MINICAP IMMUNOTYPING

MINICAP IMMUNOTYPING
Ref. 2300
2014/10
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
NAMJENA
Komplet MINICAP IMMUNOTYPING namijenjen je za detekciju i karakterizaciju monoklonskih proteina (imunotipizacija) u ljudskom serumu s pomoću
sustava za kapilarnu elektroforezu MINICAP, SEBIA. Koristi se u kombinaciji s kompletom MINICAP PROTEIN(E) 6, SEBIA, namijenjenom za
separaciju proteina u 6 glavnih frakcija u lužnatom puferu (pH 9,9).
Sve sekvence postupka MINICAP provodi automatski, a dobije se profil proteina za kvalitativnu analizu. Svaki uzorak seruma izmiješan je
pojedinačnim antiserumima koji su specifični protiv teških lanaca gama (Ig G), alfa (Ig A) i mi (Ig M) te lakih lanaca kapa i lambda (slobodnih i vezanih).
Proteini, odvojeni u silika kapilarama, izravno su detektirani prema svojoj adsorbanciji na 200 nm.
Elektroforegrami se vizualno procjenjuju kako bi se detektirala prisutnost specifičnih reakcija s monoklonskim proteinima na koje se sumnja.
Za dijagnostičku upotrebu in vitro.
NAPOMENA : U ovim uputama, naziv "MINICAP" koristi se za automatizirane instrumente MINICAP i MINICAP FLEX-PIERCING.
PRINCIP TESTA
Elektroforeza proteina predstavlja dobro poznatu tehniku koja se svakodnevno koristi u kliničkim laboratorijima za testiranje serumskih uzoraka na
nenormalnosti proteina (1, 3, 5, 6, 7, 10). Sustav za kapilarnu elektroforezu MINICAP, SEBIA, razvijen je kako bi se omogućilo potpuno automatizirano
testiranje uz brzo razdvajanje i dobru rezoluciju. U mnogim vidovima ova se metodologija može smatrati posredničkom između klasične zonske
elektroforeze i tekućinske kromatografije (1, 4, 5).
Sustav MINICAP koristi princip kapilarne elektroforeze u slobodnoj otopini. Prema toj tehnici, nabijene se molekule odvajaju prema njihovoj
elektroforetskoj mobilnosti u lužnatom puferu specifične pH vrijednosti. Osim toga, razdvajanje se događa prema pH vrijednosti elektrolita i
elektroosmotskom toku (2, 9, 10).
U kapilarnoj elektroforezi, za nenormalne frakcije u elektroforegramu serumskih proteina, prvenstveno onih u zonama beta globulina i gama globulina,
uvijek se sumnja da su monoklonski proteini (M-proteini, paraproteini, monoklonski imunoglobulini) pa stoga indikacija monoklonskih gamopatija.
Primjenom postupka MINICAP IMMUNOTYPING, provodi se imunotipizacija s pomoću specifičnih antitijela kako bi se identificirale nenormalne
frakcije.
Sustav MINICAP ima 2 kapilare koje paralelno funkcioniraju. Za upotrebu u tom sustavu, pripremi se razrijeđeni uzorak i istodobno se aspiracijom
ubrizgava u anodne krajeve dviju kapilara, uzastopce 3 puta. Za imunotipizaciju, uzorak izmiješan s ELP otopinom ubrizgava se u kapilaru dobije se
referentni obrazac (ELP obrazac) koji predstavlja kompletni elektroforetski obrazac uzorka proteina. Obrasci antiseruma dobiju se na temelju niza od
5 analiza, ubrizgavanjem prethodno razrijeđenog uzorka izmiješanog sa specifičnim antiserumima protiv gama (Ig G), alfa (Ig A), mi (Ig M) teških
lanaca, i protiv slobodnih i vezanih kapa i lambda lakih lanaca.
Zatim se provodi razdvajanje proteina pod visokim naponom, a izravna detekcija hemoglobina provodi se na 200 nm na katodnom dijelu kapilare.
Kapilare se odmah ispiru otopinom za ispiranje i pripremaju za sljedeću analizu s puferom.
Polaganje ELP obrasca na obrasce antiseruma omogućuje vizualizaciju nestanka i/ili smanjenja monoklonske frakcije iz obrasca antiseruma i ukazuje
na gamopatiju.
NAPOMENA : U postupku MINICAP IMMUNOTYPING, proteini su detektirani od katode prema anodi ovim redoslijedom : gama globulini, beta-2
globulini, beta-1 globulini, alfa-2 globulini, alfa-1 globulini i albumin s tim da svaka zona sadrži jedan ili više proteina. Kompleks antigen-antitijelo
(između imunoglobulina serumskog uzorka i specifičnog antiseruma) ima vrlo anodnu mobilnost (između alfa-1 zone i albumina ili anodnije od
albumina).
Imunotipiziranje se provodi u četiri automatizirana koraka :
1. Razrjeđenje uzorka seruma specifičnim razrjeđivačem u reagens čašici. Ovo razrjeđenje provodi se prema koncentraciji imunoglobulina u uzorku.
2. Miješanje razrijeđenog seruma pojedinačnim specifičnim antiserumima (2 antiseruma po reagens čašici). Kompleks antigen-antitijelo oblikuje se
u tekućem mediju brzo, bez potrebe za dodatnim korakom inkubacije ili uklanjanja imunosnih kompleksa.
3. Tri sljedeća ubrizgavanja pripremljenih uzoraka istodobnom aspiracijom u 2 kapilare na anodnom kraju i razdvajanje proteina elektroforezom uz
visoki napon. Razdvojeni proteini detektiraju se na katodnom kraju kapilare pri 200 nm.
4. Dodavanje ELP obrasca na obrasce antiseruma (Ig G, Ig A, Ig M, kapa i lambda) omogućuje karakterizaciju monoklonske komponente na koju se
sumnja.
REAGENSI KOJI SE DOBIJU U MINICAP KOMPLETU ZA IMUNOTIPIZACIJU
UPOZORENJE : Vidjeti sigurnosne podatke.
DIJELOVI
PN 2300
Razrjeđivač uzorka (spreman za upotrebu)
6 bočica, svaka 4,0 mL
Nosač s ELP otopinom i epruvetama antiseruma
ELP otopina (spremna za upotrebu)
Imunoglobulini sisavaca, anti-humani gama teški lanci (spremni za upotrebu)
Imunoglobulini sisavaca, anti-humani alfa teški lanci (spremni za upotrebu)
Imunoglobulini sisavaca, anti-humani mi teški lanci (spremni za upotrebu)
Imunoglobulini sisavaca, anti-humani kapa (slobodni i vezani) laki lanci (spremni za upotrebu)
Imunoglobulini sisavaca, anti-humani lambda (slobodni i vezani) laki lanci (spremni za upotrebu)
1 bočica, 1,2 mL
1 bočica, 1,2 mL
1 bočica, 1,2 mL
1 bočica, 1,2 mL
1 bočica, 1,2 mL
1 bočica, 1,2 mL
Tijekom prijevoza, komplet se može čuvati izvan hladnjaka (na temperaturi od 15 do 30 °C) u trajanju od 15 dana bez negativnih učinaka na
djelotvornost.
ZA OPTIMALNE REZULTATE :
Sve reagense iz istog kompleta treba uvijek upotrijebiti zajedno i prema uputama umetnutim u pakovanje.
MOLIMO PAŽLJIVO PROČITAJTE LISTIĆ UMETNUT U PAKOVANJE.
- 138 -
INSTRUKCIJSKI LIST SEBIA - Hrvatski
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
UPOZORENJE : Nemojte koristiti deioniziranu vodu dostupnu na tržištu, kao što je na primjer voda za glačanje (opasnost od značajnog
oštećenja kapilara). Upotrijebiti samo vodu ultra čiste kvalitete, kao što je voda za injekcije.
1. RAZRJEĐIVAČ UZORKA
Priprema
Razrjeđivač uzorka je spreman za upotrebu. Sadrži : pufersku otopinu pH 9.4 ± 0.5 ; aditive koji nisu štetni u korištenim koncentracijama i koji su
potrebni za optimalan učinak.
Upotreba
Specifični razrjeđivač za automatsko razrjeđivanje uzoraka za analizu proteina u kapilarnoj elektroforezi u automatiziranom MINICAP sustavu.
Omogućuje optimalno dodavanje elektroforetskih obrazaca.
Postaviti izravno na MINICAP rotirajući uzimatelj uzoraka nakon skidanja čepa bočice. Bar kod treba biti vidljiv kroz otvore na rotirajućem uzimatelju
uzoraka.
Skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
Čuvajte razrjeđivač uzoraka na sobnoj temperaturi (15 do 30 °C) ili u hladnjaku (2 do 8 °C). Stabilan je do isteka roka trajanja naznačenog na pakiranju
kompleta ili na naljepnicama na bočicama razrjeđivača.
Razrjeđivač uzoraka ne smije imati talog.
NEMOJTE ZAMRZAVATI.
2. NOSAČ S ELP OTOPINOM I EPRUVETAMA ANTISERUMA
Nosač s ELP otopinom i epruvetama anti-Ig G, anti-Ig A, anti-Ig M, anti-kapa i anti-lambda antiseruma spreman je za upotrebu. Staviti izravno na
MINICAP rotirajući uzimatelj uzoraka. Bar kodovi moraju biti vidljivi kroz otvore na rotirajućem uzimatelju uzoraka.
VAŽNO : Postavite nosač na rotirajući uzimatelj uzoraka MINICAP neposredno prije pokretanja analiza, a neposredno nakon završetka analiza odmah
ga pohranite u hladnjak (2 – 8 °C).
2.1. ELP OTOPINA
Priprema
ELP otopina spremna je za upotrebu. Sadrži : pufersku otopinu pH 7.4 ± 0.5 ; aditive koji nisu štetni u korištenim koncentracijama i koji su potrebni za
optimalan učinak.
Radi lakše identifikacije ELP otopine te kao pomoć u nadziranju primjene, ELP otopina je obojana (žuto) neškodljivom bojom koja odgovara boji
naljepnice na bočici.
Upotreba
Za dobivanje elektroforetskog obrasca proteina u uzorku (ELP obrazac).
Skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
ELP otopinu treba čuvati u hladnjaku (2 to 8 °C) na nosaču. Prije prve upotrebe, stabilna je do isteka roka valjanosti naznačenog na pakiranju kompleta
ili na naljepnici bočice s ELP otopinom.
Bočica ELP otopine smještena na nosaču i stavljena na MINICAP rotirajući uzimatelj uzoraka, stabilna je najviše 60 sati (akumulirano) na sobnoj
temperaturi (15 do 30 °C).
Nakon svake upotrebe, ELP otopinu treba neizostavno i bez ikakvog odlaganja pohraniti u hladnjak (između 2 i 8 °C), ona je tada stabilna do
isteka valjanosti navedenog na naljepnici bočice ELP otopine.
VAŽNO : Akumulirano vrijeme čuvanja ELP otopine na sobnoj temperaturi ne smije prelaziti 60 sati.
ELP otopina ne smije imati talog.
NEMOJTE ZAMRZAVATI.
2.2. ANTISERUMI
Priprema
Antiserumi su spremni za upotrebu. Svaka bočica sadrži : antihumane imunoglobuline sisavaca gama teških lanaca (ružičasta), alfa teških lanaca
(tamnoplava), mu teških lanaca (žutozelena), kapa (slobodnih i vezanih ) lakih lanaca (svijetlozelena), lambda (slobodnih i vezanih ) lakih lanaca
(svijetloplava) i aditive koji nisu štetni u korištenim koncentracijama, a potrebni su za optimalan učinak.
Radi lakše identifikacije antiseruma te kao pomoć u praćenju njihove primjene, antiserumi su obojani različitim neškodljivim bojama koje odgovaraju
boji naljepnice na bočici.
Upotreba
Za imunotipizaciju proteina u sustavu MINICAP.
VAŽNO : Antiserumi su specifični za postupak MINICAP IMMUNOTYPING. Oni se ni na koji način ne smiju upotrijebiti za postupak imunofiksacije na
agaroznim gelovima i obrnuto.
Skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
Antiserume treba čuvati u hladnjaku (2 to 8 °C) na nosaču. Prije prve upotrebe, stabilni su do isteka roka valjanosti naznačenog na kompletu ili na
naljepnicama bočica antiseruma.
Bočice s antiserumom smještene na nosaču i stavljene na MINICAP rotirajući uzimatelj uzoraka, stabilne su najviše 60 sati (akumulirano) na sobnoj
temperaturi (15 do 30 °C).
Nakon svake upotrebe, antiserume treba neizostavno i bez ikakvog odlaganja pohraniti u hladnjak (između 2 i 8 °C), oni su tada stabilni do
isteka valjanosti navedenog na naljepnici bočice antiseruma.
VAŽNO : Akumulirano vrijeme čuvanja antiseruma na sobnoj temperaturi ne smije prelaziti 60 sati.
Antiserumi ne smiju imati talog.
NEMOJTE ZAMRZAVATI.
NAPOMENA : Tijekom prijevoza, ELP otopina i antiserumi mogu se čuvati izvan hladnjaka (na temperaturi od 15 do 30 °C) u trajanju od 15 dana bez
negativnih učinaka na njihovo djelovanje.
- 139 -
ANALIZA UZORAKA SERUMA : POSTUPAK MINICAP IMMUNOTYPING
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
POTREBNI REAGENSI (koji se ne dobiju u kompletu MINICAP IMMUNOTYPING)
UPOZORENJE : Vidjeti sigurnosne podatke.
1. KOMPLET MINICAP PROTEIN(E) 6 (SEBIA, PN 2203)
Prezentacija, upotreba, skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
Vidjeti listić s uputama priložen uz komplet.
2. DESTILIRANA ILI DEIONIZIRANA VODA
Upotreba
Koristi se za isplahnjivanje kapilara u sustavu za kapilarnu elektroforezu MINICAP System, SEBIA.
Preporučuje se upotrijebiti filtriranu destiliranu ili deioniziranu vodu (filtar poroznosti ≤ 0,45 μm) te otpora iznad 10 megaohma x cm.
Kako biste spriječili mikrobnu proliferaciju, promijenite vodu svaki dan.
Za optimalan rad dodajte 35 µL/dL CLEAN PROTECT (SEBIA, PN 2059, 1 bočica od 5 mL).
VAŽNO : Prije punjenja, preporučuje se spremnik za isplahnjivanje obilno isprati destiliranom ili deioniziranom vodom.
3. CAPICLEAN
Sastav
Bočica CAPICLEAN koncentrirane otopine (SEBIA, PN 2058, 25 mL) sadrži : proteolitičke enzime, tenzide i aditive koji nisu štetni u korištenim
koncentracijama i koji su potrebni za optimalan učinak.
Upotreba
Za čišćenje sonde za uzorke u automatiziranom sustavu za kapilarnu elektroforezu MINICAP, SEBIA, tijekom sekvence CAPICLEAN čišćenja.
VAŽNO : Pokrenite sekvencu čišćenja CAPICLEAN barem jedanput na tjedan a najviše jedanput na dan, ili nakon svakih 500 analiza ako se provode
unutar manje od tjedan dana.
Vidjeti listić s uputama za CAPICLEAN, SEBIA.
VAŽNO : Za optimalnu upotrebu CAPICLEAN otopine u sustavu MINICAP, neophodno je upotrijebiti naljepnicu s bar kodom i obilježiti epruvetu za
hemolizu koja drži mikroepruvetu s razrijeđenom CAPICLEAN otopinom (odrezati kapicu na mikroepruveti prije korištenja).
Skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
CAPICLEAN držati u hladnjaku (2 - 8 °C). Otopina je stabilna do isteka datuma valjanosti navedenog na naljepnici bočice. NEMOJTE ZAMRZAVATI.
Možda će se u bočici CAPICLEAN-a opaziti talog ili kombinirane čestice (flokule), ali to nema nikakvih štetnih utjecaja na upotrebu.
Nemojte otapati talog ili te čestice. Preporučuje se uzeti samo supernatant.
Za kasniju upotrebu, pohranite epruvetu koja sadrži razrijeđenu otopinu na 2 - 8 °C. Upotrijebiti u istom danu.
4. OTOPINA NATRIJEVOG HIPOKLORITA (za čišćenje sonde za uzorkovanje)
Priprema
Pripremite otopinu natrijevog hipoklorita (2 % do 3 % klorida) razrjeđivanjem 250 mL 9,6 %-tne kloridne koncentrirane otopine hladnom destiliranom
ili deioniziranom vodom do 1 litre.
Upotreba
Koristi se za čišćenje sonde za uzorkovanje u sustavu MINICAP (za tjedno održavanje kako bi se eliminirali adsorbirani proteini sa sonde).
Vidjeti priručnik s uputama SEBIA MINICAP.
• Stavite 500 µL prethodno pripremljene razrijeđene klorirane otopine u mikroepruvetu.
• Odrežite kapicu na mikroepruveti.
• Postavite mikroepruvetu, smještenu na novoj epruveti za hemolizu koja služi kao držač (obilježenoj naljepnicom s bar kodom, specifičnom za
otopinu natrijevog hipoklorita), u položaj br. 1 na rotirajućem uzimatelju uzoraka sustava MINICAP.
• Postavite novu reagens čašicu na automatizirani sustav za punjenje čašica u MINICAP-u (pojavit će se poruka ako nedostaje reagens čašica).
• Umetnite rotirajući uzimatelj uzoraka u sustav MINICAP.
• Zatvorite vratašca sustava MINICAP i ciklus čišćenja će početi automatski.
VAŽNO : Za optimalnu upotrebu otopine natrijevog hipoklorita u sustavu MINICAP, neophodno je naljepnicom s bar kodom obilježiti epruvetu za
hemolizu, koja drži mikroepruvetu s otopinom (odrežite kapicu na mikroepruveti prije korištenja).
Skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
Radnu kloriranu otopinu držite na sobnoj temperaturi u zatvorenoj posudi, ona je tako stabilna 3 mjeseca. Izbjegavajte skladištenje na sunčevoj
svjetlosti, blizu izvora topline ili zapaljivog izvora te blizu kiselina i amonijaka.
5. CAPILLARYS / MINICAP OTOPINA ZA ISPIRANJE
Priprema
Svaka bočica gotove CAPILLARYS / MINICAP otopine za ispiranje (SEBIA, PN 2052, 2 bočice, 75 mL) treba biti razrijeđena do 750 mL destiliranom
ili deioniziranom vodom.
Za MINICAP je odgovarajuće razrijediti samo 25 mL gotove otopine do 250 mL destiliranom ili deioniziranom vodom.
Nakon razrjeđenja, otopina za ispiranje sadrži lužnatu otopinu pH ≈ 12.
Upotreba
Za ispiranje MINICAP kapilara.
VAŽNO : Prije punjenja spremnika otopinom za ispiranje, preporučuje se isprati otvor spremnika, konektor i epruvetu s mnogo destilirane ili
deionizirane vode kako bi se izbjeglo taloženje soli.
- 140 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
Skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
Pohranite gotovu otopinu za ispiranje i radnu otopinu za ispiranje u zatvorene posude na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. Gotova otopina za ispiranje
stabilna je do isteka roka trajanja naznačenog na kompletu ili na naljepnici na bočici otopine za ispiranje.
Radna otopina za ispiranje stabilna je 3 mjeseca.
Bacite radnu otopinu za ispiranje ako promijeni izgled, npr. postane zamućen zbog kontaminacije mikrobima.
6. BETA-MERKAPTOETANOL (BME ili 2-MERKAPTOETANOL) (ne isporučuje SEBIA)
NAPOMENE :
Ispitivanja koje su provedene za validaciju reagensa, pokazale su da varijacija ± 5% na konačni volumen za različite otopine i upotrebom prilagođene
opreme za rekonstituciju volumena, nema štetni učinak na analizu.
U destiliranoj ili deioniziranoj vodi koja se upotrebljava za rekonstituiranje otopina ne smije postojati proliferacija bakterija i plijesni (upotrijebiti filtar
≤ 0.45 µm) i treba imati otpornost veću od 10 megohms x cm.
POTREBNA OPREMA I DODACI
1.
2.
3.
4.
5.
MINICAP System, SEBIA, PN 1230, MINICAP FLEX-PIERCING System, SEBIA, PN 1232.
Rotirajući uzimatelj uzoraka koji se dobije uz MINICAP.
Komplet spremnika isporučen uz MINICAP : spremnik za isplahnjivanje (za punjenje destiliranom ili deioniziranom vodom) i spremnik za otpad.
MINICAP reagens čašice, SEBIA (250 jedinica), PN 2280.
Poklopci za spremnik za odlaganje iskorištenih čašica reagensa, SEBIA (12 komada), PN 2286 : poklopci za zatvaranje posuda koje sadrže
korištene čašice.
UZORCI ZA ANALIZU
Skupljanje i skladištenje uzoraka
Za analizu se preporučuju svježi uzorci seruma. Serum treba uzeti prema ustanovljenim postupcima koji se koriste u kliničkim laboratorijskim
testiranjima.
Uzorci se mogu čuvati do 10 dana, na temperaturi između 2 i 8 °C. Za duže skladištenje uzorke treba zamrznuti unutar 8 sati od skupljanja. Zamrznuti
serumi stabilni su mjesec dana.
NAPOMENA : Uzorci se ne smiju čuvati na sobnoj temperaturi!
Za serume pohranjene na temperaturi od 2 do 8 °C, degradacija proteina, a osobito degradacija komplementa, ovisi o samom uzorku.
Priprema uzoraka
Upotrijebite nerazrijeđene uzorke seruma.
Nakon skladištenja na 2 do 8 °C ili nakon zamrzavanja, neki serumi (osobito oni koji sadrže krioglobulin ili kriogel) mogu postati viskozni ili zamućeni.
Na sobnoj temperaturi ovi se uzorci mogu analizirati izravno. Uzorci koji sadrže polimerizirani imunoglobulin mogu se koristiti bez obrade.
Prije analize, preporučuje se provjeriti svojstva seruma (npr. znakove hemolize, krioglobulina ili zamućenosti).
Uzorci koje treba izbjegavati
• Izbjegavajte stare, nepravilno pohranjene uzorke seruma jer će beta frakcije biti izmijenjene.
• Izbjegavajte uzorke plazme. Fibrinogen migrira u beta-2 položaj (podupre beta-2).
NAPOMENA : Epruvete za skupljanje bioloških uzoraka opisane su u postojećoj dokumentaciji o predanalitičkoj fazi biomedicinske analize (podaci
koji se dobiju od proizvođača epruveta, upute i preporuke o skupljanju bioloških uzoraka). Ako u uputama ne postoje one koje se odnose na upotrebu
određene vrste epruveta, molimo potražite ih u ovim tekstovima, a za dimenzije epruveta koje treba upotrijebiti pogledajte tekst "Karakteristike
epruveta koje treba upotrijebiti sukladno instrumentu". Predanalitičku fazu treba provoditi prema najnovijim saznanjima, drugim preporukama,
uključujući preporuke proizvođača epruveta te važećim propisima.
POSTUPAK
Sustav MINICAP predstavlja multiparametarski instrument za analizu serumskih proteina na 2 paralelne kapilare postupkom imunotipizacije MINICAP
IMMUNOTYPING, sljedećim redoslijedom :
• Očitavanje bar koda na epruvetama s uzorcima seruma (do 18), na epruvetama reagensa za imunotipizaciju MINICAP IMMUNOTYPING i
rotirajućeg uzimatelja uzoraka ;
• Razrjeđivanje uzoraka iz prvobitnih epruveta u reagens čašice ;
• Miješanje razrijeđenih uzoraka seruma s ELP otopinom i specifičnim antiserumima u reagens čašice ;
• Ispiranje kapilara ;
• Ubrizgavanje razrijeđenih uzoraka ;
• Razdvajanje proteina i izravna detekcija razdvojenih proteina na kapilarama.
Koraci koji se provode ručno, uključuju :
• Postavite otvorene epruvete s uzorcima u rotirajući uzimatelj uzoraka na mjesta 1 do 18 ;
• Postavite epruvetu s razrjeđivačem uzorka u rotirajući uzimatelj uzoraka na mjesto 27 ;
• Postavite nosač s ELP otopinom i epruvetama antiseruma u rotirajući uzimatelj uzoraka na mjesta 19 do 24 ;
• Postavite rotirajući uzimatelj uzoraka u MINICAP instrument ;
• Uklonite epruvete s uzorcima nakon analize ;
• Uklonite i zatvorite posude za korištene čašice.
Elektroforetska analiza sustavom MINICAP prvo uključuje postupak MINICAP PROTEIN(E) 6 kako bi se izabrali uzorci za koje se sumnja da sadrže
monoklonski protein/monoklonske proteine (npr. s nenormalnim obrascem proteina ili frakcijom).
MOLIMO PAŽLJIVO PROČITAJTE PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA MINICAP.
- 141 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
I. PRIPREMA ELEKTROFORETSKE ANALIZE
1. Izaberite uzorke s nenormalnom frakcijom proteina na elektroforegramu dobivenom primjenom postupka MINICAP PROTEIN(E) 6.
2. Uključite MINICAP instrument i kompjutor.
3. Kako biste pokrenuli instrument, postavite bar jednu novu reagens čašicu na automatizirani sistem za čašice MINICAP-a (pojavit će se poruka
ako nedostaje reagens čašica).
4. Odredite postavke softvera i instrument će se pokrenuti automatski.
5. Za svaki uzorak koji treba analizirati te prema njegovoj ukupnoj koncentraciji imunoglobulina, izaberite program razrjeđivanja koji će se provesti
automatski :
• "HYPERGAMMA" ako je razina ukupnih imunoglobulina > 2 g/dL (hipergamaglobulinemija),
• "HYPOGAMMA" ako je razina ukupnih imunoglobulina > 0,8 g/dL (hipogamaglobulinemija),
• "STANDARD" ako je razina ukupnih imunoglobulina između 0,8 i 2 g/dL (postupak razrjeđivanja zadan programom).
6. Za analizu uzoraka seruma, komplet MINICAP IMMUNOTYPING bi na instrumentu MINICAP trebao pokrenuti program analize
"IMMUNOTYPING 6" i pufer MINICAP PROTEIN(E) 6. Za izbor programa analize "IMMUNOTYPING 6" i postavljanje bočice pufera MINICAP
PROTEIN(E) 6 u položaj "B1" na instrumentu, molimo pažljivo pročitajte priručnik s uputama za MINICAP i slijedite upute prikazane na
zaslonu.
NAPOMENA : Pri promjeni postupka iz MINICAP PROTEIN(E) 6 u MINICAP IMMUNOTYPING (i obrnuto), nije potrebno mijenjati bočicu
pufera.
7. Postavite nove reagens čašice na automatizirani sustav za punjenje čašica u MINICAP-u (pojavit će se poruka ako nedostaju reagens čašice).
8. Postavite novu posudu za korištene čašice u MINICAP, na mjesto predviđeno za tu svrhu.
9. Provjerite do koje su razine napunjene bočice reagensa, dodajte reagens ako je potrebno i ispraznite spremnik za otpadni materijal. U
prozorčiću "Provjerite razine reagensa" ("Check reagent levels"), ažurirajte softver pomicanjem kursora.
10. Rotirajući uzimatelj uzoraka ima 28 položaja za epruvete s uzorcima :
• Postavite do 18 otvorenih epruveta s uzorcima na rotirajući uzimatelj uzoraka (položaji br. 1 do 18), bar kod svake epruvete mora biti vidljiv
kroz otvore na rotirajućem uzimatelju uzoraka. Ako epruveta s uzorkom na nosaču uzoraka nije prethodno odabrana, automatski će se
uključiti program razrjeđivanja "STANDARD".
• Nosač s ELP otopinom i epruvetama anti-Ig G, anti-Ig A, anti-Ig M, anti-kapa i anti-lambda antiseruma spreman je za upotrebu.
Nosač umetnite izravno u rotirajući uzimatelj uzoraka na mjesto za ELP otopinu i antiserume, služeći s dvjema kvačicama sa svake strane,
a bar kod svake epruvete mora biti vidljiv kroz otvore na rotirajućem uzimatelju uzoraka.
VAŽNO : Prije pokretanja analize, provjerite je li nosač pravilno umetnut u rotirajući uzimatelj uzoraka.
• Skinite kapicu s epruvete s razrjeđivačem uzorka i stavite ga na mjesto br. 27 (mjesto razrjeđivač / otopina tj. "Diluent / Solution"), bar kod
epruvete mora biti vidljiv kroz otvor na rotirajućem uzimatelju uzoraka.
VAŽNO : Za jednu analizu, ELP otopina i svi antiserumi moraju imati isti broj serije. Ni u kojem slučaju ne miješajte ostatke antiseruma s onima
jednake specifičnosti ili s ELP otopinom između 2 sljedeće bočice, čak i kad su iz iste serije.
VAŽNO : Ako nedostaje epruveta na mjestu za epruvete s uzorcima, položaji br. 19 do 24 (antiserumi i ELP otopina) i položaj br. 27
(razrjeđivač uzoraka), analiza ne može početi i pojavit će se poruka.
11. Umetnite rotirajući uzimatelj uzoraka u sustav MINICAP.
12. Zatvorite vratašca sustava MINICAP i analiza će početi automatski.
13. Nakon analize uklonite rotirajući uzimatelj uzoraka s analiziranim epruvatama s uzorkom. Uklonite nosač s ELP otopinom i epruvete
antiseruma te ih bez odlaganja pohranite u hladnjak (2 - 8 °C).
VAŽNO : Ako su epruvete ostavljene u instrumentu dulje vrijeme, može se zapaziti pomak obrazaca ELP i antiseruma između alfa-2 i beta-1
zona.
14. Ako je potrebno, pažljivo skinite posudu s upotrijebljenim reagens čašicama, čvrsto je zatvorite odgovarajućim poklopcem i bacite je.
UPOZORENJE : Pažljivo rukovati posudama u kojima se nalaze korištene reagens čašice s biološkim uzorcima.
RAZRJEĐIVANJE - MIGRACIJA - OPIS AUTOMATIZIRANIH KORAKA
1. Očitavaju se bar kodovi na epruvetama s uzorkom (do 18), na epruvetama s reagensom MINICAP IMMUNOTYPING te na rotirajućem uzimatelju
uzoraka.
2. Uzorak je razrijeđen u razrjeđivaču uzorka u reagens čašici.
3. Aspiriraju se 2 prva reagensa i razrijeđeni uzorak, a zatim se izmiješaju u reagens čašici. Sonda za uzorkovanje isplahnjuje se nakon svakog
uzorka. Izabrani program razrjeđivanja bit će proveden za svaki uzorak. Ako program nije izabran, prema zadanim postavkama programa bit će
proveden program razrjeđivanja "STANDARD". Redoslijed reagensa je sljedeći : ELP otopina i anti-Ig G, anti-Ig A i anti-Ig M i anti-Kappa i
anti-Lambda antiserumi.
4. Kapilare su isprane.
5. Razrijeđeni uzorci s reagensima ubrizgavaju se u kapilare.
6. Migracija se provodi pod konstantnim naponom u trajanju otprilike 4 minute, a temperatura se kontrolira Peltierovim efektom.
7. Proteini su direktno detektirani skeniranjem na 200 nm, a na zaslonu sustava pojavi se elektroforetski profil.
NAPOMENA : Koraci 3 do 7 provode se ponovno za sljedeće reagense (anti-Ig A i anti-Ig M te anti-kapa i anti-lambda prema zadanim postavkama
programa).
NAPOMENA : Ovi koraci opisani su za 2 prva reagensa (ELP otopina i anti-Ig G). Za sljedeće reagense (anti-Ig A, anti-Ig M, anti-kapa i anti-lambda
antiserume), 3. korak provodi se za vrijeme 2 prethodne analize. Cjeloviti elektroforetski obrazac koji odgovara imunotipizaciji uzorka, pojavi se nakon
otprilike 35 minuta.
U prozorčiću statusa :
- Mapa legende ("Legend") pokazuje kako napreduju analize na rotirajućem uzimatelju uzoraka.
- Brojač ("IT counter") pokazuje broj provedenih analiza i prikazuje se samo u režimu epruveta s kapicom ("capped tubes"). Nakon instalacije verzije
softvera, brojač analize počinje od nule. Brojač mjeri analizu koja se provodi i analizu koja je završila ili je zaustavljena (nakon prekida).
Kada su epruvete prazne, resetirajte brojač (pritisnite gumb "reset").
NAPOMENA : Nakon 60 provedenih analiza, u prozorčiću statusa prikaže se treptavi signal upozorenja. Signal ostane prikazan ali ne zaustavlja
analize koje slijede, sve dok brojač analiza ne bude resetiran.
- 142 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
II. REZULTATI ANALIZE
Na kraju analize, svaki obrazac antiseruma(Ig G, Ig A, Ig M, kapa i lambda) automatski prekriva ELP obrazac. Ako su zajedno reagirali monoklonska
komponenta i specifični antiserum, odgovarajuća frakcija nestaje iz obrasca antiseruma.
Ove usporedbe omogućuju identifikaciju i karakterizaciju monoklonskih komponenata.
III. KRAJ CIKLUSA ANALIZE
Na kraju svakog ciklusa analize, osoba koja provodi analizu mora na sustavu MINICAP pokrenuti postupak ''stand by'' (spremno) ili ''shut down''
(isključivanje) kako bi kapilare ostale u optimalnim uvjetima.
VAŽNO : Postavite bar jednu novu reagens čašicu na automatizirani sistem za punjenje čašica u MINICAP-u (poruka će se pojaviti ako nedostaje
reagens čašica).
IV. PUNJENJE POSUDA ZA REAGENS
Sustav MINICAP ima automatsku kontrolu reagensa.
VAŽNO : Molimo pogledajte upute za zamjenu posuda za reagens, vodeći računa o boji koda za bočice i konektore.
Poruka će se pojaviti kada je potrebno provesti jedan od ovih zadataka :
• Postavite novu bočicu s puferom i / ili ;
• Napuniti posudu radnom otopinom za ispiranje i / ili ;
• Napuniti posudu filtriranom destiliranom ili deioniziranom vodom za isplahnjivanje kapilara i / ili ;
• Isprazniti spremnik za otpad.
UPOZORENJE : Nemojte koristiti deioniziranu vodu dostupnu na tržištu, kao što je na primjer voda za glačanje (opasnost od značajnog
oštećenja kapilara). Upotrijebiti samo vodu ultra čiste kvalitete, kao što je voda za injekcije.
VAŽNO : Prije punjenja, preporučuje se spremnik za isplahnjivanje obilno isprati destiliranom ili deioniziranom vodom.
MOLIMO PAŽLJIVO PROČITAJTE PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA MINICAP.
KONTROLA KAKVOĆE
Preporučuje se upotrijebiti ispitani kontrolni serum (kao što je IT / IF Control, SEBIA PN 4788) nakon svake promjene serije reagensa.
NAPOMENA : Ako je potrebno, normalni kontrolni serum (Normal Control Serum), SEBIA, PN 4785, može se analizirati kao negativna kontrola.
REZULTATI
Smjernice za analizu obrazaca
1. Referentni obrazac (ELP obrazac)
• Prvo, preporučuje se pažljivo promotriti ima li kakvih nenormalnosti u referentnom obrascu (ELP obrazac).
• Kada uočite neku nenormalnost na ELP vrpci, obratite pozornost na migracijski položaj vrha/vrhova unutar krivulje - alfa-2, beta, beta-gama ili
gama zone. Primjenom ELP obrasca. posebno potražite područja nenormalnosti uspoređujući ELP obrazac sa svakim tretiranim okvirom - G,
A, M, kapa i lambda).
• Nenormalnosti se mogu pojaviti kao monoklonske, biklonske, triklonske, oligoklonske komponente, kao teški lanci, slobodni laki lanci, itd...
2. Pregledajte svaki okvir tretiran imunoglobulinom uspoređujući s krivuljom iznad dodanog referentnog obrasca (ELP
obrazac). Tražite odsutnost ili smanjenje nenormalnog vrha :
• Ig G : Ig G imunoglobulini su najbrojnija vrsta imunoglobulina nađenih u serumu i obično se zapaža normalno poliklonsko uklanjanje. Normalno
poliklonsko smanjenje ovog vrha ne smije se pogrešno protumačiti kao monoklonska komponenta. Poliklonsko uklanjanje javlja se kao redukcija
frakcije bez promjene simetrije frakcije. Monoklonski Ig G pokazat će se uklanjanjem vrha, uz promjenu simetrije vidljivu u usporedbi s ELP
obrascem.
• Ig A : Normalno je Ig A koncentracija relativno mala u usporedbi s Ig G koncentracijom. Tražite lagane redukcije u beta-ranom gama području.
ELP obrazac bi trebao odražavati Ig A u normalnim uzorcima.
• Ig M : Obrazac je sličan Ig A, osim što je koncentracija obično čak i manja. U normalnim uzorcima, smanjenje će biti vrlo malo bez promjene
simetrije frakcije. ELP obrazac bi trebao odražavati Ig M obrazac u normalnim uzorcima.
• Kapa : Normalno su prisutni u omjeru 2 kapa na 1 lambda. Normalno, zapazite 2/3 redukcije u gama frakciji. Poliklonsko uklanjanje javlja se
kao redukcija frakcije bez promjene simetrije frakcije. Monoklonska kapa komponenta pokazat će se uklanjanjem vrha, uz promjenu simetrije
vidljivu u usporedbi s ELP obrascem.
• Lambda : Zbog omjera kapa i lambda 2:1, lambda vrpca treba predstavljati 1/3 sveukupne redukcije u gama frakciji u normalnim uzorcima.
Poliklonsko uklanjanje javlja se kao redukcija frakcije bez promjene simetrije frakcije. Monoklonska lambda komponenta pokazat će se
uklanjanjem vrha, uz promjenu simetrije vidljivu u usporedbi s ELP obrascem.
Identifikacija monoklonske komponente postiže se uočavanjem odsutnosti ili uklanjanja nenormalnog vrha/nenormalnih vrhova u odgovarajućim
tretiranim okvirima. Primjerice, uklanjanje nenormalnog vrha u oba tretirana okvira G i kapa može upućivati na Ig G, kapa monoklonsku komponentu.
Interpretacija analize uzoraka seruma
Odsutnost monoklonske komponente
Normalni uzorak seruma ili uzorak s hipergamaglobulinemijom pokazuje nestanak poliklonskih imunoglobulina na obrascima antiseruma (vidljiv kao
smanjenje gama i/ili beta frakcija) bez učinka na druge frakcije proteina (sl. 1).
Prisutnost monoklonske komponente
• Prisutnost monoklonskog proteina (monoklonska gamopatija) karakterizirana je nestankom frakcije s jednim od anti-teškog lanca antiseruma (gama,
alfa ili mi) i bilo anti-kapa ili anti-lambda lakim lancem antiseruma. Detektirani monoklonski vrh, obično oštar i demarkiranog izgleda, mora biti
smješten na jednakoj migracijskoj udaljenosti kao i frakcija za koju se sumnja da je monoklonska u referentnoj vrpci (ELP vrpca) (slike 3 i 4).
- 143 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
• Odsutnost reakcije s bilo kojim primijenjenim antiserumskim anti-teškim lancem i reakcija s jednim od antiserumskih lakih lanaca može upućivati
da :
a) vrlo rijetka Ig D ili Ig E gamopatija : potvrditi anti-delta ili anti-epsilon teškim lancom antiseruma i postupcima SEBIA HYDRAGEL IF,
b) gamopatija lakog lanca : potvrditi antiserumskim anti-kapa ili anti-lambda slobodnim lakim lancima i postupcima SEBIA HYDRAGEL BENCE
JONES ili HYDRAGEL IF,
• Ukoliko ne zapazite pozitivnu reakciju uz bilo koji od primijenjenih anti-lakih lanaca antiseruma, a anti-teški lanac antiseruma reagira, to bi moglo
upućivati na vrlo rijetku gamopatiju teškog lanca (gama, alfa ili mi).
Prisutnost dviju ili više monoklonskih komponenata
Jednaka interpretacija moguća je za uzorke s dvije ili više monoklonskih komponenata. U rijetkim slučajevima, nekoliko klonskih komponenti B-stanica
proliferira kao što pokazuje nekoliko monoklonskih traka dobivenih imunotipizacijom :
• Biklonsku gamopatiju karakterizira nestanak dviju frakcija teškog lanca (identičnih ili različitih) i dviju frakcija lakih lanaca (identičnih ili različitih)
(sl. 5).
• Polimerizirani imunoglobulini karakterizirani su nestankom nekoliko frakcija istog tipa teškog lanca i istog tipa lakog lanca.
Kako bi se potvrdila prisutnost jedne monoklonske nenormalnosti, potrebno je depolimerizirati beta-merkaptoetanolom i ponoviti imunotipizaciju. U
tom slučaju (i) pripremite 1% beta-merkaptoetanola (BME ili 2-merkaptoetanol, 2 ME) u Fluidilu (SEBIA, PN 4587, 1 bočica 5 mL), (ii) MINICAP
sustav spremno čeka na rotirajući uzimatelj uzoraka, dodajte 100 µL ove otopine za redukciju u 300 µL čistog seruma, (iii) zavrtite i pričekajte najviše
15 minuta, te zatim postupite u skladu sa standardnim postupkom.
VAŽNO : Nakon redukcijskog tretmana beta-merkaptoetanolom, uzorak treba analizirati bez odlaganja ; nijedna umetnuta epruveta s uzorkom ne
smije čekati na analizu u sustavu MINICAP.
Nakon tretmana beta-merkaptoetanolom, uzorak pokazuje samo jednu monoklonsku komponentu ako je u uzorku prisutan jedan klon. Redukcijski
tretman uzorka potiče degradaciju komplementa C3 (uz veliku distorziju beta zone) ; može se pojaviti široka frakcija između alfa-1 zone i albumina.
• Oligoklonska gamopatija karakterizirana je nestankom višestrukih, obično malih vršaka ili defleksija u jednom ili više tipova teških lanaca i dva tipa
lakih lanaca (sl. 7).
Posebni slučajevi :
• Ako monoklonska frakcija ne nestane potpuno iz obrazaca antiseruma, ponovite postupak s uzorkom većeg razrjeđenja. Izaberite "STANDARD"
program razrjeđivanja umjesto programa "HYPOGAMMA", ili program razrjeđivanja "HYPERGAMMA" umjesto "STANDARD".
• Uzorci s monoklonskim komponentama pri visokim razinama ukupnih imunoglobulina ("HYPERGAMMA" program razrjeđivanja)
U tom slučaju, kompleks antigen-antitijelo predstavlja veliku i široku frakciju smještenu između albumina i alfa-1 zone ; monoklonska frakcija ili više
njih, možda neće potpuno nestati iz obrazaca antiseruma (sl. 2).
• Uzorci s polimeriziranim monoklonskim komponentama
U tom slučaju, kompleks antigen-antitijelo predstavlja veliku i široku frakciju smještenu između albumina i beta-1 zone.
• Uzorci s monoklonskim komponentama u zonama beta-1 ili beta-2
Ako monoklonska komponenta nije detektirana u gama zoni, izaberite program razrjeđenja koji je prilagođen koncentraciji Ig-a uzorka.
Ako se sumnja na postojanje još jedne monoklonske komponente u gama zoni, izaberite program razrjeđenja koji odgovara tom proteinu.
• Bikloni
Biklonske komponente mogu se pojaviti zbog imunosnih kompleksa ili biklonskih gamopatija, ili unakrsnih reakcija koje su vrlo rijetke (vidjeti odjeljak
Međudjelovanja i ograničenja).
• Nestanak Ig M na obrascima antiseruma anti-kapa i lambda :
U slučaju potpunog oduzimanja vrha uz lake lance antiseruma anti-Ig M, anti-kapa i anti-lambda istodobno, preporučuje se uzorak tretirati betamerkaptoetanolskim reducirajućim agensom (vidjeti prethodni odlomak) i ponoviti imunotipizaciju.
• U slučaju višestrukih istodobnih reakcija s protu-teškim lancima G, A i M, preporučuje se ponoviti analizu serumskog uzorka izborom optimiziranog
("OPTIMIZED") režima razrjeđivanja.
Međudjelovanje i ograničenja
VAŽNO : Upotreba antiseruma, osim onih koji su specifični za postupak MINICAP IMMUNOTYPING i dobiju se u kompletu, može utjecati na rezultate.
Upotrebljavajte samo antiserume specifične za postupak MINICAP IMMUNOTYPING.
Vidjeti UZORCI ZA ANALIZU.
Zbog rezolucije i granica osjetljivosti zonske elektroforeze, moguće je da se ovom metodom neke monoklonske komponente ne mogu detektirati.
Mnoga su ispitivanja pokazala da se reakcija antigen-antitijelo razlikuje između tekućine i agarozne faze. Budući da se postupak MINICAP
IMMUNOTYPING potpuno provodi u tekućem mediju, neki antiserumi mogu katkad unakrsno reagirati s monoklonskim komponentama prisutnim u
uzorku.
Ne postoji opasnost od lažno negativnih rezultata kao što je nemogućnost detekcije gamopatije, ali ova unakrsna reakcija koja se događa vrlo rijetko,
može dovesti do zaključka da se radi o biklonskoj umjesto o stvarnoj, monoklonskoj gamopatiji. Prema literaturnim podacima, u kliničkom liječenju
nema razlike između biklonske gamopatije i monoklonske gamopatije (Kyle et al, 1981).
Ako je biklonski obrazac nesiguran, možda je potrebno provesti daljnje testiranje primjenom HYDRAGEL kompleta za imunofiksaciju.
Mogu se uočiti slabi pomaci između ELP obrasca i iznad dodanih obrazaca antiseruma (osobito u beta-1 zoni). Ne smije ih se smatrati rezultatom
nestajanja monoklonske frakcije u jednom ili više antiserumskih obrazaca.
Kao i u bilo kojoj drugoj elektroforetskoj metodi, može biti teško zamijetiti male monoklonske proteine koji ko-migriraju s drugim normalnim serumskim
proteinima. Ako se sumnja na postojanje malih monoklonskih komponenti, možda je potrebno daljnje testiranje upotrebom kompleta za imunofiksaciju
SEBIA HYDRAGEL.
Kada se primjenom MINICAP postupka za analizu proteina MINICAP PROTEIN(E) 6 detektira monoklonska komponenta ali postupkom MINICAP
IMMUNOTYPING izostane karakterizacija, preporučuje se ponoviti imunotipizaciju uzorka prethodno obrađenog beta-merkaptoetanolom (vidjeti
prethodni odjeljak) te ako postoji nesigurnost, potvrditi rezultat imunofiksacijom na agaroznom gelu.
Uz postupak MINICAP IMMUNOTYPING nije detektirana interferencija uslijed visoke koncentracije kolesterola (≤ 8,24 mmol/L), triglicerida
(≤ 11,58 mmol/L) i hemoglobina (≤ 0.40 g/dL) u serumskom uzorku.
Za postupak MINICAP IMMUNOTYPING nisu proučavane interferencije zbog bilirubina. Savjetuje se promatrati osobine serumskog uzorka ; ako se
sumnja na interferencijsku frakciju, preporučuje se ponovno provesti analizu serumskog uzorka ili primijeniti komplementarna ispitivanja drugim
tehnikama.
Rješavanje problema
Nazovite Tehničku službu dobavljača proizvoda SEBIA ako test ne uspije iako ste pažljivo slijedili upute za pripremu i skladištenje materijala te za
provođenje postupka.
Sigurnosno-tehničke listove s podacima za reagense kompleta i informacije o zbrinjavanju odbačenih proizvoda možete dobiti od tehničke službe
dobavljača.
- 144 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
PODACI O DJELOVANJU
Reproducibilnost unutar istog ciklusa i između analiza
Reproducibilnost unutar istog ciklusa i između analiza pokazana je na tri različita patološka serumska uzorka s monoklonskom komponentom (Ig GL,
Ig AK i Ig MK) i na jednom normalnom serumskom uzorku. Analizirani su na 3 MINICAP sustava postupkom MINICAP IMMUNOTYPING i programom
razrjeđivanja "STANDARD", upotrebom iste serije kompleta MINICAP IMMUNOTYPING. Svaki serum analiziran je 3 puta na obje kapilare svakom
sustava MINICAP primjenom jednog od 6 reagensa prema analiziranom uzorku (ELP otopina za normalni uzorak, anti-Ig G, anti-Ig A, anti-Ig M,
anti-kapa i anti-lambda antiserume za patološke uzorke, prema monoklonskoj komponenti).
Sva ponavljanja dala su identične rezultate unutar ciklusa i između analiza, a obrasci su odgovarali tipu svakog testiranog uzorka. Imunotipizacija
postupkom MINICAP IMMUNOTYPING omogućuje karakterizaciju samo jedne monoklonske komponente za svaki patološki uzorak te nijednu
nenormalnu frakciju u normalnom uzorku.
Reproducibilnost između analiza i između sustava
Reproducibilnost između analiza i između sustava pokazana je na tri različita patološka serumska uzorka s jednom monoklonskom komponentom
(Ig GK, Ig GL i Ig MK) i različitih koncentracija imunoglobulina. Jedan uzorak (ukupna razina Ig < 0,8 g/dL) analiziran je postupkom MINICAP
IMMUNOTYPING i programom razrjeđivanja "HYPOGAMMA", jedan (ukupna razina Ig između 0,8 i 2 g/dL) "STANDARD" programom razrjeđivanja,
a jedan (ukupna razina Ig > 2 g/dL) "HYPERGAMMA" programom razrjeđivanja. Ovi uzorci analizirani su uzastopce 3 puta na svakom od 3 MINICAP
sustava uz primjenu iste serije iz kompleta MINICAP IMMUNOTYPING.
Sva ponavljanja dala su između analiza i između sustava identične rezultate, a na obrascima su se pravilno identificirale monoklonske komponente.
Imunotipizacija provedena postupkom MINICAP IMMUNOTYPING omogućila je karakterizaciju očekivanih monoklonskih komponenata u tri patološka
uzorka.
Reproducibilnost između analiza i između serija
Reproducibilnost između analiza i između serija prikazana je na dva različita patološka serumska uzorka s jednom monoklonskom komponentom
(Ig GK i Ig MK, svaka posebno) i na jednom serumskom uzorku s dvije monoklonske komponente (Ig AL), a u svim uzorcima razina Ig iznosila je
između 0,8 i 2 g/dL. Ovi su uzorci analizirani uzastopce 3 puta primjenom triju različitih serija kompleta MINICAP IMMUNOTYPING i režima
razrjeđivanja "STANDARD".
Sva ponavljanja dala su između analiza i između serija identične rezultate, a na obrascima su se pravilno identificirale monoklonske komponente.
Imunotipizacija provedena postupkom MINICAP IMMUNOTYPING omogućila je karakterizaciju očekivanih monoklonskih komponenata u tri patološka
uzorka.
Ispitivanje podudarnosti
Ispitivanje podudarnosti provedeno je na 69 serumskih uzoraka između postupka MINICAP IMMUNOTYPING i komercijalno dostupnog sustava za
imunotipizaciju kapilarnom elektroforezom : u obje tehnike analizirano je 57 različitih patoloških i 12 normalnih uzoraka seruma. Ovo ispitivanje
pokazalo je 100%-tno slaganje dviju tehnika :
• Za 12 normalnih uzoraka seruma : potpuno slaganje (podudarnost).
• Za 57 patoloških uzoraka seruma : potpuno slaganje (podudarnost).
U svim slučajevima, s pomoću obje tehnike postignuto je potpuno slaganje u detekciji i karakterizaciji monoklonskih proteina (imunotipizacija) u
ljudskom serumu.
Osjetljivost
Serijska razrjeđenja pripremljena su u normalnom serumu s tri patološka uzorka seruma koji su svi pokazivali monoklonske komponente, i analizirana
su primjenom postupka MINICAP IMMUNOTYPING.
Slijedi sažeti prikaz rezultata :
UZORAK Br.
1
2
3
MONOKLONSKA KOMPONENTA
Tip
Alfa
Ig A, L
Lambda
Gama
Ig G, K
Kapa
Mi
Ig M, K
Kapa
Granica detekcije monoklonske komponente iznosi oko 25 mg/dL.
KONCENTRACIJA (g/dL)
(u originalnom serumu)
2,7
2,9
1,7
GRANICA DETEKCIJE (mg/dL)
25
25
25
25
25
25
NAPOMENA : Granica detekcije može varirati ovisno o blizini i jačini djelovanja interferirajućeg proteina. Osjetljivost može biti veća za monoklonsku
komponentu koja migrira na katodni kraj gama zone, a manja u sredini zone poliklonske hipergamaglobulinemije. Granica detekcije može varirati
prema položaju monoklonske komponente i poliklonske pozadine u gama i beta zonama.
- 145 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
ANALIZA UZORAKA MOKRAĆE : POSTUPAK MINICAP IMMUNOTYPING URINE ZA IMUNOTIPIZACIJU MOKRAĆE
POTREBNI REAGENSI (koji se ne dobiju u kompletu MINICAP IMMUNOTYPING)
UPOZORENJE: Vidjeti sigurnosne podatke.
1. KOMPLET MINICAP PROTEIN(E) 6 (SEBIA, PN 2203)
Opis, upotreba, skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
Vidjeti upute priložene uz komplet.
2. KOMPLET CAPILLARYS / MINICAP URINE (SEBIA, PN 2013)
Opis, skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
Vidjeti upute priložene uz komplet.
Upotreba
Za pripremu uzoraka mokraće prije razdvajanja proteina ljudske mokraće kapilarnom elektroforezom u sustavu MINICAP.
3. DESTILIRANA ILI DEIONIZIRANA VODA
Upotreba
Koristi se za isplahnjivanje kapilara u automatiziranom sustavu za kapilarnu elektroforezu MINICAP, SEBIA.
Preporučuje se upotreba filtrirane destilirane ili deionizirane vode (kroz filtar poroznosti ≤ 0.45 μm) i otpornosti veće od 10 megaohma x cm.
Kako biste spriječili kontaminaciju mikrobima, promijenite vodu svaki dan.
Za optimalan rad dodajte 35 µL/dL CLEAN PROTECT (SEBIA, PN 2059, 1 bočica od 5 mL).
VAŽNO: Prije punjenja, preporučuje se spremnik za isplahnjivanje obilno isprati destiliranom ili deioniziranom vodom.
4. CAPICLEAN
Sastav
Bočica CAPICLEAN koncentrirane otopine (SEBIA, PN 2058, 25 mL) sadrži: proteolitičke enzime, tenzide i aditive koji nisu štetni u korištenim
koncentracijama i koji su potrebni za optimalan učinak.
Upotreba
Za čišćenje sonde za uzorke u automatiziranom sustavu za kapilarnu elektroforezu MINICAP, SEBIA za vrijeme sekvence čišćenja CAPICLEAN.
VAŽNO: Pokrenite sekvencu čišćenja CAPICLEAN barem jednom tjedno a najviše jednom dnevno, ili poslije svakih 500 analiza ako su provedene
unutar manje od tjedan dana.
Vidjeti upute za CAPICLEAN, SEBIA.
VAŽNO: Za optimalnu upotrebu otopine CAPICLEAN u sustavu MINICAP, neophodno je upotrijebiti naljepnicu s bar kodom i obilježiti epruvetu za
hemolizu koja drži mikroepruvetu s razrijeđenom CAPICLEAN otopinom (odrezati kapicu na mikroepruveti prije upotrebe).
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Otopinu CAPICLEAN čuvajte u hladnjaku (2 – 8 °C). Ona je stabilna do isteka roka trajanja naznačenog na naljepnici na bočici. NEMOJTE
ZAMRZAVATI.
Možda će se u bočici CAPICLEAN-a opaziti talog ili kombinirane čestice (flokule), ali to nema nikakvih štetnih utjecaja na upotrebu.
Nemojte otapati talog ili te čestice. Preporučuje se uzeti samo supernatant.
Za kasniju upotrebu, epruvetu s razrijeđenom otopinom pohranite na temperaturi 2 – 8 °C. Valja je upotrijebiti u istom danu.
5. OTOPINA NATRIJEVOG HIPOKLORITA (za čišćenje sonde za uzorkovanje)
Priprema
Pripremite otopinu natrijeva hipoklorita (2% do 3% klorida) razrjeđivanjem 250 mL 9,6%-tne koncentrirane kloridne otopine hladnom destiliranom ili
deioniziranom vodom do 1 litre.
Upotreba
Koristi se za čišćenje sonde za uzorkovanje u MINICAP sustavu (za tjedno održavanje kako bi se eliminirali adsorbirani proteini sa sonde).
Vidi priručnik s uputama za SEBIA MINICAP.
• Stavite 500 µL prethodno pripremljene razrijeđene klorirane otopine u mikroepruvetu.
• Odrežite kapicu na mikroepruveti.
• Postavite mikroepruvetu, spojenu na novu epruvetu za hemolizu koja služi kao nosač (označenu naljepnicom s bar kodom specifičnim za otopinu
natrijeva hipoklorita), na mjesto br. 1 na rotirajućem uzimatelju uzoraka sustava MINICAP.
• Postavite novu reagens čašicu na automatizirani sustav za punjenje čašica u MINICAP-u (ako nedostaje reagens čašica, pojavit će se poruka).
• Umetnite rotirajući uzimatelj uzoraka u sustav MINICAP.
• Zatvorite vratašca sustava MINICAP i slijedite upute koje se prikažu na zaslonu.
VAŽNO: Za optimalnu upotrebu otopine natrijevog hipoklorita u sustavu MINICAP, neophodno je naljepnicom s bar kodom obilježiti epruvetu za
hemolizu, koja drži mikroepruvetu s otopinom (odrežite kapicu na mikroepruveti prije upotrebe).
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Pohranite radnu kloriranu otopinu na sobnoj temperaturi u zatvorenoj posudi, ona je tako stabilna 3 mjeseca. Izbjegavajte skladištenje na sunčevoj
svjetlosti, blizu izvora topline ili zapaljivog izvora te blizu kiselina i amonijaka.
- 146 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
6. CAPILLARYS / MINICAP OTOPINA ZA ISPIRANJE
Priprema
Svaku bočica gotove otopine za ispiranje CAPILLARYS / MINICAP Wash Solution (SEBIA, PN 2052, 2 bočice, 75 mL) treba razrijediti do 750 mL
destiliranom ili deioniziranom vodom.
Za MINICAP je odgovarajuće razrijediti samo 25 mL gotove otopine do 250 mL destiliranom ili deioniziranom vodom.
Nakon razrjeđenja, otopina za ispiranje sadrži lužnatu otopinu pH ≈ 12.
Upotreba
Za ispiranje MINICAP kapilara.
VAŽNO: Prije punjenja spremnika otopinom za ispiranje, preporučuje se oprati otvor spremnika, konektor i epruvetu s mnogo destilirane ili deionizirane
vode kako bi se izbjeglo taloženje soli.
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Pohranite gotovu otopinu i radnu otopinu za ispiranje u zatvorene spremnike na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. Gotova otopina za ispiranje stabilna
je do isteka roka trajanja naznačenog na kompletu ili na naljepnici bočice otopine za ispiranje.
Radna otopina za ispiranje stabilna je 3 mjeseca.
Bacite radnu otopinu za ispiranje ako promijeni izgled, npr. postane zamuζena zbog kontaminacije mikrobima.
NEPOMENE:
Testovi koji su provedeni za validaciju reagensa pokazali su da za različite otopine te uz primjenu opreme prilagođene za rekonstituciju volumena,
varijacija od ± 5% za konačni volumen nema štetni učinak na analizu.
U destiliranoj ili deioniziranoj vodi koja se upotrebljava za rekonstituciju otopina, ne smije postojati proliferacija bakterija i plijesan (upotrijebiti filtar
≤ 0,45 µm) i treba imati otpornost veću od 10 megaohma x cm.
POTREBNA OPREMA I DODACI
1.
2.
3.
4.
5.
Sustav MINICAP, SEBIA, PN 1230.
Rotirajući uzimatelj uzoraka koji se dobije uz MINICAP.
Komplet spremnika isporučen uz MINICAP: spremnik za isplahnjivanje (za punjenje destiliranom ili deioniziranom vodom) i spremnik za otpad.
MINICAP reagens čašice, SEBIA (250 čašica), PN 2280.
Poklopci za spremnike za odlaganje iskorištenih čašica reagensa, SEBIA (12 komada), PN 2286 : poklopci za zatvaranje posuda koje sadrže
korištene čašice.
6. Epruvete za hemolizu (visine 75 mm, promjera 13 mm).
UZORCI ZA ANALIZU
Skupljanje i čuvanje uzoraka
Analizu je poželjno provoditi na svježim uzorcima mokraće prikupljenim u roku od 24 sata. Uzorke mokraće treba uzimati prema ustanovljenim
postupcima koji se koriste u kliničkim laboratorijskim testiranjima.
Uzorci mokraće mogu biti pohranjeni na temperaturi od 2 do 8 °C najviše do sedam dana.
Za razdoblja dužeg skladištenja preporučuje se uzorke čuvati zamrznute na – 70 / – 80 °C (stabilni su najmanje mjesec dana).
VAŽNO: Nemojte čuvati uzorke na – 20 °C.
Odmrznuti ili nepravilno pohranjeni uzorci mogu pokazati modificirane ili dodatne frakcije uslijed degradacije proteina.
NAPOMENA: Uzorci mokraće ne smiju se čuvati na sobnoj temperaturi.
Priprema uzorka
Prije analize pripremite uzorke mokraće prema postupku dijalize i ukoncentriravanja opisanom u uputama priloženim uz komplet CAPILLARYS /
MINICAP URINE (vidjeti odjeljak "Reagensi koji su potrebni ali nisu isporučeni").
Upotrijebite izravno te pripremljene uzorke mokraće.
VAŽNO: Tehnika analize mokraće kapilarnom elektroforezom zahtijeva 2 koraka: korak dijalize i korak koncentriranja uzoraka mokraće sustavima za
dijalizu SEBIA (epruvete 20 mL). Upotrijebite samo jednu epruvetu po uzorku. Dijalizirani i ukoncentrirani uzorci mokraće mogu se zatim analizirati
postupcima MINICAP URINE i MINICAP IMMUNOTYPING URINE.
Uzorke mokraće analizirajte unutar najviše jednog dana od njihove pripreme. Kako bi se ograničila adsorpcija proteina na membrani uređaja za dijalizu
i ukoncentriravanje (sustav za dijalizu), ne preporučuje se poslije centrifugiranja uzorke držati u sustavu za dijalizu, nego u mikroepruveti pohranjenoj
u hladnjaku (između 2 i 8 °C).
Uzorci koje treba izbjegavati
• Izbjegavajte stare, nepravilno pohranjene uzorke mokraće jer će frakcije zbog denaturacije biti izmijenjene.
• Preporučuje se provjeriti svojstva uzorka mokraće nakon prvog centrifugiranja (npr. znakove hemolize ili zamućenosti).
• Ne pohranjujte uzorke u uređaje za dijalizu i ukoncentriravanje, jer bi se neki proteini mogli vezati na membranu.
NAPOMENA: Epruvete za skupljanje uzoraka i parametri centrifugiranja za biološke uzorke opisani su u postojećoj dokumentaciji o predanalitičkoj fazi
biomedicinske analize (podaci koji se dobiju od proizvođača epruveta, upute i preporuke o skupljanju bioloških uzoraka...). Ako u uputama ne postoje
one koje se odnose na upotrebu određene vrste epruveta ili na centrifugiranje, molimo potražite ih u ovim tekstovima, a za dimenzije epruveta koje
treba upotrijebiti pogledajte tekst tvrtke SEBIA "Karakteristike epruveta koje treba upotrijebiti sukladno instrumentu". Predanalitičku fazu treba provoditi
prema najnovijim saznanjima, drugim preporukama, uključujući preporuke proizvođača epruveta te važećim propisima.
- 147 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
POSTUPAK
Sustav MINICAP je multiparametarski instrument za analizu proteina u mokraći na 2 paralelne kapilare postupkom imunotipizacije MINICAP
IMMUNOTYPING URINE, ovim redoslijedom:
• očitavanje bar koda na epruvetama s uzorcima mokraće (do 18 epruveta), na epruvetama reagensa MINICAP IMMUNOTYPING i na rotirajućem
uzimatelju uzoraka;
• razrjeđivanje uzoraka u reagens čašicama;
• miješanje razrijeđenih uzoraka mokraće s ELP otopinom i specifičnim antiserumima u reagens čašicama;
• ispiranje kapilara;
• ubrizgavanje razrijeđenih uzoraka;
• razdvajanje proteina i izravna detekcija razdvojenih proteina na kapilarama.
Koraci koji se provode ručno, uključuju:
• postavljanje mikroepruveta (bez kapica) s uzorcima za analizu koje drže epruvete za hemolizu, na rotirajući uzimatelj uzoraka na mjesta od 1 do
18; svaka epruveta obilježena je specifičnom naljepnicom s bar kodom za identifikaciju uzorka, u skladu s uzorkom za analizu;
• postavljanje epruvete s razrjeđivačem uzorka u rotirajući uzimatelj uzoraka na mjesto 27;
• postavljanje nosača s ELP otopinom i epruvetama antiseruma u rotirajući uzimatelj uzoraka na mjesta 19 do 24;
• postavljanje rotirajućeg uzimatelja uzoraka u MINICAP instrument;
• uklanjanje epruveta s uzorcima nakon analize;
• uklanjanje i zatvaranje posude za korištene čašice.
Elektroforetsku analizu u sustavu MINICAP primjenom postupka MINICAP URINE, najprije treba provesti kako bi se odabrali uzorci za koje se sumnja
da sadrže monoklonski protein / monoklonske proteine (npr. s nenormalnim proteinskim obrascem ili frakcijom).
MOLIMO PAŽLJIVO PROČITATI PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA MINICAP.
I. PRIPREMA ELEKTROFORETSKE ANALIZE
1. Izaberite uzorke s nenormalnom frakcijom proteina na elektroforegramu dobivenom primjenom postupka MINICAP URINE.
2. Uključite MINICAP instrument i kompjutor.
3. Kako biste pokrenuli instrument, postavite bar jednu novu reagens čašicu na automatizirani sustav za čašice MINICAP-a (pojavit će se poruka
ako nedostaje reagens čašica).
4. Odredite postavke softvera i instrument će se pokrenuti automatski.
5. Za analizu svakog uzorka, odredite vrijednost nenormalne frakcije "Ratio urine" (omjer u mokraći) za karakterizaciju iz elektroforetskog obrasca
koji se dobije programom analize "URINE" (vidjeti odjeljak "Analiza rezultata" u uputama priloženim uz komplet CAPILLARYS / MINICAP
URINE). Vrijednost "Ratio urine" (omjer u mokraći) definira se proporcijom područja nenormalne frakcije u odnosu na ukupno područje
serumskih proteina normalnog kontrolnog uzorka.
6. Izaberite program razrjeđenja koji će se automatski pokrenuti prema vrijednosti "Ratio urine":
• "HYPOGAMMA" ako je vrijednost "Ratio urine" < 0,55.
• "STANDARD" ako je vrijednost "Ratio urine" između 0,55 i 1,55.
• "HYPERGAMMA" ako je vrijednost "Ratio urine" > 1,55.
NAPOMENA: Kada je vrijednost "Ratio urine" ± 10% u odnosu na graničnu vrijednost (0,55 ili 1,55), preporučuje se izabrati program
razrjeđenja prema nenormalnoj frakciji kako bi se provela karakterizacija postupkom MINICAP IMMUNOTYPING URINE:
- za poboljšanje detekcije slabe frakcije, manje razrijedite uzorak mokraće izborom "HYPOGAMMA" programa razrjeđenja, umjesto programa
"STANDARD", i izborom programa razrjeđenja "STANDARD" umjesto programa "HYPERGAMMA",
- za bolju imunotipizaciju jake frakcije, više razrijedite uzorak mokraće izborom programa razrjeđenja "STANDARD" umjesto programa
"HYPOGAMMA", i izborom programa razrjeđenja "HYPERGAMMA" umjesto programa "STANDARD".
7. Za analizu uzoraka mokraće, predviđeno je da komplet MINICAP IMMUNOTYPING koristi program za analizu "IMMUNOTYPING URINE" na
instrumentu MINICAP i pufer MINICAP PROTEIN(E) 6. Za izbor programa analize "IMMUNOTYPING URINE" i postavljanje bočice pufera
MINICAP PROTEIN(E) 6 u položaj "B1" na instrumentu, molimo pažljivo pročitajte priručnik s uputama za MINICAP i slijedite upute prikazane
na zaslonu.
NAPOMENA: Pri promjeni postupka iz MINICAP URINE u MINICAP IMMUNOTYPING URINE (i obrnuto), nije potrebno mijenjati bočicu
pufera.
8. Postavite nove reagens čašice na automatizirani sustav za punjenje čašica u MINICAP-u (ako nedostaju reagens čašice, pojavit će se poruka).
9. Postavite novu posudu za korištene čašice u MINICAP, na mjesto predviđeno za tu svrhu.
10. Provjerite razinu ispunjenosti bočica reagensa, dodajte reagens ako je potrebno i ispraznite spremnik za otpadni materijal. U prozorčiću
"Provjerite razine reagensa" ("Check reagent levels"), ažurirajte softver pomicanjem kursora miša.
11. Rotirajući uzimatelj uzoraka sadrži 28 mjesta za epruvete s uzorcima:
• Stavite do 18 praznih epruveta za hemolizu (služe kao nosači), označenih naljepnicama s bar kodom za svakog bolesnika, na rotirajući
uzimatelj uzoraka (mjesta br. 1 do 18), a zatim stavite mikroepruvete s dijaliziranim uzorcima mokraće; prije upotrebe odrežite kapicu na
svakoj mikroepruveti. Bar kod svake epruvete mora biti vidljiv kroz otvore na rotirajućem uzimatelju uzoraka. Ako epruveta s uzorkom
postavljena na rotirajući uzimatelj uzoraka nije prethodno odabrana, automatski će se uključiti program razrjeđivanja "HYPOGAMMA".
• Sačuvajte kapicu svake mikroepruvete radi daljnjeg čuvanja uzoraka, ako je potrebno.
VAŽNO: Svaku epruvetu za hemolizu koja drži mikroepruvetu s uzorkom za analizu, preporučuje se obilježiti posebnom naljepnicom za
identifikaciju uzorka, s bar kodom koji odgovara uzorku.
• Nosač s ELP otopinom i epruvetama anti-Ig G, anti-Ig A, anti-Ig M, anti- kapa i anti-lambda antiseruma spreman je za upotrebu.
Držeći nosač za dvije kvačice smještene sa svake strane, umetnite ga u rotirajući uzimatelj uzoraka na mjesta za ELP otopinu i antiserume,
a bar kod svake epruvete mora biti vidljiv kroz otvore na rotirajućem uzimatelju uzoraka.
VAŽNO: Prije pokretanja analize, provjerite je li nosač pravilno umetnut u rotirajući uzimatelj uzoraka.
• Odrežite kapicu epruvete s razrjeđivačem uzroka i umetnite epruvetu na mjesto br. 27 (mjesto za razrjeđivač / otopinu ("Diluent / Solution"),
s tim da bar kod epruvete mora biti vidljiv kroz otvor na rotirajućem uzimatelju uzoraka.
VAŽNO: Za jednu analizu, ELP otopina i svi antiserumi moraju imati isti broj serije. Ni u kojem slučaju ne miješajte ostatke antiseruma s onima
jednake specifičnosti ili s ELP otopinom između 2 sljedeće bočice, čak i kad su iz iste serije.
- 148 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
VAŽNO: Ako nedostaju epruvete na mjestima za epruvete s uzorcima, mjesta od br. 19 do 24 (antiserumi i ELP otopina) i na mjestu br. 27
(razrjeđivač uzorka), analiza ne može početi i pojavit će se poruka.
12. Umetnite rotirajući uzimatelj uzoraka u sustav MINICAP.
13. Zatvorite vratašca sustava MINICAP i slijedite upute koje se prikažu na zaslonu.
14. Nakon analiza uklonite rotirajući uzimatelj uzoraka s analiziranim epruvetama s uzorkom. Uklonite nosač s ELP otopinom i epruvetama
antiseruma te ih bez odlaganja pohranite u hladnjak (2 – 8 °C).
VAŽNO: Ako su epruvete ostavljene u instrumentu dulje vrijeme, može se zapaziti pomak ELP-a i obrazaca antiseruma između alfa-2 i beta-1
zona.
15. Ako je potrebno, pažljivo skinite posudu s upotrijebljenim reagens čašicama, čvrsto je zatvorite odgovarajućim poklopcem i bacite je.
UPOZORENJE: Pažljivo rukovati posudama koje sadrže korištene reagens čašice s biološkim uzorcima.
RAZRJEĐIVANJE - MIGRACIJA - OPIS AUTOMATIZIRANIH KORAKA
1. Očitavanje bar kodova na epruvetama s uzorcima mokraće za analizu (najviše 18), na epruvetama s reagensom MINICAP IMMUNOTYPING i na
rotirajućem uzimatelju uzoraka.
2. Razrjeđivanje dijaliziranog uzorka mokraće u razrjeđivaču uzoraka u reagens čašici.
3. Aspiriranje prvih 2 reagensa i razrijeđenog uzorka te miješanje u reagens čašici. Sonda za uzorkovanje isplahnjuje se nakon svakog uzorka.
Izabrani program razrjeđivanja provodi se za svaki uzorak. Ako program nije izabran, prema zadanim postavkama provodi se program
razrjeđivanja "HYPOGAMMA". Redoslijed reagensa je sljedeći: ELP otopina i anti-Ig G, anti-Ig A i anti-Ig M te anti-kapa i anti-lambda antiserumi.
4. Kapilare su oprane.
5. Ubrizgavanje razrijeđenih uzoraka s reagensima u kapilare.
6. Migracija se provodi pod konstantnim naponom u trajanju od otprilike 4 minute, a temperatura se kontrolira Peltierovim efektom.
7. Proteini se detektiraju izravno, skeniranjem na 200 nm, a na zaslonu sustava pojavi se elektroforetski profil.
NAPOMENA: Koraci od broja 3 do 7 provode se ponovno za sljedeće reagense (anti-Ig A i anti-Ig M, te anti-kapa i anti-lambda prema zadanim
postavkama).
NAPOMENA: Ovi koraci opisani su za 2 prva reagensa (ELP otopina i anti-Ig G). Za sljedeće reagense (anti-Ig A, anti-Ig M, te anti-kapa i anti-lambda
antiserume), korak 3 proveden je tijekom 2 prethodne analize. Potpuni elektroforetski obrasci, odgovarajući za imunotipizaciju uzorka, pojavljuju se
otprilike 35 minuta.
U prozorčiću statusa:
- Mapa "Legend" pokazuje kako napreduju analize na rotirajućem uzimatelju uzoraka.
- "IT counter" (brojač) pokazuje broj provedenih analiza i prikazuje se samo u režimu "capped tubes" tj. epruveta s kapicom. Nakon instalacije verzije
softvera, brojač analiza počinje od nule. Brojač bilježi analizu koja se provodi i svaku završenu ili zaustavljenu analizu (poslije prekida).
Kada su epruvete prazne, resetirajte brojač (pritisnite gumb "reset").
NAPOMENA: Kada je završeno 60 analiza, u prozorčiću statusa prikaže se treptajući signal upozorenja. Signal upozorenja ostaje na zaslonu sve dok
se brojač analiza ne resetira, ali ne zaustavlja analize koje slijede.
II. REZULTATI ANALIZE
Na kraju analize, svaki obrazac antiseruma (Ig G, Ig A, Ig M, kapa i lambda) automatski prekriva ELP obrazac. Ako su zajedno reagirali monoklonska
komponenta i specifični antiserum, odgovarajuća frakcija nestaje iz obrasca antiseruma.
Ove usporedbe omogućuju identifikaciju i karakterizaciju monoklonskih komponenata.
Analizom uzoraka mokraće, na zaslonu i u izvješću rezultata identificiraju se različiti položaji zone proteina (albumin, alfa 1, alfa 2, beta i gama).
III. KRAJ CIKLUSA ANALIZE
Na kraju svakog ciklusa analize, osoba koja provodi analizu mora na sustavu MINICAP pokrenuti postupak ‘’stand by’’ (spremno) ili ‘’shut down’’
(isključivanje) kako bi kapilare ostale u optimalnim uvjetima.
VAŽNO: Stavite najmanje jednu novu reagens čašicu na automatizirani sustav za punjenje čašica u instrumentu MINICAP (ako nedostaje reagens
čašica, pojavit će se poruka).
IV. PUNJENJE SPREMNIKA ZA REAGENS
Sustav MINICAP provodi automatsku kontrolu reagensa.
VAŽNO: Molimo pogledajte upute za zamjenu spremnika za reagens, vodeći računa o boji koda za bočice i konektore.
Pojavit će se poruka kada bude potrebno obaviti neki od sljedećih zadataka:
• postaviti novu bočicu s puferom i / ili;
• napuniti spremnik radnom otopinom za ispiranje i / ili;
• napuniti spremnik filtriranom destiliranom ili deioniziranom vodom za isplahnjivanje kapilara i / ili;
• isprazniti spremnik za otpadni materijal.
UPOZORENJE: Nemojte koristiti deioniziranu vodu dostupnu na tržištu, kao što je na primjer voda za glačanje (opasnost od značajnog
oštećenja kapilara). Koristite jedino vodu ultra čiste kvalitete, kao što je voda za injekcije.
VAŽNO: Prije punjenja, preporučuje se spremnik za isplahnjivanje obilno isprati destiliranom ili deioniziranom vodom.
MOLIMO PAŽLJIVO PROČITATI PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA MINICAP.
- 149 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
REZULTATI
Interpretacija analize uzoraka mokraće
Odsutnost monoklonske komponente
• Uzorak mokraće s glomerularnom ili miješanom proteinurijom i poliklonskim imunoglobulinima, pokazuje nestanak poliklonskih imunoglobulina na
obrascima antiseruma (vidljiv kao smanjenje gama i/ili beta frakcija) bez ikakvog učinka na druge frakcije proteina.
Prisutnost monoklonske komponente
• Prisutnost čitavog monoklonskog imunoglobulina karakterizirana je nestankom frakcije s jednim od antiseruma anti-teškog lanca (gama, alfa ili mu)
i s antiserumom anti-kapa ili anti-lambda lakog lanca. Detektirani monoklonski vrh, obično oštar i jasno ocrtanog izgleda, mora biti smješten na
jednakoj migracijskoj udaljenosti kao i frakcija za koju se sumnja da je monoklonska u referentnoj vrpci (ELP vrpca).
• Odsutnost reakcije s bilo kojim primijenjenim anti-teškim lancem antiseruma i reakcija s jednim od antiserumskih lakih lanaca može upućivati na
gamopatiju lakog lanca: potvrditi anti-kapa ili anti-lambda slobodnim lakim lancima antiseruma i postupcima SEBIA HYDRAGEL BENCE JONES ili
HYDRAGEL IF.
• Ukoliko ne zapazite pozitivnu reakciju uz bilo koji od primijenjenih anti-lakih lanaca antiseruma, a anti-teški lanac antiseruma reagira, to bi moglo
upućivati na vrlo rijetku gamopatiju teškog lanca (gama, alfa ili mi).
Prisutnost dviju ili više monoklonskih komponenata
• Polimerizirani imunoglobulini karakterizirani su nestankom nekoliko frakcija istog tipa lakog lanca.
Posebni slučajevi:
• Ako monoklonska frakcija ne nestane potpuno iz obrazaca antiseruma, ponovite postupak s uzorkom mokraće većeg razrjeđenja. Izaberite
"STANDARD" program razrjeđivanja umjesto programa "HYPOGAMMA" ili program razrjeđivanja "HYPERGAMMA" umjesto "STANDARD".
• Uzorci s visokim koncentracijama monoklonskih komponenata (program razrjeđivanja "HYPERGAMMA"):
U tom slučaju, kompleks antigen-antitijelo predstavlja veliku i široku frakciju smještenu između albumina i alfa-1 zona; monoklonska frakcija ili više
njih, možda neće potpuno nestati iz obrazaca antiseruma.
• Prisutnost čitavog imunoglobulina povezanog sa slobodnim lakim lancem može biti karakterizirana nestankom dviju frakcija s jednim od antiseruma
anti-lakog lanca i nestankom samo jedne frakcije s antiserumom anti-teškog lanca.
• Program razrjeđivanja preporučuje se izabrati prema nenormalnoj frakciji koju treba karakterizirati kako bi se postigla bolja detekcija slabe frakcije
ili imunotipizacija jake frakcije (vidjeti odjeljak "Priprema elektroforetske analize").
Međudjelovanje i ograničenja
VAŽNO: Upotreba antiseruma, osim onih koji su specifični za postupak MINICAP IMMUNOTYPING URINE i dobiju se u kompletu, može utjecati na
rezultate. Upotrebljavajte samo antiserume koji su namijenjeni specifično za postupak MINICAP IMMUNOTYPING URINE.
Vidjeti UZORCI ZA ANALIZU.
Analizirajte samo uzorke pripremljene uređajima za dijalizu i ukoncentriravanje, kao što su sustavi za dijalizu SEBIA ili nekim ekvivalentnim uređajem
koji ima jednaku djelotvornost i odobren je za kliničke analize.
Nedovoljna analiza uzorka može rezultirati neproteinskim rezidualnim frakcijama. Ako se sumnja na interferentnu frakciju, preporučuje se ponovno
dijalizirati uzorak mokraće. Međudjelovanja izazvana lijekom ili solima eliminiraju se tijekom koraka dijalize. Ako se pažljivo ne provede ovaj korak,
vrhovi koji se zapažaju mogu biti lažni.
Poznato je da hemoglobin, kada postoji u uzorku mokraće, ko-migrira s transferinom (beta frakcija). Preporučuje se provjeriti svojstva uzorka mokraće
nakon prvog centrifugiranja (npr. znakove crvenih krvnih stanica i / ili hemolize u uzorku mokraće).
Mnoga su ispitivanja pokazala da se reakcija antigen–antitijelo razlikuje između tekućinske i agarozne faze. Budući da se postupak MINICAP
IMMUNOTYPING URINE potpuno provodi u tekućem mediju, neki antiserumi mogu katkad unakrsno reagirati s monoklonskim komponentama
prisutnim u uzorku.
Ne postoji opasnost od lažno negativnih rezultata, kao što je nemogućnost detekcije gamopatije, ali ova unakrsna reakcija koja se događa vrlo rijetko,
može dovesti do zaključka da se radi o biklonskoj umjesto o stvarnoj, monoklonskoj gamopatiji. Prema literaturnim podacima, u kliničkom liječenju
nema razlike između biklonske gamopatije i monoklonske gamopatije (Kyle et al , 1981).
Ako je biklonski obrazac nesiguran, možda je potrebno provesti daljnje testiranje primjenom HYDRAGEL kompleta za imunofiksaciju.
Mogu se uočiti slabi pomaci između ELP obrasca i iznad položenih obrazaca antiseruma (osobito u beta-1 zoni). Ne smije ih se smatrati rezultatom
nestajanja monoklonske frakcije u jednom ili više antiserumskih obrazaca.
Zbog rezolucije i granica osjetljivosti zonske elektroforeze, moguće je da se ovom metodom neke monoklonske komponente ne mogu detektirati.
Kao i u bilo kojoj drugoj elektroforetskoj metodi, može biti teško zamijetiti male monoklonske proteine. Ako se sumnja na postojanje malih
monoklonskih komponenti, možda je potrebno daljnje testiranje upotrebom kompleta za imunofiksaciju SEBIA HYDRAGEL.
Rješavanje problema
Nazovite tehničku službu dobavljača tvrtke SEBIA kada test ne funkcionira a pažljivo ste slijedili upute za pripremu i pohranu materijala te upute za
provedbu postupka.
Sigurnosno-tehničke listove s podacima za reagense kompleta i informacije o zbrinjavanju odbačenih proizvoda možete dobiti od Tehničke službe
dobavljača.
PODACI O DJELOVANJU
Ispitivanje podudarnosti
Ispitivanje podudarnosti između imunotipizacije postupkom MINICAP IMMUNOTYPING URINE i komercijalno dostupnog sustava kapilarne
elektroforeze (referentni postupak), provedeno je za karakterizaciju paraproteina i slobodnih lakih lanaca na 39 različitih patoloških uzoraka mokraće
(s paraproteinima ili slobodnim lakim lancima kapa ili lambda), na 2 uzorka s poliklonskim obrascem te na 5 normalnih uzoraka. Svi uzorci, ukupno
46, analizirani su primjenom i jedne i druge tehnike.
- 150 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
Ovo ispitivanje pokazalo je 100%-tno slaganje 2 tehnika:
Za 5 normalnih uzoraka mokraće: potpuno slaganje (podudarnost).
Za 2 uzorka mokraće s poliklonskim obrascem: potpuno slaganje (podudarnost).
Za 39 patoloških uzoraka mokraće: potpuno slaganje (podudarnost).
Analizirani patološki uzorci mokraće pokazali su pojedinačnim postupcima slaganje rezultata, a na svim patološkim uzorcima u svakom sustavu
detektirane su identične vrpce.
- 151 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY
1. Cameron JS. 1987. The nephrotic syndrome. Am. J. Kidney Dis, 10 : 157-171.
2. Chopin N. 1991. Étude de la protéinurie. Inf. Tech. Biol., 1 : 23-28.
3. Clark R et al. Rapid capillary electrophoretic analysis of human serum proteins : qualitative comparison with high-throughput agarose gel
electrophoresis. J. Chromatogr. A, 744, 205 - 213 (1996).
4. Gay-Bellile C, Bengoufa D, Houze P, Le Carrer D, Benlakehal M, Bousquet B, Gourmel B, Le Bricon T. Automated multicapillary electrophoresis
for analysis of human serum proteins. Clin. Chem., 49, 1909 - 1915 (2003).
5. Henskens Y et al. Detection and identification of monoclonal gammopathies by capillary electrophoresis. Clin. Chem., 44, 1184 - 1190 (1998).
6. Jellum E et al. Journal of Chromatography Biomedical Applications : Diagnostic applications of chromatography and capillary electrophoresis. J.
Chromatogr. B, 689, 155 - 164 (1997).
7. Jenkins MA and Guerin MD. Journal of Chromatography Biomedical Applications : Capillary electophoresis procedures for serum protein analysis :
comparison with established techniques. J. Chromatogr. B, 699, 257 - 268 (1997).
8. Joachim GR, Cameron JS, Chwartz M, Belker EL. 1964. Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome. J. Clin. Invest.,
43, 2332-2346.
9. Katzmann JA et al. Identification of monoclonal proteins in serum : A quantitative comparison of acetate, agarose gel, and capillary electrophoresis.
Electrophoresis, 18, 1775 - 1780 (1997).
10. Keren DF. Detection and characterization of monoclonal components in serum and urine. Clin. Chem., 44, 6, 1143 – 1145 (1998).
11. Kyle RA, Robinson RA, Katzmann JA. The clinical aspects of biclonal gammopathies. Review of 57 cases. Am. J. Med., 71, 6, 999 - 1008 (1981).
12. Landers JP. Clinical Capillary Electrophoresis. Clin. Chem., 41, 495 - 509 (1995).
13. Le Bricon T. 2002. Identification et dosage des proteines urinaires au laboratoire d’analyses. Ann. Biol. Clin., 60 : 525-540.
14. Le Carrer D. 1990. Protéinuries : Mise au point sur leur exploration biologique en 1990. L’Eurobiologiste, 190 : 395-405.
15. Le Carrer D, Nicolas A, Ducasse L. 1992. L’analyse des protéinuries au laboratoire de biologie en 1992. Revue française des laboratoires, 225 :
41-47.
16. Le Carrer D, Chopin N. 1994. Profil protéique urinaire : Proposition d’un protocole d’exploration biologique des protéinuries. Revue française des
laboratoires, 269 : 29-37.
17. Philipon C. 1989. Protéines urinaires : Intérêt clinique et interprétation. Technique et Biologie, 6 : 239-249.
18. Oda RP et al. Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids. Electrophoresis, 18, 1715 - 1723
(1997).
19. Waller KV, Ward KM, Mahan JD, Wismatt DK. 1989. Current concepts in proteinuria. Clin. Chem., 35 : 755-765.
20. Westermeier R., "Electrophoresis in Practice. A Guide to Theory and Practice", VCH Publishers, New York, NY, 1993.
21. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.
Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93 - 97.
- 359 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
PHOTO
INSERTION DU SUPPORT SUR LE CARROUSEL - INSERTION OF THE RACK IN THE ROTATING SAMPLER
- 360 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES DE SÉRUMS - ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES
Sérum Normal / Normal serum
Figure 1
ELP
Ig G
Ig A
Ig M
L
K
- 361 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES DE SÉRUMS - ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES
Sérum Hypergamma / Hypergamma serum
Figure 2
Immun complexe
Immune complex
ELP
Ig G
Ig A
Ig M
Immun complexe
Immune complex
Immun complexe
Immune complex
K
L
- 362 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES DE SÉRUMS - ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES
Figure 3
Protéine monoclonale 0,5 g/L / Monoclonal component 0.5 g/L
Paraprotéine éliminée / Decreased paraprotein
Paraprotéine non affectée / Not affected paraprotein
Ig G
ELP
Ig A
Ig M
K
L
Interpretation : Ig G, Lambda
- 363 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES DE SÉRUMS - ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES
Figure 4
Ig G, Kappa - mode de dilution Hypergamma / Hypergamma dilution program
Paraprotéine éliminée / Decreased paraprotein
Paraprotéine non affectée / Not affected paraprotein
ELP
Ig G
Ig A
Ig M
K
L
Interpretation : Ig G, Kappa
- 364 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES DE SÉRUMS - ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES
Figure 5
Profil biclonal / Biclonal pattern : Ig G, Kappa + Ig M, Kappa
Paraprotéine éliminée / Decreased paraprotein
Paraprotéine non affectée / Not affected paraprotein
ELP
Ig G
Ig A
Ig M
K
L
Interpretation : Ig G, Kappa + Ig M, Kappa
- 365 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES DE SÉRUMS - ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES
Figure 6
Profil biclonal / Biclonal pattern : Ig G, Kappa + Ig G, Lambda
Paraprotéine éliminée / Decreased paraprotein
Paraprotéine non affectée / Not affected paraprotein
ELP
Ig G
Ig A
Ig M
K
L
Interpretation : Ig G, Kappa + Ig G, Lambda
- 366 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES DE SÉRUMS - ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES
Profil oligoclonal / Oligoclonal pattern
Figure 7
ELP
Ig G
Ig A
Ig M
K
L
- 367 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES D'URINES - ELECTROPHORETIC PATTERNS OF URINE SAMPLES
Figure 8
Proteine monoclonale / Monoclonal component – mode de dilution Hypogamma / Hypogamma dilution program
Albumin(e)
Paraprotéine éliminée / Decreased paraprotein
Paraprotéine non affectée / Not affected paraprotein
Alpha 1
Alpha 2
Beta
Albumin(e)
Gamma
Alpha 1
Alpha 1
Alpha 2
Beta
Albumin(e)
Gamma
Alpha 1
Alpha 1
Alpha 2
K
Interpretation :
Gamma
Alpha 2
Beta
Gamma
Beta
Gamma
Ig M
Ig A
Albumin(e)
Beta
Ig G
ELP
Albumin(e)
Alpha 2
Beta
Albumin(e)
Gamma
Alpha 1
Alpha 2
L
Suspicion de chaîne légère libre Kappa (à confirmer)
Kappa free light chain suspected (to confirm)
- 368 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES D'URINES - ELECTROPHORETIC PATTERNS OF URINE SAMPLES
Figure 9
Proteine monoclonale / Monoclonal component – mode de dilution Hypergamma / Hypergamma dilution program
Albumin(e)
Paraprotéine éliminée / Decreased paraprotein
Paraprotéine non affectée / Not affected paraprotein
Alpha 1
Alpha 2
Beta
Albumin(e)
Gamma
Alpha 1
Alpha 1
Alpha 2
Beta
Albumin(e)
Gamma
Alpha 1
Alpha 1
Alpha 2
K
Interpretation :
Gamma
Alpha 2
Beta
Gamma
Beta
Gamma
Ig M
Ig A
Albumin(e)
Beta
Ig G
ELP
Albumin(e)
Alpha 2
Beta
Gamma
Albumin(e)
Alpha 1
Alpha 2
L
Suspicion de chaîne légère libre Lambda (à confirmer)
Lambda free light chain suspected (to confirm)
- 369 -
MINICAP IMMUNOTYPING - 2014/10
SCHÉMAS / FIGURES
PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES D'URINES - ELECTROPHORETIC PATTERNS OF URINE SAMPLES
Profil biclonal / Biclonal pattern – mode de dilution Hypogamma / Hypogamma dilution program
Figure 10
Paraprotéine éliminée / Decreased paraprotein
Paraprotéine non affectée / Not affected paraprotein
Albumin(e)
Alpha 1
Alpha 2
Beta
Albumin(e)
Gamma
Alpha 1
Alpha 1
Alpha 2
Beta
Albumin(e)
Gamma
Alpha 1
Alpha 1
Alpha 2
Gamma
Alpha 2
Beta
Gamma
Beta
Gamma
Ig M
Ig A
Albumin(e)
Beta
Ig G
ELP
Albumin(e)
Alpha 2
Beta
Albumin(e)
Gamma
K
Alpha 1
Alpha 2
L
Interpretation : Ig G, Lambda + suspicion de chaîne légère libre Lambda (à confirmer)
Ig G, Lambda + Lambda free light chain suspected (to confirm)
- 370 -

Download Report