カスタムターゲットエンリッチメント用オンラインデザインツール

カスタムターゲットエンリッチメント用オンラインデザインツール
ニ
ン
ブ
ル
デ
ザ
イ
ン
NimbleDesign
2015年6月
ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社
シークエンスソリューションG
NimbleDesignとは
使い方概要
NimbleDesignによるカスタムデザインワークフロー
シンプルなワークフローで、24時間以下でデザイン作成を完了
生物種とアプリケーションを指定
ターゲットの入力
パラメーターの設定
結果の確認、承認
NimbleDesign でカスタムデザインが可能な製品
SeqCap EZ とSeqCap RNA
SeqCap EZ
• ヒトゲノム解析（SeqCap EZ Choice）
• マウスゲノム解析（SeqCap EZ Developer Library）
SeqCap RNA
• ヒトRNA解析（SeqCap RNA Choice）
• マウスRNA解析（SeqCap RNA Developer Library）
• これら以外のカスタム製品をご利用いただく場合には、NimbleGen専任
スタッフによるデザインとなります。
NimbleDesignとは
使い方概要
詳細は NimbleDesign Software User‘s Guide: Version 4.0 をご参照ください。
NimbleDesignアカウントの作成1
① https://design.nimblegen.comにアクセスしてください
注）居住国の設定を確認。「Japan」以外に
設定されている場合には変更します
② ユーザー名とパスワードを作成します
注）ユーザーIDには記号を使用することはできません。パス
ワードは数字と記号を組み合わせた6文字以上で設定して
ください。
NimbleDesignアカウントの作成2
③ 利用規約をご確認いただき、同意いただける場合には「Accept」ボタンをクリックしてください
④ アカウント情報を追記してください
注）15分以上何もしないと自動でログアウトされます。
NimbleDesignホームページ
デザインリストのページに移動します
Homeページに戻ります
注文履歴のページに移動します
アカウント情報を修正することができます
新しいデザインを作成します
各種資料ダウンロードへの
リンクと、NimbleDesignに
ついてのお知らせが記載さ
れています
デザインの完了やエラーなどのNimbleDesign
からのメッセージが表示されます。
最近設計した5件までのデ
ザインへのショートカットが
記載されます
Designタブ
生物種とアプリケーションを指定
Create New Design
ボタンをクリックします
14文字以下でデザイン名を付けます
注）記号やスペースを使用することはできません。同一の
名前でデザインを作成することはできず、作成後に修正す
ることはできません。
生物種、データベース、アプリケーションを
選択します
デザインに関するメモがあれば入力してください
次に進みます
Target Regionタブ
ターゲット入力の流れ
ターゲットリスト
ターゲットを入力方法は3種類：
候補遺伝子やゲノム位置情報についてあらかじめ纏めておきます
• Manual Entry
ターゲットのレビュー
• Upload File
NimbleDesign画面上で、追加や削除などの操作ができます
ターゲットの確定
Target Regionタブでの作業を完了し、Nextボタンをクリックします
インプットフィール
ドにターゲットリストを直接入力します。
あらかじめ作成し
ておいたファイル(.txt)をアップロードします。
• Gene Search
遺伝子名を検索
し、ターゲットリストに追加します。
Target Regionタブ
Manual Entryによるターゲットの追加
1. フォーマットを選択します
2. インプットフィールドに直接ターゲット
リストを入力します
・ターゲットリストとは？
位置情報リストまたは、遺伝子名や遺伝子IDリス
ト
※ リストフォーマットが異なる場合には、フォーマッ
ト毎にAdd Regionで追加してください。
3. タグを付けたい場合に利用します
例）
リストに対する14文字以下のメモを追加できます。
スペースを使用することはできません
4. Add Regionボタンをクリックします
Target Regionタブ
Upload Fileによるターゲットの追加
1. フォーマットを選択します
2. タブ区切り形式で保存したターゲット
リスト.txtをアップロードします
・ターゲットリストとは？
位置情報リストまたは、遺伝子名や遺伝子IDリスト
※ リストフォーマットが異なる場合には、フォーマット
毎にAdd Regionで追加してください。
3. タグを付けたい場合に利用します
例）
リストに対する14文字以下のメモを追加できます。
スペースを使用することはできません
4. Add Regionボタンをクリックします
Target Regionタブ
Gene Searchによるターゲットの追加
1. 遺伝子名や遺伝子IDをタイプします
※ 入力すると直ぐに検索が始まります。
2. 検索結果から１つを選択します
3. タグを付けたい場合に利用します
例）
リストに対する14文字以下のメモを追加できます。
スペースを使用することはできません
4. Add Features to Listボタンをクリックします
Target Regionタブ
ターゲットのレビュー：入力情報の確認、追加や削除
様々なフィルターを利用して
ターゲットの追加や削除をします
直前の入力情報についての文章をダウンロードできます。
エラーの詳細についても確認できます
直前の入力情報とその結果について概説しています
ターゲットレビューリ
ストの現在の状況
について概説してい
ます
ターゲットレビューリ
ストをフィルタリング
して追加・削除する
ことができます
ターゲットレビューリストのページ表示を切り替えます
Target Regionタブ
ターゲットのレビュー：フィルター機能について
様々なフィルターを利用して表示を切り替えます
※ Transcript BioType列の一般的な意味についてはENSEMBLの用語
ページを（useast.ensembl.org/info/website/glossary.html#Biotype）、
ENSEMBLのアノテーションパイプラインによる特別な定義(Havana and VEGA)
についてはVegaのページ（vega.sanger.ac.uk/info/about/gene_and_
transcript_types.html）を参照してください。
複数行を編集する場合にはマーク機能を利用
します
マークされた行を削除したり修正したりします
補足
ターゲット領域のプロセシング
ターゲット領域は様々にプロセシングされる場合があります
chr5 4000 5000 infoA
chr5 4400 5000 infoB
chr5 5500 5550 null
CHR5 6000 7000 null
重なり合った領域 ⇒ 統合されます（4列目は「:」で結合されます）
小さい領域 ⇒ 拡大されます（アプリケーションによりサイズは異なります）
大文字を使用 ⇒ 小文字に修正されます
プロセシング結果はデザイン前にも確認することができます（Reviewタブ）
ターゲットレビューリスト
プロセシング結果
Parametersタブ
ユニーク性/カバレージパラメーターの設定
Preferred close matchesを設定します
プローブ選択の基準値となるパラメーター
です。数値が低い程、ユニーク性の高いプ
ローブが採用されます。
Maximum close matchesを設定します
プローブカバレージの改善を行うためのパラ
メーターです。数値が高い程、ターゲット領域
のプローブカバー率が上がります。
※Preferred close matchesの設定値より低い値
は設定できません。
補足
ユニーク性/カバレージパラメーターによる影響
SeqCapのユニーク性を重視
したデザイン
A社のユニーク性を重視した
デザイン
ターゲット領域
SeqCapのプローブカバー率
を重視したデザイン
A社のプローブカバー率を重
視したデザイン
プローブで
カバーされた領域
ユニーク性重視
プローブカバー率重
視
ターゲット領域の
カバー率
SeqCap EZ
2.79 Mb
79.3%
A社デザイン
1.77 Mb
50.2%
SeqCap EZ
2.83 Mb
80.5%
A社デザイン
2.31 Mb
65.6%
プローブでカバーされない領域はシークエンスされません
補足
2つのパラメーターについて
NimbleDesignのアルゴリズムでは、一つ一つのプローブ候補のClose Matchスコア（部分的なプローブ配列がリファレン
スゲノム内でどのくらい存在するかを示すスコア。値が低い程ユニークなプローブ）に従って、2段階でプローブが選択さ
れます。
①Preferred close matchesで設定した以下のClose Matchス
コアのプローブ候補のみを残します。
例えば、「3」と設定した場合、青線で描かれたプローブが残され
ます。
この段階でターゲット領域に対するカバーを確認します。
青四角で描かれた領域がプローブでカバーされましたが、ター
ゲットの右端についてはプローブでカバーされていません。
②プローブでカバーされていない領域に対して、プローブ候補
を再スクリーニングします。この時、Close Matchスコアを
Maximum close matchesで設定した値まで順次上げます。
図の例では、Maximum close matchesを「20」と設定していますが、Close Matchスコアを15まで上げたときに、ターゲット領域の全長
がカバーされましたので、ここでプローブのスクリーニングが終了し、結果的には20のプローブは採用されません。
最終的に、ターゲット領域に対してプローブでカバーされた領域の大きさは青とオレンジの四角の領域になります。
補足
パラメーター入力の参考に
Contiguous: 50kb~数Mbなどの連続的な領域
Exon: 500bp以下の小さな断片的な領域の集合
例）
設定したパラメーター値
Unique
Your
Relaxed
Matches
Preferred
1
1
3
7
20
Maximum
1
100.0%
92.1%
90.3%
Percent Probes At
Match Levels
20
2-5
0.0%
7.6%
8.0%
6-10
0.0%
0.3%
1.1%
11-20
0.0%
0.0%
0.6%
95.2%
99.5%
99.9%
Predicted Target Coverage
一般的なプローブカバレージの予測値
※繰り返し配列などで分断されているデザインは「Contiguous」を、繰り返し配列を含まないデザインは「Exon」を選択します。
※ターゲット領域に依存しない予測値ですので、実際のカバレージはReviewのステップでご確認ください。
Reviewタブ
デザイン作成の開始
Submit for Selectionボタンを
クリックします
デザインを削除
デザインをコピー
（パラメーターを修正して複数のデザインを作成する場合に便利）
ターゲット領域の大きさにより、デザイン完了までの時間は変動します（~24時間）
デザインが完了した旨のメールが届きます
Reviewタブ
デザイン結果の確認
Designsリンクをクリックします
ステータスがReady for reviewのデザインを
クリックします
（１）
（２）
（３）
（４）
（５）
（６）
Design Report (PDF)
Coverage Summary (TXT)
Region-by-Region Coverage (ZIP-TXT)
Primary Targets (ZIP-BED)
Capture Targets (ZIP-BED)
Predicted Uncovered Targets (ZIP-BED)
カスタムデザイン結果確認ガイド（日本語）
⇒ http://roche-biochem.jp/products/pdf/custom_design/SeqCap_Custom_Design_RevAppr_Guide_v3(J).pdf
デザイン結果の確認
（１） Probe Set Report (PDF)
プローブ設計条件、結果概要等をまとめたファイルです
カスタムデザイン結果確認ガイド（日本語）
⇒ http://roche-biochem.jp/products/pdf/custom_design/SeqCap_Custom_Design_RevAppr_Guide_v3(J).pdf
デザイン結果の確認
（２） Coverage Summary (TXT)
インプット領域内の塩基のうち、シークエンスさ
れると予測される塩基の割合（％）
検体あたりどのくらいのシークエンシングデータが必要となるかを試算するために
利用する値（インプット領域から大きく離れた値となる場合があります）
カスタムデザイン結果確認ガイド（日本語）
⇒ http://roche-biochem.jp/products/pdf/custom_design/SeqCap_Custom_Design_RevAppr_Guide_v3(J).pdf
デザイン結果の確認
（３） Region-by-Region Coverage (TXT)
必要であれば、Primary Targetsフラグメントごとのプローブカバー率を確認します。
カバー率で並べ替えを行うと、ズームインして確認すべき領域を特定しやすくなります。
カスタムデザイン結果確認ガイド（日本語）
⇒ http://roche-biochem.jp/products/pdf/custom_design/SeqCap_Custom_Design_RevAppr_Guide_v3(J).pdf
デザイン結果の確認
（４） Primary Targets (BED)
（５） Capture Targets (BED)
（６） Predicted Uncovered Targets (BED)
視覚的に、どの領域がプローブでカバーされたか（プローブでカバーされていないか）を確認します
BEDファイルの視覚化方法；
①UCSCゲノムブラウザ
（「Add Custom Tracks」で追加）
②SignalMapソフトウェア（v2.0以降）
（無料でダウンロード可能）
※ BEDファイルはテキストエディタ（Excelなど）で開くこともできます
カスタムデザイン結果確認ガイド（日本語）
⇒ http://roche-biochem.jp/products/pdf/custom_design/SeqCap_Custom_Design_RevAppr_Guide_v3(J).pdf
デザイン結果の確認
（４） Primary Targets (BED)
（５） Capture Targets (BED)
（６） Predicted Uncovered Targets (BED)
Primary Targets
プロセシング（Consolidation, Padding）済のインプット領域です。
Capture Targets
プローブでカバーされる領域です。複数のプローブが重なり合っている場合には統合され
ています。
Predicted Uncovered Targets
Capture Targetsから100bp延長してもカバーされないPrimary Targets領域です。これは
100bのリード長のシークエンシングでデータが得られないと推測される領域と考えることが
できます。
ポジコンなど、必ず読みたいと考えている領
域には無いことを確認します
カスタムデザイン結果確認ガイド（日本語）
⇒ http://roche-biochem.jp/products/pdf/custom_design/SeqCap_Custom_Design_RevAppr_Guide_v3(J).pdf
Reviewタブ
デザインの承認
デザインを承認します
Configuration Numberが発行されます
Reviewタブからショッピングカートページへ
包装サイズと注文数を入力
カートに入れます
製品（包装サイズ）を選択します
注文数を選択します
Transmitボタンをクリックします
メールが届きます
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NimbleDesignでの作業は終了です
代理店様にご注文の旨をお伝えください
・製品番号
・製品名
・数量
・Configuration Number
◆ご注意ください！◆
代理店様からのご注文書が確認でき次第、製造に進
めさせていただきます。確認に時間が掛かり、納品まで
にお時間が掛かる場合があります。
Doing now what patients need next

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