR.IRDye700Ⓡ および IRDye800Ⓡ）を用いて行われる。これにより、 4倍までプールすることができる標識PCR産物が生じる。変性の後再度アニールされ、変異型および野性型PCR産物間でヘテロ二重鎖形成を誘発する。ヘテロ二重鎖はエンドヌクレアーゼCel-1によって切断され、その結果生じる蛍光標識断片は精製され、スラブゲルシーケンサーを用いた高分解能 SDS-PAGE によって分離される。この TILLINGアッセイのためにGeminiソフトウェアを用いて様々な分注ステップを含む全自動プロトコルを設定した。RoMaアームは、サーマルサイクラーブロックおよび分注プラットホーム間でPCRプレートを移動する。全ての混合溶液に対して冷却ユニットの利用が可能である。4 枚の 384 ウエルプレート（1,536個のサンプル）を11時間以内に処理することができるが、精製にはさらに2∼3 時間かかる。推定された突然変異の検出は、莫大な数のサンプルを取り扱うため、スクリーニング装置の自動化を必要とする。例えば、比較的まれなナンセンス突然変異（停止コドンは全 SNPの5%に相当）を単離するためには、非常に多数のゼブラフィッシュの変異個体を用いて、約400∼500万の塩基対をスクリーニングしなければならない。現在我々は、週当たり9,000個以上のサンプルを処理できる。これは、1回のスクリーニングあたりの検出率を500塩基対と控えめに見積もっても、週当たり450万塩基対のゲノム情報に相当する。したがって、我々の装置は、毎週１つのナンセンス突然変異に加えて多くのミスセンス突然変異を同定することができる。また、機能的なゲノム研究のために日常的に突然変異体を作製するための自動TILLING 法の適性を実証している。 ■この記事は2006年9月発行 Tecan Journal 3/2006 に掲載されているユーザーストーリーを抜粋、翻訳したものです。ご質問、ご要望は下記までお願いします。テカンジャパン株式会社 8チャンネルチップアームが384ウェルプレートへ分注 Sylke Winkle氏と Genesis 200 文献 1.McCallum, C.M., Comai, L., Greene, E.A., Henikoff, S.: Tageted screening for induced mutations. Nature Biotechnology 18: 455 (2000) 2.Wienholds, E., Schulte-Merker, S., Walderich, B., Plasterk, R.H.A.: Targetselected inactivation of the zebrafish rag1 gene. Science 297: 99 (2002). 3. Colbert, T., Till, B.J., Tompa, R., Reynolds, S., Steine, M.N., Yeung, A.T., McCallum, C.M., Comai, L., Henikoff, S.: High-throughput screening for induced point mutations.Plant Physiology 126: 480 (2001). 4.Winkler, S., Schwabedissen, A., Backasch, D., Bokel, C., Seidel, C., Bonisch, S., Furthauer, M., Kuhrs, A., Cobreros, L., Brand, M., Gonzalez-Gaitan, M.: Target-selected mutant screen by TILLING in Drosophila. Genome Research 15: 718 (2005). For review: Stemple, D.L.: TILLING – a highthroughput harvest form functional genomics. Nature Reviews 5: 1 (2004). ドレスデンTILLINGプロジェクトは、ゼブラフィッシュDanio rerio（Michael Brand, TU Dresden and MPI-CBG; Carl-Philipp Heisenberg, MPICBG）、線虫Caenorhabditis elegans（Anthony Hyman, MPI-CBG）およびショウジョウバエ Drosophila melanogaster4（Marcos GonzalezGaitan, MPI-CBG）についての共同研究として始まった。ワークテーブルとPCRの統合化は、 MPI-CBG 技術開発スタジオ（TDS）の Hannes GrabnerおよびJan Wagnerの支援によって設計された。ドレスデンTILLINGプロジェクトは、欧州委員会の第６次研究フレームワークプログラムによって資金援助を受けた。「ヒトの発達および疾患のためのゼブラフィッシュモデル」（ZFMODELS）、ドレスデン工科大学、およびマックスプランク研究所分子遺伝学研究所。 TEL. 044-556-7311/FAX.044-556-7312 E-mail: [email protected] Tecan Journal 3/2006 23