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日中医学協会
理事長
中島章殿
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.過去の研究歴
1984年から 1997年支でに ‘ 中国医科大学修十課稗掌牛 ‘ 助手 ‘ 令沢大掌大学院研費牛 . 大学院博士ト
諜稗掌牛疋び余沢大学助手存続て . 度膚紋理の漬伝 . 骨格の件茅 . 法医実務試料の件別及てfABO式血
液型判定 . ミイラの件別 tABO式血液型の検杏 . 祐ぴに人獣鰐別について幅広く研努移行いました .
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.過去の研究実績
1984年かち 1997年までに、国際誌 . 中国及 u円本の雑誌にで 26篇の論文房発表
し.国際及び中国r_日本の国内の学会で 7閉の口頭発表安行い去した .
lV.本年度の研究業績
(1)学会、研究会等においての口頭発表(学会名・内容)
日本牛化学会第 1
5向北陸地方舎(余沢、 1997年 5月 31円)にて‘ DNA升析の方法君子用
Iについで口頭持表春行いましか .
いかヒトシヒト以外の零長類動物の篤男J
(
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) 学会誌等に発表した論文
無
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(雑誌名・論文名)
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V，今後の研究計画及び希望
。
。
，
，
今後手J引斉続三i". 増幅で夫る STRLocus君子探し.ミトコンドリア DNAについであ検杏し
て.これらミイラの人種及び血縁関係和解明するよろ検討します.
V
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.研
究
報
告(日本語、文は英語で書いて下さい。
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0
0字以上で記載して下さい.別紙可)
別紙参照.
四.指導教官の意見
これまで林子清博士は私と共に中国・新彊で発見された 9体のミイラの性
別と ABO式血液型の遺伝子型判定を中心に
様々な種類の法医学的試料につ
いて， DNAレベルでの研究を行ってきました . 本研究では，近年注目されて
いる STR多型についてミイラ試料を対象に検討し， DNAの抽出法及びポリ
メラーゼ連鎖反応 (PCR)阻止因子の除去法について、独自の方法で工夫した
ところ，
1300年以上経過したミイラ試料の STR HUMTHOl locusの増幅
に成功しました . この成果は，極めて古い考古学試料についても STR多型の
検査が可能であることを示すもので，今後， STR多型が個人識別や親子鑑定
等の法医学実務のみならず，考古学や人類遺伝学などの関連分野おいても有
用であることを実証しています.
研究報告
-PCR法を用いた約 1300年前のミイラに対する STR増幅の試み一
林子清
金沢大学医学部法医学教室
協力研究員
中国医科大学法医学系法医人類学教室講師
テキスト 9
枚，写真説明 1枚，写真 2
枚，表 1枚，計 1
3枚
連絡先:林子清
中国医科大学法医学系
干1
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法医人類学教室
中国遼寧省溶陽市和平区北二馬路 9
2号
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31，内線:法医人類学教室
又は，金沢大学医学部法医学教室
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目的
1985年，
Jeffreys らは，ヒト D N Aにおいて 33塩基対を基本単
位とする繰り返し配列，いわゆるミニサテライトを発見し，その後
も，彼らは，
ミニサテライトより基本単位の塩基数が少ないマイク
ロサテライトを発見した.これら遺伝マーカーは極めて高度の多型
を示し，
しかもメンデルの法則に従って安定に遺伝するので，現在，
D N Aフィンガープリントやシングルローカスプロープとして，人
類学，遺伝学及び法医学などの￨幅広い分野で利用されている . しか
しながら，これらの検出には少なくとも数 μgの高分子 D N Aが必要
とされるため，回収される D N Aの絶対量が少なかったり，あるい
は断片化している可能性が高い古代の試料では，
ミニサテライトの
検出も困難である場合が多い.
近年，
ミニサテライトよりも短い，
2-5塩基を基本単位とした反
復配列である S T R (short tandem repeat) が急速に注目され
ている.すなわち，
STR はミニサテライトやマイクロサテライトと
同様に，繰り返し配列の回数が個人によって異なる上，
がメンデル法則に従って安定に遺伝し，
この個人差
しかも a1
1e1eの長さは通常
百から数百塩基対 (bp ) と比較的短く，微量かっ低分子化した
D N A試料からでも型検出が可能である . また型判定の方法も比較
的簡単であるため，法医実務においても広く応用されて来ている.
我々は今までに，
日本の大谷光瑞探険隊が中国・新彊で発見した
9休のヒトのミイラ ( 現在，中国遼寧省旅 I
J
頃博物館に所蔵されてい
る ) について D N A検査を行い，性別と ABO式血液型を判定し，報
告してきた . しかし，これら 9体のミイラの血縁関係については，
発掘当時の状況や同時に発見された副葬品等からは判定できずにい
るため，今回，これらミイラの人種や血縁関係の判定を試みて，
9
体のミイラのうち 8 体の STR多型について検討した .
研究材料および方法
1. ミイラ
ミイラは中国・新彊ウイグル自治区の砂漠地帯であるトルファン
で発見されたもので，発掘された古墳は中国唐代 ( 紀元 7世紀 ) の
高昌国のものであると考古学的に鑑定されている. したがってミイ
ラは今から約 1300年前の高昌国のヒトであると考えられる .
今回対象とした 8体のミイラは外表所見に基づき成人と判定され
る (Fig.l). 8 体中，
6体の性別は外表上の形態的特徴により推定
可能であり，残り 2体の性別は外表所見からは推定できなかったが，
2体とも男性であること ( 性染色体が xy) が我々のこれまでの研
究から明らかである . また，既に D N A検査及び血清学的方法を用
いて，各ミイラの A B O式血液型の遺伝子型も判定している . 今回，
各成人ミイラからは毛髪，骨格筋及び皮膚を採取し，研究試料とし
た.
2. D N A抽出および精製
各ミイラから採取した毛髪約 10本，骨格筋約 100mg，或いは皮
2
膚約 0.5cm2 を， 1.5m 1のエッベンドルフチューブに入れ，
の滅菌生理的食塩水
1.0m 1
(0.85%の NaClを合む滅菌蒸留水 ) を加え，
室温で 24時間 ( 途中で滅菌生理的食塩水を 2国交換 ) ，緩徐に振渥
した後，生理的食塩水を除去し，
1.0m 1の l%SDSを合む TNE 緩
衝液 (10mM Tris-HCl， pH8.0， 50mM NaCl， 10mM
ED TA) で 30分間振還しながら，十分に洗浄した . 同様な洗浄を 3
回繰り返した後，
2.0% SDS， 0.04M DTTと 200μgのプロテナ
ーゼ K を含む TNE緩衝液 1.
0m 1を加えて，
50o
cで 20時間反応させ
た.チューブ中の試料が完全に分解されたことを肉眼的に確認した
後，水飽和の中性フェノールを 2回，フェノール / クロロホルム
(24:1)を 2回，クロロホルムを 1回加えて除蛋白した . 除蛋白後の
水溶液を n- ブタノールで 200μlに濃縮し，続いて 6MNaI，
0.5%N-ラウロイルサルコシンナトリウムと 10mM Tris-HCl
(pH8.0)を合む水溶液 200t
Jlをチューブに加え，
応後，
液
45o
cで 15分間反
12，000rpm/minで 5分間遠心し，沈殿物を 15μlの T E緩衝
(10mM Tris-HCl， pH8.0， 1mM EDTA) に溶解した . TE
緩衝液に溶解した D N A溶液が褐色或いは黒色を呈する場合は，さ
らにスピンカラム(吉井ら，
日法医誌，
47， 323-329， 1993)を用
い，十分に D N A溶液中に含まれる PCR 阻止因子を除去した .
3. PC R 反応
HUMTH01 及び H U M V W Aの増幅に用いたプライマーは，
Edwardsら (Edwards e
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l， Genomics， 12， 241 253，
・
3
1992)と M oI
Ierら (Moller et al， Int ] Legal Med， 106，
183・ 189， 1994)の報告に従った ( 表 1). 反応液は全量を 50μ! と
し，各プライマーを 1.0μM， Taq D N A ポリメラーゼ ( 宝酒造 )
を 5.0単位，
dN TPを 200μM，付属の 10倍濃度の緩衝液
(500mM KCl， 15mM MgCl2， 100mM Tris-HCl pH8.0)
を 5μl，ウシ血清アルブミン (BSA )を 20f
.
1g，並びに，抽出した
D N A溶液 5f
.
1lを加えた . PC R 反応は表 1 に示した条件で行った .
4. 結果判定
PC R 反応後の溶液をエタノールで沈殿させ，
一色素混合液 (0.1% キシレンシアノール，
ブルー，
5μlのホルムアミド
0.1% ブロモフェノール
2 0 m M E D T A，ホルムアミド 100ml) に溶解した後，
7M
の尿素を含む 6 % ポリアクリルアミドゲル (135 x 135 XO.3mm)を
用いて，
150V の定電圧で 3時間，電気泳動を行い，
Budowle らの
方法 ( A m J H u m Genet， 48， 137-144， 1991)に従って銀染色
を施し，各増幅産物のバンドパターンを観察した.
成績
1 . 抽出 D N Aの性状と P CR 法による増幅
抽出された D N A溶液が褐色または黒色に着色していた場合は，
そのままの状態で P CR 反応液に加えて増幅反応を試みても，
H U M T H 0 1と H U M V W Aのいずれも増幅されなかった . しかし，
スピンカラムでこの D N A抽出液中の不純物を除去すると，
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D N Ai
容
液は無色ないし薄茶色になり，この
行うと
DNA溶液を用いて PCR反応を
HUMTHOlは増幅された . しかし， HUMVWAについては，
依然，増幅されなかった.
また，スピンカラムによる精製後，なお
HUMTHOlと
HUMVWAの両方が増幅されなかった DNA溶液については， PC R
阻止因子の作用を抑える目的で P CR 反応液中に，段階的に濃度を
変えたウシ血清アルブミン
反応液中に
(BSA) を加えたところ，総量 50μlの
BSAを 20μg加えることで HUMTHOlが特異的に増幅
された. しかしながら
HUMVWAは BSAの濃度とは関係なく，い
ずれも増幅されなかった.
2.
HUMTHOlの検査
HUMTHOl については，
イラのうち 6体
が，
Fig.2に示したように，
8体の成人ミ
(No.l， 3， 4， 6， 7と 8)は 2本のバンドを示した
N0.2と N0 .5は 1本のみのバンドを示した . また，この N0.2 と
N 0 .5のバンドは，他の 6 体のミイラが示した 2 本のバンドのうち
の短いバンドと同一位置に検出された.
3. HUMVWAの検査
8体の
HUMVWAを検査したところ，いずれの試料を用いても
目的とした D NAバンドが増幅されなかった .
考察
1984年カリフオルニア大学の Higuchi らは，南アフリカの絶滅
5
動物「クアッガ」の剥製標本から抽出した DNAの塩基配列を決定
し，クアッガの系統的位置付けを行った.その後，スウェーデン・
ウプサラ大学の P託託 bo らによって，約 7000年前のアメリカ原住民
の脳をもとに，
ミトコンドリア DNA断片のクローニングと，その
塩基配列が決定されるなど，
PCR法の開発により，考古学や人類
学研究は目覚ましく進歩している . 現在では，約 4万年前のマンモ
スや約 1億 3千万年前の珠玉白中の昆虫化石からの DNAの増幅及び塩
基配列決定の成功をはじめ，ヒトを含めた数多くの生物について，
化石などの古代生物が残した様々な試料を用いて，遺伝子レベルで
の研究が進んでいる.たとえば，これらの研究成果によって絶滅生
物を合む生物の起源や進化が解明されつつある.
しかし考古学試料については，発掘ないしは発見されるまでの期
間放置された環境の影響により，
DN Aが低分子化したり，また，
生物体内の糖や蛋白質などが変性したことによって，
PC R反応に
対する阻害物質が多量に形成される場合には，古代試料の DNA検
査は一般的に困難である . 特に STRのような単一コピーの 1
0CU Sで
は
，
D N A低分子化の過程でその 1
0CU Sが断裂することにより，
PCRによる増幅が不可能となるため， STR多型の検査がミトコン
ドリア D N Aや DYZ3のようなコピー数の多い 10 C U S に比べて，さ
らに困難になると考えられる.
本研究では，まず極めて乾燥した試料を生理食塩水の中に入れて，
組織や細胞にできる限り水分を浸透させ，プロテナーゼ Kが反応し
6
やすい状態にまで回復し，出来る限り多量の蛋白質が分解されるよ
うに工夫した.また，除蛋白も通常のフェノーノレ/クロロホルム法
以外に
Na1法も加え，最大限に DNAが抽出できるように工夫し，
しかも PCR 阻止因子を可能な限り除去した . その上，
ンカラムを用いて，
BSA とスピ
PC R 阻止因子の作用を最小限に抑えた結果，
1300年以上も経過した古いミイラ試料についても
HUMTHOl
10cusを増幅することに成功した .
1996年 Zierdt らは，
1957年に発掘した紀元 5・ 8世紀位の古墳
にあったヒトの骨と歯牙を試料とし，二重 PC R 法を行ったところ，
90サイクルの増幅により
告したが，本研究では
HUMVWA locusの型判定ができたと報
HUMVWA locusは増幅されなかった . そ
の原因については， ① 増幅回数がまだ少ない， ② Z iertらが骨と歯
牙のような硬組織を試料としたが，我々は一般的に硬組織より保存
性の低い皮膚や筋肉などの軟組織を用いた，③発掘されるまで或い
は発掘された後の保存状態が十分でなく，本研究に用いた試料の
DNAの低分子化がさらに進んでいる，などが考えられる . 今後，
ミイラの骨や歯牙などの硬組織を採取し，
増やして，
PCR増幅回数をさらに
HUMVWA locusや他の locusを検討する必要がある .
また本研究では，同一
DNA抽出液を用いて HUMTHOl と
HUMVWAを同時に増幅して， HUMTHOlは増幅されるが
HUMVWAが増幅されない場合があった . その原因としては，プ
ライマーがテンプレート
DNAとアニーリングしたり，目的とする
7
領域のテンプレート D N Aの立体構造の違いにより増幅しえなかっ
た可能性が考えられる.
本研究結果において，これらミイラの S T R H U M T H 0 1 locus
の a11e1eの確定はできないが，同時に泳動した D N Aのサイズマー
カーとの位置関係から考察すると，短い方のバンドは，現代人の
allele 7 (191 bp)に相当し，より長い方のバンドは現代人の
allele 9 (199 bp)或いは allele 8 (195 bp)に相当するものと
考える . 現代の中国漢民族における a1
1e1e 7の頻度は約
a1
1e1e 9は約
o.
57で
，
a1
1e1e 8は約
o.26，
o.04であるので (Meyer
et
al， Int J Legal M e d， 107， 314-322， 1995)，この結果は，
対象としたミイラが中国・唐の時代の漢民族である可能性を示唆し
ていると考えるが，さらに今後の検討が必要である.
8体のミイラの血縁関係については，
を有し，
しかもいずれも同様なバンドパターンであった.また，
N 0 .2と N 0.5 の 2体は他の 6体と異なり，
が，
6体のミイラは 2本のバンド
2体のバンドが同じ長さで，
1本のバンドのみを示した
しかもそのバンドは，他の 6体が
有する 2本のバンドのうち，短い方のバンドと同一位置に検出され
た.このように，
8体のミイラは 1本の共通のバンドを有しているの
で，各ミイラ聞の血縁関係については，現段階では否定されなかっ
た.
8
結論
1. PC R 法を用いることにより，
1300年以上を経過した古いミ
イラ試料について STR(HUMTH01)の増幅に成功した .
2. 8体のミイラの血縁関係については，増幅された
HUMTH01の電気泳動のバンドパターンより，現段階では血縁関
係の存在の可能性を否定できなかった.
謝辞
本稿を終えるにあたり，日中医学協会から「在留中国人研究者助
成」を頂いたことに対し，深く感謝致します.また，研究の御指導
と報告書の御校閲を賜りました思師，金沢大学医学部法医学教室大
島徹教授に深甚なる謝意を表します.なお，多大なご協力を賜りま
した金沢大学医学部法医学教室近藤稔和講師及び教室員の皆様に深
謝致します.
研究発表
Ampification of Human Short Tandem Repeats on
Mummies Discovered at Taklamakan Desert. 6th.
lndo- Pacific Congress on Legal Medicine and
Forensic Sciences， July， 1998， Kobe(発表予定 )•
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AbstractSubmissionForm
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