CYTODEX-1 MĐKROTAŞIYICILAR ÜZERĐNDE KÜLTÜRE EDĐLEN PRĐMER FETAL KONDROSĐTLERĐN TRĐPSĐN, PRONAZ ve KOLLAJENAZ KULLANILARAK GERĐ KAZANILMASI Gaye Çetinkaya1, Menemşe Gümüşderelioğlu2, Mehmet Ali Onur3, Sezen Arat1*, Şakir Sekmen1 1 TÜBĐTAK MAM Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Enstitüsü (GMBE), Gebze/Kocaeli. 2 Hacettepe Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Ankara. 3 Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Ankara. GĐRĐŞ MATERYAL METOD Mikrotaşıyıcılı sistemler, hücre ve hücresel ürünlerin eldesinde başarıyla kullanılmaktadır. Mikrotaşıyıcı denilen polimerik küreler birim hacimdeki yüzey alanını arttırarak daha fazla sayıda hücre üretilmesine ve buna bağlı olarak daha çok hücresel ürün eldesine olanak sağlarlar. Mikrotaşıyıcılı sistemlerdeki başlıca sorunlardan biri, fiziksel veya fizyolojik harabiyet verilmeden hücrelerin polimerik kürelerden kaldırılmalarıdır. Hücre bankacılığı gibi hücre sayısının çoğaltımasının hedeflendiği çalışmalarda üretilen hücrelerin mikrotaşıyıcılardan geri kazanılamaması bir dezavantajdır. Mikrotaşıyıcılardan hücrelerin geri kazanılması için önerilen yöntem 15 dakika boyunca 37ºC’de tripsinle çalkalayarak inkübe etmektir. Hücre bankacılığında saklanacak hücrelerin sağlıklı ve fonksiyonel olmaları, tüm fizyolojik görevlerini tam anlamıyla yerine getirebilmeleri vazgeçilmez bir esastır. Bu çalışmada üç farklı enzimin mikrotaşıyıcılardan hücre kaldırmadaki başarısı karşılaştırılmış ve 15 dakika süren şiddetli enzim muamelesinin hücrelerde yaratabileceği olası fizyolojik harabiyet incelenmiştir. Mikrotaşıyıcılı hücre kültür sistemlerinin hücre bankacılığı için uygulanabilirliği test edilmiştir. Fetal sığır kıkırdak hücreleri, 3 aylık sığır fetusunun kıkırdak dokusundan eksplant ekim yöntemiyle geliştirilmiştir. Pasaj 5 fetal kıkırdak hücreleri 4 saat boyunca PBS ile şişirilen ve sonrasında otoklavlanan 200 mgr Cytodex-1’in üzerine uygulanmıştır. Mikrotaşıyıcılar ve hücreler 100 ml hacimdeki BellCo karıştırıcılı şişelerde 50 ml %10 FBS içeren besiyeriyle 20 rpm hızda karıştırılarak kültüre edilmişlerdir. 12 gün boyunca kültüre olan hücrelerin sayısı MTT testi ile tayin edilmiştir. 1 ml hücre polimer karışımının üzerinde 100 µl MTT (5 mgr/ml) uygulanarak 5 saat %5 CO2’li 37 ºC inkübatörde inkübe edildikten sonra 40 mM HCl içeren isopropanol solusyonuyla formazan kristalleri çözülmüştür. Örnekler 590 nm’de Biorad ELISA okuyucu ile ölçülmüştür. Đmmünfloresan boyama için hücreler lamellerin üzerine %4 paraformaldehitle fikse edilip, Kollajen tip 2 monoklonal antibadisiyle (NeoMarkers) gece boyu +4ºC’de bekletilmiştir. Ertesi gün fare IgG-FITC sekonder antibadisi ve ardından DAPI boyası uygulanmıştır. Hücreler Leica DMI 4000B invert mikroskop ile görüntülenmiştir. SONUÇLAR B A A 100.000 cell / ml inoculation 10.000 cell / ml inoculation B 6 1,5x10 Şekil 1. Fetal kıkırdak hücrelerinin karakterizasyonu 6 Cell / ml Pasaj 5 ve pasaj 12 sığır fetal kondrositleri Kollajen tip 2 ile karakterize edildiler. (A) Fetal kondrositlerin Kollajen tip 2 monoklonal antibadisi ile immünfloresan boyaması (x200) (B) Fetal kondrositlerin kollajen tip 2 monoklonal antibadisi ve DAPI ile immünfloresan boyaması (x100) 1,0x10 5 5,1x10 4 1,0x10 2 4 6 Day 8 10 12 C Şekil 2. Fetal kondrositlerin Cytodex-1 mikrotaşıyıcıları üzerinde kültürasyonu Şekil 3. Fetal kondrositlerin mikrotaşıyıcılardan kaldırılması enzimatik yöntemle Cytodex-1 Mikrotaşıyıcılar üzerindeki toplam hücre konsantrasyonu MTT ile analiz edilmiştir. Hücre taşıyan mikrotaşıyıcılar, Ca+2 and Mg+2 içermeyen 0,02 % EDTA’lı PBS (pH 8) ile iki kere yıkandıktan sonra birinci grupta 100 µg/ml pronaz ile; ikinci grupta 0,25 % tripsin-EDTA (pH 8) ile; üçüncü grupta 500 µg/ml kollajenaz ile 15 dakika boyunca 37 ºC’de aralıklarla çalkalanarak inkübe edilmiştir. Kaldırılan hücreler trypan blue ile boyandıktan sonra hemositometrik olarak sayılmıştır. Pronaz ile %67,2; tripsin ile % 39,5; kollajenaz ile % 14,1 oranında canlı hücre geri kazanılmıştır. Bu çalışmada pronazın primer fetal sığır kıkırdaklarının mikrotaşıyıcılardan kaldırılabilmesi için en uygun enzim olduğu gösterilmiştir. Fetal kondrositler mililitrede 10.000 ve mililitrede 100.000 hücre olmak üzere iki farklı konsantrasyonda Cytodex-1 (4 mgr/ ml) mikrotaşıyıcıların üzerine ekildikten sonra %5 CO2’li ortamda 20 rpm’de karıştırılarak 12 gün boyunca kültüre edilmiştir. 12 günün sonunda hücrelerin sayısı 100.000 hücre/ml grubunda 72.533.000; 10.000 hücre/ml grubunda 21.726.600 olarak tespit edilmiştir. Bu çalışma ile primer sığır fetal kondrositleri Cytodex-1 mikrotaşıyıcıları üzerinde başarıyla kültüre edilmiştir. Şekil 4. Mikrotaşıyıcıların üzerinden kaldırılan hücrelerin populasyon katlanma süresi analizleri ve MTT testi. 100 80 Pronaz Saat (a)Fetal kondrositlerin 12. gün sonunda mikrotaşıyıcıların üzerindeki görüntüsü (x200); (b) (x400) (c) fetal kondrositlerin Cytodex-1 mikrotaşıyıcıları üzerindeki üreme eğrisi. 60 Tripsin Kollajenaz 40 Kontrol Polimerden enzimatik yöntemle kaldırılan hücrelerin populasyon katlanma sayıları petri kaplarında 3 defa pasajlanarak hesaplanmıştır. Kaldırılan hücreler trypan blue ile boyandıktan sonra hemositometrik olarak sayılmışlardır. [Populasyon katlanma sayısı = Log (kaldırılan hücre/ekilen hücre) x 3,33]. Populasyon katlanma süresi, iki pasaj arasında geçen sürenin katlanma sayısına bölünmesiyle elde edilmiştir. Polimerden enzimatik yöntemle kaldırılan hücrelerin populasyon katlanma süreleri petriden pasajlanan kontrol grubu hücrelerine göre daha uzun olduğu tespit edilse de aradaki anlamlı değildir. 20 Polimerden ve petriden kaldırılan hücreler mililitrede 20.000 hücre olacak şekilde 96 gözlü petrilere ekilmiş ve 48 saat boyunca %10 FBS’li ortamda kültüre edilmiştir. 10 µl MTT uygulandıktan sonra hücreler 2 saat daha inkübe edilmiştir. 40 mM HCl içeren isopropanol ile formazan kristalleri çözülmüş ve petriler 590 nm’de analiz edilmiştir. 0 Populasyon Katlanma Süresi Mikrotaşıyıcılardan pronaz, kollajenaz ve tripsinle kaldırılan hücrelerin absorbansı, petri kaplarından 5 dakika tripsin uygulamasıyla kaldırılan kontrol hücre grubunun absorbansından düşüktür. MTT testinde polimerden kaldırılan hücrelerin proliferasyon kabiliyetleri biraz azalmış gözükse de kontrol grubuyla aralarındaki fark büyük değildir. 0,14 0,12 OD (nm) 0,1 Pronaz 0,08 Tripsin 0,06 Kollajenaz Kontrol 0,04 0,02 0 MTT testi Sonuç olarak, bu çalışmada primer fetal kıkırdak hücreleri başarıyla elde edilmiş çoğaltılmış ve mikrotaşıyıcılı sisteme adapte edilmiştir. Pronaz kullanılarak kaldırılan hücrelerin sayısı tripsin ve kollajenaz uygulanarak kaldırılan hücrelerin sayısından fazladır. 15 dakika süren şiddetli enzim reaksiyonu hücrelerin proliferasyon kabiliyetini az da olsa etkilemiştir. Bu çalışma ile mikrotaşıyıcılı kültür sistemlerinin hücre bankacılığı için kullanılabileceği ancak hücre eldesinde kullanılan enzimatik yöntemlerin optimize edilmesi gerektiği gösterilmiştir. Bu çalışma Türkhaygen-1 isimli Tübitak projesi kapsamında gerçekleştirilmiştir. (KAMAG 106G005): www.turkhaygen.gov.tr
© Copyright 2024 Paperzz
