特定微生物用試験 —————————— 培地

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培地性能試験ガイド(特定微生物試験)
特定微生物用試験
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特定微生物用試験の目的は、非滅菌医薬品または成分中の特定微生物が、薬局方によって確立された
限度を超えるかどうかを判断することです。特定微生物の一例は、Salmonella enteritidisです。試験は、
増菌培養液中、製品サンプルを培養し、次に培地性能および/または選択寒天培地を使用して、特定微
生物を分離することによって実施されます。製品を試験する前に、特定微生物が少数存在する場合、
試験のために使用する培地がそれを発育させるかどうかを知っておく必要があります。（米国薬局方
協会、2012年）。
培地性能試験の目的は、微生物を検出するために使用された培地が適切であることを示すことです。少数の
微生物を培地の新しいバッチに植菌することによって試験を実施します。培地が適切な場合、微生物は発育
します。
（米国薬局方協会、2012年）。
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培地
試験に使用される培地は、特定微生物を分離するように設計されています。培地は表2に記載されてい
ます。
微生物
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表1は、培地性能試験に使用されるレファレンスカルチャー微生物をリストしています。リストは、米国薬局方（USP）、
欧州薬局方（Ph. Eur.）、および日本薬局方（JP）の要件に基づいています。3つの薬局方はこの試験に
関して統一されているので、要件は同じです。
表1にリストアップされているMicrobiologics製品は、参照培養からの4代継代以内の凍結乾燥微生物
です。溶解された微生物の濃度は、≦100 CFU/0.1 mlです。製品に関する詳細情報については、当社のウェ
ブサイトwww.microbiologics.comをご覧ください。微生物は以下の4つの形態で提供されます：
1. EZ-Accu Shot™ キットには以下が含まれます。菌数計算された単一微生物株のバイアル5個（バイアル
1個あたり凍結乾燥ペレット1個）、および水和液を含むバイアル5個（各1.2 mL）。各ペレットで10回の
試験が実施でき、キット1個あたり合計で試験50回分となります。
2. EZ-CFU™ One Stepキットには以下が含まれます。菌数計算された単一微生物株のバイアル2個（バイアル
1個あたり凍結乾燥ペレット10個）、および水和液を含むバイアル10個（各2 mL）。各微生物懸濁液から
19回の試験が実施でき、キット1個あたり合計で試験190回分となります。
3. E Z - C F U ™ キットには以下が含まれます。菌数計算された単一微生物株のバイアル2 個（バイアル
1個あたり凍結乾燥ペレット 1 0個）、および水和液を含むバイアル10個（各2 mL）。EZ-CFU™ は
EZ-CFU™ One Stepと似ていますが、ペレットの溶解後、リン酸緩衝液で1:10 に希釈する必要がありま
す。各微生物懸濁液から90回の試験が実施でき、キット1個あたり合計で試験900回分となります。
4. EZ-Accu Shot™ Select キットには以下が含まれます。5つの標準菌株のバイアル1個（バイアル1個あたり
凍結乾燥ペレット1個）、および水和液を含むバイアル5個（各1.2 mL）。各ペレットで10回の試験が実施
でき、キット1個あたり合計で試験50回分となります。
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表1：Microbiologicsカタログ番号
微生物名
Microbiologicsカタログ番号
Candida albicans ATCC® 10231™*
0443
Clostridium sporogenes ATCC® 19404™*
0317
Clostridium sporogenes ATCC® 11437™*
0487
Escherichia coli ATCC® 8739™*
0483
Pseudomonas aeruginosa ATCC® 9027™*
0484
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony NCTC 6017
0890
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC® 14028™*
0363
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 6538™*
0485
試験の要件
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1. 購
入した調製済み培地、乾燥培地またはラボで成分から調製された培地の新しい各バッチについて培地性能
を実施します。
2. 発育促進特性および鑑別特性に対しては、≦100 CFUで培地に植菌します。選択特性に対しては、≧100
CFUで培地に植菌します。
3. 薬局方で推奨される微生物株を使用します。菌株は、レファレンスカルチャーから5代継代以内でなければ
なりません。
4. 以前に承認された培地と並行して新しい培地を試験します。以前に承認された非選択寒天培地に植菌
して、接種材料中のCFU数を決定します。接種材料中のCFU数が基準値です。並行試験が使用される
場合、培地の新規および以前に承認されたバッチは、同じ接種材料で、同じ技術者が植菌する必要が
あり、同一培養条件とします。唯一の変数は培地です。
5. 各培地は、1回に1つの微生物株のみで試験します。
6. 二重に試験を実施します。
材料
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• EZ-Accu Shot™、EZ-CFU™ One Step、またはEZ-CFU™ キット1
• 培地の新しいバッチ
• 以前に承認されたバッチの培地
• 液体培地を試験する場合は非選択寒天培地
• ピペット
• スプレッター
• ボルテックスミキサー
固体培地および液体培地の発育促進特性および鑑別特性のための試験手順
——————
1. E
Z-Accu Shot™、EZ-CFU™ One StepまたはEZ-CFU™使用説明書2に従って、必要な微生物のそれぞれに
対する接種材料を準備します。
2. 新規および以前に承認されたバッチの培地に、微生物懸濁液0.1 mlを植菌します。
1 キットで提供された水和液のみを使用してください。
2 セトリミドカンテン培地上のPseudomonas aeruginosaの試験の代替品としてはKWIK-STIKTM Plusが推奨されます。
KWIK-STIKTM Plusスワブで非選択寒天培地に植菌し、培養して、分光光度計または濁度計を使用してCFU濃度を≦100 CFU/0.1 mLに調整します。
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3. 新
しい培地が液体または選択寒天培地の場合、微生物懸濁液0.1 mlが≦100 CFUを含むことを確認するた
めにコントロールを使用することが推奨されます。コントロールは、非選択寒天培地です。
4. 固体培地またはコントロールの非選択寒天培地については、スプレッダーを使用して接種材料を寒天培地
全体に分散させます。
5. 試験される各微生物に対する培養温度および培養時間については薬局方の指示に従います（表2を参照）。
6. 以下の合否基準を使用して、新しい培地が使用に適しているかどうかを決定します。
合否基準
——————————
1. 固体培地
培地の新しいバッチからのコロニー数および、以前に承認されたバッチの培地からのコロニー数を平均
します。承認が必要な培地の新しいバッチについては、試験される各微生物に関して、以下の合否基準
が満たされる必要があります。
• 新しいバッチの培地上の平均コロニー数は、以前に承認されたバッチ上の平均コロニー数と「同等」
でなければなりません。「同等」の量的定義は、USP、Ph. Eur.およびJPでは確立されていません。
• コントロール（非選択寒天培地）のコロニー数は≦100個でなければなりません。
2. 液体培地
培養後、液体培地の新しいバッチの濁度を、液体培地の以前に承認されたバッチの濁度と目視で比較し
ます。承認が必要な培地の新しいバッチについては、試験される各微生物に対して以下の合否基準を満
たす必要があります。
• 新規および以前に承認されたバッチの培地に発育が見られなければなりません。液体培地の新しいバッ
チからの濁度の量は、液体培地の以前に承認されたバッチからの濁度の量と同等であるべきです。「同
等」の量的定義は、USP、Ph. Eur.およびJPでは確立されていません。目視での同等性で十分です。
• コントロール（非選択寒天培地）のコロニー数は≦100個でなければなりません。
3. 鑑別反応
寒天プレート上のコロニーを、培地の以前に承認されたバッチと目視で比較します。コロニーは、外観
が同様であるべきです。予想される鑑別反応が、表2に記述されています。
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固体培地および液体培地の選択特性に対する試験手順
1. EZ-CFUTM を使用して、必要な微生物のそれぞれの接種材料を準備します。3
2. EZ-CFUTM 使用説明書に記述されているように、2 mLの水和液中、2個のペレットを再水和します。
3. 新規および以前に承認されたバッチの培地に、微生物懸濁液0.1 mLを植菌します。 1.0 mL を 9.0 mLに移
さないでください。
4. 新しい培地が液体の場合、微生物懸濁液0.1 mLが≧100 CFUを含むことを確認するためにコントロールを
使用することが推奨されます。コントロールは、非選択寒天培地です。
5. 固体培地またはコントロールの非選択寒天培地については、スプレッダーを使用して接種材料を寒天培地
全体に分散させます。
6. 試験される各微生物に対する培養温度および培養時間については薬局方の指示に従います（表2を参照）。
7. 4ページの合否基準を用いて、新しい培地が使用に適しているかどうかを判断します
3 代替的方法は、KWIK-STIKTM Plus から発育させたコロニーを使用して、≧100 CFUの接種材料を調製することです。
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合否基準
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1. 試験微生物は、新規および以前に承認されたバッチの両方で選択されなければなりません。
2. コントロールの非選択寒天培地上には少なくとも100個のコロニーがなければなりません。
表2：培地の発育促進、選択及び鑑別特性
培地のタイプ
モーゼル腸内細菌
ブイヨン培地
微生物
E. coli
P. aeruginosa
S. aureus
バイオレット・レッド・
胆汁酸・ブドウ糖・
カンテン培地
マッコンキー液体培地
24時間
30°C～35°C
24時間
48時間
30°C～35°C
P. aeruginosa
発育促進および指標
（無色コロニー）
発育：18時間
鑑別：18～24
時間
30°C～35°C
発育：18時間
42°C～44°C
24時間
42°C～44°C
48時間
30°C～35°C
発育促進
発育：18時間
鑑別：18～24
時間
30°C～35°C
18時間
選択
30°C～35°C
48時間
30°C～35°C
発育：18時間
鑑別：18～48
時間
30°C～35°C
18時間
30°C～35°C
72時間
30°C～35°C
発育：18時間
鑑別：18～72
時間
30°C～35°C
72時間
E. coli
ラパポート・バシリアジス
サルモネラ増菌液体培地
S. enterica subsp.
enterica serovar
Typhimuriumまたは
S. enterica subsp.enterica serovar Abony
S. aureus
S. enterica subsp.
enterica serovar
Typhimurium または
S. enterica subsp.enterica serovar Abony
P. aeruginosa4
E. coli
S. aureus subsp.
aureus
E. coli
強化クロストリジウムコロ
ンビア培地
選択
30°C～35°C
30°C～35°C
マッコンキーカンテン培地
マンニット・食塩カンテン
培地
発育促進
培養期間
発育促進および鑑別
（赤紫色のコロニー）
E. coli
セトリミドカンテン培地
発育促進
温度
E. coli
S. aureus
XLD (キシロース・リジンデソキシコール酸)
カンテン培地
特性
発育促進
選択
発育促進および
鑑別（ピンク色の
コロニー）
発育促進および鑑別
（赤色コロニーで黒
い中心がある場合とな
い場合がある）
発育促進
選択
発育促進および鑑別
（黄色または黄色部分
がある白色コロニー）
選択
C. sporogenes
発育促進
30°C～35°C
コロンビア寒天培地
C. sporogenes
発育促進
48～72時間
嫌気条件
30°C～35°C
サブロー・ブドウ糖液体
培地
C. albicans
発育促進
48時間
嫌気条件
30°C～35°C
3日
30°C～35°C
発育：24～48時間
鑑別：24～48
サブロー・ブドウ糖カンテン C. albicans
デキストロース培地
発育促進および鑑別
（白色コロニー）
4 セトリミドカンテン培地上のPseudomonas aeruginosaの試験の代替品としてはKWIK-STIKTM Plusが推奨されます。
KWIK-STIKTM Plusスワブで非選択寒天培地に植菌し、培養して、分光光度計または濁度計を使用してCFU濃度を≦100 CFU/0.1 mLに調整します。
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培地性能試験のベストプラクティス
準備
• 薬局方で推奨される微生物株を使用します。培養株は、
トレーサビリティーを有する、
レファレンスカルチャー
から5代継代以内でなければなりません。
装置
• ピペットを使用します。定期的にその精度を確認します。
• 年1回、温度計を校正し、インキュベーターをバリデーションします。
コントロール
• 培地性能試験に対しては陰性コントロール（希釈剤5）が推奨されます。Microbiologicsは、水和液の無菌試験を行
なっており、結果を記載した分析証明書が、ご要望に応じて入手可能です。追加の水和液が必要な場
合、Microbiologicsではキットとは別売りの水和液を提供しています。
試験
• 培地およびペレットのバイアルは、使用前に、室温に戻してください。
• EZ-CFU™ One StepまたはEZ-CFU™を使用する場合、水和液および希釈液は、使用前に35˚Cで30分間加温
してください。
• EZ-CFU™ One StepまたはEZ-CFU™を使用する場合、水和液の栓とペレットバイアルの栓を入れ替えない
でください。水和液の栓の水分がペレットを損傷する可能性があります。
• 懸濁液が均一になるまでボルテックス攪拌します。
• 混釈平板法を使用する場合、微生物懸濁液0.1 mLを滅菌ペトリ皿に加えます。溶融寒天培地に接種材料を
植菌し、プレート中の内容物を十分に渦動させることによって混和します。溶融寒天培地は、44℃～46℃
に冷却し、3時間超にわたって溶融状態に置かないようにすべきです。寒天培地の凝固後に、同培地を反転さ
せ、培養します。
• 選択寒天培地を使用する時は、接種材料を2倍使用しなければならないことがあります。この場合、並行
して、非選択および選択寒天培地に植菌します。非選択寒天培地上には≤100個のコロニーがなければな
りません。
• セトリミド寒天培地上のPseudomonas aeruginosaの試験の代替品としてはKWIK-STIKTM Plusが推奨され
ます。KWIK-STIKTM Plusスワブで非選択寒天培地に植菌し、培養して、分光光度計または濁度計を使用し
てCFU濃度を≦100 CFU/0.1 mLに調整します。
培養
• 混釈培養では比較的長い時間にわたる培養が必要となり、コロニーのサイズにバラツキが認められるため、
バックライト式コロニーカウンターの使用が推奨されます。
その他
• Microbiologicsは、EZ-Accu Shot™、EZ-CFU One Step™および EZ-CFU™の使用に対する手順を検証して
います。製品が会社手順、装置等に合うことを確かめるため、顧客検証研究を実施することが推奨されま
す。検証試験については、Microbiologicsでは、同じ接種材料権濁液を使用して、5回反復試験を行うこと
をお勧めします。結果は、本文書に概説されている規格に適合している必要があります。EZ-Accu Shot™
および EZ-CFU One Step™の検証プロトコルガイド（TIB.281）は、ウェブサイトwww.microbiologics.com
でもご覧になれます。
• エンドユーザーの安全を確保するため、医薬品は、特定微生物試験で言及されたもの以外の微生物
について、試験を実施する必要がある場合があります。培地性能試験に使用できるEZ-Accu Shot™、
EZ-CFU™ One StepおよびEZ-CFU™微生物の詳細なリストについては、当社ウェブサイト
www.microbiologics.comをご覧ください。
5 希釈剤は水和液です。EZ-CFU™を使用する場合、希釈剤は水和液およびpH 7.2リン酸緩衝液です。
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参考文献
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European Pharmacopoeia (7th Edition). Microbiological Examination of Nonsterile Products.
Japanese Pharmacopoeia (16th Edition). Microbial Limits Test. 2011.
United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 36-NF 31). Vol 1. Rockville, MD: United States
Pharmacopeia Convention; 2012.
通知 ——————————
*ATCC Licensed Derivative Emblem、ATCC Licensed Derivative 単語マークおよびATCCカタログマー
クはATCCの商標です。Microbiologics, Inc. はこれらの商標の使用およびATCC®培養物から派生した
製品を販売する認可を受けています。ATCC®培養物から派生した製品についてはATCC Derivative®
のマークをご確認ください。
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イラストレーション説明書
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特定微生物試験で使用する固体培地の新しいバッチの発育促進特性および鑑別特性を試験するための
説明書
2
1
EZ-Accu Shot™、EZ-CFU™ One Stepまたは
EZ-CFU™使用説明書に従って、必要な各微生
物用の接種材料を準備します。2
3
新しい培地が液体の
場合、微生物懸濁液
0.1 mLが≦100 CFU
を含むことを確認す
るためにコントロー
ルを使用することが
推奨されます。
コント
ロールは、非選択寒
天培地です。
5
新規および以前に承認されたバッチの培地に、微生物懸
濁液0.1 mLを植菌します。
4
コントロールの非選択寒天培地については、
スプレッダーを
使用して接種材料を寒天培地全体に分散させます。
6
:::
:::
試験される各微生物に適用される培養温
度および培養時間については、薬局方の指
示に従います（4ページの表2を参照）。
:::
:::
:::
:::
:::
:::
3ページの合否基準を用いて、新しい培地が使用に
適しているかどうかを判断します。
2 セトリミド寒天培地上のPseudomonas aeruginosaの試験の代替品としてはKWIK-STIKTM Plusが推奨されます。
KWIK-STIKTM Plusスワブで非選択寒天培地に植菌し、培養して、分光光度計または濁度計を使用してCFU濃度を≦100 CFU/0.1 mLに調整します。
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イラストレーション説明書
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特定微生物試験で使用する液体培地の新しいバッチの発育促進特性および鑑別特性を試験するための
説明書
2
1
EZ-Accu Shot™、EZ-CFU™ One Stepまたは
EZ-CFU™使用説明書に従って、必要な各微生
物用の接種材料を準備します。2
3
新しい培地が液体の
場合、微生物懸濁液
0.1 mLが≦100 CFU
を含むことを確認す
るためにコントロー
ルを使用することが
推奨されます。
コント
ロールは、非選択寒
天培地です。
5
新規および以前に承認されたバッ
チの培地に、微生物懸濁液0.1 mL
を植菌します。
4
コントロールの非選択寒天培地については、
スプレッダーを
使用して接種材料を寒天培地全体に分散させます。
6
:::
:::
試験される各微生物に適用される培養温
度および培養時間については、薬局方の指
示に従います（4ページの表2を参照）。
:::
:::
:::
:::
:::
:::
3ページの合否基準を用いて、新しい培地が使用に
適しているかどうかを判断します。
2 セトリミド寒天培地上のPseudomonas aeruginosaの試験の代替品としてはKWIK-STIKTM Plusが推奨されます。
KWIK-STIKTM Plusスワブで非選択寒天培地に植菌し、培養して、分光光度計または濁度計を使用してCFU濃度を≦100 CFU/0.1 mLに調整します。
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イラストレーション説明書
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固体培地の新しいバッチの選択特性を試験するための説明書。注: 一部のタイプの液体培地は、選択特性
についても試験されます。
2
1
EZ-CFUTMを使用して、必要な各微生物用の接
種材料を準備します。3
3
新規および以前に承認されたバッチの培地
に、微生物懸濁液0.1 mLを植菌します。
1.0 mL を 9.0 mLに移さないでください。
4
EZ-CFUTM 使用説明書に記載されているように、2 mLの水和
液中、2個のペレットを再水和します。
4
固体培地については、
スプレッダーを使用して接種材
料を寒天培地全体に分散させます。
5
:::
:::
試験される各微生物に適用される培養温度およ
び培養時間については、薬局方の指示に従いま
す（4ページの表2を参照）。
:::
:::
:::
4ページの合否基準を用いて、新しい培地が使用に
適しているかどうかを判断します。
3 代替的方法は、KWIK-STIKTM Plus から発育させたコロニーを使用して、≧100 CFUの接種材料を調製することです。
TIB.2017.JPN Rev A
:::
:::
:::

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