ΜΕΡΟΣ III 9 Δομή και λειτουργία των κυττάρων ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 Διαλογή και μεταφορά πρωτεϊνών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 Βιοενεργητική και μεταβολισμός ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 Ο κυτταροσκελετός και η κυτταρική κίνηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13 Η κυτταροπλασματική μεμβράνη ΚΕΦΑΛΑΙΟ 14 υτταρικά τοιχώματα, εξωκυτταρικό στρώμα Κ και αλληλεπιδράσεις των κυττάρων Ο πυρήνας 9 9.1 Ο πυρηνικός φάκελος και η κυκλοφορία μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα 530 9.2 Eσωτερική οργάνωση του πυρήνα 548 9.3 Ο πυρηνίσκος και η επεξεργασία του rRNA 555 ΜΟΡΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ Ασθένειες που συνδέονται με την πυρηνική λάμινα 534 ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣ Η ταυτοποίηση των σημάτων πυρηνικού εντοπισμού 538 Ο πυρήνας Η παρουσία πυρήνα είναι το βασικό γνώρισμα που διαφοροποιεί τα ευκαρυωτικά κύτταρα από τα προκαρυωτικά. Στεγάζοντας το γονιδίωμα του κυττάρου, ο πυρήνας χρησιμεύει τόσο ως χώρος αποθήκευσης της γενετικής πληροφορίας όσο και ως κέντρο ελέγχου για το κύτταρο. Στον πυρήνα γίνεται η αντιγραφή του DNA, η μεταγραφή, καθώς και η ωρίμανση του RNA, ενώ στο κυτταρόπλασμα λαμβάνει χώρα μόνο το τελικό στάδιο της γονιδιακής έκφρασης (η μετάφραση). Ο διαχωρισμός του γονιδιώματος από το κυτταρόπλασμα, ο οποίος γίνεται με τον πυρηνικό φάκελο, επιτρέπει τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω μηχανισμών που συναντώνται αποκλειστικά στους ευκαρυώτες. Ενώ στους προκαρυώτες το mRNA μεταφράζεται όσο η μεταγραφή του βρίσκεται ακόμη σε εξέλιξη, το mRNA των ευκαρυωτών υπόκειται σε αρκετές μορφές μετα-μεταγραφικής επεξεργασίας προτού μεταφερθεί από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Κατά συνέπεια, η παρουσία του πυρήνα επιτρέπει τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω μετα-μεταγραφικών μηχανισμών, όπως είναι το εναλλακτικό μάτισμα. Περιορίζοντας την πρόσβαση επιλεγμένων πρωτεϊνών στο γενετικό υλικό, ο πυρηνικός φάκελος προσφέρει επίσης νέες ευκαιρίες για έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης στο επίπεδο της μεταγραφής. Για παράδειγμα, η έκφραση ορισμένων ευκαρυωτικών γονιδίων ελέγχεται από τη ρυθμιζόμενη μεταφορά μεταγραφικών παραγόντων από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, η οποία είναι μια μορφή μεταγραφικής ρύθμισης που δε διαθέτουν οι προκαρυώτες. Ο διαχωρισμός επομένως της θέσης του γονιδιώματος από τη θέση όπου πραγματοποιείται η μετάφραση του mRNA έχει κεντρικό ρόλο στη γονιδιακή έκφραση των ευκαρυωτών. 530 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 9.1 Ο πυρηνικός φάκελος και η κυκλοφορία μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα Ο πυρηνικός φάκελος διαχωρίζει τα περιεχόμενα του πυρήνα από το κυτταρόπλασμα και συγκροτεί το δομικό πλαίσιο του πυρήνα. Οι δύο μεμβράνες του πυρηνικού φακέλου δρουν ως φραγμοί που εμποδίζουν την ελεύθερη διέλευση μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα, με αποτέλεσμα ο πυρήνας να συνιστά ένα διακριτό βιοχημικό διαμέρισμα. Οι μόνοι δίαυλοι που διαπερνούν τον πυρηνικό φάκελο είναι τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων, τα οποία επιτρέπουν τη ρυθμιζόμενη ανταλλαγή μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Η επιλεκτική διακίνηση πρωτεϊνών και RNA μέσω των πυρηνικών πόρων αφενός καθορίζει την εσωτερική σύσταση του πυρήνα και αφετέρου έχει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης των ευκαρυωτών. Η δομή του πυρηνικού φακέλου Ο πυρηνικός φάκελος (nuclear envelope) έχει πολύπλοκη δομή. Αποτελείται από δύο πυρηνικές μεμβράνες, την πυρηνική λάμινα, η οποία τον επενδύει εσωτερικά, και τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων (Εικόνα 9.1). Ο πυρήνας περιβάλλεται από ένα σύστημα δύο ομόκεντρων μεμβρανών, οι οποίες ονομάζονται εσωτερική και εξωτερική πυρηνική μεμβράνη (nuclear membrane). Η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη αποτελεί συνέχεια του ενδοπλασματικού δικτύου (ER), με συνέπεια ο χώρος ανάμεσα στην εσωτερική και την εξωτερική πυρηνική μεμβράνη να συνδέεται άμεσα με τον αυλό του ενδοπλασματικού δικτύου. Η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη είναι λειτουργικά όμοια με τις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου (βλ. Κεφάλαιο 10) και φέρει ριβοσώματα στην κυτταροπλασματική της επιφάνεια, διαφέρει όμως σε μικρό βαθμό ως προς την πρωτεϊνική της σύσταση, καθώς είναι πλούσια σε μεμβρανικές πρωτεΐνες που προσδένονται στον κυτταροσκελετό και δε διαθέτει τις πρωτεΐνες που προσδίδουν στο ER τη σωληνοειδή του οργάνωση. Αντίθετα, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη φέρει πρωτεΐνες που συναντώνται αποκλειστικά στον πυρήνα, όπως είναι οι πρωτεΐνες που προσδένονται στην πυρηνική λάμινα (οι οποίες θα συζητηθούν παρακάτω). Η λειτουργία των πυρηνικών μεμβρανών είναι ζωτικής σημασίας, καθώς δρουν ως ένας φραγμός που διαχωρίζει τα περιεχόμενα του πυρήνα από το κυτταρόπλασμα. Όπως και οι άλλες μεμβράνες του κυττάρου, κάθε πυρηνική μεμβράνη είναι μια φωσφολιπιδική δι- Ο πυρήνας (A) 531 (Β) Ενδοπλασματικό δίκτυο Σύμπλοκο πυρηνικού πόρου Εξωτερική μεμβράνη Χρωματίνη Πυρηνίσκοσ Εσωτερική μεμβράνη 0,2 μm Εξωτερική μεμβράνη Περιπυρηνικόσ χώροσ Εσωτερική μεμβράνη Λείο ενδοπλασματικό δίκτυο (Γ) Ριβοσώματα Σύμπλοκο πυρηνικού πόρου Πυρηνική λάμινα ΕΙΚΟΝΑ 9.1 Ο πυρηνικός φάκελος. (Α) Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που5e,δείχνει έναν πυρήνα. Η εσωτερική και η εξωτερική πυCooper Cell Biology Sinauer/ASM Figure 9.01 #0801 ενώνονται στα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων (βέλη). ρηνική μεμβράνη (Β) Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει τη συνέχεια της εξωτερικής πυρηνικής μεμβράνης με το ενδοπλασματικό δίκτυο. (Γ) Σχηματική αναπαράσταση του πυρηνικού φακέλου. Η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη επενδύεται από την πυρηνική λάμινα, η οποία χρησιμεύει ως θέση προσάρτησης της χρωματίνης. (A, David M. Phillips/Photo Researchers, Inc. B, ευγενική προσφορά του Dr. Werner W. Franke, German Cancer Research Center, Heidelberg/Γερμανικό Κέντρο Αντικαρκινικής Έρευνας, Χαϊδελβέργη.) Πυρηνίσκοσ Χρωματίνη Αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο 532 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΕΙΚΟΝΑ 9.2 Φωτογραφία ηλε κτρονικού μικροσκοπίου που δεί χνει πυρηνικούς πόρους. Σε αυτό το παρασκεύασμα πυρηνικού φακέλου που έχει υποστεί τεμαχισμό υπό ψύξη διακρίνονται πολλοί πυρηνικοί πόροι (βέλη). (Don W. Fawcett/Photo Researchers, Inc.) 0,5 μm Τα ερυθροκύτταρα (ή ερυθρά αιμοσφαίρια) των θηλαστικών δε διαθέτουν πυρήνα. Ο πυρή νας αποβάλλεται από το κύττα ρο κατά την ανάπτυξη των ερυ θροκυττάρων από τα πρόδρομά τους κύτταρα. »» Cooper Cell Biology, Sinauer/ASM Figure 9.02 #15 ΕΙΚΟΝΑ 9.3 Φωτογραφία ηλε κτρονικού μικροσκοπίου που δεί χνει την πυρηνική λάμινα. Η λάμινα είναι ένα δίκτυο ινιδίων που βρίσκεται κάτω από την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη και εκτείνεται στο εσωτερικό του πυρήνα. (Από τη δημοσίευση των U. Aebi, J. Cohn, L. Buhle και L. Gerace, 1986. Nature 323: 560.) πλοστιβάδα διαπερατή μόνο από μικρά μη πολικά μόρια (βλ. Εικόνα 2.27). Άλλα μόρια δεν μπορούν να διαπεράσουν τη διπλοστιβάδα με διάχυση. Η εσωτερική και η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη ενώνονται στα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων, που είναι οι μοναδικοί δίαυλοι μέσω των οποίων μπορούν να διαπεράσουν τον πυρηνικό φάκελο μικρά πολικά μόρια και μακρομόρια (Εικόνα 9.2). Όπως θα συζητηθεί στη συνέχεια, το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου είναι μια πολύπλοκη δομή που ευθύνεται για την επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών και RNA ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Η πυρηνοπλασματική επιφάνεια της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης επενδύεται από την πυρηνική λάμινα (nuclear lamina), ένα ινώδες δίχτυ που παρέχει στον πυρήνα δομική στήριξη (Εικόνα 9.3). 0,5 μm Ο πυρήνας Η πυρηνική λάμινα αποτελείται από ινώδεις πρωτεΐνες μοριακής μάζας 60 έως 80 kDa που ονομάζονται λαμίνες (lamins), καθώς και από τις πρωτεΐνες που συνδέονται με αυτές. Τα φυτικά κύτταρα έχουν ένα παρόμοιο ινώδες δίκτυο, το οποίο αποτελείται από πρωτεΐνες που δε συγγενεύουν με τις λαμίνες. Οι λαμίνες είναι μια κατηγορία πρωτεϊνών των ενδιάμεσων ινιδίων. Οι άλλες κατηγορίες πρωτεϊνών των ενδιάμεσων ινιδίων συναντώνται στον κυτταροσκελετό (βλ. Κεφάλαιο 12). Τα κύτταρα των θηλαστικών διαθέτουν τρία γονίδια για τις λαμίνες, τα Α, Β και C, τα οποία κωδικοποιούν τουλάχιστον επτά διακριτές πρωτεΐνες. Οι λαμίνες, όπως και άλλες πρωτεΐνες των ενδιάμεσων ινιδίων, συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας δομές με υψηλότερο βαθμό οργάνωσης (Εικόνα 9.4), αν και θεωρείται ότι η σύνδεση των λαμινών διαφέρει σε έκταση και πολικότητα από αυτήν που συναντάται σε άλλα ενδιάμεσα ινίδια. Το πρώτο στάδιο σύνδεσης των λαμινών είναι η αλληλεπίδραση δύο λαμινών που οδηγεί στον σχηματισμό ενός διμερούς. Στο διμερές αυτό, οι περιοχές α-έλικας των δύο πολυπεπτιδικών αλυσίδων τυλίγονται η μία γύρω από την άλλη σχηματίζοντας μια δομή που ονομάζεται σπειρωμένο σπείραμα (coiled coil). Στη συνέχεια, τα διμερή λαμίνης συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας την πυρηνική λάμινα. Η σύνδεση των λαμινών με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη διευκολύνεται από τη μετα-μεταφραστική προσθήκη λιπιδίων – συγκεκριμένα, από την πρενυλίωση των καρβοξυτελικών καταλοίπων κυστεΐνης (βλ. Εικόνα 8.34). Επιπλέον, οι λαμίνες προσδένονται σε ειδικές πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, όπως είναι η εμερίνη και ο υποδοχέας της λαμίνης Β, μεσολαβώντας στην Πολυπεπτίδιο λαμίνησ ΕΙΚΟΝΑ 9.4 Μοντέλο συναρμο λόγησης των λαμινών. Τα πολυπεπτίδια λαμίνης σχηματίζουν διμερή στα οποία οι κεντρικές περιοχές α-έλικας δύο πολυπεπτιδικών αλυσίδων τυλίγονται η μία γύρω από την άλλη. Στην περαιτέρω συναρμολόγηση μπορεί να συνεισφέρουν η κατά σειρά σύνδεση των διμερών, με την οποία σχηματίζονται γραμμικά πολυμερή, και η πλευρική σύνδεση των πολυμερών, με την οποία σχηματίζονται δομές υψηλότερης οργάνωσης. Διμερέσ Κατά σειρά σύνδεση των διμερών Πολυμερέσ Πλευρική σύνδεση των πολυμερών Δομή υψηλότερησ οργάνωσησ 533 534 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΜΟΡΙΑΚ Η ΙΑΤΡΙΚ Η Ασθένειες που συνδέονται με την πυρηνική λάμινα Οι ασθένειες Το 1966, οι Alan Emery και Fritz E. Dreifuss περιέγραψαν μια νέα μορφή μυϊκής δυστροφίας που συνδέεται με το χρωμόσωμα Χ. Κατά τα πρώτα στάδια της ασθένειας εμφανίζεται ακαμψία στους αγκώνες, στον λαιμό και στις φτέρνες των ασθενών και συχνά υπάρχει αποκλεισμός αγωγής στην καρδιά. Τα συμπτώματα αυτά παρατηρούνται μέχρι την ηλικία των δέκα ετών και συμπεριλαμβάνουν «ακροποδητί βάδιση» λόγω ακαμψίας του αχίλλειου τένοντα στις φτέρνες και δυσκολία κάμψης των αγκώνων. Από την ηλικία των 20 ετών οι ασθενείς αναπτύσσουν καρδιακά προβλήματα και πολλές φορές κρίνεται απαραίτητη η χρήση βηματοδότη. Παρουσιάζεται σταδιακός εκφυλισμός και εξασθένηση των μυών του ώμου και του βραχίονα, καθώς και των μυών της κνήμης, κάτι που όμως συμβαίνει με αργό ρυθμό και συχνά δεν αποτελεί πρόβλημα προτού το άτομο φτάσει σε προχωρημένη ηλικία. Σχεδόν 30 χρόνια μετά την αρχική περιγραφή της ασθένειας διαπιστώθηκε ερευνητικά ότι η φυλοσύνδετη μυϊκή δυστροφία Emery-Dreifuss οφειλόταν σε μεταλλαγές μιας άγνωστης μέχρι τότε διαμεμβρανικής πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη αυτή ονομάστηκε εμερίνη, προς τιμήν του Alan Emery. Σύντομα, αρκετές ερευνητικές ομάδες ανακάλυψαν ότι η εμερίνη είναι μια πρωτεΐνη που εντοπίζεται στην εσωτερική (A) πυρηνική μεμβράνη και απουσιάζει από τους ασθενείς που πάσχουν από τη φυλοσύνδετη μυϊκή δυστροφία Emery-Dreifuss. Το εύρημα αυτό ήταν απροσδόκητο, καθώς φαινόταν ότι μεταλλαγές μιας πρωτεΐνης του πυρηνικού φακέλου η οποία εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα προκαλούν μια ιστοειδική ασθένεια. Αν και η πρωτεΐνη απουσίαζε από όλα τα κύτταρα του σώματος των ασθενών, η παθολογία εκδηλωνόταν μόνο στον μυϊκό ιστό. Στη συνέχεια, άλλοι ερευνητές αποκάλυψαν ότι η ίδια μορφή δυστροφίας μπορεί να κληρονομηθεί επίσης με μη φυλοσύνδετο τρόπο. Οι οικογένειες στις οποίες εμφανιζόταν η μη φυλοσύνδετη μορφή της μυϊκής δυστροφίας Emery-Dreifuss έφεραν μεταλλαγές στο γονίδιο LMNA, το γονίδιο που κωδικοποιεί τις πυρηνικές λαμίνες Α και C. Μεταλλαγές επομένως σε δύο διαφορετικά γονίδια –το γονίδιο μιας πρωτεΐνης της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης και το γονίδιο μιας από τις κυριότερες πυρηνικές λαμίνες– προκαλούν μυϊκή δυστροφία με την ίδια κλινική εικόνα. Ακόμη μεγαλύτερη έκπληξη προκάλεσε το γεγονός ότι άλλες, παράλληλες μελέτες συνέδεσαν διαφορετικές μεταλλαγές του γονιδίου LMNA με διαφορετικές ασθένειες: τη μερική λιποδυστροφία τύπου Dunnigan, τη διαταραχή Charcot-Marie-Tooth τύπου 2Β1 και το σύνδρομο προγηρίας Hutchinson-Gilford, μια ασθένεια που προκαλεί πρόωρη γήρανση. Μέχρι πρότινος, οι ιατροί ταξινομούσαν τις ασθένειες αυτές σε διακριτές κατηγορίες, με κριτήριο τα κλινικά χαρακτηριστικά και τον τρόπο κληρονόμησής τους. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν εξάλλου ότι οι μεταλλαγές μιας άλλης πρωτεΐνης της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, του υποδοχέα της λαμίνης Β, αποτελούν τη βάση της διαταραχής Pelger-Huët. Μοριακή και κυτταρική βάση Οι περισσότεροι βιολόγοι θεώρησαν ότι οι μεταλλαγές των λαμινών θα προκαλούσαν γενικευμένα ελαττώματα στην αρχιτεκτονική του πυρήνα και σοβαρά προβλήματα στα ταχέως διαιρούμενα κύτταρα. Ωστόσο, η δομή του πυρήνα των κυττάρων των ασθενών δεν εμφανίζει παρά ελάχιστες αποκλίσεις από το φυσιολογικό. Το ερώτημα λοιπόν είναι με ποιον τρόπο οι μεταλλαγές των πυρηνικών λαμινών ή των πρωτεϊνών που προσδένονται σε αυτές προκαλούν διαφορετικές ιστοειδικές ασθένειες. Η απάντηση δεν είναι ακόμη γνωστή, όμως δύο είναι οι επικρατέστερες υποθέσεις. Η πρώτη είναι η υπόθεση της «γονιδιακής έκφρασης». Σύμφωνα με αυτήν, η ενδεδειγμένη αλληλεπίδραση των δύο λαμινών, Α και C, με τον πυρηνικό φάκελο είναι απαραίτητη για την κανονική ιστοειδική έκφραση ορισμένων γονιδίων. Μεταγραφικώς ανενεργά γονίδια εντοπίζο- (B) DNA Εξόνιο Έλλειμμα 150 νουκλεοτιδίων Ιντρόνιο 5’ 3’ 1 2 3 4 5 6 7 89 10 11 12 3’ 5’ Λαμίνη A (Α) Παιδί που πάσχει από προγηρία Hutchinson-Gilford. (B) Διάγραμμα της δομής ιντρο νίων-εξονίων του γονιδίου LMNA και της πρωτεΐνης της λαμίνης Α. Οι σφαιρικές επικράτειες υποδεικνύονται με κόκκινο χρώμα και οι ραβδοειδείς επικράτειες με κίτρινο. Στο μεταλλαγμένο γονίδιο που φαίνεται στο διάγραμμα υπάρχει μια έλλειψη 150 bp (μαύρο χρώμα) στο εξόνιο 11. (Α, ευγενική προσφορά της Maggie Bartlett, NHGRI.) Cooper Cell Biology 5e, Sinauer/ASM MM chap 09 03/01/06 Ο πυρήνας 535 ΜΟΡΙΑΚ Η ΙΑΤΡΙΚ Η νται κατά προτίμηση στην περιφέρεια του πυρήνα, ενώ γονίδια που εκφράζονται συγκεντρώνονται στο κέντρο του πυρήνα, με πρότυπο κατανομής που εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Επομένως, η βάση των παραπάνω ασθενειών θα μπορούσε να είναι μια αλλαγή στη γονιδιακή έκφραση λόγω ελαττωματικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών. Σύμφωνα με μια δεύτερη υπόθεση, την υπόθεση του «μηχανικού στρες», οι μεταλλαγές του πυρηνικού συμπλόκου λαμινών-εμερίνης θεωρείται ότι εξασθενούν τη δομική ακεραιότητα ενός ενιαίου κυτταροσκελετικού δικτύου. Σε όλα τα κύτταρα, η λάμινα, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη και τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων είναι στενά συνδεδεμένα μεταξύ τους. Σύμφωνα με την υπόθεση του «μηχανικού στρες», η λάμινα θα μπορούσε, μέσω ινιδίων που προσδένονται στο σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου, να συνδέεται έμμεσα με τον κυτταροσκελετό των μυϊκών κυττάρων. Μια τέτοια ερμηνεία αρμόζει περισσότερο στην περίπτωση των μυϊκών δυστροφιών. Πρόληψη και θεραπεία Η ανακάλυψη ότι μεταλλαγές σε κοινά εκφραζόμενες πρωτεΐνες του συμπλέγματος της πυρηνικής λάμινας προκαλούν διαφορετικές κληρονομούμενες ιστοειδικές ασθένειες προκάλεσε μεγάλη έκπληξη στους επιστήμονες και άλλαξε τον γενικό τρόπο θεώρησης των πυρηνικών λαμινών. Περαιτέρω ερευνητικές προσπάθειες απαιτούνται για να κατανοηθεί κατά πόσο η κλινική εικόνα για καθεμία από αυτές τις ασθένειες βασίζεται σε μειωμένη μηχανική σταθερότητα του πυρηνικού φακέλου ή σε απορρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, η γνώση της μοριακής φύσης των ασθενειών απλοποιεί σημαντικά τη διάγνωσή τους και καθιστά πιθανή την εύρεση της κατάλληλης θεραπευτικής αντιμετώπισης. Ένα πρώτο βήμα προς αυτήν την κατεύθυνση αποτελεί η πρόσφατη ανάπτυξη ενός πειραματικού μοντέλου ποντικιού που φέρει χρωμοσωμική απαλοιφή του γονιδίου LMNA (knock out). Συμπτώματα μυϊκής δυστροφίας Emery-Dreifuss εμφανίζονται στα ποντίκια αυτά κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Τέλος, οι ερευνητές γνωρίζουν πλέον ότι στις «λαμινοπάθειες» του πυρήνα είναι πιθανόν να συμπεριλαμβάνονται αρκετές συγγενείς ασθένειες βραδείας ανάπτυξης. Βιβλιογραφικές αναφορές De Sandre-Giovannoli, A., M. Chaouch, S. Kozlov, J. M. Vallat, M. Tazir, N. Kassouri, P. Szepetowski, T. Hammadouche, A. Vandenberghe, C. L. Stewart, D. Grid and N. Levy. 2002. Homozygous defects in LMNA, encoding lamin A/C nuclear-envelope proteins, cause autosomal recessive axonal neuropathy in human (Charcot-MarieTooth disorder type 2) and mouse. Am. J. Hum. Genet. 70: 726-736. Gruenbaum, Y., A. Margalit, R. D. Goldman, D. K. Shumaker and K. L. Wilson. 2005. The nuclear lamina comes of age. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6: 21-31. πρόσδεσή τους στον πυρηνικό φάκελο και συμβάλλοντας στην τοποθέτηση και στην οργάνωσή τους μέσα στον πυρήνα (Εικόνα 9.5). Η πυρηνική λάμινα προσδένεται επίσης στη χρωματίνη μέσω Σύμπλοκο πυρηνικού πόρου Ριβοσώματα LBR Εξωτερική πυρηνική μεμβράνη Εσωτερική πυρηνική μεμβράνη Εμερίνη Λάμινα Πρωτεΐνεσ που συνδέονται με λαμίνεσ Χρωματίνη ΕΙΚΟΝΑ 9.5 Η πυρηνική λάμινα. Η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη περιέχει αρκετές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, όπως είναι η εμερίνη και ο υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR, Lamin B Receptor), που αλληλεπιδρούν με τις λαμίνες του πυρήνα. Οι λαμίνες και οι πρωτεΐνες που συνδέονται με αυτές αλληλεπιδρούν επίσης με τη χρωματίνη. 536 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 των ιστονών Η2Α και Η2Β, καθώς και μέσω άλλων πρωτεϊνών της χρωματίνης. Αν και η πυρηνική λάμινα προσδένεται άμεσα στο DNA, δεν έχει διευκρινιστεί κατά πόσο αυτή η αλληλεπίδραση είναι σημαντική για το κύτταρο. Επιπρόσθετα, οι λαμίνες σχηματίζουν ένα χαλαρό δίχτυ που εκτείνεται σε ολόκληρο το εσωτερικό του πυρήνα. Είναι γνωστό ότι στις λαμίνες προσδένονται πολλές πυρηνικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη σύνθεση του DNA, στη μεταγραφή ή στην τροποποίηση της χρωματίνης, παρόλο που η σημασία αυτών των αλληλεπιδράσεων μόλις έχει αρχίσει να κατανοείται. Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου Παθητική διάχυση Ενεργόσ μεταφορά Πρωτεΐνεσ Πυρήνασ E Μικρά μόρια E RNA ΕΙΚΟΝΑ 9.6 Κυκλοφορία μορίων μέσω των συμπλόκων των πυρηνι Cooper Cell Biology 5e, Sinauer/ASM κών Τα μικρά μόρια μπορούν Figureπόρων. 09.06 #0910 03/02/06 να διέλθουν ταχύτατα, με παθητική διάχυση, από ανοικτούς διαύλους του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Αντίθετα, τα μακρομόρια (πρωτεΐνες και RNA) μεταφέρονται με έναν επιλεκτικό μηχανισμό που απαιτεί κατανάλωση ενέργειας. Τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων (nuclear pore complexes) είναι οι μόνοι δίαυλοι που επιτρέπουν τη μεταφορά μικρών πολικών μορίων, ιόντων και μακρομορίων (πρωτεϊνών και RNA) ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Πρόκειται για εξαιρετικά ευμεγέθεις δομές με διάμετρο περίπου 120 nm και εκτιμώμενη μοριακή μάζα περίπου 125 εκατομμύρια Da, δηλαδή μέγεθος 30 φορές μεγαλύτερο από το μέγεθος ενός ριβοσώματος. Στα σπονδυλωτά, το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου αποτελείται από περίπου 30 διαφορετικές πρωτεΐνες (που ονομάζονται νουκλεοπορίνες), οι περισσότερες από τις οποίες είναι παρούσες σε πολυάριθμα αντίγραφα. Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου έχει θεμελιώδη ρόλο στη φυσιολογία όλων των ευκαρυωτικών κυττάρων, καθώς ελέγχει τη διακίνηση μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Τα μόρια RNA που συντίθενται στον πυρήνα θα πρέπει να εξαχθούν στο κυτταρόπλασμα, προκειμένου να λάβουν μέρος στην πρωτεϊνοσύνθεση. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες που απαιτούνται για τη λειτουργία του πυρήνα (π.χ. μεταγραφικοί παράγοντες) θα πρέπει να μεταφερθούν από το κυτταρόπλασμα, όπου γίνεται η σύνθεσή τους, στον πυρήνα. Επιπρόσθετα, πολλές πρωτεΐνες μετακινούνται συνεχώς (shuttle) ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Η μεταφορά μορίων μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου μπορεί να γίνει με δύο διαφορετικούς μηχανισμούς, ανάλογα με το μέγεθος των μορίων (Εικόνα 9.6). Τα μικρά μόρια και μερικές πρωτεΐνες μοριακής μάζας μικρότερης των 20-40 kDa διέρχονται ελεύθερα από τον πόρο προς οποιαδήποτε από τις δύο κατευθύνσεις: από το κυτταρόπλασμα προς τον πυρήνα ή από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα. Αυτά τα μόρια περνούν με παθητική διάχυση από το υδατικό μέσο ανοικτών διαύλων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου, που εκτιμάται ότι έχουν διάμετρο περίπου 9 nm. Ωστόσο, οι περισσότερες πρωτεΐνες και τα περισσότερα μόρια RNA Ο πυρήνας δεν μπορούν να περάσουν από αυτούς τους ανοικτούς διαύλους. Τα μεγαλύτερα αυτά μακρομόρια περνούν από τον κεντρικό δίαυλο του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου, που έχει διάμετρο περίπου 10-40 nm, με μια ενεργή διεργασία κατά την οποία κατάλληλες πρωτεΐνες και RNA αναγνωρίζονται και μεταφέρονται επιλεκτικά προς μία συγκεκριμένη κατεύθυνση (είτε από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα είτε από το κυτταρόπλασμα προς τον πυρήνα). Η απεικόνιση των συμπλόκων των πυρηνικών πόρων με ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκαλύπτει μια δομή με οκταπλή συμμετρία, οργανωμένη γύρω από έναν μεγάλο κεντρικό δίαυλο (Εικόνα 9.7). Ο κεντρικός αυτός δίαυλος αποτελεί την οδό μέσω της οποίας διασχίζουν τον πυρηνικό φάκελο οι πρωτεΐνες και τα RNA. Λεπτομερείς δομικές μελέτες, όπως η ανάλυση εικόνας βάσει υπολογιστή, έχουν οδηγήσει στην ανάπτυξη τρισδιάστατων δομικών μοντέλων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου (Εικόνα 9.8). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου αποτελείται από οκτώ ακτίνες διατεταγμένες γύρω από έναν κεντρικό δίαυλο. Οι οκτώ ακτίνες συνδέονται με δακτυλίους στην πυρηνική και στην κυτταροπλασματική επιφάνεια, συγκροτώντας μια δομή που βρίσκεται αγκυροβολημένη στο εσωτερικό του πυρηνικού φακέλου σε 0,2 μm ΕΙΚΟΝΑ 9.7 Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει σύμπλοκα πυρηνικών πόρων. Στην κάτοψη αυτή διακρίνονται μεμονωμένα σύμπλοκα πυρηνικών πόρων, τα οποία αποτελούνται από οκτώ δομικές υπομονάδες που περιβάλλουν έναν κεντρικό δίαυλο. (Ευγενική προσφορά του Dr. Ron Milligan, The Scripps Research Institute.) 537 538 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣ Η ταυτοποίηση των σημάτων πυρηνικού εντοπισμού A Short Amino Acid Sequence Able to Specify Nuclear Location Daniel Kalderon, Bruce L. Roberts, William D. Richardson, and Alan E. Smith National Institute for Medical Research, Mill Hill, London Cell, Volume 39, 1984, pages 499-509 Το ευρύτερο πλαίσιο Η διατήρηση του πυρήνα ως διακριτού βιοχημικού διαμερίσματος απαιτεί έναν μηχανισμό διαχωρισμού μεταξύ πρωτεϊνών του πυρήνα και πρωτεϊνών του κυτταροπλάσματος. Μελέτες κατά τη δεκαετία του 1970 είχαν δείξει ότι μικρά μόρια διαχέονται ταχύτατα μέσω του πυρηνικού φακέλου, αλλά οι περισσότερες πρωτεΐνες δεν μπορούν να διέλθουν με αυτόν τον τρόπο. Κατά συνέπεια, φαινόταν πιθανό ότι οι πυρηνικές πρωτεΐνες αναγνωρίζονται με κάποιον ειδικό τρόπο από τις θέσεις σύνθεσής τους στα ριβοσώματα του κυτταροπλάσματος και μεταφέρονται επιλεκτικά στον πυρήνα. Προηγούμενα πειράματα του Günter Blobel και των συνεργατών του είχαν αποδείξει ότι η στόχευση πρωτεϊνών στο ενδοπλασματικό δίκτυο γίνεται μέσω σηματοδοτικών αλληλουχιών μικρού μήκους (βλ. Κεφάλαιο 10). Στην εργασία του 1984, ο Alan Smith και οι συνεργάτες του διεύρυναν αυτή τη θεώρηση στη στόχευση των (A) πυρηνικών πρωτεϊνών, καθώς ταυτοποίησαν μια μικρή αλληλουχία αμινοξέων που λειτουργεί ως σήμα πυρηνικού εντοπισμού. Τα πειράματα Για τις μελέτες πυρηνικού εντοπισμού σε ζωικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο μια ιική πρωτεΐνη, το αντιγόνο Τ του ιού SV40. Το αντιγόνο Τ είναι μια πρωτεΐνη 94 kDa απαραίτητη για την αντιγραφή του DNA του ιού SV40 και κανονικά εντοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων που έχουν μολυνθεί από τον ιό. Προηγούμενες μελέτες τόσο στο εργαστήριο του Alan Smith όσο και στο εργαστήριο της Janet Butel (Landford and Butel, 1984, Cell 37: 801-813) είχαν δείξει ότι μεταλλαγή του καταλοίπου Lys-128 είτε προς Thr είτε προς Asn εμπόδιζε τη συσσώρευση του αντιγόνου Τ στον πυρήνα τόσο κυττάρων πιθήκου όσο και κυττάρων τρωκτικών. Τα μεταλλαγμένα μόρια αντιγόνου Τ δεν μπορούσαν να μεταφερθούν στον πυρήνα, αλλά πα(B) Πλασμιδιακά DNA που κωδικοποιούν για χιμαιρικές πρωτεΐνες οι οποίες φέρουν αλληλουχίες του SV40 σε σύντηξη με την κινάση του πυροσταφυλικού εισήχθησαν σε κύτταρα με μικροένεση. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε ο κυτταρικός εντοπισμός των υβριδικών πρωτεϊνών μέσω μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού. (Α) Η υβριδική πρωτεΐνη περιέχει ένα ακέραιο σήμα πυρηνικού εντοπισμού του ιού SV40 (αλληλουχία 126-132). (Β) Το σήμα πυρηνικού εντοπισμού έχει απενεργοποιηθεί με απαλοιφή των καταλοίπων των αμινοξέων 131 και 132. Alan Smith ρέμεναν στο κυτταρόπλασμα, γεγονός που υποδεικνύει ότι η Lys-128 αποτελεί τμήμα ενός σήματος πυρηνικού εντοπισμού. Ο Smith και οι συνεργάτες του έλεγξαν αυτή την υπόθεση εφαρμόζοντας δύο διαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις. Καταρχήν, προσδιόρισαν την επίδραση διαφόρων ελλειμμάτων στον υποκυτταρικό εντοπισμό του αντιγόνου Τ και έδειξαν ότι μεταλλαγμένα αντιγόνα Τ με απαλοιφή αμινοξέων είτε μεταξύ των καταλοίπων 1 και 126 είτε μεταξύ του καταλοίπου 136 και του καρβοξυτελικού άκρου συσσωρεύονταν κανονικά στον πυρήνα, ενώ ένα μετάλλαγμα με απαλοιφή των καταλοίπων των αμινοξέων 127-132 παρέμενε στο κυτταρόπλασμα. Κατά συνέπεια, υπεύθυνη για τον πυρηνικό εντοπισμό του αντιγόνου Τ φαινόταν να είναι η αλληλουχία των καταλοίπων 127-132. Για να προσδιορίσουν αν αυτή η αλληλουχία ήταν ικανή να υπαγορεύσει τη στόχευση άλλων πρωτεϊνών στον πυρήνα, οι ερευνητές κατασκεύασαν χιμαιρικά μόρια ενώνοντας την αλληλουχία 126-132 του αντιγόνου Τ με πρωτεΐνες που υπό κανονικές συνθήκες εντοπίζονταν στο κυτταρόπλασμα. Τα πειράματα αυτά απέδειξαν ότι η προσθήκη της αλληλουχίας 126-132 του αντιγόνου Τ είτε στη β-γαλακτοζιδάση είτε στην κινάση του πυροσταφυλικού αρκεί για να οδηγήσει σε συσσώρευση αυτών των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών στον πυρήνα (βλ. εικόνα). Επομένως, αυτή η μικρή αλληλουχία αμινοξέων του αντιγόνου Τ του ιού SV40 λειτουργεί ως σήμα πυρηνικού εντοπισμού, δηλαδή Ο πυρήνας 539 ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣ είναι μια αλληλουχία αναγκαία και ικανή για τη στόχευση των πρωτεϊνών για εισαγωγή στον πυρήνα. Ο αντίκτυπος Ο Smith και οι συνεργάτες του στην εργασία που δημοσίευσαν το 1984 διατύπωσαν την άποψη ότι το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ του ιού SV40 «αντιπροσωπεύει μια πρότυπη μορφή παρόμοιων αλλη- Κυτταρόπλασμα Κυτταροπλασματικό ινίδιο λουχιών που συναντώνται και σε άλλες πυρηνικές πρωτεΐνες». Αυτά τα σήματα αλληλουχιών υπαγορεύουν τη στόχευση πρωτεϊνών για εισαγωγή στον πυρήνα και κατά συνέπεια έχουν βασικό ρόλο στον καθορισμό της βιοχημικής ταυτότητας του πυρήνα και στη διατήρηση της θεμελιώδους οργάνωσης του ευκαρυωτικού κυττάρου σε διαμέρισμα πυρήνα και διαμέρισμα κυτταροπλάσματος. Τα σήματα πυρη- Κυτταροπλασματικόσ δακτύλιοσ Εξωτερική πυρηνική μεμβράνη Συγκρότημα δακτυλίων-ακτίνων Πυρηνικόσ δακτύλιοσ Κεντρικόσ δίαυλοσ Πυρηνικόσ κάλαθοσ Εσωτερική πυρηνική μεμβράνη Πυρήνασ θέσεις όπου συνενώνονται η εσωτερική και η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη. Ινίδια5e,πρωτεϊνών Cooper Cell Biology Sinauer/ASM εκτείνονται τόσο από τον κυτταροπλαFigure 09.08 #0807 σματικό όσο και από τον πυρηνικό δακτύλιο, σχηματίζοντας μια διακριτή καλαθοειδή δομή στην πλευρά του πυρήνα. Επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών από και προς τον πυρήνα Κάθε λεπτό μεταφέρονται επιλεκτικά μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος αρκετά εκατομμύρια μακρομόρια. Η βάση αυτής της επιλεκτικής κυκλοφορίας μορίων μέσω του πυρηνικού φακέλου νικού εντοπισμού είναι πλέον γνωστό ότι αναγνωρίζονται από κυτταροπλασματικούς υποδοχείς που μεταφέρουν τις πρωτεΐνες-υποστρώματά τους μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Η ταυτοποίηση των σημάτων πυρηνικού εντοπισμού αποτέλεσε λοιπόν ένα βήμα προόδου καθοριστικής σημασίας για την κατανόηση της εισαγωγής πρωτεϊνών στον πυρήνα. ΕΙΚΟΝΑ 9.8 Μοντέλο του συμπλό κου του πυρηνικού πόρου. Το σύμπλοκο αποτελείται από ένα συγκρότημα οκτώ ακτίνων προσδεδεμένων σε δακτυλίους στην κυτταροπλασματική και στην πυρηνική πλευρά του πυρηνικού φακέλου. Το συγκρότημα δακτυλίων-ακτίνων περιβάλλει έναν κεντρικό δίαυλο. Από τον κυτταροπλασματικό δακτύλιο εκτείνονται κυτταροπλασματικά ινίδια, ενώ από τον πυρηνικό δακτύλιο εκτείνονται ινίδια που σχηματίζουν τον πυρηνικό κάλαθο. 540 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Η αντιγραφή πολλών ιών προϋποθέτει την είσοδό τους στον πυρήνα. Αφού μολύνουν το κύτταρο, οι ρετροϊοί, όπως ο ιός HIV, προβαίνουν σε αντί στροφη μεταγραφή του γονιδι ωματικού τους RNA μέσα στο κυτταρόπλασμα, συνθέτοντας έναν προϊό DNA. Ο ιός HIV έχει αναπτύξει ειδικούς μηχανισμούς για τη μεταφορά του προϊικού αυτού DNA στον πυρήνα, όπου μπορεί να γίνει η μεταγραφή του. »» έχει κατανοηθεί καλύτερα για πρωτεΐνες που εισάγονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Τέτοιου είδους πρωτεΐνες καλύπτουν όλες τις πτυχές της δομής και της λειτουργίας του γονιδιώματος και είναι, για παράδειγμα, ιστόνες, DNA πολυμεράσες, RNA πολυμεράσες, μεταγραφικοί παράγοντες, παράγοντες ματίσματος και πολλές άλλες πρωτεΐνες. Η στόχευση αυτών των πρωτεϊνών στον πυρήνα γίνεται μέσω ειδικών αλληλουχιών αμινοξέων που ονομάζονται σήματα πυρηνικού εντοπισμού (NLS, Nuclear Localization Signals), τα οποία αναγνωρίζονται από υποδοχείς πυρηνικής μεταφοράς (nuclear transport receptors) και κατευθύνουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Το πρώτο σήμα πυρηνικού εντοπισμού που έχει χαρτογραφηθεί λεπτομερώς χαρακτηρίστηκε από τον Alan Smith και τους συνεργάτες του το 1984. Αυτοί οι ερευνητές μελέτησαν το αντιγόνο Τ του ιού SV40 (Simian Virus 40) των πιθήκων, μια πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονιδίωμα του ιού SV40 και προωθεί την έναρξη της αντιγραφής του ιικού DNA σε κύτταρα που έχουν μολυνθεί με αυτόν τον ιό (βλ. Κεφάλαιο 6). Όπως αναμενόταν, εφόσον πρόκειται για μια πρωτεΐνη αντιγραφής, η φυσική θέση εντόπισης του αντιγόνου Τ βρέθηκε ότι είναι στον πυρήνα. Ωστόσο, η μεταλλαγή ενός και μόνο καταλοίπου λυσίνης βρέθηκε ότι εμποδίζει την εισαγωγή του αντιγόνου Τ στον πυρήνα και οδηγεί σε συσσώρευσή του στο κυτταρόπλασμα. Αυτή η παρατήρηση, σε συνδυασμό με άλλες μελέτες που ακολούθησαν, οδήγησε στην ταυτοποίηση του σήματος πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ, το οποίο αντιστοιχεί στην αλληλουχία επτά αμινοξέων Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val. Αυτή η αλληλουχία βρέθηκε ότι (α) είναι αναγκαία για τη μεταφορά του αντιγόνου Τ στον πυρήνα και (β) όταν ενσωματώνεται σε άλλες πρωτεΐνες που έχουν ως φυσική θέση εντόπισής τους το κυτταρόπλασμα, είναι ικανή να τις κατευθύνει και να οδηγήσει σε συσσώρευσή τους στον πυρήνα. Σήματα πυρηνικού εντοπισμού έχουν πλέον ταυτοποιηθεί σε πολλές πρωτεΐνες. Ορισμένες από αυτές τις αλληλουχίες-σήματα, όπως είναι η αλληλουχία του αντιγόνου Τ, έχουν μικρή έκταση και είναι πλούσιες σε βασικά αμινοξέα (όπως λυσίνη και αργινίνη). Συχνά όμως τα αμινοξέα που σχηματίζουν το σήμα πυρηνικού εντοπισμού βρίσκονται κοντά το ένα στο άλλο, αλλά δεν είναι διαδοχικά μεταξύ τους. Για παράδειγμα, το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της νουκλεοπλασμίνης (μιας πρωτεΐνης που συμμετέχει στη συγκρότηση της χρωματίνης) αποτελείται από δύο μέρη: ένα ζεύγος Lys-Arg και τέσσερα κατάλοιπα λυσίνης που ακολουθούν έπειτα από ένα Ο πυρήνας Αντιγόνο Τ ... Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val ... Νουκλεοπλασμίνη ... Lys Arg Lys Lys Lys Lys ... ΕΙΚΟΝΑ 9.9 Σήματα πυρηνικού εντοπισμού. Το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ αντιστοιχεί σε μια ενιαία αλληλουχία αμινοξέων. Αντίθετα, το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της νουκλεοπλασμίνης είναι διπαραγοντικό, καθώς αποτελείται από δύο αλληλουχίες, μία Lys-Arg και μία Lys-Lys-Lys-Lys, μεταξύ των οποίων μεσολαβεί ένα μεσοδιάστημα δέκα Cooper Cell Biology, Sinauer/ASM αμινοξέων. Figure 9.09 #299 μεσοδιάστημα δέκα αμινοξέων (Εικόνα 9.9). Τόσο η αλληλουχία Lys-Arg όσο και η αλληλουχία Lys-Lys-Lys-Lys είναι απαραίτητες για την πυρηνική στόχευση. Ωστόσο, τα δέκα αμινοξέα που μεσολαβούν ανάμεσα σε αυτές τις αλληλουχίες μπορούν να αντικατασταθούν με μεταλλαξιγένεση χωρίς να επηρεαστεί ο πυρηνικός εντοπισμός. Αυτό το σήμα πυρηνικού εντοπισμού που αποτελείται από δύο ξεχωριστά στοιχεία αλληλουχίας χαρακτηρίζεται ως διπαραγοντικό (bipartite). Παρόμοια διπαραγοντικά μοτίβα φαίνεται ότι λειτουργούν ως σήματα εντοπισμού πολλών πυρηνικών πρωτεϊνών και είναι πιθανόν να συναντώνται συχνότερα απ’ ό,τι το συνεχές, απλούστερο σήμα πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ. Αν και πολλά διπαραγοντικά σήματα πυρηνικού εντοπισμού αποτελούνται από αλληλουχίες βασικών αμινοξέων, οι οποίες συχνά ονομάζονται βασικά ή «κλασικά» σήματα πυρηνικού εντοπισμού, άλλα σήματα πυρηνικού εντοπισμού εμφανίζουν μεγάλη ποικιλία αμινοξικής αλληλουχίας και δομής. Μερικά από αυτά τα σήματα αποτελούνται από μοτίβα αλληλουχίας που απέχουν κατά πολύ στην πρωτοταγή δομή της πρωτεΐνης και η ενεργότητά τους εξαρτάται από την κανονική αναδίπλωση της πρωτεΐνης στην τριτοταγή της δομή. Τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού αναγνωρίζονται από υποδοχείς πυρηνικής μεταφοράς που ονομάζονται ιμπορτίνες (importins),* επειδή μεταφέρουν πρωτεΐνες στο εσωτερικό του πυρήνα. Η διέ*Σ.τ.Ε.: Από την αγγλική λέξη «import», που σημαίνει «εισάγω». 541 542 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΕΙΚΟΝΑ 9.10 Κατανομή της Ran/ GTP μεταξύ των δύο πλευρών του πυρηνικού φακέλου. Η άνιση κατανομή της Ran/GTP μεταξύ των δύο πλευρών του πυρηνικού φακέλου διατηρείται χάρη στον εντοπισμό της πρωτεΐνης ενεργοποίησης της GTPάσης Ran (Ran GAP, Ran GTPase-Αctivating Protein) στο κυτταρόπλασμα και του παράγοντα ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης Ran (Ran GEF, Ran Guanine nucleotide Exchange Factor) στον πυρήνα. Στο κυτταρόπλασμα, η Ran GAΡ (η οποία προσδένεται στα κυτταροπλασματικά ινίδια του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου) ενεργοποιεί την υδρόλυση του GTP που είναι προσδεδεμένο στη Ran, οδηγώντας σε μετατροπή της Ran/GTP σε Ran/ GDP. Στον πυρήνα, η Ran GEF ενεργοποιεί την ανταλλαγή του GDP που είναι προσδεδεμένο στη Ran με GTP, οδηγώντας σε μετατροπή του Ran/ GDP σε Ran/GTP. Κατά συνέπεια, το εσωτερικό του πυρήνα διατηρεί μια υψηλή συγκέντρωση Ran/GTP. Κυτταρόπλασμα Pi Ran GDP Ran GAP GDP GDP Ran GEF Πυρήνασ λευση μακρομορίων από τον πυρηνικό πόρο ρυθμίζεται από μια πρωτεΐνη που ονομάζεται Ran. Πρόκειται για έναν από τους αρκετούς τύπους μικρών πρωτεϊνών πρόσδεσης GTP, η διαμόρφωση και η ενεργότητα των οποίων ρυθμίζεται από την πρόσδεση και την υδρόλυση GTP. Άλλα παραδείγματα μικρών πρωτεϊνών πρόσδεσης GTP είναι οι πρωτεΐνες Ras (βλ. Εικόνα 8.38), αρκετοί από τους μεταφραστικούς παράγοντες που συμμετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση (βλ. Εικόνα 8.13), οι πρωτεΐνες Arf και Rab (που θα συζητηθούν στο Κεφάλαιο 10), καθώς και οι πρωτεΐνες Rac, Rho και Cdc42 (που θα συζητηθούν στο Κεφάλαιο 15). Όσον αφορά την πρωτεΐνη Ran, τα ένζυμα που ενεργοποιούν την υδρόλυση του GTP προς GDP εντοπίζονται στην κυτταροπλασματική πλευρά του πυρηνικού φακέλου, ενώ τα ένζυμα που ενεργοποιούν την ανταλλαγή GDP με GTP εντοπίζονται στην πυρηνική πλευρά (Εικόνα 9.10). Κατά συνέπεια, δεν υπάρχει ισόποση κατανομή των Ran/GTP από τις δύο πλευρές του πυρηνικού πόρου. Στο εσωτερικό του πυρήνα διατηρείται υψηλότερη συγκέντρωση μορίων Ran/GTP, η οποία καθορίζει την κατεύθυνση της πυρηνικής μεταφοράς των πρωτεϊνών-φορτίων που αναγνωρίζουν οι ιμπορτίνες. Η πρωτεΐνη Ran ρυθμίζει τη διέλευση πρωτεϊνών από τον πυρηνικό πόρο ελέγχοντας την ενεργότητα των υποδοχέων πυρηνικής μεταφοράς. Η εισαγωγή πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου ξεκινά όταν μια συγκεκριμένη ιμπορτίνη προσδεθεί στο σήμα πυρηνικού εντοπισμού μιας προς μεταφορά πρωτεΐνης Cooper The Cell 5e, Sinauer/ASM Figure# 09.10 DMG# 0902 12/10/08 Dragonfly Media Group Ο πυρήνας Κυτταρόπλασμα Πρωτεΐνη- NLS φορτίο Ran GDP Ιμπορτίνη Pi Ran GAP Ran Πυρήνασ στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 9.11). Κατόπιν, αυτό το σύμπλοκο ιμπορτίνης/φορτίου προσδένεται σε πρωτεΐνες των κυτταροπλασματικών ινιδίων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου και η μεταφορά προχωρεί με διαδοχική πρόσδεση σε ειδικές πρωτεΐνες του πυρηνικού πόρου οι οποίες βρίσκονται όλο και πλησιέστερα στην πυρηνική πλευρά του συμπλόκου του πόρου. Ιδιαίτερα σημαντικές για τη διεργασία αυτή είναι ορισμένες πρωτεΐνες (νουκλεοπορίνες) που επενδύουν τον κεντρικό δίαυλο του πόρου, οι οποίες φέρουν πολλαπλές επαναλήψεις Phe-Gly και ονομάζονται πρωτεΐνες FG. Ακολούθως, στην πυρηνική πλευρά του πόρου, το σύμπλοκο ιμπορτίνης/φορτίου διίσταται καθώς προσδένεται σε αυτό η Ran/GTP. Η πρόσδεση αυτή προκαλεί μια αλλαγή στη διαμόρφωση της ιμπορτίνης, η οποία εκτοπίζει από το σύμπλοκο την πρωτεΐνη-φορτίο και την απελευθερώνει στο εσωτερικό του πυρήνα. Στη συνέχεια, το σύμπλοκο ιμπορτίνης-Ran/GTP εξάγεται από τον πυρήνα μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου και επιστρέφει Cooper The Cell 5e, Sinauer/ASM Figure# 09.11 DMG# 0903 12/10/08 Dragonfly Media Group 543 ΕΙΚΟΝΑ 9.11 Μεταφορά πρωτεϊ νών μέσω του συμπλόκου του πυ ρηνικού πόρου. Η μεταφορά μιας πρωτεΐνης μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου ξεκινά με την αναγνώριση της αλληλουχίας πυρηνικού εντοπισμού της (NLS, Nuclear Localization Sequence) από έναν υποδοχέα πυρηνικής μεταφοράς (ιμπορτίνη). Το σύμπλοκο της πρωτεΐνης-φορτίου με την ιμπορτίνη προσδένεται σε ειδικές πρωτεΐνες του πυρηνικού πόρου στα κυτταροπλασματικά ινίδια. Στη συνέχεια, μεταφέρεται μέσω του πυρηνικού πόρου, καθώς προσδένεται διαδοχικά σε πρωτεΐνες που βρίσκονται όλο και βαθύτερα στο εσωτερικό του. Στην πυρηνική πλευρά του πόρου, το σύμπλοκο φορτίου/ιμπορτίνης διασπάται λόγω της πρόσδεσης Ran/GTP στην ιμπορτίνη. Η αλλαγή διαμόρφωσης της ιμπορτίνης εκτοπίζει την πρωτεΐνη-φορτίο και την απελευθερώνει στο εσωτερικό του πυρήνα. Το σύμπλοκο ιμπορτίνης-Ran/GTP εξάγεται και πάλι από τον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου και η πρωτεΐνη ενεργοποίησης της GTPάσης (Ran GAP) υδρολύει το GTP, που φέρει η Ran, προς GDP, προκαλώντας απελευθέρωση της ιμπορτίνης στο κυτταρόπλασμα. 544 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 9.1 ANIMATION Εισαγωγή και εξαγωγή πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Οι πρωτεΐνες στοχεύονται για εισαγωγή στον πυρήνα ή για εξαγωγή από αυτόν μέσω σημάτων πυρηνικού εντοπισμού ή σημάτων πυρηνικής εξαγωγής αντίστοιχα. Αυτά τα σήματα επιτρέπουν αναγνώριση των πρωτεϊνών από υποδοχείς οι οποίοι κατευθύνουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. στο κυτταρόπλασμα, όπου το GTP υδρολύεται σε GDP. Με αυτόν τον τρόπο αποδεσμεύεται η ιμπορτίνη, η οποία μπορεί πλέον να προσδεθεί σε μια νέα πρωτεΐνη-φορτίο στο κυτταρόπλασμα και να συμμετάσχει σε έναν νέο κύκλο πυρηνικής μεταφοράς. Η Ran/GDP που παράγεται στο κυτταρόπλασμα μεταφέρεται πίσω στον πυρήνα μέσω του δικού της μεταφορέα (που ονομάζεται NTF2), όπου και αναγεννάται η Ran/GTP. Μερικές πρωτεΐνες παραμένουν στο εσωτερικό του πυρήνα μετά την εισαγωγή τους από το κυτταρόπλασμα, πολλές άλλες όμως παλινδρομούν συνεχώς μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Μερικές από αυτές τις πρωτεΐνες λειτουργούν ως φορείς για τη μεταφορά άλλων μορίων, όπως μορίων RNA, ενώ άλλες συντονίζουν διάφορες λειτουργίες του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος (για παράδειγμα, ρυθμίζουν τις ενεργότητες μεταγραφικών παραγόντων). Η εξαγωγή πρωτεϊνών από τον πυρήνα υπαγορεύεται από ειδικές αλληλουχίες αμινοξέων, οι οποίες ονομάζονται σήματα πυρηνικής εξαγωγής (nuclear export signals). Τα σήματα πυρηνικής εξαγωγής, όπως και τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού, αναγνωρίζονται από υποδοχείς μέσα στον πυρήνα. Οι υποδοχείς των σημάτων πυρηνικής εξαγωγής, που ονομάζονται εξπορτίνες (exportins), βρίσκονται μέσα στον πυρήνα και κατευθύνουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Πολλές από τις εξπορτίνες, όπως και οι ιμπορτίνες, ανήκουν σε μια οικογένεια υποδοχέων πυρηνικής μεταφοράς οι οποίοι είναι γνωστοί με το όνομα καρυοφερίνες (karyopherins – Πίνακας 9.1). Οι εξπορτίνες προσδένονται στην πρωτεΐνη Ran, μια πρωτεΐνη που απαιτείται τόσο για την εισαγωγή όσο και για την εξαγωγή από τον πυρήνα (Εικόνα 9.12). Ωστόσο, ενώ η πρόσδεση της Ran/ GTP στις ιμπορτίνες προκαλεί διάσπαση των συμπλόκων μεταξύ των ιμπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, η πρόσδεσή της στις εξπορτίνες συμβάλλει στον σχηματισμό σταθερών συμπλόκων μεταξύ των εξπορτινών και των αντίστοιχων πρωτεϊνών-φορτίων. Κατά συνέπεια, η πρόσδεση της Ran/GTP στις εξπορτίνες καθορίζει τη μετακίνηση των πρωτεϊνών που περιέχουν σήματα πυρηνικής εξαγωγής προς το κυτταρόπλασμα. Έτσι, στο εσωτερικό του πυρήνα σχηματίζονται σταθερά σύμπλοκα μεταξύ των εξπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, στα οποία συμβάλλει και η πρόσδεση της Ran/GTP. Μετά τη μεταφορά αυτών των συμπλόκων στην κυτταροπλασματική πλευρά του πυρηνικού φακέλου, η υδρόλυση του GTP και η αποδέσμευση της Ran/GDP οδηγούν σε αποδέσμευση της 545 Ο πυρήνας ΕΙΚΟΝΑ 9.12 Εξαγωγή πρωτεϊνών από τον πυρήνα. Στον πυρήνα σχηματίζονται σύμπλοκα μεταξύ πρωτεϊνών-φορτίων που φέρουν σήματα πυρηνικής εξαγωγής (NES, Nuclear Export Signals), εξπορτινών και Ran/ GTP. Μετά τη διέλευση από το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου, η Ran GAP ενεργοποιεί την υδρόλυση του προσδεδεμένου GTP, οδηγώντας σε σχηματισμό Ran/GDP και απελευθέρωση της πρωτεΐνης-φορτίου και της εξπορτίνης στο κυτταρόπλασμα. Κυτταρόπλασμα Εξπορτίνη πρωτεΐνης-φορτίου, η οποία απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα. Στη συνέχεια, οι εξπορτίνες ανακυκλώνονται και επιστρέφουν στον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκ νέου. Ο μηχανισμός ιμπορτίνης-εξπορτίνης-Ran/GTP λειτουργεί επίσης στα ανώτερα φυτά, αν και στην περίπτωση αυτή δεν έχει κατανοηθεί πλήρως. + Pi Ran GAP Σήμα πυρηνικήσ εξαγωγήσ (NES) Ρύθμιση της εισαγωγής πρωτεϊνών στον πυρήνα Η μεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα είναι ένα ακόμη επίπεδο στο οποίο μπορούν να ελεγχθούν οι ενεργότητες των πυρηνικών πρωτεϊνών. Οι μεταγραφικοί παράγοντες, για παράδειγμα, είναι λειτουργικοί μόνο όταν βρίσκονται μέσα στον πυρήνα και κατά συνέπεια η ρύθμιση της εισαγωγής και της εξαγωγής των πρωτεϊνών αυτών προς και από τον πυρήνα συνιστά έναν νέο τρόπο ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης. Όπως θα συζητηθεί στο Κεφάλαιο 15, η ρυθ- GDP Πρωτεΐνηφορτίο Πρωτεΐνηφορτίο Ran Εξπορτίνη ΠΙΝΑΚΑΣ 9.1 Καρυοφερίνες με γνωστά υποστρώματα Καρυοφερίνη Εισαγωγή Διμερές Kapα/Kapβ1 Snurportin/Kapβ1 Ελεύθερη Kapβ1 Kapβ2 (τρανσπορτίνη) Διμερές ιμπορτίνης 7/Kapβ1 Εξαγωγή Crm1 CAS Εξπορτίνη t Εξπορτίνη 4 Πυρήνασ Υποστρώματα Πρωτεΐνες με σήμα πυρηνικού εντοπισμού που περιέχει βασικά αμινοξέα (π.χ. νουκλεοπλασμίνη) snRNP (U1, U2, U4, U5) Σύμπλοκα Cdk/κυκλίνης Πρωτεΐνες πρόσδεσης mRNA, πρωτεΐνες ριβοσώματος Ιστόνη Η1, πρωτεΐνες ριβοσώματος Πρωτεΐνες με σήμα πυρηνικής εξαγωγής πλούσιο σε κατάλοιπα λευκίνης, snurportin, snRNA Kapα tRNA Παράγοντας επιμήκυνσης 5Α Cooper The Cell 5e, Sinauer/ASM Figure# 09.12 DMG# 0904 12/10/08 Dragonfly Media Group 546 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΕΙΚΟΝΑ 9.13 Ρύθμιση της εισα γωγής μεταγραφικών παραγόντων στον πυρήνα. Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κΒ διατηρείται στο κυτταρόπλασμα υπό μορφή ανενεργού συμπλόκου με την πρωτεΐνη ΙκΒ, η οποία καλύπτει την αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού του (NLS). Όταν δεχτεί τα κατάλληλα εξωκυτταρικά σήματα, η ΙκΒ φωσφορυλιώνεται και αποικοδομείται μέσω πρωτεόλυσης, επιτρέποντας την εισαγωγή του NF-κΒ στον πυρήνα. Ο μεταγραφικός παράγοντας Pho4 του σακχαρομύκητα διατηρείται στο κυτταρόπλασμα λόγω της φωσφορυλίωσης ενός καταλοίπου σερίνης που βρίσκεται κοντά στην αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού του. Η ρυθμιζόμενη αποφωσφορυλίωση του καταλοίπου αυτού οδηγεί σε έκθεση του NLS και επιτρέπει μεταφορά του Pho4 στον πυρήνα. μιζόμενη εισαγωγή στον πυρήνα τόσο μεταγραφικών παραγόντων όσο και πρωτεϊνικών κινασών έχει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της κυτταρικής συμπεριφοράς, καθώς παρέχει έναν μηχανισμό μέσω του οποίου σήματα που λαμβάνονται στην επιφάνεια του κυττάρου μπορούν να μεταδοθούν στον πυρήνα. Η σημασία της ρυθμιζόμενης εισαγωγής στον πυρήνα αποδεικνύεται από το ότι η αλλαγή στη συγγένεια της αλληλεπίδρασης δύο μόλις πρωτεϊνών του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου προς τον υποδοχέα πυρηνικής μεταφοράς έχει συμβάλει στoν εξελικτικό διαχωρισμό των ειδών Drosophila melanogaster και Drosophila simulans. Σε έναν συγκεκριμένο μηχανισμό ρύθμισης, οι μεταγραφικοί παράγοντες (ή άλλες πρωτεΐνες) συνδέονται με κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες που καλύπτουν τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού τους και οδηγούν σε παραμονή των παραγόντων αυτών στο κυτταρόπλασμα, εφόσον τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού δεν είναι πλέον αναγνωρίσιμα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κΒ, ο οποίος ενεργοποιείται σε κύτταρα των θηλαστικών από πολλά διαφορετικά εξωκυτταρικά σήματα (Εικόνα 9.13). Στο κυτταρόπλασμα μη διεγερμένων κυττάρων, ο NF-κΒ σχηματίζει ένα ανενεργό σύμπλοκο με μια πρωτεΐνη-αναστολέα (την ΙκΒ). Η πρόσδεση της ΙκΒ καλύπτει το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του NF-κΒ, εμποδίζοντας τη μεταφορά του στον πυρήνα. Σε διεγερμένα κύτταρα, η πρωτεΐνη ΙκΒ φωσφορυλιώνεται και αποικοδομείται πρωτεολυτικά μέσω της ουβικιτίνης (βλ. Εικόνα 8.43), επιτρέποντας στον NF-κΒ να εισέλθει στον πυρήνα και να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων του. Κυτταρόπλασμα NF-κB Pho4 IκB P NLS Φωσφορυλίωση και πρωτεόλυση τησ IκB Ιμπορτίνη NLS Αποφωσφορυλίωση Ιμπορτίνη Πυρήνασ Cooper Cell Biology 5e, Sinauer/ASM Figure 09.13 #0906 Ο πυρήνας Η εισαγωγή άλλων μεταγραφικών παραγόντων στον πυρήνα ρυθμίζεται άμεσα μέσω της φωσφορυλίωσής τους και όχι μέσω σύνδεσης με πρωτεΐνες-αναστολείς (βλ. Εικόνα 9.13). Για παράδειγμα, ο μεταγραφικός παράγοντας Pho4 του σακχαρομύκητα φωσφορυλιώνεται σε ένα κατάλοιπο σερίνης που βρίσκεται δίπλα στο σήμα πυρηνικού εντοπισμού του. Η φωσφορυλίωση στη θέση αυτή προκαλεί αναστολή του παράγοντα Pho4, γιατί παρεμποδίζει την εισαγωγή του στον πυρήνα. Υπό κατάλληλες συνθήκες, όμως, η ρυθμιζόμενη αποφωσφορυλίωση αυτής της θέσης επιτρέπει τη μετατόπιση του παράγοντα Pho4 στον πυρήνα και την ενεργοποίησή του. Μεταφορά των μορίων RNA Ενώ πολλές πρωτεΐνες μεταφέρονται επιλεκτικά από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, τα περισσότερα μόρια RNA εξάγονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Εφόσον οι πρωτεΐνες συντίθενται στο κυτταρόπλασμα, η εξαγωγή από τον πυρήνα μορίων mRNA, rRNA, tRNA και miRNA αποτελεί ένα καθοριστικό βήμα της γονιδιακής έκφρασης στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η εξαγωγή αυτών των μορίων RNA μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου είναι, όπως και η εισαγωγή πρωτεϊνών, μια ενεργή, εξαρτώμενη από ενέργεια, διεργασία η οποία απαιτεί αλληλεπίδραση των υποδοχέων μεταφοράς με το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου. Ιμπορτίνες και εξπορτίνες της οικογένειας των καρυοφερινών (βλ. Πίνακα 9.1) είναι υπεύθυνες για τη μεταφορά των περισσότερων μορίων tRNA, rRNA, miRNA και μικρών πυρηνικών RNA μέσω ενός μηχανισμού εξαρτώμενου από Ran/GDP. Ωστόσο, τα μόρια mRNA εξάγονται από τον πυρήνα μέσω ενός συμπλόκου δύο πρωτεϊνών (γνωστού με το όνομα «εξαγωγέας mRNA»), από τις οποίες η μία εμφανίζει συγγένεια με τον μεταφορέα της Ran/GDP, δηλαδή τον NTF2. Αυτός ο μηχανισμός μεταφοράς των μορίων mRNA φαίνεται να είναι ανεξάρτητος της πρωτεΐνης Ran. Τα RNA μεταφέρονται μέσω του πυρηνικού φακέλου υπό μορφή συμπλόκων ριβονουκλεοπρωτεΐνης (RNP, Ribonucleoprotein complexes – Εικόνα 9.14). Τα ριβοσωμικά RNA συνδέονται αρχικά τόσο με ριβοσωμικές πρωτεΐνες όσο και με ειδικές πρωτεΐνες επεξεργασίας RNA μέσα στον πυρηνίσκο, δημιουργώντας τις δύο ριβοσωμικές υπομονάδες 60S και 40S. Οι υπομονάδες αυτές στη συνέχεια μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα (βλ. Εικόνα 9.31) μέσω ενός μηχανισμού στον οποίο συμμετέχει η καρυοφερίνη Crm1. Η εξαγωγή τους από τον πυρήνα επιτυγχάνεται μέσω της αναγνώρισης σημάτων πυρηνικής εξαγωγής που περιέχονται σε πρωτεΐνες του συμπλόκου κάθε ριβοσωμικής υπομονάδας. Τα μόρια pre-mRNA 547 548 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 (Α) (Β) ΕΙΚΟΝΑ 9.14 Μεταφορά ενός συ μπλόκου ριβονουκλεοπρωτεΐνης. Τα κύτταρα των σιελογόνων αδένων των εντόμων παράγουν ευμεγέθη σύμπλοκα ριβονουκλεοπρωτεΐνης (RNΡ), τα οποία περιέχουν 35-40 kb RNA και έχουν συνολική μάζα περίπου 30 εκατομμύρια Da. Σε αυτή τη σειρά φωτογραφιών ηλεκτρονικού μικροσκοπίου παρουσιάζονται (Α) η πρόσδεση ενός τέτοιου RNΡ σε ένα σύμπλοκο πυρηνικού πόρου και (Β-Δ) η αποδίπλωση του RNA κατά τη μεταφορά του στο κυτταρόπλασμα. (Από τη δημοσίευση των H. Mehlin et al., 1992. Cell 69: 605.) Cooper Cell Biology, Sinauer/ASM Figure 9.14 #15 (Γ) (Δ) 0,1 μm και mRNA συνδέονται με ένα σύνολο τουλάχιστον 20 πρωτεϊνών κατά την επεξεργασία τους στον πυρήνα έως και τη μεταφορά τους στο κυτταρόπλασμα. Η μεταφορά αυτή επιτυγχάνεται μέσω του συμπλόκου του εξαγωγέα mRNA, το οποίο στρατολογείται στο επεξεργασμένο mRNA. Τα μόρια tRNA και πρόδρομες μορφές των μορίων miRNA εξάγονται από τον πυρήνα άμεσα συνδεδεμένα με την εξπορτίνη t και την εξπορτίνη 5, που είναι οι αντίστοιχοι μεταφορείς τους. Σε αντιδιαστολή με τα μόρια mRNA, tRNA και rRNA, που ασκούν τη λειτουργία τους στο κυτταρόπλασμα, πολλά μικρά μόρια RNA (snRNA και snοRNA) λειτουργούν μέσα στον πυρήνα ως συστατικά του μηχανισμού επεξεργασίας RNA. Τα snRNA μεταφέρονται αρχικά από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, όπου συνδέονται με πρωτεΐνες για να σχηματίσουν λειτουργικά snRNP και στη συνέχεια επαναφέρονται στον πυρήνα (Εικόνα 9.15). Στην εξαγωγή των μορίων snRNA στο κυτταρόπλασμα συμμετέχουν η πρωτεΐνη Crm1 και άλλοι υποδοχείς μεταφοράς που προσδένονται στις 5΄ καλύπτρες 7-μεθυλογουανοσίνης των snRNA, ενώ για τη μεταφορά των snRNΡ από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα ευθύνονται αλληλουχίες που φέρουν οι πρωτεΐνες snRNΡ. 9.2 Eσωτερική οργάνωση του πυρήνα Ο πυρήνας δεν είναι απλώς ένας σάκος όπου χρωματίνη, μόρια RNA και πυρηνικές πρωτεΐνες κινούνται ελεύθερα σε ένα υδατικό διάλυμα. Αντίθετα, ο πυρήνας διαθέτει μια εσωτερική δομή που εξασφαλίζει την οργάνωση του γενετικού υλικού και τον καταμερισμό των πυρηνικών λειτουργιών. Στα ζωικά κύτταρα, ένα χαλαρά οργανωμένο πλέγμα πυρηνικών λαμινών εκτείνεται από την Ο πυρήνας Κυτταρόπλασμα Δέσμευση πρωτεΐνησ snRNP snRNA 5’ καλύπτρα m7G snRNA Crm1 snRNP 549 ΕΙΚΟΝΑ 9.15 Μεταφορά των snRNA μεταξύ πυρήνα και κυττα ροπλάσματος. Τα μικρά πυρηνικά RNA (snRNA) εξάγονται αρχικά από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα μέσω μιας εξπορτίνης (Crm1) που αναγνωρίζει την καλύπτρα 7-μεθυλογουανοσίνης του 5΄ άκρου. Στο κυτταρόπλασμα, τα snRNA συνδέονται με πρωτεΐνες και σχηματίζουν snRNP, τα οποία στη συνέχεια μεταφέρονται και πάλι στον πυρήνα. Πυρήνασ πυρηνική λάμινα ως το εσωτερικό του πυρήνα. Αυτές οι λαμίνες χρησιμεύουν ως θέσεις πρόσδεσης της χρωματίνης και οργανώνουν άλλες πρωτεΐνες σε δομές λειτουργικών πυρηνικών σωματίων. Μέσα στον πυρήνα, η χρωματίνη είναι οργανωμένη σε μεγάλους βρόχους DNA, συγκεκριμένες περιοχές των οποίων προσδένονται στο στρώμα των λαμινών μέσω πρωτεϊνών πρόσδεσης λαμινών που βρίσκονται στη χρωματίνη. Πολλές ακόμη πυρηνικές πρωτεΐνες σχηματίζουν σύμπλοκα εξαρτώμενα από λαμίνες, τα οποία με τη σειρά τους σχηματίζουν πυρηνικά σωμάτια που συμμετέχουν στην επιδιόρθωση του DNA, στην οργάνωση της χρωματίνης, στη γονιδιακή ρύθμιση και στη μεταγωγή σήματος. Θεωρείται ότι αυτός ο ρόλος της πυρηνικής λάμινας και των λαμινών στον καταμερισμό των λειτουργιών της επιδιόρθωσης του DNA και της μεταγραφής γονιδίων αποτελεί τη βάση πολλών διαφορετικών γενετικών ασθενειών που σχετίζονται με τις λαμίνες. Χρωμοσώματα και υψηλότερη οργάνωση δομής της χρωματίνης Η χρωματίνη συμπυκνώνεται σε υψηλό βαθμό κατά τη μίτωση, σχηματίζοντας τα συμπαγή μεταφασικά χρωμοσώματα που κατανέμονται στους θυγατρικούς πυρήνες (βλ. Εικόνα 5.15). Κατά τη μεσόφαση, μέρος της χρωματίνης, η λεγόμενη ετεροχρωματίνη (heterochromatin), παραμένει ιδιαίτερα συμπυκνωμένο και μεταγραφικά ανενεργό. Η υπόλοιπη χρωματίνη ή ευχρωματίνη (euchromatin) είναι αποσυμπυκνωμένη και κατανέμεται σε ολόκληρο τον πυρήνα (Εικόνα 9.16). Τα κύτταρα περιέχουν δύο τύπους ετεροχρωματίνης: την ιδιοστατική ετεροχρωματίνη, η οποία Cooper The Cell 5e, Sinauer/ASM Figure# 09.15 DMG# 0905 12/10/08 Dragonfly Media Group Τα βλεφαριδοφόρα πρωτό ζωα περιέχουν δύο τύπους πυρήνων: έναν πολυπλοειδή μακροπυρήνα που περιέχει με ταγραφικώς ενεργά γονίδια και έναν ή περισσότερους διπλοει δείς, μεταγραφικώς ανενεργούς μικροπυρήνες που συμμετέχουν στη φυλετική αναπαραγωγή. »» 550 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 1 μm ΕΙΚΟΝΑ 9.16 Ετεροχρωματίνη σε μεσοφασικούς πυρήνες. Η ευχρωματίνη είναι κατανεμημένη σε ολόκληρο τον πυρήνα. Η ετεροχρωματίνη υποδεικνύεται με τρίγωνα και ο πυρηνίσκος με βέλος. (Ευγενική προσφορά των Ada L. Olins και Donald E. Olins, Oak Ridge National Laboratory.) Cooper Cell Biology, Sinauer/ASM Figure 9.16 #15 εριέχει αλληλουχίες DNA που γενικά δε μεταγράφονται, όπως είναι π οι δορυφορικές αλληλουχίες που υπάρχουν στα κεντρομερή, και τη δυνητική ετεροχρωματίνη, η οποία περιέχει αλληλουχίες που δε μεταγράφονται στο υπό εξέταση κύτταρο αλλά μεταγράφονται σε άλλους τύπους κυττάρων. Κατά συνέπεια, η ποσότητα της δυνητικής ετεροχρωματίνης ποικίλλει ανάλογα με τη μεταγραφική ενεργότητα του κυττάρου. Αν και η μεσοφασική χρωματίνη φαίνεται να είναι ομοιόμορφα κατανεμημένη, στην πραγματικότητα τα χρωμοσώματα είναι διατεταγμένα με οργανωμένο τρόπο και χωρίζονται σε διακριτές λειτουργικές επικράτειες που έχουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Τη μη τυχαία κατανομή της χρωματίνης στον μεσοφασικό πυρήνα εισηγήθηκε για πρώτη φορά το 1885 ο Carl Rabl, ο οποίος διατύπωσε την πρόταση ότι κάθε χρωμόσωμα καταλαμβάνει μια διακριτή επικράτεια, με τα κεντρομερή και τα τελομερή να προσδένονται σε αντίθετες πλευρές του πυρηνικού φακέλου (Εικόνα 9.17). Αυτό το βασικό μοντέλο οργάνωσης της χρωματίνης επιβεβαιώθηκε σχεδόν εκατό χρόνια αργότερα (το SM Ο πυρήνας (A) (B) 1984) με λεπτομερείς μελέτες των πολυταινικών χρωμοσωμάτων των σιελογόνων αδένων της Drosophila. Όπως διαπιστώθηκε, τα χρωμοσώματα δεν τυλίγονται τυχαία το ένα γύρω από το άλλο, αλλά κάθε χρωμόσωμα καταλαμβάνει μια διακριτή περιοχή του πυρήνα (Εικόνα 9.18). Τα χρωμοσώματα συνδέονται στενά με τον πυρηνικό φάκελο σε πολλές θέσεις. Πολλές από αυτές τις συνδέσεις οδηγούν σε καταστολή της γονιδιακής έκφρασης, κάποιες άλλες όμως, όπως οι συνδέσεις με τα σύμπλοκα του πυρηνικού πόρου, προάγουν τη μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων. Μεμονωμένα χρωμοσώματα καταλαμβάνουν διακριτές επικράτειες στους πυρήνες των κυττάρων θηλαστικών (Εικόνα 9.19). Τα ενεργώς μεταγραφόμενα γονίδια εντοπίζονται στην περιφέρεια αυτών των επικρατειών, δίπλα σε «διαύλους» που χωρίζουν τα χρωμοσώματα μεταξύ τους. Θεωρείται ότι τα νεοσυντιθέμενα μόρια RNA απελευθερώνονται μέσα σε αυτούς τους «διαύλους» και εκεί λαμβάνει χώρα η επεξεργασία του RNA. Μεγάλο μέρος της ετεροχρωματίνης εντοπίζεται στην περιφέρεια του πυρήνα, καθώς πρωτεΐνες που συνδέονται με την ετεροχρωματίνη προσδένονται στο πλέγμα της πυρηνικής λάμινας. Εφόσον διαφορετικοί τύποι κυττάρων εκφράζουν διαφορετικά γονίδια, η δυνητική ετεροχρωματίνη, ΕΙΚΟΝΑ 9.17 Οργάνωση των χρω μοσωμάτων. Αναπαραγωγή χειρόγραφων σχεδίων χρωμοσωμάτων σε κύτταρα σαλαμάνδρας. (Α) Πλήρη χρωμοσώματα. (Β) Μόνο τα τελομερή (που εντοπίζονται στην πυρηνική μεμβράνη). (Από τη δημοσίευση του C. Rabl, 1885. Morphologisches Jahrbuch 10: 214.) (A) Κεντρομερή Τελομερή (B) ΕΙΚΟΝΑ 9.18 Οργάνωση των χρωμοσωμάτων της Drosophila. (Α) Μο ντέλο του πυρήνα, στο οποίο παρουσιάζονται με διαφορετικά χρώματα οι βραχίονες των πέντε χρωμοσωμάτων. Υποδεικνύονται oι θέσεις των τελομερών και των κεντρομερών. (Β) Παρουσιάζονται οι δύο βραχίονες του χρωμοσώματος 3, προκειμένου να φανεί ο τοπολογικός διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων. (Από τη δημοσίευση των D. Matdog et al., 1984. Nature 308: 414.) 551 552 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 (A) ΕΙΚΟΝΑ 9.19 Οργάνωση των χρωμοσωμάτων στον πυρήνα των θη λαστικών. (Α) Ανιχνευτές επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών του χρωμοσώματος 4 χρησιμοποιήθηκαν για πείραμα υβριδισμού σε ένα ανθρώπινο κύτταρο. Τα δύο αντίγραφα του χρωμοσώματος 4, το οποίο ταυτοποιείται με τον φθορισμό κίτρινου χρώματος, καταλαμβάνουν διακριτές επικράτειες μέσα στον πυρήνα. (Β) Μοντέλο οργάνωσης των χρωμοσωμάτων. Τα χρωμοσώματα καταλαμβάνουν διακριτές επικράτειες, οι οποίες χωρίζονται μεταξύ τους με διαχρωμοσωμικές περιοχές, όπου θεωρείται ότι λαμβάνουν χώρα η επεξεργασία και η μεταφορά του RNA. (Α, ευγενική προσφορά του Thomas Cremer, Ludwig Maximilians University, από τη δημοσίευση των A. I. Lamond και W. C. Earnshaw, 1999, Science 280: 547.) Αντίγραφα του χρωμοσώματοσ 4 (B) Διαχρωμοσωμική περιοχή Πυρηνικόσ φάκελοσ Επικράτειεσ χρωμοσωμάτων Cooper Cell Biology 5e, Sinauer/ASM Figure 09.19 #0818 καθώς και οι περιοχές των χρωμοσωμάτων που αλληλεπιδρούν με την πυρηνική λάμινα διαφέρουν μεταξύ διαφορετικών κυττάρων και ιστών. Σε μερικά κύτταρα, τα κεντρομερή και τα τελομερή είναι συγκεντρωμένα σε αντίθετους πόλους, ενώ σε άλλα κύτταρα τα χρωμοσώματα διατάσσονται ακτινωτά. Οι θέσεις των χρωμοσωμάτων μέσα στον πυρήνα διαφέρουν επίσης ανάλογα με τον οργανισμό και τον τύπο του ιστού. Εξάλλου, η χρωματίνη στο εσωτερικό του πυρήνα αναδιοργανώνεται κατά την κυτταρική διαφοροποίηση και σε συντονισμό με αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Αν και αυτή η δυναμική αναδιοργάνωση της χρωματίνης είναι πολύπλοκη και δεν έχει κατανοηθεί πλήρως, είναι γνωστό ότι βασίζεται, τουλάχιστον εν μέρει, στην ακτίνη και στη μυοσίνη του πυρήνα – πρωτεΐνες που χαρακτηρίστηκαν για πρώτη φορά στον κυτταροσκελετό (βλ. Κεφάλαιο 12). Όπως και το DNA στα μεταφασικά χρωμοσώματα (βλ. Εικόνα 5.16), η χρωματίνη των μεσοφασικών πυρήνων είναι οργανωμένη σε περιοχές βρόχων που περιέχουν περίπου 50-100 kb DNA. Ένα καλό παράδειγμα αυτής της οργάνωσης είναι τα εντόνως μεταγραφόμενα χρωμοσώματα των ωοκυττάρων των αμφιβίων, όπου οι ενεργώς μεταγραφόμενες περιοχές DNA είναι ορατές στο μικροσκόπιο ως μεγάλοι βρόχοι αποδιπλωμένης χρωματίνης (Εικόνα 9.20). Αυτές οι περιοχές φαίνεται ότι αντιστοιχούν σε διακριτές λειτουργικές μονάδες, οι οποίες ρυθμίζουν ανεξάρτητα τη γονιδιακή έκφραση (βλ. Κεφάλαιο 7). Υποδιαμερίσματα μέσα στον πυρήνα Η εσωτερική οργάνωση του πυρήνα καταδεικνύεται περαιτέρω από τον καταμερισμό των περισσότερων πυρηνικών διεργασιών σε συγκεκριμένες, διακριτές περιοχές του πυρήνα. Πολλά σημα- SM Ο πυρήνας 0,1 mm ΕΙΚΟΝΑ 9.20 Φωτογραφία φωτονικού μικροσκοπίου που δείχνει ένα χρωμόσωμα ωοκυττάρου αμφιβίου. Φαίνονται οι αποσυμπυκνωμένοι βρόχοι ενεργώς μεταγραφόμενης χρωματίνης που εκτείνονται από έναν άξονα μη μεταγραφόμενης χρωματίνης υψηλής συμπύκνωσης. (Ευγενική προσφορά του Joseph Gall, Carnegie Institute.) ντικά ένζυμα και πρωτεΐνες του πυρήνα εντοπίζονται σε διακριτά υποπυρηνικά σωμάτια με σπογγοειδή δομή χαμηλής πυκνότητας, η οποία επιτρέπει την είσοδο και έξοδο μακρομορίων από τις υπόλοιπες περιοχές του πυρήνα. Για ορισμένες από αυτές τις δομές έχουν προσδιοριστεί σήματα στόχευσης ή συγκράτησης, τα οποία όμως δεν έχουν χαρακτηριστεί ακόμη. Η φύση και η λειτουργία αυτών των διακριτών πυρηνικών δομών παραμένει ασαφής και η κατανόηση της ενδοπυρηνικής οργάνωσης συγκεκριμένων βιοχημικών διαδικασιών αποτελεί ένα πεδίο της κυτταρικής βιολογίας που δεν έχει ερευνηθεί πλήρως. Οι πυρήνες των κυττάρων των θηλαστικών περιέχουν ομαδοποιημένες θέσεις (εστίες) αντιγραφής DNA στις οποίες λαμβάνει χώρα η αντιγραφή πολλαπλών μορίων DNA. Αυτές οι διακριτές θέσεις αντιγραφής του DNA προσδιορίστηκαν με πειράματα απεικόνισης του νεοσυντιθέμενου DNA στο εσωτερικό των πυρήνων έπειτα από σήμανση των κυττάρων με βρομοδεοξυουριδίνη, ένα ανάλογο θυμιδίνης που ενσωματώνεται στο DNA και μπορεί να ανιχνευθεί μέσω χρώσης με φθορίζοντα αντισώματα (Εικόνα 9.21). Κατά την έναρξη της σύνθεσης DNA, το DNA που μόλις είχε αντιγραφεί ανιχνεύθηκε σε 20 περίπου εστίες που ήταν συγκεντρωμένες γύρω από τον πυρηνίσκο και συνδεδεμένες με πυρηνικές λαμίνες. Στη συνέχεια, 553 554 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 (Α) (Β) ΕΙΚΟΝΑ 9.21 Ομαδοποιημένες θέσεις αντιγραφής του DNA. DNA που έχει μόλις αντιγραφεί σημάνθηκε με σύντομη έκθεση των κυττάρων σε βρομοδεοξυουριδίνη, η οποία ενσωματώνεται στο DNA στη θέση της θυμιδίνης. Αυτή η αντικατάσταση επιτρέπει την ανίχνευση του νεοσυντιθέμενου DNA μέσω ανοσοφθορισμού μετά από χρώση με ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει τη βρομοδεοξυουριδίνη. Παρατηρήστε ότι το νεοσυντιθέμενο DNA συναντάται σε διακριτές εστίες που κατανέμονται σε ολόκληρο τον πυρήνα. Οι δύο φωτογραφίες δείχνουν την κατανομή στην αρχή και στο τέλος της σύνθεσης του DNA αντίστοιχα. (Από τη δημοσίευση των B. K. Kennedy et al., 2000. Genes Dev. 14: 2855.) η διαδικασία της σύνθεσης του DNA επεκτάθηκε σε εκατοντάδες εστίες διάσπαρτες σε ολόκληρο τον πυρήνα. Εφόσον σε ένα διπλοειδές κύτταρο θηλαστικού μπορούν να είναι ενεργές ανά πάσα στιγμή περίπου 4.000 θέσεις έναρξης της αντιγραφής, καθεμία από αυτές τις εστίες αντιγραφής θα πρέπει να περιέχει πολλαπλές διχάλες αντιγραφής του DNA. Φαίνεται επομένως ότι η αντιγραφή του DNA λαμβάνει χώρα σε μεγάλες δομές που περιέχουν πολυάριθμα σύμπλοκα αντιγραφής οργανωμένα σε διακριτά λειτουργικά σωμάτια. Τα σωμάτια αυτά έχουν ονομαστεί εργοστάσια αντιγραφής. Ενώ τα ενεργώς μεταγραφόμενα γονίδια εμφανίζονται κατανεμημένα σε ολόκληρο τον πυρήνα, τα συστατικά της συσκευής ματίσματος του mRNA είναι συγκεντρωμένα σε διακριτά πυρηνικά σωμάτια, που είναι γνωστά ως πυρηνικά στίγματα (nuclear speckles). Χρώσεις ανοσοφθορισμού όπου χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα που αναγνωρίζουν snRNP και παράγοντες ματίσματος έδειξαν ότι τα συστατικά της συσκευής ματίσματος RNA συγκεντρώνονται αποκλειστικά σε αυτές τις 20 έως 50 διακριτές δομές πυρηνικών στιγμάτων και δεν κατανέμονται ομοιόμορφα σε ολόκληρο τον πυρήνα (Εικόνα 9.22). Θεωρείται ότι τα πυρηνικά στίγματα είναι θέσεις αποθήκευCooper Cell Biology, Sinauer/ASM σηςFigure συστατικών της συσκευής ματίσματος, τα οποία στη συνέχεια 9.21 Ο πυρήνας στρατολογούνται σε ενεργώς μεταγραφόμενα γονίδια κατά την επεξεργασία του pre-mRNA. Οι πυρήνες περιέχουν επίσης αρκετούς άλλους τύπους διακριτών δομών. Εκτός από τους πυρηνίσκους (που θα συζητηθούν παρακάτω), μεταξύ των δομών αυτών περιλαμβάνονται τα σωμάτια PML και τα σωμάτια Cajal. Τα σωμάτια PML (5-20 σε έναν τυπικό πυρήνα) ταυτοποιήθηκαν για πρώτη φορά ως διακριτές θέσεις εντοπισμού μιας πρωτεΐνης ρύθμισης της μεταγραφής που συνδέεται με την οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (PML, Promyelocytic Leukemia). Τα σωμάτια PML είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με τη χρωματίνη (Εικόνα 9.23) και αποτελούν θέσεις συσσώρευσης μεταγραφικών παραγόντων και πρωτεϊνών τροποποίησης της χρωματίνης (όπως είναι οι απακετυλάσες των ιστονών), οι οποίες ενδέχεται να στοχεύονται στα σωμάτια PML από το μικρό πολυπεπτίδιο SUMO (όπως συζητήθηκε στο Κεφάλαιο 8). Ωστόσο, η λειτουργία των σωματίων PML παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Τα σωμάτια Cajal (Εικόνα 9.24) περιέχουν τη χαρακτηριστική πρωτεΐνη κοϊλίνη (coilin) και πλήθος μικρών RNP. Τα σωμάτια αυτά θεωρείται ότι λειτουργούν ως θέσεις συναρμολόγησης και επεξεργασίας των RNP. 9.3 Ο πυρηνίσκος και η επεξεργασία του rRNA Το εμφανέστερο από τα πυρηνικά σωμάτια είναι ο πυρηνίσκος (βλ. Εικόνα 9.1), ο οποίος αποτελεί τη θέση μεταγραφής και επεξεργασίας του rRNA, καθώς και τη θέση έναρξης της συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων. Όπως συζητήθηκε στο προηγούμενο κεφάλαιο, 555 ΕΙΚΟΝΑ 9.22 Εντοπισμός συστα τικών της συσκευής ματίσματος. Η χρώσηCell με Biology, αντισώματα ανοσοφθοριCooper Sinauer/ASM Figure 9.22 σμού δείχνει ότι οι παράγοντες ματίσματος συγκεντρώνονται σε διακριτά σωμάτια στο εσωτερικό του πυρήνα, τα οποία ονομάζονται πυρηνικά στίγματα. (Ευγενική προσφορά του David L. Spector, Cold Spring Harbor Laboratory.) ΕΙΚΟΝΑ 9.23 Ένα σωμάτιο PML. Το σωμάτιο PML (βέλος) περιβάλλεται από χρωματίνη. (Από τη δημοσίευση των G. Dellaire, R. Nisman και D. P. Bazett-Jones, 2004. Met. Enzymol. 375: 456. Ευγενική προσφορά του D. Bazett-Jones.) 556 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΕΙΚΟΝΑ 9.24 Σωμάτια Cajal στον πυρήνα. (Α) Εικόνα του πυρήνα ενός κυττάρου HeLa σε μικροσκοπία αντίθεσης-διαφορικής συμβολής. Τα βέλη υποδεικνύουν τα δύο σωμάτια Cajal. (Β) Σήμανση του ίδιου πυρήνα με ανοσοφθορισμό, χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναγνωρίζουν τις πρωτεΐνες κοϊλίνη (πράσινο) και φιμπριλλαρίνη (κόκκινο). Η φιμπριλλαρίνη συναντάται τόσο στις πυκνές ινώδεις ζώνες των πυρηνίσκων όσο και στα σωμάτια Cajal. Η κοϊλίνη ανιχνεύεται μόνο στα σωμάτια Cajal. (Από τη δημοσίευση του J. G. Gall, 2000. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 16: 273.) (A) (Β) τα κύτταρα απαιτούν μεγάλο αριθμό ριβοσωμάτων σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές ώστε να ικανοποιήσουν τις ανάγκες τους για πρωτεϊνοσύνθεση. Τα ενεργώς αυξανόμενα κύτταρα θηλαστικών, για παράδειγμα, περιέχουν 5 έως 10 εκατομμύρια ριβοσώματα, τα οποία πρέπει να συντεθούν κάθε φορά που διαιρείται το κύτταρο. Ο πυρηνίσκος είναι ένα εργοστάσιο παραγωγής ριβοσωμάτων, σχεδιασμένο για να πληροί την ανάγκη για ρυθμιζόμενη και αποδοτική παραγωγή rRNA και για συναρμολόγηση των ριβοσωμικών υπομονάδων. Πρόσφατα στοιχεία υποδεικνύουν ότι οι πυρηνίσκοι έχουν επίσης έναν πιο γενικό ρόλο στην τροποποίηση του RNA και ότι αρκετοί τύποι μορίων RNA κινούνται από και προς τον πυρηνίσκο σε συγκεκριμένα στάδια της επεξεργασίας τους. Γονίδια του ριβοσωμικού RNA και οργάνωση του πυρηνίσκου Ο πυρηνίσκος (nucleolus), ο οποίος δεν περιβάλλεται από μεμCooper Cell Biology, Sinauer/ASM Figure 9.24 #15 βράνη, συνδέεται με τις χρωμοσωμικές περιοχές όπου περιέχονται τα γονίδια 5,8S, 18S και 28S rRNA. Τα ριβοσώματα των ανώτερων ευκαρυωτών περιέχουν τέσσερις τύπους RNA, τα 5S, 5,8S, 18S και 28S rRNA (βλ. Εικόνα 8.4). Τα 5,8S, 18S και 28S rRNA μεταγράφονται ως ενιαία μονάδα μέσα στον πυρηνίσκο από την RNΑ πολυμεράση Ι, η οποία παράγει ένα πρόδρομο ριβοσωμικό RNA, το 45S (Εικόνα 9.25). Το 45S pre-rRNA υπόκειται σε επεξεργασία, από την οποία προκύπτουν το 18S rRNA της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας (40S) και τα 5,8S και 28S rRNA της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας (60S). Η μεταγραφή του 5S rRNA, το οποίο επίσης συναντάται στη ριβοσωμική υπομονάδα 60S, λαμβάνει χώρα εκτός του πυρηνίσκου στους ανώτερους ευκαρυώτες και καταλύεται από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. Προκειμένου να ανταποκριθούν στην ανάγκη για μεγάλο αριθμό μορίων rRNA, όλα τα κύτταρα περιέχουν πολυάριθμα αντίγραφα των γονιδίων rRNA. Το γονιδίωμα του ανθρώπου, για παράδειγμα, Ο πυρήνας Μεσοδιάστημα μη μεταγραφόμενου DNA Γονίδιο rRNA 18S 5,8S 28S 557 Γονίδιο rRNA 18S 5,8S 28S DNA Μεταγραφή Μεσοδιάστημα μεταγραφόμενου DNA Pre-rRNA 45S περιέχει 200 περίπου αντίγραφα του γονιδίου που κωδικοποιεί για τα 5,8S, 18S και 28S rRNA και 2.000 περίπου αντίγραφα του γονιδίου που κωδικοποιεί για το 5S rRNA. Τα γονίδια των 5,8S, 18S και 28S rRNA ομαδοποιούνται σε συστοιχίες διαδοχικών επαναλήψεων σε πέντε διαφορετικά ανθρώπινα χρωμοσώματα (χρωμοσώματα 13, 14, 15, 21 και 22), ενώ τα γονίδια του 5S rRNA συναντώνται σε μία μόνο συστοιχία διαδοχικών επαναλήψεων στο χρωμόσωμα 1. Η σημασία της παραγωγής ριβοσωμάτων είναι ιδιαίτερα εμφανής στα ωοκύτταρα, όπου τα γονίδια rRNA ενισχύονται ώστε να υποστηριχτεί η σύνθεση του μεγάλου αριθμού ριβοσωμάτων που απαιτούνται για τα πρώιμα στάδια ανάπτυξης των εμβρύων. Στα ωοκύτταρα του βατράχου Xenopus, τα γονίδια rRNA πολλαπλασιάζονται δύο χιλιάδες περίπου φορές, με αποτέλεσμα να υπάρχουν ένα εκατομμύριο περίπου αντίγραφά τους ανά κύτταρο. Αυτά τα πολλαπλασιασμένα γονίδια rRNA κατανέμονται σε χιλιάδες πυρηνίσκους (Εικόνα 9.26), οι οποίοι υποστηρίζουν τη συσσώρευση σχεδόν 1012 ριβοσωμάτων ανά ωοκύτταρο. Από μορφολογική άποψη, ο πυρηνίσκος διακρίνεται σε τρεις περιοχές: το ινώδες κέντρο, το πυκνό ινώδες συστατικό και το κοκ- ΕΙΚΟΝΑ 9.26 Πυρηνίσκοι σε ωο κύτταρα αμφιβίων. Τα πολλαπλασιασμένα γονίδια rRNA ωοκυττάρων Xenopus συγκεντρώνονται σε πολυάριθμους πυρηνίσκους (σκουρόχρωμες κηλίδες). (Από τη δημοσίευση των D. D. Brown και I. B. Dawid, 1969. Science 160: 272.) ΕΙΚΟΝΑ 9.25 Τα γονίδια του ρι βοσωμικού RNA. Κάθε γονίδιο rRNA αποτελεί μια μονάδα μεταγραφής που περιέχει τα 18S, 5,8S και 28S rRNA, καθώς και μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενων αλληλουχιών. Τα γονίδια rRNA οργανώνονται σε συστοιχίες διαδοχικών επαναλήψεων, οι οποίες χωρίζονται μεταξύ τους από μεσοδιαστήματα μη μεταγραφόμενου DNA. 558 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΕΙΚΟΝΑ 9.27 Δομή του πυρηνί σκου. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει το ινώδες κέντρο (FC, Fibrillar Center), το πυκνό ινώδες συστατικό (DFC, Dense Fibrillar Component) και το κοκκιώδες συστατικό (G, Granular component) ενός πυρηνίσκου. (Ευγενική προσφορά του David L. Spector, Cold Spring Harbor Laboratory.) FC G DFC G DFC DFC FC 3 μm Cooper Cell Biology, Sinauer/ASM Figure 9.27 #15 κιώδες συστατικό (Εικόνα 9.27). Αυτές οι διαφορετικές περιοχές θεωρείται ότι αντιπροσωπεύουν τις θέσεις όπου επιτελούνται τα διαδοχικά στάδια της μεταγραφής rRNA, της επεξεργασίας rRNA και της συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων αντίστοιχα. Η τροποποίηση άλλων μικρών μορίων RNA, όπως αυτών του σωματίου αναγνώρισης σήματος (βλ. Κεφάλαιο 10), λαμβάνει χώρα σε άλλες περιοχές του πυρηνίσκου. Έπειτα από κάθε κυτταρική διαίρεση, οι πυρηνίσκοι συνδέονται με τις χρωμοσωμικές περιοχές που περιέχουν τα γονίδια των 5,8S, 18S και 28S rRNA, οι οποίες γι’ αυτόν τον λόγο ονομάζονται περιοχές οργανωτή του πυρηνίσκου (nucleolar organizing regions). Ο σχηματισμός πυρηνίσκων απαιτεί τη μεταγραφή του 45S pre-rRNA, η οποία φαίνεται να οδηγεί στη σύντηξη μικρών πρόδρομων σωματίων που περιέχουν παράγοντες επεξεργασίας και άλλα συστατικά του πυρηνίσκου. Στα περισσότερα κύτταρα, πυρηνίσκοι που αρχικά είναι μεμονωμένοι συντήκονται, σχηματίζοντας έναν ενιαίο, μεγαλύτερο πυρηνίσκο. Το μέγεθος του πυρηνίσκου εξαρτάται από τη μεταβολική δραστηριότητα του κυττάρου, δηλαδή μεγάλοι πυρηνίσκοι συναντώνται σε κύτταρα με έντονη πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα. Αυτή η διακύμανση μεγέθους οφείλεται κυρίως σε διαφορές στο μέγεθος του κοκκιώδους συστατικού του πυρηνίσκου, οι οποίες αντανακλούν τα διαφορετικά επίπεδα συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων. Μεταγραφή και επεξεργασία του rRNA Κάθε περιοχή οργανωτή του πυρηνίσκου περιέχει μια συστοιχία διαδοχικά επαναλαμβανόμενων γονιδίων rRNA, τα οποία χωρίζονται Ο πυρήνας μεταξύ τους από μεσοδιαστήματα μη μεταγραφόμενου DNA. Τα γονίδια αυτά μεταγράφονται πολύ ενεργά από την RNA πολυμεράση Ι και επομένως είναι ορατά με ευχέρεια σε ηλεκτρονική μικροσκοπία (Εικόνα 9.28). Στις φωτογραφίες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου, καθένα από τα γονίδια rRNA της συστοιχίας φαίνεται να περιβάλλεται από αυξανόμενες αλυσίδες RNA πυκνής διάταξης, οι οποίες σχηματίζουν μια δομή που θυμίζει χριστουγεννιάτικο δέντρο. Η υψηλή πυκνότητα των αυξανόμενων αλυσίδων RNA αντανακλά την υψηλή πυκνότητα των μορίων RNA πολυμεράσης, τα οποία συναντώνται με μέγιστη πυκνότητα ενός περίπου μορίου πολυμεράσης ανά εκατό ζεύγη βάσεων της μήτρας DNA. Στους ανώτερους ευκαρυώτες, το πρωτογενές μετάγραφο των γονιδίων rRNA είναι το μεγάλο pre-rRNA 45S, το οποίο περιέχει τα 18S, 5,8S και 28S rRNA, καθώς και μεταγραφόμενες περιοχές μεσοδιαστήματος (Εικόνα 9.29). Τόσο τα 5΄ άκρα όσο και τα 3΄ άκρα Cooper Cell Biology, Sinauer/ASMεξωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφότων pre-rRNA περιέχουν Figure 9.28 μενης αλληλουχίας, ενώ μεταξύ των αλληλουχιών των 18S, 5,8S και 28S rRNA υπάρχουν επίσης δύο εσωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενης αλληλουχίας. Τα αρχικά βήματα επεξεργασίας 5’ ETS 18S 5,8S 28S Pre-rRNA ETS 3’ ITS Ώριμα rRNA 18S 5,8S 28S 559 ΕΙΚΟΝΑ 9.28 Μεταγραφή γονι δίων rRNA. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει τη χρωματίνη του πυρηνίσκου. Φαίνονται τρία γονίδια rRNA χωρισμένα μεταξύ τους από μεσοδιαστήματα μη μεταγραφόμενου DNA. Κάθε γονίδιο rRNA περιβάλλεται από μια συστοιχία αυξανόμενων αλυσίδων RNA, σχηματίζοντας μια δομή που θυμίζει χριστουγεννιάτικο δέντρο. (Ευγενική προσφορά του O. L. Miller, Jr.) ΕΙΚΟΝΑ 9.29 Επεξεργασία του pre-rRNA. Το μετάγραφο 45S prerRNA των ανώτερων ευκαρυωτών περιέχει εξωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενης αλληλουχίας (ETS, External Transcribed Spacers) στα δύο άκρα του και εσωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενης αλληλουχίας (ΙTS, Internal Transcribed Spacers) ανάμεσα στις αλληλουχίες των 18S, 5,8S και 28S rRNA. Το prerRNA υπόκειται σε επεξεργασία μέσω μιας σειράς τομών, από τις οποίες παράγονται τα ώριμα rRNA. 560 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 του μεταγράφου περιλαμβάνουν τομές στο εξωτερικό μεσοδιάστημα μεταγραφόμενης αλληλουχίας του 5΄ άκρου του pre-rRNA και απομάκρυνση του εξωτερικού μεσοδιαστήματος μεταγραφόμενης αλληλουχίας του 3΄ άκρου. Ακολουθούν επιπλέον τομές, που οδηγούν στον σχηματισμό των ώριμων μορίων rRNA. Η επεξεργασία του rRNA ακολουθεί παρόμοιο πρότυπο σε όλους τους ευκαρυώτες, αν και μπορεί να υπάρχουν διαφορές ως προς τη σειρά ή τον αριθμό των τομών. Εκτός από τομές, η επεξεργασία του pre-rRNA περιλαμβάνει σε σημαντικό βαθμό τροποποίηση βάσεων, η οποία προκύπτει τόσο από την προσθήκη μεθυλομάδων σε συγκεκριμένες βάσεις και κατάλοιπα ριβόζης όσο και από τη μετατροπή ουριδίνης σε ψευδοουριδίνη (βλ. Εικόνα 7.44). Στα ζωικά κύτταρα, η επεξεργασία του pre-rRNA περιλαμβάνει μεθυλίωση εκατό περίπου καταλοίπων ριβόζης και δέκα αζωτούχων βάσεων, καθώς και σχηματισμό εκατό περίπου ψευδοουριδινών. Οι περισσότερες από αυτές τις τροποποιήσεις συμβαίνουν κατά τη διάρκεια ή λίγο μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης του pre-rRNA, αν και ορισμένες από αυτές λαμβάνουν χώρα σε μετέπειτα στάδια της επεξεργασίας του pre-rRNA. Η επεξεργασία του pre-rRNA προϋποθέτει τη δράση τόσο πρωτεϊνών όσο και μορίων RNA που εδράζονται στον πυρηνίσκο. Στο Κεφάλαιο 7 συζητήθηκε η συμμετοχή μικρών πυρηνικών RNA (snRNA) στο μάτισμα του pre-mRNA. Οι πυρηνίσκοι περιέχουν πάνω από 300 πρωτεΐνες και πολλά (περίπου 200) μικρά πυρηνισκικά RNA (snoRNA, small nucleolar RNA), τα οποία συμμετέχουν στην επεξεργασία του pre-rRNA. Τα snoRNA, όπως και τα snRNA του σωματίου ματίσματος, σχηματίζουν σύμπλοκα με πρωτεΐνες, δίνοντας snoRNP. Κάθε snoRNP αποτελείται από ένα μόριο snoRNA συνδεδεμένο με οκτώ έως δέκα πρωτεΐνες. Στη συνέχεια, τα snoRNP συγκεντρώνονται πάνω στο pre-rRNA και σχηματίζουν σύμπλοκα επεξεργασίας κατά τρόπο ανάλογο με τον σχηματισμό των σωματίων ματίσματος στο pre-mRNA. Ορισμένα από τα snoRNA είναι υπεύθυνα για τις τομές του prerRNA, απ’ όπου προκύπτουν προϊόντα 18S, 5,8S και 28S. Για παράδειγμα, το snoRNA U3, το οποίο συναντάται σε 200.000 περίπου αντίγραφα ανά κύτταρο και είναι αυτό που υπάρχει σε μεγαλύτερη αφθονία στον πυρηνίσκο, απαιτείται για την τομή του pre-rRNA στα 5΄ εξωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενης αλληλουχίας. Ομοίως, το snoRNA U8 απαιτείται για την τομή του pre-rRNA ώστε να προκύψουν τα 5,8S και 28S rRNA, ενώ το snoRNA U22 απαιτείται για την τομή του pre-rRNA ώστε να προκύψει το 18S rRNA. 561 Ο πυρήνας Τα περισσότερα snoRNA ωστόσο συμμετέχουν στη σύνθεση rRNA ως RNA-οδηγοί που κατευθύνουν τις ειδικές τροποποιήσεις βάσεων του pre-rRNA, όπως είναι η μεθυλίωση συγκεκριμένων καταλοίπων ριβόζης και ο σχηματισμός ψευδοουριδινών (Εικόνα 9.30). Τα περισσότερα snoRNA περιέχουν αλληλουχίες μικρού μήκους, 15 περίπου νουκλεοτιδίων, συμπληρωματικές προς τις αλληλουχίες των 18S ή 28S rRNA, οι οποίες μάλιστα περιλαμβάνουν τις θέσεις τροποποίησης βάσεων στο rRNA. Σχηματίζοντας ομόλογα ζεύγη βάσεων με τις συγκεκριμένες περιοχές του pre-rRNA, τα snoRNA λειτουργούν ως RNA-οδηγοί που καθοδηγούν τα ένζυμα της μεθυλίωσης της ριβόζης ή της ψευδοουριδυλίωσης στις σωστές θέσεις του μορίου pre-rRNA. Η τροποποίηση βάσεων είναι απαραίτητη και σε άλλους τύπους RNA εκτός του rRNA. Ένα σχετικό παράδειγμα είναι το σωμάτιο αναγνώρισης σήματος RNA (βλ. Κεφάλαιο 10). Ο εντοπισμός των snoRNP στον πυρηνίσκο θεωρείται ότι αποτελεί τη βάση του γενικότερου ρόλου που έχει ο πυρηνίσκος στις διεργασίες τροποποίησης RNA. Η συναρμολόγηση των ριβοσωμάτων Ο σχηματισμός των ριβοσωμάτων περιλαμβάνει τη συναρμολόγηση του πρόδρομου ριβοσωμικού RNA τόσο με ριβοσωμικές πρωτεΐνες όσο και με το 5S rRNA (Εικόνα 9.31). Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες μεταγράφονται έξω από τον πυρηνίσκο, από την RNA πολυμεράση ΙΙ, παράγοντας μόρια mRNA που μεταφράζονται στα ριβοσώματα του κυτταροπλάσματος. Στη συνέχεια, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μεταφέρονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρηνίσκο, όπου συναρμολογούνται μαζί με τα rRNA για να σχηματίσουν προριβοσωμικά σωμάτια. Αν και τα γονίδια του 5S rRNA μεταγράφονται επίσης έξω από τον πυρηνίσκο, σε αυτή την περίπτωση από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ, τα 5S rRNA μεταφέρονται και αυτά στο εσωτερικό του πυρηνίσκου, όπου σχηματίζουν προριβοσωμικά σωμάτια. Η σύνδεση ριβοσωμικών πρωτεϊνών με το rRNA ξεκινά ενώ η σύνθεση του pre-rRNA βρίσκεται ακόμη σε εξέλιξη και περισσότερες από τις μισές ριβοσωμικές πρωτεΐνες σχηματίζουν σύμπλοκο με το pre-rRNA snoRNP 3’ pre-rRNA 5’ CH3 ΕΙΚΟΝΑ 9.30 Ο ρόλος των snoRNA στην τροποποίηση των βάσεων του pre-rRNA. Τα snoRNA περιέχουν μικρές αλληλουχίες συμπληρωματικές με rRNA. Το ζευγάρωμα βάσεων μεταξύ snoRNA και pre-rRNA οδηγεί σε στόχευση των ενζύμων που καταλύουν τη χημική τροποποίηση αζωτούχων βάσεων (π.χ. μεθυλίωση) στις κατάλληλες θέσεις του pre-rRNA. snoRNA 5’ 3’ Cooper Cell Biology 5e, Sinauer/ASM Figure 09.30 #0827 562 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Πυρήνασ rDNA Πυρηνίσκοσ 5S rRNA Pre-rRNA Ριβοσωμικέσ πρωτεΐνεσ 28S Pre-18S Προριβοσωμικά σωμάτια 5,8S 5S 28S 18S Κυτταρόπλασμα ΕΙΚΟΝΑ 9.31 Συναρμολόγηση του ριβοσώματος. Οι ριβοσωμικές Cooper Cell Biology 5e, Sinauer/ASM πρωτεΐνες εισάγονται από το κυτταFigure 09.31 #0909 ρόπλασμα στον πυρηνίσκο και αρ03/02/06 χίζουν να συναρμολογούνται πάνω στο pre-rRNA πριν ακόμη αρχίσει η επεξεργασία του. Κατά την επεξεργασία του pre-rRNA συναρμολογούνται επιπλέον ριβοσωμικές πρωτεΐνες και το 5S rRNA (το οποίο συντίθεται σε άλλη περιοχή του πυρήνα), ώστε να σχηματιστούν προριβοσωμικά σωμάτια. Τα τελικά στάδια ωρίμανσης λαμβάνουν χώρα μετά την εξαγωγή των προριβοσωμικών σωματίων στο κυτταρόπλασμα και οδηγούν στον σχηματισμό των ριβοσωμικών υπομονάδων 40S και 60S. Υπομονάδα 40S Υπομονάδα 60S 5,8S 5S pre-rRNA πριν αρχίσει η τομή του. Οι υπόλοιπες ριβοσωμικές πρωτεΐνες καθώς και το 5S rRNA ενσωματώνονται στα προριβοσωμικά σωμάτια προοδευτικά κατά την τομή του pre-rRNA. Από τα αρχικά στάδια συναρμολόγησης του ριβοσώματος, η επεξεργασία των δύο νεοσχηματιζόμενων ριβοσωμικών υπομονάδων ακολουθεί διαφορετική πορεία. Η επεξεργασία της μικρότερης υπομονάδας (40S), που περιέχει μόνο το 18S rRNA, είναι απλούστερη και περιλαμβάνει μόνο τέσσερις ενδονουκλεολυτικές τομές. Στους ανώτερους ευκαρυώτες, η επεξεργασία αυτή ολοκληρώνεται μέσα στον πυρήνα, ενώ στον σακχαρομύκητα η τελική τομή που οδηγεί στον σχηματισμό του ώριμου 18S rRNA συμβαίνει μετά την εξαγωγή της υπομονάδας 40S στο κυτταροδιάλυμα. Η επεξεργασία της μεγαλύτερης υπομονάδας (60S), που περιέχει τα 28S, 5,8S και 5S rRNA, περιλαμβάνει εκτενείς νουκλεολυτικές τομές και ολοκληρώνεται μέσα στον πυρηνίσκο. Κατά συνέπεια, τα περισσότερα προριβοσωμικά σωμάτια στον πυρηνίσκο αντιστοιχούν σε πρόδρομα σύμπλοκα της μεγάλης υπομονάδας (60S). Τα τελικά στάδια ωρίμανσης των ριβοσωμικών υπομονάδων ολοκληρώνονται μετά την εξαγωγή των προριβοσωμικών σωματίων στο κυτταρόπλασμα και οδηγούν στον σχηματισμό των ενεργών υπομονάδων 40S και 60S των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων. Ο πυρήνας ΠΕΡΙΛΗΨΗ 563 ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΙ ΟΡΟΙ Ο πυρηνικός φάκελος και η κυκλοφορία μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα Η δομή του πυρηνικού φακέλου: Ο πυρηνικός φάκελος διαχωρίζει τα περιεχόμενα του πυρήνα από το κυτταρόπλασμα, διατηρώντας τον πυρήνα ως ένα διακριτό βιοχημικό διαμέρισμα που στεγάζει το γενετικό υλικό και λειτουργεί ως θέση μεταγραφής και επεξεργασίας του RNA στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ο πυρηνικός φάκελος αποτελείται από την εσωτερική και την εξωτερική πυρηνική μεμβράνη, οι οποίες ενώνονται στα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων, και από την πυρηνική λάμινα, που υποστηρίζει την πυρηνοπλασματική επιφάνεια της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης. πυρηνικός φάκελος (nuclear envelope), πυρηνική μεμβράνη (nuclear membrane), πυρηνική λάμινα (nuclear lamina), λαμίνη (lamin) Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου: Τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων είναι μεγάλες δομές που παρέχουν τις μοναδικές διόδους για τη διακίνηση μορίων μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Μικρά μόρια διαχέονται ελεύθερα μέσω ανοικτών διαύλων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Μακρομόρια μεταφέρονται επιλεκτικά με μια διαδικασία που απαιτεί δαπάνη ενέργειας. σύμπλοκο πυρηνικού πόρου (nuclear pore complex) Επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών από και προς τον πυρήνα: Οι πρωτεΐνες που προορίζονται για εισαγωγή στον πυρήνα περιέχουν σήματα πυρηνικού εντοπισμού τα οποία αναγνωρίζονται από υποδοχείς που κατευθύνουν τη μεταφορά αυτών των πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Οι πρωτεΐνες που παλινδρομούν μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος περιέχουν σήματα πυρηνικής εξαγωγής τα οποία υπαγορεύουν τη μεταφορά τους από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Στις περισσότερες περιπτώσεις, για τη μετακίνηση μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου απαιτείται η μικρή πρωτεΐνη Ran, μια πρωτεΐνη πρόσδεσης GTP η οποία καθορίζει και την κατεύθυνση της μεταφοράς. σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS, Nuclear Localization Signal), υποδοχέας πυρηνικής μεταφοράς (nuclear transport receptor), ιμπορτίνη (importin), Ran, σήμα πυρηνικής εξαγωγής (nuclear export signal), εξπορτίνη (exportin), καρυοφερίνη (karyopherin) Βλ. Αnimation 9.1 Ρύθμιση της εισαγωγής πρωτεϊνών στον πυρήνα: Η ενεργότητα ορισμένων πρωτεϊνών, όπως των μεταγραφικών παραγόντων, ελέγχεται μέσω ρύθμισης της εισαγωγής και της εξαγωγής τους από και προς τον πυρήνα. Μεταφορά των μορίων RNA: Τα RNA μεταφέρονται μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου υπό μορφή ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων. Τα αγγελιαφόρα RNA, τα ριβοσωμικά RNA και τα μεταφορικά RNA εξάγονται από τον πυρήνα ώστε να λάβουν μέρος στην πρωτεϊνοσύνθεση. Αρκετές κατηγορίες μικρών πυρηνικών RNA μεταφέρονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, όπου συνδέονται με πρωτεΐνες σχηματίζοντας RNP, και στη συνέχεια επαναφέρονται στον πυρήνα. Εσωτερική οργάνωση του πυρήνα Χρωμοσώματα και υψηλότερη οργάνωση δομής της χρωματίνης: Ο μεσοφασικός πυρήνας περιέχει ετεροχρωματίνη, η οποία είναι μεταγραφικά ανενεργή και ιδιαίτερα συμπυκνωμένη, καθώς και ευχρωματίνη, η οποία είναι αποσυμπυκνωμένη. Τα μεσοφασικά χρωμοσώματα διευθετούνται με οργανωμένο τρόπο στο εσωτερικό του πυρήνα και χωρίζονται σε μεγάλες επικράτειες βρόχων που λειτουργούν ως ανεξάρτητες μονάδες. ετεροχρωματίνη (eterochromatin), ευχρωματίνη (euchromatin) 564 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΙ ΟΡΟΙ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Υποδιαμερίσματα μέσα στον πυρήνα: Μερικές διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα μέσα στον πυρήνα, όπως η αντιγραφή του DNA και ο μεταβολισμός του mRNA, μπορεί να εντοπίζονται σε διακριτές υποπυρηνικές δομές. Ο πυρηνίσκος και η επεξεργασία του rRNA πυρηνίσκος (nucleolus), περιοχή οργανωτή του πυρηνίσκου (nucleolar organizing region) Γονίδια του ριβοσωμικού RNA και οργάνωση του πυρηνίσκου: Ο πυρηνίσκος συνδέεται με τα γονίδια που κωδικοποιούν για ριβοσωμικά RNA. Αποτελεί τη θέση της μεταγραφής rRNA, της επεξεργασίας rRNA, της συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων και της τροποποίησης αρκετών μικρών μορίων RNA. μικρό πυρηνισκικό RNA (snoRNA, small nucleolar RNA) Μεταγραφή και επεξεργασία του rRNA: Το πρωτογενές μετάγραφο των γονιδίων rRNA είναι το pre-rRNA 45S, από την επεξεργασία του οποίου προκύπτουν τα 18S, 5,8S και 28S rRNA. Η επεξεργασία του pre-rRNA και άλλων μικρών RNA επιτυγχάνεται μέσω μικρών πυρηνισκικών RNA (snoRNA). Η συναρμολόγηση των ριβοσωμάτων: Οι υπομονάδες των ριβοσωμάτων συναρμολογούνται μέσα στον πυρηνίσκο από rRNA και ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Ερωτήσεις 1. Διαχωρίζοντας τη θέση της μεταγραφής από τη θέση της μετάφρασης, ο πυρηνικός φάκελος δίνει στους ευκαρυώτες τη δυνατότητα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης μέσω διαδικασιών που δε συναντώνται στους προκαρυώτες. Ποιοι είναι αυτοί οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί που συναντώνται αποκλειστικά στους ευκαρυώτες; 2. Ποιους ρόλους διαδραματίζουν οι λαμίνες στη δομή και στη λειτουργία του πυρήνα; 3. Έστω ότι ενίετε σε ένα ωάριο βατράχου δύο σφαιρικές πρωτεΐνες. Η μία έχει μοριακή μάζα 15 kDa, η άλλη 100 kDa και καμία από τις δύο δε φέρει σήμα πυρηνικού εντοπισμού. Θα εισέλθει κάποια από αυτές στον πυρήνα; 4. Τι καθορίζει την κατευθυντικότητα της εισαγωγής στον πυρήνα; 5. Περιγράψτε πώς μπορεί να ρυθμιστεί η ενεργότητα ενός μεταγραφικού παράγοντα στο επίπεδο της εισαγωγής του στον πυρήνα. 6. Έστω ότι μελετάτε έναν μεταγραφικό παράγοντα που ρυθμίζεται μέσω της φωσφορυλίωσης καταλοίπων σερίνης και γνωρίζετε ότι η φωσφορυλίωση αυτή απενεργοποιεί το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του. Πώς θα επηρέαζε τον υποκυτταρικό εντοπισμό του μεταγραφικού παράγοντα και την έκφραση του γονιδίου-στόχου του η αντικατάσταση αυτών των καταλοίπων σερίνης με αλανίνη; 7. Πώς θα μπορούσε να επηρεάσει την υποκυτταρική κατανομή μιας πρωτεΐνης η οποία κανονικά παλινδρομεί μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος μια μεταλλαγή που απενεργοποιεί το σήμα πυρηνικής εξαγωγής της; 8. Η αντιγραφή του DNA φαίνεται ότι λαμβάνει χώρα σε συγκεκριμένες θέσεις ή εργοστάσια αντιγραφής. Πώς θα μπορούσατε να εντοπίσετε αυτές τις θέσεις σε κύτταρα θηλαστικών σε καλλιέργεια; 9. Πώς έδειξαν ο Smith και οι συνεργάτες του ότι η αλληλουχία αμινοξέων 126-132 του αντιγόνου Τ επαρκεί για τη συσσώρευση της πρωτεΐνης αυτής στον πυρήνα; 10. Ποια είναι η σημασία των πυρηνικών στιγμάτων; 11. Ποια είναι η λειτουργία των snoRNA; 12. Ποια επίδραση θα είχε η χορήγηση RNAi έναντι της ανθρώπινης εξπορτίνης t σε καλλιέργεια ανθρώπινων ινοβλαστών; Ο πυρήνας 565 Βιβλιογραφικές αναφορές Ο πυρηνικός φάκελος και η κυκλοφορία μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα Alber, F., S. Dokudovskaya, L. M. Veenhoff, W. Zhang, J. Kipper, D. Devos, A. Suprapto, O. Karni-Schmidt, R. Williams, B. T. Chait, A. Sali and M. P. Rout. 2007. The molecular architecture of the nuclear pore complex. Nature 450: 695-701. [P] Beck, M., V. Lucic, F. Forster, W. Baumeister and O. Medalia. 2007. Snapshots of nuclear pore complexes in action captured by cryo-electron tomography. Nature 449: 611-615. [P] Chook, Y. M. and G. Blobel. 1999. Structure of the nuclear transport complex karyopherin-ß2-Ran•GppNHp. Nature 399: 230–237. [P] Crisp, M. and B. Burke. 2008. The nuclear envelope as an integrator of nuclear and cytoplasmic architecture. FEBS Lett. 582: 2023-2032. [R] Cronshaw, J. M., A. N. Krutchinsky, W. Zhang, B. T. Chait and M. J. Matunis. 2002. Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex. J. Cell Biol. 158: 915–927. [P] protein function in development. Trends Cell Biol. 14: 294–302. [R] mary mammalian cells. Genes Dev. 14: 2855–2868. [P] Presgraves, D. C., L. Balagopalan, S. M. Abmayr and H. A. Orr. 2003. Adaptive evolution drives divergence of a hybrid inviability gene between two species of Drosophila. Nature 423: 715–719. [P] Lanctôt, C., T. Cheutin, M. Cremer, G. Cavalli and T. Cremer. 2007. Dynamic genome architecture in the nuclear space: regulation of gene expression in three dimensions. Nature Rev. Genet. 8: 104115. [R] Quimby, B. B. and M. Dasso. 2003. The small GTPase Ran: Interpreting the signs. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 338–344. [R] Stewart, M. 2007. Molecular mechanism of the nuclear protein import cycle. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8: 195-208. [R] Tran, E. J. and S. R. Wente. 2006. Dynamic nuclear pore complexes: life on the edge. Cell 125: 1041-1053. [R] Taddei, A., H. G. Van, F. Hediger, V. Kalck, F. Cubizolles, H. Schober and S. M. Gasser. 2006. Nuclear pore association confers optimal expression levels for an inducible yeast gene. Nature 441: 774-778. [P] Weis, K. 2003. Regulating access to the genome: Nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle. Cell 112: 441– 451. [R] Takahashi, Y., V. Lallemand-Breitenbach, J. Zhu and T. H. de Thé. 2004. PML nuclear bodies and apoptosis. Oncogene 23: 2819– 2824. [R] Εσωτερική οργάνωση του πυρήνα Trinkle-Mulcahy, L. and A. I. Lamond. 2008. Nuclear functions in space and time: Gene expression in a dynamic, constrained environment. FEBS Lett. 582: 1960-1970. [R] Bernardi, R. and P. P. Pandolfi. 2007. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8: 1006-1016. [R] Gruenbaum, Y., A. Margalit, R. D. Goldman, D. K. Shumaker and K. L. Wilson. 2005. The nuclear lamina comes of age. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6: 21–31. [R] Branco, M. R. and A. Pombo. 2007. Chromo some organization: new facts, new models. Trends Cell Biol. 17: 127-134. [R] Kohler, A. and E. Hurt. 2007. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8: 761-773. [R] Meier, I. 2007. Composition of the plant nuclear envelope: theme and variations. J. Exp. Bot. 58: 27-34. [R] Mosammaparast, N. and L. F. Pemberton. 2004. Karyopherins: From nuclear-transport mediators to nuclear-function regulators. Trends Cell Biol. 14: 547–556. [R] Polesello, C. and F. Payre. 2004. Small is beautiful: What flies tell us about ERM Sexton, T., H. Schober, P. Fraser and S. M. Gasser. 2007. Gene regulation through nuclear organization. Nature Struct. Mol. Biol. 14: 1049-1055. [R] Vetter, I. R., A. Arndt, U. Kutay, D. Gorlich and A. Wittinghofer. 1999. Structural view of the Ran-importin β interaction at 2.3 Å resolution. Cell 67: 635–646. [P] Goldman, R. D., Y. Gruenbaum, R. D. Moir, D. K. Shumaker and T. P. Spann. 2002. Nuclear lamins: Building blocks of nuclear architecture. Genes Dev. 16: 533–547. [R] King, M. C., C. P. Lusk and G. Blobel. 2006. Karyopherin-mediated import of integral inner nuclear membrane proteins. Nature 442: 1003-1007. [P] Misteli, T., J. F. Caceres and D. L. Spector. 1997. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature 387: 523–527. [P] Gall, J. G. 2000. Cajal bodies: The first 100 years. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 16: 273– 300. [R] Grosshans, H., K. Deinert, E. Hurt and G. Simos. 2001. Biogenesis of the signal recognition particle (SRP) involves import of SRP proteins into the nucleolus, assembly with the SRP-RNA, and Xpo1p-mediated export. J. Cell Biol. 153: 745–762. [P] Johnson, A. W., E. Lund and J. Dahlberg. 2002. Nuclear export of ribosomal subunits. Trends Biochem. Sci. 27: 580–585. [R] Kennedy, B. K., D. A. Barbie, M. Classon, N. Dyson and E. Harlow. 2000. Nuclear organization of DNA replication in pri- Vartiainen, M. K. 2008. Nuclear actin dynamics–From form to function. FEBS Lett. 582:2033-2040. [R] Ο πυρηνίσκος και η επεξεργασία του rRNA Granneman, S. and S. J. Baserga. 2004. Ribo some biogenesis: Of knobs and RNA processing. Exp. Cell Res. 296: 43–50. [R] Kiss, T. 2002. Small nucleolar RNAs: An abundant group of noncoding RNAs with diverse cellular functions. Cell 109: 145–148. [R] Miller, O. L., Jr. and B. Beatty. 1969. Visual ization of nucleolar genes. Science 164: 955–957. [P] Nazar, R. N. 2004. Ribosomal RNA processing and ribosome biogenesis in eukaryotes. IUBMB Life 56: 457–465. [R] Olson, M. O., K. Hingorani and A. Szebeni. 2002. Conventional and nonconventional 566 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 roles of the nucleolus. Int. Rev. Cytol. 219: 199–266. [R] Thiry, M. and D. L. Lafontaine. 2005. Birth of a nucleolus: The evolution of nucleo- lar compartments. Trends Cell Biol. 15: 194–199. [R] Zemp, I. and U. Kutay. 2007. Nuclear export and cytoplasmic maturation of ribosomal subunits. FEBS Lett. 581:2783-2793. [R]
© Copyright 2024 Paperzz
