ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ
ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ
ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ
ΝΕΦΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ
Δ/ΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ. Χ. ΣΙΑΜΟΠΟΥΛΟΣ
ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΩΝ ΕΠΙΤΟΠΩΝ ΜΕ ΣΥΝΘΕΣΗ
ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ
ΑΥΤΟΑΝΟΣΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΤΑ ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ.
ΙΩΑΝΝΗΣ Γ. ΡΟΥΤΣΙΑΣ
ΧΗΜΙΚΟΣ, ΙΑΤΡΟΣ
ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ
ΙΩΑΝΝΙΝΑ 1998
ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ
ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ
ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ
ΝΕΦΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ
Δ/ΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ. Χ. ΣΙΑΜΟΠΟΥΛΟΣ
ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΩΝ ΕΠΙΤΟΠΩΝ ΜΕ ΣΥΝΘΕΣΗ
ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ
ΑΥΤΟΑΝΟΣΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΤΑ ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ.
ΙΩΑΝΝΗΣ Γ. ΡΟΥΤΣΙΑΣ
ΧΗΜΙΚΟΣ, ΙΑΤΡΟΣ
ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ
ΙΩΑΝΝΙΝΑ 1998
Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή
του
Πανεπιστημίου Ιωαννίνων δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα
(Νομός 5343/32, άρθρο 202, §2).
ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ
1.
Σιαμόπουλος Κωνσταντίνος, Καθηγητής Παθολογίας/Νεφρολογίας Ιατρικής
Σχολής Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων, επιβλέπων.
2.
Μουτσόπουλος Χαράλαμπος, Καθηγητής Παθολογικής Φυσιολογίας Ιατρικής
Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών, μέλος.
3.
Δρόσος Αλεξανδρός, Αναπληρωτής Καθηγητής Παθολογίας/Ρευματολογίας
Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, μέλος.
ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ
1.
Μουτσόπουλος Χαράλαμπος, Καθηγητής Παθολογικής Φυσιολογίας Ιατρικής
Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών, μέλος.
2.
Σακαρέλλος Κωνσταντίνος, Καθηγητής Οργανικής Χημείας Χημικού Τμήματος,
Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, μέλος.
3.
Σακαρέλλου-Δαϊτσιώτου Μαρία, Καθηγήτρια Βιοχημείας Χημικού Τμήματος
Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, μέλος.
4.
Σιαμόπουλος Κωνσταντίνος, Καθηγητής Παθολογίας/Νεφρολογίας Ιατρικής
Σχολής Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων, επιβλέπων.
5.
Τσόλας Ορέστης, Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου
Ιωαννίνων, μέλος.
6.
Δρόσος Αλέξανδρος, Αναπληρωτής Καθηγητής Παθολογίας/Ρευματολογίας
Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, μέλος.
7.
Τζιούφας Αθανάσιος, Επίκουρος Καθηγητής Παθολογικής Φυσιολογίας Ιατρικής
Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών, μέλος.
Στους γονείς μου
Σε όσους με στήριξαν
στην προσπάθεια μου αυτή
ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ
ADCC:
Κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από το αντίσωμα
AIDS:
Σύνδρομο επίκτητης ανοσοποιητικής ανεπάρκειας
ANA:
Αντιπυρηνικά αντισώματα
ΒΗΑ:
Βενζυδρυλαμίνη ρητίνη
BOC:
t-βουτυλοξυκαρβόνυλο ομάδα
cDNA:
Συμπληρωματικό DNA
CDRs:
Συμπληρωματικές καθορίζουσες την αντιγονικότητα περιοχές
DCC:
Δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμίδιο
DMF:
Διμεθυλοφορμαμίδιο
dsDNA:
DNA διπλής έλικας
EAE:
Πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλίτιδα
ELISA:
Ανοσοενζυμική μέθοδος στερεάς φάσεως
ENA:
Αυτοαντισώματα κατά εκχυλισμάτων πυρήνα
Fab:
Περιοχή αντισώματος που αλληλεπιδρά με το αντιγόνο
Fc:
Σταθερή περιοχή αντισώματος
Fmoc:
9-φλουορενυλομεθυλοξυκαρβόνυλο ομάδα
HLA:
Ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα
IgA:
Ανοσοσφαιρίνη A
IgE:
Ανοσοσφαιρίνη E
IgG:
Ανοσοσφαιρίνη G
IgM:
Ανοσοσφαιρίνη M
IL-1:
Ιντερλευκίνη 1
IL-10:
Ιντερλευκίνη 10
IL-2:
Ιντερλευκίνη 2
IL-3:
Ιντερλευκίνη 3
IL-4:
Ιντερλευκίνη 4
IL-5:
Ιντερλευκίνη 5
IL-6:
Ιντερλευκίνη 6
IL-10:
Ιντερλευκίνη 10
IL-13:
Ιντερλευκίνη 13
INF-γ:
Ιντερφερόνη γ
MHC-I:
Μέγιστο σύμπλεγμά ιστοσυμβατότητας τάξεως Ι
MHC-IΙ:
Μέγιστο σύμπλεγμά ιστοσυμβατότητας τάξεως ΙΙ
ΜΝΣΙ:
Μικτή νόσος του συνδετικού ιστού
MPS:
Τεχνική πολλαπλής πεπτιδικής σύνθεσης
PAGE:
Ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου
PAM:
4-υδρόξυ-φαίνυλο-ακετάμιδο-μέθυλο ρητίνη
Pfp:
Πενταφθοροφαινυλεστέρας
ΡΑ:
Ρευματοειδής Αρθρίτιδα
RGD:
Αλληλουχία προσκόλλησης (Arg-Gly-Asp)
RIA:
Ραδιοανοσολογική μέθοδος
rRNA:
Ριβοσωματικό RNA
SDS:
Δωδεκυλοθειϊκό νάτριο
ΣΕΛ:
Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος
ΣΣ:
Σύνδρομο Sjogren
TCR:
Υποδοχέας Τ-λεμφοκυττάρου
TFA:
Τριφθοροοξεικό οξύ
TH1:
Τ-βοηθητικά 1 λεμφοκύτταρα
TH2:
Τ-βοηθητικά 2 λεμφοκύτταρα
TNF:
Παράγοντας νέκρωσης των όγκων
VSV:
Ιός της φυσαλιδώδους στοματίτιδας
ΠΡΟΛΟΓΟΣ
Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή εκπονήθηκε στο Ανοσολογικό Εργαστήριο
του τομέα Παθολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων και
εν μέρει στο Ερευνητικό Εργαστήριο Χημείας Πεπτιδίων και τομέα Οργανικής
Χημείας και Βιοχημεία του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων
στη περίοδο 1991-1998 όπου εργάσθηκα ως Ειδικός Μεταπτυχιακός Υπότροφος
(Ε.Μ.Υ.) του Ιδρύματος Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ) (έτη 1992-1998).
Το θέμα της Διδακτορικής Διατριβής μου ανέθεσε ο καθηγητής της Ιατρικής
Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών κ. Χαράλαμπος Μ Μουτσόπουλος σε
συνεργασία με τον καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Σακαρέλλο και την καθηγήτρια κ.
Μαρία Σακαρέλλου-Δαϊτσιώτου του Χημικού Τμήματος του Πανεπιστημίου
Ιωαννίνων, στους οποίους εκφράζω και την βαθιά μου ευγνωμοσύνη για την
ανάθεση της διατριβής και τη μύηση μου στα δύσβατα πεδία της έρευνας.
Ιδιαίτερα υποβάλω τις θερμές ευχαριστίες μου στο καθηγητή κ. Χαράλαμπο
Μουτσόπουλο για την αμέριστη, γεμάτη οξυδέρκεια και συνεχή συμπαράσταση
του στην εκπόνηση της διατριβής και τη καθοριστική συμβολή του στην
επιστημονική μου κατάρτιση και σταδιοδρομία. Επίσης θερμότατες ευχαριστίες
υποβάλω
στην καθηγήτρια κ.
Μαρία Σακαρέλλου-Δαϊτσιώτου και στον
καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Σακαρέλλο για την ακούραστη παρακολούθηση,
καθοδήγηση και την πολύτιμη βοήθεια τους σε όλη
την περίοδο της
πραγματοποίησης της διατριβής μου. Τις θερμές μου ευχαριστίες και τα
ευγνώμονα αισθήματα μου ακόμη απευθύνω στον Επίκουρο Καθηγητή της
Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών κ. Αθανάσιο Γ Τζιούφα για την
παρακολούθηση, τις πολύτιμες συμβουλές και την ακαταπόνητη και συνεχή
συνδρομή του στην εκπόνηση και ολοκλήρωση της διατριβής αυτής.
Θερμές ευχαριστίες ε πίσης οφείλω στον καθηγητή Παθολογίας/Νεφρολογίας κ.
Κωνσταντίνο
Σιαμόπουλο
Παθολογίας/Ρευματολογίας
συμπαράσταση
που
μου
και
κ.
στον
Αλέξανδρο
προσέφεραν.
αναπληρωτή
Δρόσο
Ιδιαίτερα
για
θα
καθηγητή
την
ήθελα
ευχαριστήσω τον Επίκουρο καθηγητή του Χημικού τμήματος
ειλικρινή
επίσης
να
κ. Βασίλειο
Τσίκαρη για τη μεγάλη βοήθεια, τις πολύτιμες οδηγίες και συμβουλές καθώς και
την
αμέριστη
συμπαράσταση
που
μου
έδειξε.
Ακόμα
ευχαριστώ
τους
μεταπτυχιακούς συνεργάτες Έφη Γιαννάκη, Δήμητρα Μπούμπα, Κώστα Κίστη,
Δημήτρη Τζοβάρα, Κατερίνα Ρίζου, Άρη Κονίδη και το προσωπικό του
Ανοσολογικού Εργαστηρίου Τζένη Σπύρου, Κλ. Γκαραλέα, Αλ. Μάγκου, και Γλ.
Παπατζίμα για την ηθική υποστήριξη, την άριστη συνεργασία και την πολύτιμη
συμπαράσταση τους.
Ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στον Γιώργο Παπανικολάου για την
συμβολή του στην εμφάνιση του κειμένου και τον Θανάση Παγώνη για τη
συμβολή
του στην δημιουργία
ορισμένων
σχημάτων.
Τέλος θερμότατες
ευχαριστίες οφείλω στους φίλους μου και σε όσους με στήριξαν στην
προσπάθεια μου αυτή.
Η εργασία αυτή υποστηρίχτηκε οικονομικά από τα ερευνητικά προγράμματα (i)
ΕΠΕΤ ΙΙ – ΕΚΒΑΝ-ΙΙ Π #45 της Γενικής Γραμματείας Έρευνας και
Τεχνολογίας
(ΓΓΕΤ)
με
τίτλο
«Προτυποποίηση
μεθόδων
ανίχνευσης
αυτοαντισωμάτων με τη χρήση συνθετικών πεπτιδίων», (ii) ΓΓΕΤ: 3526 (ΕΡΕ)
με τίτλο «Ανάπτυξη μοριακών τεχνικών και ανοσοδραστικών συνθετικών
πεπτιδίων για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων κατά Ro/SSA» και (iii)
Ε339/Α2 /5664/1992/Υπ. Υγείας Προν. Κοιν. Ασφ. με τίτλο «Παραγωγή και
χρήση συνθετικών πεπτιδίων στην ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό
αυτοαντισωμάτων: Εφαρμογές στη διάγνωση και πρόγνωση των αυτοάνοσων
ρευματικών νόσων και της βαρειάς μυασθένειας» με υπεύθυνους τους
καθηγητές κ. Χ. Μ. Μουτσόπουλο και κ. Κ. Σακαρέλλο.
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ
Γενικό Μέρος
Α. ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΕΠΤΙΔΙΑ
Α.Ι. Συνθετικά πεπτίδια και εφαρμογές τους στην ιατρική
1
Α.Ι.1 Γενικά............................................................................................................................. 1
Α.Ι.2 Διαγνωστικές μέθοδοι .................................................................................................... 2
Α.Ι.3 Ανοσοποιήσεις-Εμβόλια ................................................................................................ 3
Α.Ι.4 Θεραπευτικές χρήσεις πεπτιδίων.................................................................................... 6
Α.Ι.4.1 Νεοπλασίες-Καρκίνος............................................................................................. 6
Α.Ι.4.2 Αυτοάνοσες νόσοι ................................................................................................... 7
Α.Ι.4.3 Μεταμοσχεύσεις ..................................................................................................... 8
Α.I.4.4 Άλλες χρήσεις.......................................................................................................... 8
Α.ΙΙ. Πεπτιδική σύνθεση............................................................................................................. 10
Α.III. Τεχνικές πεπτιδικής σύνθεσης ......................................................................................... 12
Α.ΙΙI.1 Σύνθεση σε υγρή φάση............................................................................................... 12
Α.ΙII.2 Σύνθεση σε στερεά φάση ........................................................................................... 13
Α.ΙΙI.2.1 Το αδιάλυτο πολυμερές ..................................................................................... 15
Α.ΙΙI.2.2 Προστατευτικές ομάδες...................................................................................... 16
Α.ΙΙI.2.3 Μέθοδοι σύζευξης .............................................................................................. 17
Α.IV. Σύνθεση πολλαπλών πεπτιδίων......................................................................................... 20
Α.IV.1 Γενικά ........................................................................................................................ 20
Α.IV.2 Σύνθεση σε «Σακουλάκι τσαγιού» ............................................................................. 21
Α.IV.3 Σύνθεση σε «Κηλίδες κυτταρίνης» ............................................................................ 22
Α.IV.4 Σύνθεση σε δίσκους κυτταρίνης ή βαμβακιού ........................................................... 23
Α.IV.5 Σύνθεση σε φιλμ πολυστυρολίου-πολυαιθυλενίου...................................................... 23
Α.IV.6 Σύνθεση σε ράβδούς .................................................................................................. 23
A.V. Βιβλιοθήκες πεπτιδίων ....................................................................................................... 30
Β. ΑΝΟΣΙΑ-ΑΥΤΟΑΝΟΣΙΑ
Β.Ι. Η φυσιολογική απόκριση ..................................................................................................... 33
Β.Ι.1 Γενικά ........................................................................................................................... 33
Β.Ι.2 Η Ανοσολογική απόκριση............................................................................................. 35
Β.Ι.2.1 Αναγνώριση του αντιγόνου.................................................................................... 35
Β.Ι.2.2 Παρουσίαση του αντιγόνου ................................................................................... 39
Β.Ι.2.3 Ενεργοποίηση ανοσοδραστικών κυττάρων ........................................................... 40
B.I.2.4 Ρυθμιστικοί μηχανισμοί ......................................................................................... 43
Β.Ι.2.5 Θυμοανεξάρτητη ανοσολογική απάντηση.............................................................. 45
Β.ΙΙ. Η αυτοάνοση ανοσολογική απόκριση................................................................................. 46
Β.ΙΙ.1 Αιτιολογικοί μηχανισμοί.............................................................................................. 47
B.II.2 Γενετικές Συσχετίσεις.................................................................................................. 51
Γ. ΑΝΤΙΓΟΝΑ-ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΗ ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗ
Γ.I Αντιγόνα και η αλληλεπίδραση τους με τα αντισώματα........................................................ 55
Γ.II Μέθοδοι αντιγονικής χαρτογράφησης ................................................................................ 61
Γ.II.1 Γενικά .......................................................................................................................... 61
Γ.II.2 Αντιγονική χαρτογράφηση με αλγόριθμους πρόβλεψης αντιγονικότητας.................... 61
Γ.II.3 Αντιγονική χαρτογράφηση με ενζυματική πέψη .......................................................... 63
Γ.II.4 Αντιγονική χαρτογράφηση με ανασυνδιασμένες πρωτεϊνες ........................................ 64
Γ.II.5 Αντιγονική χαρτογράφηση με συνθετικά πεπτίδια....................................................... 65
Γ.II.5.1 Εντοπισμός των επιτόπων .................................................................................... 67
Γ.II.5.2 Περιορισμός του μήκους των επιτόπων ................................................................ 69
Γ.II.5.3 Καθορισμός των σημαντικών για τη δέσμευση του αντισώματος αμινοξέων. ....... 71
Γ.II.5.4 Η στρατηγική των μιμοτόπων................................................................................ 71
Δ. ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ Ro/SSA ΚΑΙ ΚΑΛΡΕΤΙΚΟΥΛΙΝΗΣ
Δ.I. Αυτοαντισώματα.................................................................................................................. 75
Δ.I.1 Γενικά ........................................................................................................................... 75
Δ.Ι.2 Η ποικιλομορφία των αυτοαντισωμάτων....................................................................... 76
Δ.I.3 Αυτοντισώματα κατά ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων......................................... 77
Δ.II Το ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο Ro RNP.................................................................. 79
Δ.ΙΙ.1 Δομή του συμπλόκου Ro RNP ..................................................................................... 79
Δ.II.1.1 Τα hY RNAs ........................................................................................................ 80
Δ.II.1.2 Η πρωτεΐνη Ro60KD............................................................................................ 81
Δ.II.1.3 Η πρωτεΐνη Ro52KD............................................................................................ 83
Δ.II.1.4 Η πρωτεΐνη La48KD ............................................................................................ 85
Δ.II.1.5 Η πρωτεΐνη καλρετικουλίνη 46KD ....................................................................... 86
Δ.II.2 Πιθανός λειτουργικός ρόλος του RoRNP.................................................................... 87
Δ.II.2.1 Πιθανός βιολογικός ρόλος της La πρωτεϊνης ....................................................... 88
Δ.II.2.2 Πιθανός βιολογικός ρόλος της Ro60 πρωτεϊνης................................................... 88
Δ.II.2.3 Πιθανός βιολογικός ρόλος της Ro52 πρωτεϊνης................................................... 89
Δ.II.2.4 Πιθανός βιολογικός ρόλος της καλρετικουλίνης .................................................. 90
Δ.II.3 Σχηματισμός των RoRNP συμπλόκων ......................................................................... 92
Δ.IIΙ Αυτοαντισώματα κατά Ro/SSA και καλρετικουλίνης ..................................95
Δ.III.1 Τα αυτοαντισώματα αντί-Ro/SSA .............................................................................. 95
Δ.ΙΙI.1.1 Ιστορική αναδρομή – Ποσοστά εμφάνισης ......................................................... 95
Δ.III.1.2 Ετερογένεια της αντί-Ro ανοσολογικής απόκρισης............................................ 96
Δ.III.1.3 Γένεση των αυτοαντισωμάτων αντί-Ro ............................................................... 97
Δ.III.1.3.1 Μοριακή μίμηση με τον ιό της Φυσσαλιδώδους Στοματίτιδας..................... 97
Δ.III.1.3.2 Αλλαγές στην ποσοτική και ποιοτική έκφραση του Ro αντιγόνου κάτω
από συνθήκες στρές ή ορμονικής διέγερσης................................................ 98
Δ.III.1.3.3 Τα αντί-Ro/SSA αυτοαντισώματα σαν αντί-ιδιότυποι των αντί-DNA
αυτοαντισωμάτων .................................................................................... 100
Δ.III.1.3.4 Τα αντί-Ro αυτοαντισώματα σαν αντί-HLA αυτοαντισώματα .................. 101
Δ.ΙΙI.1.4 Μοριακή δομή των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων.................................................. 103
Δ.III.1.5 Κλινικές συσχετίσεις των αυτοαντισωμάτων αντί-Ro....................................... 104
Δ.III.1.5.1 Συσχετίσεις στον Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο ................................ 104
Δ.III.1.5.2 Συσχετίσεις στο Σύνδρομο Sjogren ........................................................... 107
Δ.III.1.5.3 Συσχετίσεις Ρευματοειδή Αρθρίτιδα......................................................... 107
Δ.III.2 Τα αυτοαντισώματα αντί-καλρετικουλίνης.............................................................. 108
Δ.ΙIΙ.2.1 Ιστορική αναδρομή – Ποσοστά εμφάνισης ....................................................... 108
Δ.III.2.2 Γένεση των αυτοαντισωμάτων αντί-καλρετικουλίνης........................................ 109
Δ.III.2.2.1 Μοριακή μίμιση......................................................................................... 109
Δ.III.2.2.2 Αλλαγές στην ποσοτική και ποιοτική έκφραση της καλρετικουλίνης κάτω
από συνθήκες στρές................................................................................... 110
Δ.III.2.3 Κλινικές συσχετίσεις των αυτοαντισωμάτων αντί-καλρετικουλίνης.................. 111
Δ.ΙV Ανίχνευση των αυτοαντισωμάτων .................................................................................... 113
Δ.IV.1 Γενικά ...................................................................................................................... 113
Δ.IV.2 Ανοσοδιάχυση και αντίθετή ανοσοηλεκτροφόρηση ................................................. 113
Δ.IV.3 ELISA ...................................................................................................................... 117
Δ.ΙV.3.1 Μη ανταγωνιστική έμμεση ELISA για τον προσδιορισμό αντισώματος ........... 117
Δ.IV.3.1.1 Κάλυψη του πλακιδίου .............................................................................. 117
Δ.IV.3.1.2 Αλληλεπίδραση αντιγόνου – αντισώματος ................................................ 121
Δ.IV.3.1.3 Η ενζυμική αντίδραση............................................................................... 123
Δ.IV.3.2 Παραλλαγές της ELISA ................................................................................... 124
Δ.IV.3.2.1 ELISA με ομοιοπολική σύνδεση................................................................ 124
Δ.IV.3.2.2 ELISA με βιοτινυλιωμένα πεπτίδια........................................................... 125
Δ.IV.4 Ανοσοαποτύπωση..................................................................................................... 126
Δ.IV.4.1 Ηλεκτροφόρηση σε γέλη πολυακρυλαμιδίου .................................................... 126
Δ.IV.4.2 Μεταφορά των πρωτεϊνών σε φύλλα νιτροκυτταρίνης...................................... 129
Δ.ΙV.4.3 Ανοσοαποτύπωση ............................................................................................. 129
Δ.V Επίτοποι των αυτοαντισωμάτων που στρέφονται ενάντια στο σύμπλοκο Ro RNP. ................ 130
Δ.V.1 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο Ro60 .............................................................................. 130
Δ.V.2 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο Ro52 .............................................................................. 131
Δ.V.3 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο La................................................................................... 132
Δ.V.4 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο καλρετικουλίνη .............................................................. 133
Δ.V.5 Επίτοποι στα hYRNA................................................................................................ 133
Δ.V.6 Επίτοποι με ειδικότητα για νόσο ............................................................................... 134
Δ.V.7 Ενδομοριακή και διαμοριακή εξάπλωση των επιτόπων............................................. 135
Δ.V.8 Ρόλος της εξάπλωσης των επιτόπων στην παθογένεση των αυτοάνοσων ασθενειών...... 138
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ .......................................................................................................................... 147
Ειδικό Μέρος
ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ.......................................................................................................... 199
Ε.I ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΕΠΤΙΔΙΚΑ ΑΝΑΛΟΓΑ ΤΗΣ ΚΑΛΡΕΤΙΚΟΥΛΙΝΗΣ ΚΑΙ
ΑΝΤΙ-ΠΕΠΤΙΔΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΣΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΑ ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ..... 201
Ε.I.1 Εισαγωγή ......................................................................................................................... 202
Ε.I.2 Ασθενείς και μέθοδοι ...................................................................................................... 204
Ε.I.2.1 Οροί ασθενών .......................................................................................................... 204
Ε.I.2.2 Πεπτιδική σύνθεση και καθαρισμός των αναλόγων της CaR. .................................. 204
Ε.I.2.3 Σύζευξη πεπτιδίου σε πρωτεΐνη-φορέα ............................................................... 205
Ε.I.2.4 ELISA.................................................................................................................. 205
Ε.I.2.5 Ανοσοαποτύπωση κηλίδων .................................................................................. 206
Ε.I.3 Αποτελέσματα.................................................................................................................. 206
Ε.I.3.1 Ποιοτική ανάλυση των αυτοαντισωμάτων ενάντια στα πεπτιδικά ανάλογα
της CaR (SP24, SP18).......................................................................................... 206
Ε.I.3.2 Αντιγονικότητα των πεπτιδικών αναλόγων της CaR............................................ 207
Ε.I.4 Συζήτηση.......................................................................................................................... 209
Ε.I.5 Βιβλιογραφία................................................................................................................... 211
Ε.II ΤΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΕΝΑΝΤΙΑ ΣΤΟ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΟ ΜΕ ΤΟΝ ΙΟ ΤΗΣ
ΦΥΣΣΑΛΙΔΩΔΟΥΣ ΣΤΟΜΑΤΙΤΙΔΑΣ ΠΕΠΤΙΔΙΟ EYRKKMDI ΑΠΟΤΕΛΟΥΝ ΕΝΑ
ΜΙΚΡΟ ΜΟΝΟ ΜΕΡΟΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΑΝΤΙ-Ro 60KD. .................................... 215
Ε.II.1 Εισαγωγή........................................................................................................................ 217
Ε.II.2 Ασθενείς και μέθοδοι ..................................................................................................... 219
Ε.II.2.1 Οροί .................................................................................................................. 219
Ε.II.2.2 Πεπτιδική σύνθεση και καθαρισμός του οκταπεπτιδίου EYRKKMDI (8p)....... 219
Ε.II.2.3 Καθαρισμός της πρωτεΐνης Ro/SSA................................................................... 220
Ε.II.2.4 Εκχύλισμα κυττάρων και ανοσοαποτύπωση ....................................................... 220
Ε.II.2.5 Καθαρισμός των αντισωμάτων αντί-8p............................................................... 220
Ε.II.2.6 ELISA ................................................................................................................ 221
Ε.II.2.7 Πειράματα αναστολής ....................................................................................... 222
Ε.II.2.8 Στατιστική ανάλυση ........................................................................................... 222
Ε.II.3 Αποτελέσματα ................................................................................................................ 222
Ε.II.3.1 Συσχετίσεις μεταξύ των αντισωμάτων αντί-Ro 60kD και αντί-8p....................... 222
Ε.II.3.2 Δραστικότητα αντί-Ro 60kD των αντισωμάτων αντί-8p ..................................... 224
Ε.II.3.3 Μελέτες αναστολής των αντισωμάτων αντί-8p................................................... 225
Ε.II.4 Συζήτηση ........................................................................................................................ 225
Ε.II.5 Βιβλιογραφία.................................................................................................................. 229
Ε.III Η ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΗ ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗ ΤΟΥ ΑΥΤΟΑΝΤΙΓΟΝΟΥ RO/SSA 60kD
ΑΠΟΚΑΛΥΠΤΕΙ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΑ ΓΙΑ ΝΟΣΟ.......... 233
Ε.III.1 Εισαγωγή ...................................................................................................................... 235
Ε.III.2 Υλικά και μέθοδοι......................................................................................................... 237
Ε.III.2.1 Οροί και καθαρισμός της IgG........................................................................... 237
Ε.III.2.2 Πεπτιδική σύνθεση ........................................................................................... 238
Ε.III.2.3 Κυτταρικό εκχύλισμα και ανοσοαποτύπωση .................................................... 239
Ε.III.2.4 ELISA............................................................................................................... 239
Ε.III.2.5 Καθαρισμός του αντιγόνου Ro/SSA και πειράματα αναστολής........................ 240
Ε.III.2.6 Προβλέψεις με ηλεκτρονικούς υπολογιστές και έρευνα ομολογιών ................. 240
Ε.III.3 Αποτελέσματα ............................................................................................................... 241
Ε.III.3.1 Προσδιορισμός των αντιγονικών περιοχών ..................................................... 241
Ε.III.3.2 Προσδιορισμός του ελάχιστου απαιτούμενου μήκους των αντιγονικών
καθοριστων ......................................................................................................... 243
Ε.III.3.3 Αναστολή της δέσμευσης αντισώματος στα αντιγονικά πεπτίδια ..................... 244
Ε.III.3.4 Προβλεπόμενα χαρακτηριστικά των αντιγονικών επιτόπων του Ro60kD ........ 245
Ε.III.3.5 Ομοιότητες αλληλουχίας των ανοσοκαθοριστικών επιτόπων............................ 245
Ε.III.4 Συζήτηση ....................................................................................................................... 246
Ε.III.5 Βιβλιογραφία ................................................................................................................ 251
Ε.IV ΔΟΜΙΚΕΣ, ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΓΡΑΜΜΙΚΩΝ
Β-ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΕΠΙΤΟΠΩΝ ΤΟΥ ΑΥΤΟΑΝΤΙΓΟΝΟΥ RO60KD. ................................ 255
Ε.IV.1 Εισαγωγή ...................................................................................................................... 257
Ε.IV.2 Υλικά και μέθοδοι......................................................................................................... 259
Ε.IV.2.1 Οροί ασθενών και καθαρισμός της IgG 259
Ε.IV.2.2 Πεπτιδική σύνθεση ........................................................................................... 260
Ε.IV.2.3 ELISA............................................................................................................... 262
Ε.IV.2.4 Πειράματα κυκλικού διχρωισμού (CD) και μοντελοποιήσης............................ 264
Ε.IV.2.5 Ανοσοποιήσεις ζωών ....................................................................................... 264
Ε.IV.3 Αποτελέσματα................................................................................................................ 265
Ε.IV.3.1 Υποκαταστάσεις Αλανίνης .............................................................................. 265
Ε.IV.3.2 Αντί-Ro 60kD δραστικότητα της ομόλογης με τον επίτοπο Ro 60kD
169-190 περιοχής του HLA-DR........................................................................... 266
Ε.IV.3.3 Δομικά χαρακτηριστικά των επιτόπων Ro 60kD και του ομολόγου HLA DR3 .... 266
Ε.IV.3.4 Δραστικότητα αντίορων κατά των πεπτιδικών επιτόπων
NGWSHKDLLR (175-184) και KALSVETEKLLKYLEAV (216-232) .............. 269
Ε.IV.3.5 Συχνότητα των αντιπεπτιδικών αντισωμάτων σε αυτοάνοσους ορούς............... 269
Ε.IV.4 Συζήτηση ....................................................................................................................... 271
Ε.IV.5 Βιβλιογραφία................................................................................................................ 275
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ................................................................................................................................. 279
SUMMARY .................................................................................................................................. 287
Α΄
Α.Ι.
ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΕΠΤΙΔΙΑ
ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΕΠΤΙΔΙΑ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΟΥΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ
Α.Ι.1 Γενικά
Τ α πεπτίδια είναι οργανικά μόρια που αποτελούνται από αμινοξέα συνδεόμενα
μεταξύ τους με αμιδικό δεσμό. Στη φύση είναι ευρέως διαδεδομένα κυρίως με τη
μορφή των πρωτεϊνών (πεπτίδια μεγέθους >100 αμινοξέων) καλύπτοντας δομικές και
λειτουργικές ανάγκες των έμβιων όντων.
Πεπτίδια μικρού σχετικά μήκους
ανευρίσκονται στον ανθρώπινο οργανισμό: (i) στις ορμόνες του υποθαλάμου και τους
εκλυτικούς τους παράγοντες (π.χ. σωματοστατίνη), (ii) στα πεπτίδια της υπόφυσης (πχ
αδενοκορτικοτροπίνη, ωκυτοκίνη) και (iii) σε άλλους ιστούς (πχ γλυκαγόνη,
αγγειοτενσίνη II, βραδυκινίνη).
Το 1953 έγινε η πρώτη συνθετική παραγωγή των πεπτιδικών ορμονών οξυτοκίνη
και βασοπρεσίνη από τον Vincent du Vingneaud. Από τότε έως σήμερα η
πεπτιδοχημεία αναπτύχθηκε ραγδαία. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τη στροφή
ενός μεγάλου τμήματος της ιατρικής έρευνας σε μελέτες μοριακού επιπέδου οδήγησε
στην ευρεία χρήση των συνθετικών πεπτιδίων στην ιατρική. Η κύρια χρήση τους είναι η
αποκάλυψη και τροποποίηση των βιολογικών διαδικασιών που συμβαίνουν στον
ανθρώπινο οργανισμό, είτε φυσιολογικά, είτε κατά την έναρξη και διαδρομή μιας
νόσου. Επιπλέον τα συνθετικά πεπτίδια σαν τμήματα των πρωτεϊνών που είναι, είναι
δυνατόν να δράσουν βιολογικά όμοια με αυτές, έχοντας όμως το μεγάλο πλεονέκτημα
της συνθετικής παρασκευής και της χημικής καθαρότητας. Έτσι εκτός από τις
πεπτιδικές ορμόνες και παράγωγα τους που λειτουργούν σαν αγωνιστές ή
ανταγωνιστές, έχουν παρασκευαστεί πεπτίδια με ενζυμική δράση (1,2) και πεπτίδια με
ανοσολογική δράση [ανάλογα της Ιντερλευκίνης 1 (3)].
Τα συνθετικά πεπτίδια στην ιατρική μπορούν να χρησιμοποιηθούν κυρίως σε
διαγνωστικές μεθόδους (διαγνωστικοί δείκτες), σε εμβόλια και ως θεραπευτικά.
Πολλές από τις εφαρμογές αυτές στην πλειοψηφία τους σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα με
το ανοσοποιητικό σύστημα και στη συνέχεια θα περιγράψουμε τις σημαντικότερες από
αυτές.
Α.Ι.2 Διαγνωστικές μέθοδοι
Τα
συνθετικά πεπτίδια συνήθως χρησιμοποιούνται σαν αντιγόνα για την
ανίχνευση ποικίλων αντισωμάτων με διαγνωστικό ενδιαφέρον. Το πραγματικό
πρωτεϊνικό
αντιγόνο
συχνά
είναι
δύσκολο
να
απομονωθεί.
Τυπικά
τέτοια
παραδείγματα είναι ανθρώπινα αυτοαντιγόνα ή αντιγόνα ιών που προσβάλλουν τον
άνθρωπο και που δύσκολα εκφράζονται σε μη ανθρώπινα κύτταρα ή κυτταρικές
σειρές. Η παραγωγή των αντιγόνων αυτών σε επαρκή ποσότητα για εμπορικά
διαθέσιμες διαγνωστικές τεχνικές μπορεί να γίνει είτε με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες
είτε με πεπτιδική σύνθεση, η οποία είναι μια πλήρως ελεγχόμενη χημική διαδικασία, σε
αντίθεση με την in vivo παραγωγή μιας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Έτσι τα πεπτίδια
που προκύπτουν συνθετικά υπερτερούν από άποψη καθαρότητας σε σχέση με τις
ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που συχνά εμπεριέχουν προσμίξεις βακτηριακών
πρωτεϊνών. Επιπλέον τα πεπτίδια είναι πιο σταθερά μόρια και μπορούν να
τροποποιηθούν ή να υποβληθούν σε κάποια χημική επεξεργασία για την εφαρμογή
τους σε διαφορετικές διαγνωστικές τεχνικές (πχ ειδική ομοιοπολική σύζευξη τους σε
μικροπλακίδια τιτλοποιήσης ανοσοενζυμικής μεθόδου ELISA). Οι ανοσοχημικές
μέθοδοι στερεάς φάσης (π.χ. RIA, ELISA) που στηρίζονται στη χρήση συνθετικών
πεπτιδίων είναι πολύ ευαίσθητες, εξειδικευμένες και επιτρέπουν τον ποσοτικό
προσδιορισμό των αντισωμάτων (4). Τέτοιες μέθοδοι εφαρμόζονται σήμερα:
(i)
στην ιολογία (5) και κυρίως στην ανίχνευση αντισωμάτων κατά του ιού της
ηπατίτιδας C (6,7) ή του ιού του συνδρόμου της επίκτητης ανοσοποιητικής
ανεπάρκειας (AIDS) (8).
(ii)
στον προσδιορισμό
αυτοαντισωμάτων, τόσο σε οργανοειδικές αυτοάνοσες
ασθένειες όπως η βαριά μυασθένεια (Myasthenia Gravis) (9) και η νόσος του
Graves (εξώφθαλμος βρογχοκήλη ) (10), όσο και σε πολυσυστηματικές αυτοάνοσες
ασθένειες όπως η μικτή νόσος του συνδετικού ιστού (MCTD) (11).
(iii) μια
άλλη χρήση των συνθετικών πεπτιδίων για διαγνωστικούς σκοπούς που δεν
εμπίπτει στο πλαίσιο αλληλεπίδρασης αντιγόνου αντισώματος είναι η χρήση
ραδιοσεσημασμένων πεπτιδίων σε απεικονιστική τεχνική (σπινθηρογράφημα),
όπως στην περίπτωση διάγνωσης εν τω βάθει θρομβώσεων ή πνευμονικών εμβολών
(12).
Α.Ι.3 Ανοσοποιήσεις-Εμβόλια
Ε να
από τα σημαντικότερα επιτεύγματα της ανοσολογίας είναι η χρήση των
εμβολίων για την ανάπτυξη τεχνητής ενεργητικής ανοσίας στον άνθρωπο έναντι
πολλών λοιμογόνων παραγόντων. Τα υπάρχοντα εμβόλια σήμερα αποτελούνται κυρίως
από εξασθενημένα μικρόβια, νεκρά μικρόβια και τοξίνες ή ατοξίνες μικροβίων. Η
παρασκευή των εμβολίων αυτών όμως παρουσιάζει ορισμένα προβλήματα όπως (i)
δυσκολίες ελέγχου της λοιμογόνου δύναμης των εξασθενημένων ή νεκρωμένων
μικροβίων που τυχόν παραμένει, (ii) δυσκολίες παρασκευής επαρκούς ποσότητας
εμβολίων από ιούς και παράσιτα που δεν αναπτύσσονται σε καλλιέργειες και (iii) την
γενετική και αντιγονική μεταβλητότητα που παρουσιάζουν οι ιοί και τα παράσιτα με
αποτέλεσμα να αναπτύσσονται καινούργια ανθεκτικά στελέχη που απαιτούν τη
δημιουργία νέων εμβολίων. Για αυτούς τους λόγους σήμερα υπάρχει τάση ανάπτυξής
συνθετικών εμβολίων είτε με τη παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών είτε με
χημική σύνθεση πεπτιδίων (13).
Η θεμελίωση της χρήσης των συνθετικών πεπτιδίων σαν εμβόλια έγινε ήδη από
τη δεκαετία του 1960 όταν μελετήθηκε η αντιγονικότητα σε μοριακό επίπεδο (14). Από
τότε, λόγω και της ραγδαίας ανάπτυξης των μοριακών τεχνικών, έγινε δυνατόν να
προσδιοριστεί η πρωτοταγής δομή πολλών χιλιάδων πρωτεϊνών, γεγονός που έδωσε
βάση στη συνθετική προσέγγιση της παρασκευής εμβολίων. Έτσι σήμερα έχουν
προσδιοριστεί οι αντιγονικοί καθοριστές πολλών μικροβιακών και ιικών πρωτεϊνών, η
πλειοψηφία των οποίων έχει παρασκευαστεί συνθετικά και μπορεί δυνητικά να
χρησιμοποιηθεί για εμβολιασμό. Τέτοια εμβόλια είναι:
(i)
Αντι-βακτηριάκα εμβόλια. Συνθετικά τμήματα της στρεπτοκοκκικής Μ πρωτεΐνης
(15), της τοξίνης της διφθερίτιδας (16) και της τοξίνης της χολέρας (17) έχει βρεθεί
ότι είναι αντιγονικά και ικανά να επάγουν τον σχηματισμό αντισωμάτων με
εξουδετερωτική δράση που παρέχει προστασία από τον αντίστοιχο βακτηριακό
παράγοντα.
(ii)
Αντι-ιικά εμβόλια. Αντιγονικά δραστικά πεπτιδικά ανάλογα έχουν παρασκευαστεί
για το HBs αντιγόνο του ιού της ηπατίτιδας Β (18), την αιμοσυγκολιτίνη του ιού της
γρίπης (19) και της VP1 πρωτείνης του Foot and Mouth Disease Virus (20).
(iii) Αντι-παρασιτικά
εμβόλια. Για το παράσιτο της ελονοσίας P. falciparum έχουν
βρεθεί συνθετικά πεπτίδια με προστατευτική από το παράσιτο δράση (21)
Ένα γενικό πρόβλημα που παρουσιάζει ο εμβολιασμός με ανασυνδυασμένες πρωτείνες ή
συνθετικά ανάλογα τους είναι η ανάγκη χρήσης ανοσοενισχυτικού για να αυξηθεί η
αποτελεσματικότητα της ανοσίας που επιδιώκεται. Έτσι ενώ σε πειραματόζωα
χρησιμοποιείται το ανοσοενισχυτικό του Freund (ειδικό γαλάκτωμα που εμπεριέχει νεκρά
μυκοβακτηρίδια), στον άνθρωπο δεν είναι δυνατό αυτό να χρησιμοποιηθεί. Για το σκοπό
αυτό έχουν αναπτυχθεί συνθετικά ανοσοενισχυτικά, όπως πεπτίδια ανάλογα της
Ιντερλευκίνης 1 (3), ανάλογα της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 (HSP70) (22) ή
ολιγοπεπτίδια συζευγμένα με λιπίδια (23), τα οποία μπορούν να ενσωματωθούν στο
συνθετικό πεπτίδιο - εμβόλιο προσδίδοντας του και ενδογενή ανοσοενισχυτική δράση.
Για να επιτευχθεί αποτελεσματική ανοσοποιήση, θα πρέπει επίσης να υπάρχει
άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ Τ-βοηθητικών και Β-λεμφοκυττάρων, τα οποία για το
σκοπό αυτό θα πρέπει να αναγνωρίζουν αντιγονικούς καθοριστές (επιτόπους) στο
ίδιο μόριο. (24). Η αναγνώριση επιτόπων
παρουσιάζει
εξάρτηση
από
τον
από τα
απλότυπο
του
Τ-λεμφοκύτταρα όμως
μεγίστου
συμπλέγματος
ιστοσυμβατότητας με αποτέλεσμα η ανοσολογική απάντηση στον εμβολιασμό να
εξαρτάται από το γενετικό υπόβαθρο του κάθε ανθρώπου (25). Παρόλα αυτά
υπάρχουν ορισμένοι επίτοποι Τ λεμφοκυττάρων, που δεσμεύονται σε πληθώρα
διαφορετικών αντιγόνων ιστοσυμβατότητας, όπως κάποιοι επίτοποι από την τοξίνη
του τετάνου (26). Οι επίτοποι αυτοί μπορούν με τη χρήση της πεπτιδικής σύνθεσης
να συνδυαστούν με ένα ειδικό επίτοπο Β-λεμφοκυττάρων σε ένα πεπτίδιο-υβρίδιο
που ξεπερνά τον περιορισμό των απλοτύπων στην ανοσολογική απόκριση (27).
Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε ότι η χρήση συνθετικών πεπτιδίων ως εμβόλια
παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα όπως (i) η παρασκευή αντιγόνου σε επαρκή
ποσότητα για ιούς και παράσιτα που δύσκολα αναπτύσσονταί σε καλλιέργειες, (ii) η
δυνατότητα σύνδεσης διαφορετικών πεπτιδίων στο ίδιο μόριο φορέα επιτρέποντας
έτσι την παρασκευή πολυδύναμων συνθετικών εμβολίων, (iii) ο περιορισμός
ανάπτυξης αντισωμάτων από άσχετα αντιγόνα-προσμίξεις λόγω της υψηλής
καθαρότητας των συνθετικών πεπτιδίων, (iv) η δυνατότητα παρασκευής εμβολίων
με ενδογενή ανοσοενισχυτική δράση και (v) η δυνατότητα σύνθεσης πεπτιδίων που
να ξεπερνούν γενετικούς περιορισμούς στη παραγωγή αντισωμάτων.
Α.Ι.4 Θεραπευτικές χρήσεις πεπτιδίων
Τα τελευταία χρόνια διαφαίνεται η δυνατότητα χρήσης συνθετικών πεπτιδίων με
βιολογική δραστικότητα και ικανότητα τροποποίησης της ανοσολογικής απόκρισης
για θεραπευτικούς σκοπούς. Έτσι πολλά συνθετικά πεπτίδια σε μελέτες με
πειραματόζωα και σε κλινικές δοκιμές έχει βρεθεί ότι διαθέτουν σαφή θεραπευτικά
αποτελέσματα, όπως στις παρακάτω περιπτώσεις:
Α.Ι.4.1 Νεοπλασίες-Καρκίνος:
Τα συνθετικά πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε περιπτώσεις
κακοήθους όγκου με τρεις κυρίως τρόπους: (i) με απευθείας δράση κατά του όγκου, (ii)
με ενίσχυση - καθοδήγηση της άμυνας του οργανισμού προς τον όγκο και (iii) με
παρεμπόδιση των μεταστάσεων του όγκου προς απομακρυσμένα όργανα και ιστούς.
(i)
Απευθείας δράση κατά των καρκινικών κυττάρων έχουμε στην περίπτωση
λεμφώματος Β-λεμφοκυττάρων, όπου έχουν βρεθεί συνθετικά πεπτίδια που
δεσμεύονται σε ειδικές ανοσοσφαιρίνες επιφανείας των κυττάρων του λεμφώματος.
Τα πεπτίδια αυτά όταν παρασκευασθούν σε σύνδεση με μια ραδιενεργή ένωση
επιτρέπουν την ειδική καταστροφή των κυττάρων στόχων τους (28). Άλλα πεπτίδια
με αντι-νεοπλασματική δράση είναι πεπτίδια-τμήματα της C-αντιδρώσας πρωτείνης
(CRP). Τα πεπτίδια αυτά έχει βρεθεί ότι περιορίζουν την ανάπτυξή του όγκου, τις
μεταστάσεις και αυξάνουν την επιβίωση των πειραματοζώων σε προκλινικά
μοντέλα νεοπλασμιών (29).
(ii)
Με την ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος και καθοδήγηση του προς τον
όγκο μπορούμε να έχουμε ειδική επαγωγή είτε της κυτταρικής είτε της χυμικής
ανοσίας. Έτσι επαγωγή αντινεοπλασματικών κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων
που καταστρέφουν καρκινικά κύτταρα μελανώματος μπορεί να επέλθει με τη χρήση
συνθετικού πεπτιδίου - αναλόγου προϊόντος του ογκογονιδίου MAGE-3 (30).
Παρόμοια χυμική ανοσολογική απάντηση με τη μορφή αντισωμάτων εναντίον
νεοπλασματικών κυττάρων καρκίνου των ωοθηκών ή του μαστού μπορεί να επέλθει
με τη βοήθεια πεπτιδίου που εμπεριέχει τις αλληλουχίες ενός ειδικού επιτόπου Βλεμφοκυττάρων
της
MUC-1
πρωτείνης
και
ενός
γενικού
επιτόπου
Τ-
λεμφοκυττάρων (31).
(iii) Η
μετάσταση των καρκινικών κυττάρων είναι πορεία που περιλαμβάνει αρχικά την
προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων τόσο σε ειδικά μόρια πρόσδεσης που
βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων του ενδοθηλίου του αγγειακού και
λεμφικού δικτύου, όσο και σε γλυκοπρωτεΐνες του μεσοκυττάριου χώρου και στη
συνέχεια την διείσδυση τους διαμέσου της βασικής μεμβράνης. Συνθετικά πεπτίδια
που εμποδίζουν την μετάσταση μπορούν να παραχθούν με βάση την πρωτοταγή
δομή τμημάτων των γλυκοπρωτεϊνών του μεσοκυττάριου χώρου και ειδικότερα της
φιμπρονεκτίνης , λαμινίνης, και του κολλαγόνου τύπου IV (32). Έτσι διάφορα
πεπτιδικά ανάλογα της «RGD» αλληλουχίας συγκόλλησης που εμπεριέχεται στη
φιμπρονεκτίνη έχει βρεθεί ότι εμποδίζουν την μετάσταση νεοπλασματικών
κυττάρων μελανώματος (33). Επίσης, πεπτίδια με ανάλογη δράση έχουν παραχθεί
συνθετικά με βάση τις αλληλουχίες της λαμινίνης και του κολλαγόνου τύπου IV (34,
35).
Α.Ι.4.2 Αυτοάνοσες νόσοι:
Οι αυτοάνοσες ασθένειες χαρακτηρίζονται κυρίως από την ενεργοποίηση του
ανοσολογικού συστήματος κατά ιδίων αντιγόνων υπό την μορφή αυτοαντισωμάτων ή
και αυτοδραστικών κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυτταρικών κλώνων.
Ορισμένοι τύποι των αυτοάνοσων ασθενειών συσχετίζονται με ορισμένους
απλοτύπους του μεγίστου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (HLA). Στις περιπτώσεις
αυτές συνθετικά πεπτίδια που συνδέονται ισχυρά με τα συγκεκριμένα HLA μπορούν
να περιορίσουν την ποσότητα των διαθέσιμων αντιγόνων ιστοσυμβατότητας για την
εκδήλωση της αυτοάνοσης αντίδρασης, χωρίς ωστόσο να προκαλούν γενικευμένη
ανοσοκαταστολή λόγω της συνύπαρξης
και άλλων HLA ισοτύπων που δεν
παρεμποδίζονται από τα συγκεκριμένα πεπτίδια (36).
Μία άλλη θεραπευτική εφαρμογή των συνθετικών πεπτιδίων στις αυτοάνοσες
ασθένειες είναι η δέσμευση των κυκλοφορούντων αυτοαντισωμάτων. Έτσι στη βαρεία
μυασθένεια (μυασθένεια Gravis) τα αυτοαντισώματα κατά του υποδοχέα της
ακετυλοχολίνης (AChR) μπορούν να απομακρυνθούν εν μέρει με μία διαδικασία
κάθαρσης του πλάσματος, όπου δεσμεύονται σε στήλη πεπτιδικού αναλόγου του κύριου
αντιγονικού καθοριστή του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (AchR). (37).
Τέλος,
φιμπρονεκτίνης
έχουν
αναφερθεί
συνθετικά
πεπτίδια
ανάλογα
τμημάτων
της
(πχ RGD πεπτίδια), που προκαλούν ύφεση της ρευματοειδούς
αρθρίτιδας εμποδίζοντας την ικανότητα προσκόλλησης των λεμφοκυττάρων, που στη
νόσο αυτή εμφανίζεται αυξημένη (38).
Α.Ι.4.3 Μεταμοσχεύσεις
Η απόρριψη αλλομοσχεύματος οφείλεται στην ειδική αναγνώριση των
αντιγόνων ιστοσυμβατότητας (MHC) των ιστών του μοσχεύματος από κυτταροτοξικά
CD8+ Τ-λεμφοκύτταρα του δέκτη. Η κυτταρική απάντηση καθορίζεται από την
μοριακή αλληλεπίδραση του υποδοχέα Τ-λεμφοκυττάρων (TCR) του δέκτη με τα
αντιγόνα ιστοσυμβατότητας των ιστών του μοσχεύματος. Για την παρεμπόδιση της
αντίδρασης αυτής έχουν χρησιμοποιηθεί πεπτίδια - ανάλογα περιοχών του MHC
(μεταβλητών και μη) (39) καθώς και πεπτιδικό ανάλογο της μεταβλητής περιοχής του
TCR με πολύ καλά αποτελέσματα (40).
Α.I.4.4 Άλλες χρήσεις
Συνθετικά πεπτίδια έχουν επίσης τις παρακάτω θεραπευτικές χρήσεις:
(i)
Αντιθρομβωτικά. Πεπτίδια που εμπεριέχουν την RGD αλληλουχία μπορούν να
παρεμποδίσουν την συγκόλληση των αιμοπεταλίων και κατά συνέπεια τη θρόμβωση
και διάφορες θρομβοεμβολικές καταστάσεις (41).
(ii)
Αντιφλεγμονώδη. Συνθετικά πεπτίδια ανάλογα της σελεκτίνης μπορούν να
παρεμποδίσουν την προσκόλληση των ουδετερόφιλων στα κύτταρα του ενδοθηλίου,
και την εμφάνιση έτσι της αντιφλεγμονώδους δράσης τους (42).
Α.ΙΙ. ΠΕΠΤΙΔΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ
Τ
α πεπτίδια είναι αμίδια που σχηματίζονται με ακυλίωση της αμινομάδας ενός αμινοξέος από την
καρβοξυλομάδα ενός άλλου, σύμφωνα με την αντίδραση:
Η ομάδα -CONH- που προκύπτει ονομάζεται πεπτιδικός δεσμός. Η αντίδραση αυτή
δεν ευνοείται θερμοδυναμικά και ενώ στο κύτταρο
καταλύεται από κατάλληλο
σύμπλεγμα t-RNA-ριβοσώματος-mRNA, στο εργαστήριο απαιτεί δραστικές συνθήκες.
Οι δραστικές συνθήκες όμως δημιουργούν μια σειρά από παράπλευρες αντιδράσεις
και παραπροϊόντα, και έτσι στην πράξη χρησιμοποιούνται ηπιότερες συνθήκες με
ταυτόχρονη ενεργοποίηση των ομάδων πού συμμετέχουν στο πεπτιδικό δεσμό. Επειδή
πρακτικά δεν υπάρχει μέθοδος κατάλληλη για την ενεργοποίηση της αμινομάδας,
εφαρμόζεται ενεργοποίηση του καρβοξυλίου. Κατά τη σύζευξη δύο αμινοξέων, εκτός
από τις ομάδες του ενεργοποιημένου καρβοξυλίου και της αμινομάδας που αντιδρούν,
υπάρχουν και άλλες ομάδες που μπορούν να δώσουν ανεπιθύμητες αντιδράσεις. Αυτές
είναι η αμινομάδα του αμινοξέος που δίδει το καρβοξύλιο, η καρβοξυλομάδα του
αμινοξέος που δίδει την αμινομάδα καθώς και οι δραστικές ομάδες των παράπλευρών
αλυσίδων που τυχόν υπάρχουν. Έτσι είναι αναγκαία η παροδική προστασία των
ομάδων αυτών. Τα στάδια της πεπτιδικής σύνθεσης συμφωνά με τα παραπάνω είναι:
(i)
Παροδική προστασία της α-αμινομάδας του Ν-τελικού αμινοξέος. Σκοπός αυτού
του σταδίου είναι η μείωση της πυρηνοφιλίας της αμινομάδας με μια προστατευτική
ομάδα, η οποία αφενός θα είναι σταθερή στις συνθήκες της σύζευξης, αφετέρου θα
απομακρύνεται εύκολα μετά το τέλος της. Η πρώτη τέτοια ομάδα πού
χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία είναι η βενζυλοξυκαρβονυλική ή Ζ-ομάδα, ενώ στην
ίδια
κατηγορία
ανήκουν
διφαινυλισοπροπυλοξυκαρβόνυλο
καρβονυλο (Fmoc) ομάδες.
οι
t-βουτυλοξυκαρβόνυλο
(Bpoc)
και
η
(BOC),
2-
9-φλουορενυλομεθυλοξυ-
Παροδική προστασία του α-καρβοξυλίου του C-τελικού αμινοξέος. Γίνεται συνήθως
(i)
με μετατροπή της καρβοξυλομάδας σε μεθυλ-, αιθυλ-, tβουτυλ ή βενζυλεστερομάδα.
(ii)
Παροδική προστασία των δραστικών ομάδων των παράπλευρων αλυσίδων. Τέτοιες
ομάδες είναι η ε-NH2 της λυσίνης, το β-COOH του ασπαρτικού οξέος, το γ-COOH
του γλουταμινικού οξέος, η γουανιδομάδα της αργινίνης, η -SH ομάδα της
κυστείνης, και η -OH της σερίνης και τυροσίνης.
(iii) Σχηματισμός
του πεπτιδικού δεσμού. Επιτυγχάνεται με ενεργοποίηση του
καρβοξυλίου του Ν-τελικού αμινοξέος και σύζευξη του ενεργού ενδιαμέσου με την
αμινομάδα του C-τελικού αμινοξέος. Οι κυριότερες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται
είναι των καρβοδιιμιδίων, των ενεργών εστέρων, των μικτών ανυδριτών και των
αζιδίων.
(iv)
Απομάκρυνση των προστατευτικών ομάδων. Η απόσπαση γίνεται με μέσα που δεν
θίγουν τον πεπτιδικό δεσμό, ώστε να παραχθεί το ελεύθερο πεπτίδιο.
Α.III. ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΕΠΤΙΔΙΚΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ
Α.ΙΙI.1 Σύνθεση σε υγρή φάση
Ε ίναι η παλαιότερη μέθοδος πεπτιδικής σύνθεσης. Χρησιμοποιείται κυρίως για τη σύνθεση μικρών
πεπτιδίων αφού γενικά απαιτεί πολύ χρόνο, περιλαμβάνει διαδοχικούς καθαρισμούς στα ενδιάμεσα στάδια,
και συχνά παρουσιάζονται προβλήματα διαλυτότητας με την αύξηση του μήκους της πεπτιδικής αλυσίδας.
Η πορεία της παρουσιάζεται στο Σχήμα 1.
Σχήμα 1. Διάγραμμα σύνθεσης διπεπτιδίου σε υγρή φάση μέσω ενεργοποίησης του
καρβοξυλίου (ομάδα Ε).
Α.ΙII.2 Σύνθεση σε στερεά φάση
Η τεχνική αυτή αναπτύχθηκε αρχικά από τον Merrifield (βραβείο Nobel
Χημείας 1984). Η βασική αρχή της σύνθεσής σε στερεή φάση στηρίζεται στην
επιμήκυνση μιας πεπτιδικής αλυσίδας με διαδοχική σύζευξη αμινοξέων στο ένα άκρο
της αλυσίδας ενώ το άλλο άκρο παραμένει συνδεδεμένο με ένα αδιάλυτο, στους
συνηθισμένους διαλύτες, πολυμερές. Το μεγάλο πλεονέκτημα αυτής της πορείας είναι
ότι αφού το στερεό υποστήριγμα της σύνθεσης είναι αδιάλυτο μπορούν να
αντικατασταθούν όλοι οι καθαρισμοί και οι απομονώσεις των ενδιαμέσων προϊόντων
με απλές εκπλύσεις και διηθήσεις του στερεού. Η όλη σύνθεση μάλιστα μπορεί να
λάβει χώρα μέσα σε ένα και μόνο κατάλληλο δοχείο χωρίς να απαιτούνται συνεχείς
μεταφορές του υλικού με επακόλουθη απώλεια μέρους αυτού (Σχήμα 2). Στο τέλος της
σύνθεσης το πεπτίδιο απελευθερώνεται από το στερεό πολυμερές με την επίδραση
καταλλήλου αντιδραστηρίου. Η πορεία της σύνθεσης σε στερεά φάση παρουσιάζεται
στο Σχήμα 3.
Σχήμα 2. Συσκευή πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεά φάση
Σχήμα 3. Διαγραμματική πορεία σύνθεσης πεπτιδίου σε στερεή φάση κατά Merrifield.
Η επιτυχία της σύνθεσης με τη μέθοδο της στερεάς φάσεως είναι συνάρτηση των
αποδόσεων στα ενδιάμεσα στάδια αποπροστασίας και σύζευξης. Όταν στα στάδια
αυτά έχουμε μικρές αποδόσεις ή/και ανεπιθύμητες αντιδράσεις όπως μερική
απομάκρυνση παράπλευρων προστατευτικών ομάδων, ρακεμίωση, επαναδιευθετήσεις,
κυκλοποιήσεις, τότε αφενός η συνολική απόδοση της σύνθεσης είναι πολύ μικρή,
αφετέρου τα παραπροϊόντα με περαιτέρω αντιδράσεις δίδουν με την ολοκλήρωση της
σύνθεσης μια σειρά από ανεπιθύμητα παράγωγα, συχνά με δομή παρόμοια με το τελικό
προϊόν πού κατά συνέπεια είναι πολύ δύσκολο να διαχωριστούν από αυτό. Για την
αντιμετώπιση των προβλημάτων αυτών υπάρχει μια συνεχής βελτίωση των αδιάλυτων
πολυμερών, των ομάδων προστασίας και των μεθόδων σύζευξης.
Α.ΙΙI.2.1 Το αδιάλυτο πολυμερές
Το αδιάλυτο πολυμερές θα πρέπει να είναι χημικώς αδρανές στα αντιδραστήρια και στους
διαλύτες που χρησιμοποιούνται στη πεπτιδική σύνθεση, να φέρει δραστικές ομάδες πάνω
στις οποίες θα γίνει ποσοτική σύζευξη του πρώτου αμινοξέος και να επιτρέπει την εύκολη
απόσπαση του πεπτιδίου στο τέλος της σύνθεσης. Μια ακόμη χρήσιμη ιδιότητα είναι η
ικανότητα του να διογκώνεται σε κάποιους διαλύτες και να συρρικνώνεται σε άλλους
διευκολύνοντας έτσι τις εκπλύσεις και την απομάκρυνση προσροφημένων ουσιών.
Το ευρύτερα χρησιμοποιούμενο πολυμερές είναι το χλωρομεθυλιωμένο πολυστυρόλιο,
που παρασκευάζεται από συμπολυμερισμό στυρολίου και διβινυλοβενζολίου (σε ποσοστό
1-2%) και φέρει ομάδες χλωρίου στη μορφή βενζυλοχλωριδίου (Σχήμα 4). Το καρβοξυτελικό αμινοξύ προσκολλάται με εστεροποίηση. Μια βελτιωμένη ρητίνη που σχηματίζει
σταθερότερο δεσμό με το πεπτίδιο είναι η 4-υδρόξυ-φαίνυλο-ακετάμιδο-μέθυλο-ρητίνη
(PAM) (43). Η σύνθεση ενός πεπτιδίου με ένα καρβοξυ-τελικό αμίδιο μπορεί να
επιτευχθεί με τη χρήση της βενζυδρυλαμίνης ρητίνης (BHA).
Σχήμα 4. Είδη ρητινών και οι δραστικές τους ομάδες
Α.ΙΙI.2.2 Προστατευτικές ομάδες
Για την προστασία της α-αμινομάδας αμινοξέος χρησιμοποιούνται δύο κυρίως ομάδες
(Σχήμα 5)
(i)
Η t-βουτυλοξυκαρβονυλομάδα (BOC), της οποίας η απομάκρυνση γίνεται με
διάλυμα τριφθοροξεικού οξέος (TFA) σε διχλωρομεθάνιο (30-50% v/v) για 10-20
min.
(ii) Η
9-φλουορενύλομεθυλοξύκαρβονυλομάδα (Fmoc) που απομακρύνεται σε βασικές
συνθήκες με διάλυμα πιπεριδίνης σε διμεθυλοφορμαμίδιο (20% v/v) για 20 min.
Σχήμα 5. Οι συχνότερα χρησιμοποιούμενες ομάδες
προστασίας της α-αμινομάδας.
Οι ομάδες προστασίας των παράπλευρων αλυσίδων ποικίλουν ανάλογα με τη στρατηγική
προστασίας της α-αμινομάδας (Fmoc ή Boc) και τις συνθήκες απομάκρυνσης του πεπτιδίου.
Έτσι αν για παράδειγμα ακολουθείται η Fmoc στρατηγική επιλέγουμε ομάδες προστασίας
που είναι σταθερές στις συνθήκες απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας (βασικές συνθήκες) και
μπορούν εύκολα να απομακρυνθούν ταυτόχρονα με την απομάκρυνση του πεπτιδίου από τη
ρητίνη.
Τέτοιες κατάλληλες ομάδες είναι ο t-βουτυλαιθέρας (-tBu) για τα υδροξύλια της
σερίνης, θρεονίνης και τυροσίνης, ο t-βουτυλεστέρας (-OΒu’) για τα καρβοξύλια του
ασπαρτικού και γλουταμικού οξέος, η t-βουτυλοξυκαρβονυλομάδα (Boc-) για τις
αμινομάδες της λυσίνης και της ιστιδίνης, η 4-μεθυλοξυ-2,3,6-τριμεθυλό-βενζυλοσουλφονυλομάδα (Mtr-) για την γουανιδομάδα της αργινίνης και η τριτυλ-ομάδα (Trt-)
για την σουλφυδρυλομάδα της κυστεϊνης.
Α.ΙΙI.2.3 Μέθοδοι σύζευξης
Η ιδανική μέθοδος σύζευξης των αμινοξέων πρέπει να είναι ποσοτική, ταχεία
και να διατηρεί την στερεοχημική διάταξη των αμινοξέων. Οι κυριότερες μέθοδοι
είναι:
(i) Η μέθοδος των καρβοδιιμιδίων (Σχήμα 6)
Χρησιμοποιείται
καρβοδιιμίδιο
και
συγκεκριμένα
το
δικυκλοεξυλο-
καρβοδιιμίδιο (DCC) για την in situ ενεργοποίηση του καρβοξυλίου του αμινοξέος
που δέχεται την πυρηνόφιλη προσβολή της αμινομάδας (44). Προβλήματα
Σχήμα 6. Σύνθεση διπεπτιδίου με τη μέθοδο των καρβοδιιμιδίων.
παρουσιάζονται λόγω της δυσδιαλυτότητας της παραγόμενης δικυκλοεξυλουρίας
και λόγω παράπλευρων αντιδράσεων όπως η O Æ N ενδομοριακή μετάθεση. Για
να
περιοριστούν
οι
παράπλευρες
αντιδράσεις
προστίθεται
το
1-
υδρόξυβενζοτριαζόλιο (HOBt) το οποίο καταλυτικά επιταχύνει την αντίδραση
σύζευξης.
(ii) Η μέθοδος των ενεργών εστέρων (Σχήμα 7)
Χρησιμοποιούνται αμινοξέα των οποίων το καρβοξύλιο μπορεί να είναι εκ των
προτέρων στη μορφή του ενεργού εστέρα [κυρίως σαν πενταφθοροφαινυλεστέρας
(-OPfp)] ή να σχηματίζεται in situ ενεργός εστέρας όπως με το αντιδραστήριο
PyBOP (45).
Σχήμα 7. Σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού με τη χρήση του PyBOP
αντιδραστηρίου
Επειδή η πεπτιδική σύνθεση κυρίως στοχεύει στην παρασκευή βιολογικά
δραστικών πεπτιδίων, απαραίτητη προϋπόθεση είναι η διατήρηση της L-στερεοχημικής
διάταξης των αμινοξέων. Κατά την πεπτιδική σύνθεση όλα τα αμινοξέα που έχουν
ασύμμετρο άτομο άνθρακα (πλην της γλυκίνης) μπορούν θεωρητικά να ρακεμιωθούν
δίνοντας μίγματα διαστεροϊσομερών του πεπτιδίου, τα οποία είναι εξαιρετικά δύσκολο
να διαχωριστούν. Με την ανάπτυξη των βελτιωμένων μεθόδων σύζευξης που
προαναφέρθηκαν ο βαθμός της ρακεμίωσης έχει περιοριστεί στο ελάχιστο. Ένα άλλο
πρόβλημα είναι ο καθαρισμός πεπτιδίων από μίγματα παραπροϊόντων με παραπλήσιες
χημικές ιδιότητες. Τη λύση στο πρόβλημα αυτό έδωσε η ανάπτυξη σύγχρονων
χρωματογραφικών μεθόδων καθαρισμού και κυρίως της υγρής χρωματογραφίας
υψηλής πίεσης HPLC.
Έτσι οι νέες τεχνικές σύνθεσης και καθαρισμού επέτρεψαν τη σύνθεση πεπτιδίων με
περισσότερα από 100 αμινοξέα σε (46). Επίσης κατάλληλα συνθετικά πεπτίδια μεγάλου
σχετικά μήκους είναι δυνατό να συζευχθούν μεταξύ τους ενζυματικά (47) δίδοντας πρωτείνες
με πλήρη βιολογική δράση (48).
Α.IV. ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ
Α.IV.1 Γενικά
Η
ραγδαία ανάπτυξη των βιολογικών επιστημών, τις τελευταίες δεκαετίες,
συνέβαλαν στον εντοπισμό ενός πολύ μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών με βιολογικό,
διαγνωστικό ή θεραπευτικό ενδιαφέρον που η μελέτη τους απαιτεί ένα συνεχώς
αυξανόμενο αριθμό συνθετικών πεπτιδίων. Οι συμβατικές μέθοδοι πεπτιδικής
σύνθεσης αδυνατούν να αντεπεξέλθουν σε αυτή την αυξανόμενη ζήτηση συνθετικών
πεπτιδίων (49-51) Από την άλλη πλευρά η ποσότητα των πεπτιδίων που απαιτείται
συνεχώς μειώνεται λόγω της ανάπτυξης περισσότερο ευαίσθητων βιολογικών και
βιοχημικών τεχνικών (52-53). Έτσι από το 1985 και μετά έχουν αναπτυχθεί ποικίλες
τεχνικές πολλαπλής πεπτιδικής σύνθεσης (Multiple Peptide Synthesis : MPS), που σαν
σκοπό έχουν την ταυτόχρονη και πολλαπλή σύνθεση μεγάλου αριθμού πεπτιδίων σε
συνήθως μικρές αλλά επαρκείς ποσότητες. Οι μέθοδοι αυτές ανάλογα με τη ποσότητα
του πεπτιδίου που παρασκευάζεται παρουσιάζονται στον Πίνακα 1
Πίνακας 1: Μέθοδοι πολλαπλής πεπτιδικής σύνθεσης.
Α. Ποσότητες > 50 μmoles πεπτιδίου.
Μέθοδος
«Σακουλάκι
Φιλμ πολυαιθυλενίου
Πεπτιδική σύνθεση
πολυστυρολίου
συνεχούς ροής
τσαγιού»
Πολυμερές
Αριθμός Πεπτιδίων
PS-DVB
PS-PE-φιλμ
PS-DVB
<150
10
8
50-500 μmol
500 μmol
20-400 ìmol
Fmoc/Boc
Boc
Fmoc/Boc
Ενεργοποίηση
TBTU/HOBt
Συμμετρ. Ανυδρίτες
HOBt/DIC
Πρόγραμμα Η/Υ
Απαραίτητο
Έλεγχος
πικρικό οξύ
Ποσότητα
Ομάδα προστασίας
Παραπομπή
54
Νυνιδρίνη
55
56
Β. Ποσότητες < 50 μmoles πεπτιδίου.
Μέθοδος
Ράβδοι
«Κηλίδες
Δίσκοι
Δίσκοι
πολυαιθυλενίου
κυτταρίνης»
κυτταρίνης
βαμβακιού
PE – ράβδοι
Κυτταρίνη
κυτταρίνη
κυτταρίνη
Αριθμός Πεπτιδίων
96 / μπλοκ
96
10
10
Ποσότητα
300 nmol
100 nmol
4-6 μmol
3 μmol
Fmoc
Fmoc
Ενεργοποίηση
Pfp εστέρας
DIC/HOBt
DIC/HOBt
Πρόγραμμα Η/Υ
απαραίτητο
απαραίτητο
απαραίτητο
BPB
BPB
BPB
BPB
57
58
59
60
Πολυμερές
Ομάδα προστασίας
Έλεγχος
Παραπομπή
Fmoc
Fmoc
DIC/HOBt
PS: πολυστυρόλιο, PE: πολυαιθυλένιο, DVB: διβινυλόβενζόλιο, BPB: δείκτης μπλε
βρωμοφαινόλης, Pfp: πενταφθόροφαινύλεστέρας,
Στις μεθόδους κατά τις οποίες το πεπτίδιο συντίθεται σε ποσότητα > 5 mg, το
πεπτίδιο μπορεί να κοπεί και να καθαριστεί πριν τη χρήση του, ενώ στις υπόλοιπες
συνήθως χρησιμοποιείται συνδεδεμένο στο στερεό υπόστρωμα στο οποίο συνετέθη.
Α.IV.2 Σύνθεση σε «Σακουλάκι τσαγιού»
Η μέθοδος αναπτύχθηκε για πρώτη φορά το 1985 (54) (Σχήμα 8) και αποτελεί
μία από τις παλαιότερες στρατηγικές πολλαπλής πεπτιδικής σύνθεσης. Οι αποδόσεις
της είναι της τάξεως των 50 mg καθαρού πεπτιδίου. Ο διαχωρισμός του πολυμερούς
υποστρώματος γίνεται σε διάτρητα πλαστικά σακουλάκια τα οποία κατά την πεπτιδική
σύνθεση χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα και στο ίδιο δοχείο στα στάδια της
αποπροστασίας των α-αμινομάδων, των εκπλύσεων και της ακετυλίωσης. Στο στάδιο
της σύζευξης του αμινοξέος τα διάτρητα πλαστικά σακουλάκια χρησιμοποιούνται
παράλληλα σε ξεχωριστά δοχεία που εμπεριέχουν διάλυμα του καταλλήλου για κάθε
πεπτίδιο αμινοξέος. Συνήθως, η σύνθεση αυτή εφαρμόζεται για μεγάλο αριθμό ρητινών
τόσο με την Boc όσο και με την Fmoc στρατηγική πεπτιδικής σύνθεσης. Η μέθοδος
αυτή έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε μελέτες διαμόρφωσης (61), δραστικότητας (62),
Σχήμα 8. Βήματα της συνθετικής πορείας πολλαπλής πεπτιδικής σύνθεσης σε
σακουλάκια τσαγιού.
και αλληλεπίδρασης αντιγόνου-αντισώματος (63).
Α.IV.3 Σύνθεση σε «Κηλίδες κυτταρίνης»
Σ τη μέθοδο αυτή που παρουσιάστηκε από τους Frank et al (58), σε ένα
φύλλο
κυτταρίνης τα αμινοξέα τοποθετούνται σε προκαθορισμένα σημεία-κουκίδες που
απέχουν 1cm το ένα με το άλλο. Ολόκληρο το φύλλο χαρτιού βυθίζεται σε κατάλληλα
διαλύματα για τις εκπλύσεις, την αποπροστασία και την ακετυλίωση. Έπειτα
στεγνώνεται και τα αμινοξέα προστίθενται σε κηλίδες χρησιμοποιώντας μικροσιφώνια
ακριβείας. Η μέθοδος εφαρμόζεται σε ανοσολογικά τεστ οπού το φύλλο κυτταρίνης
χρησιμοποιείται όπως οι μεμβράνες στην τεχνική του Western Blot. Η μέθοδος αυτή
έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στην ανάλυση επιτόπων του ιού του αναπνευστικού
συγκυτίου (CMV) (64).
Α.IV.4 Σύνθεση σε δίσκους κυτταρίνης ή βαμβακιού
Έχουν αναφερθεί πολλές τροποποιήσεις όπως αυτή των Eichler και συν. (65)
που χρησιμοποίησαν λωρίδες χαρτιού με ανάλογο τρόπο με τα «σακουλάκια τσαγιού».
Οι Frank και συν. (59,66) χρησιμοποίησαν δίσκους κυτταρίνης που τοποθετούνται μέσα
σε στήλες μηχανήματος σύνθεσης πεπτιδίων συνεχούς ροής για τα βήματα της
αποπροστασίας και των εκπλύσεων, ενώ διαχωρίζονται κατάλληλα στα βήματα
σύζευξης. Λόγω των προβλημάτων που δημιουργούνται από τη χαμηλή μηχανική
σταθερότητα του χαρτιού κυτταρίνης, αναπτύχθηκε μία παραλλαγή με σύνθεση σε
δίσκους βαμβακιού (67). Ο διαχωρισμός των δίσκων στη μέθοδο αυτή από τα διάφορα
μίγματα διαλυτών γίνεται με φυγοκέντρηση.
Α.IV.5 Σύνθεση σε φιλμ πολυστυρολίου-πολυαιθυλενίου
Στη μέθοδο αυτή το στυρόλιο πολυμερίζεται σε φιλμ πολυαιθύλενιου χρησιμοποιώντας
γ-ακτινοβολία (55). Στη συνέχεια κόβεται σε μικρά κομμάτια τα οποία χρησιμοποιούνται
όπως τα «σακουλάκια τσαγιού». Η μέθοδος έχει εφαρμοσθεί σε μελέτες διαμόρφωσηςδραστικότητας (68,69).
Α.IV.6 Σύνθεση σε ράβδους
Ε ίναι
σήμερα η περισσότερο χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τη παράλληλη
πολλαπλή πεπτιδική σύνθεση. Αναπτύχθηκε το 1984 από τον Mario Geysen (57) και
επιτρέπει την ταυτόχρονη σύνθεση εκατοντάδων πεπτιδίων με πολύ χαμηλό κόστος. Η
σύνθεση γίνεται σε ράβδους πολυαιθυλενίου (4mm διαμέτρου, 40mm μήκους) πάνω
στις οποίες πολυμερίζεται ακρυλικό οξύ με γ-ακτινοβολία και προσκολλάται διαδοχικά
1,6 διαμινοεξάνιο (1,6 diaminohexane HMD) και β-αλανίνη (β-Ala) έτσι ώστε το
Σχήμα 9. Σχηματική αναπαράσταση του πεπτιδίου όπως αυτό συντίθεται στη ράβδο.
πεπτίδιο που στη συνέχεια θα ζευχθεί να βρίσκεται σε κάποια απόσταση από την
επιφάνεια της ράβδου και να μην αλληλεπιδρά στερικά με αυτή. (Σχήμα 9). Στη
συνέχεια τα πεπτίδια παρασκευάζονται με την Fmoc στρατηγική (Σχήμα 10). Όλα τα
στάδια σύζευξης γίνονται σε ειδικά πλακίδια 96 θέσεων όπου οι ποσότητες και το είδος
των διαλυμάτων αμινοξέων που θα προστεθούν σε κάθε θέση υπολογίζεται με τη
βοήθεια ειδικού προγράμματος Η/Υ. Το ίδιο πρόγραμμα επίσης παρέχει ακριβή
σχεδιαγράμματα του πλακιδίου και των θέσεων όπου θα προστεθεί κάθε φόρα το κάθε
διάλυμα, επιτρέποντας έτσι την ακριβή και χωρίς λάθη μεταφορά των διαλυμάτων των
αμινοξέων στις σωστές θέσεις για αρκετές εκατοντάδες ράβδους. Η περάτωση της
σύζευξης ελέγχεται με την αλλαγή του χρώματος του ευαίσθητου δείκτη μπλε της
βρωμοφαινόλης (Σχήμα 11).
Σχήμα 10.
Πορεία της πεπτιδικής σύνθεσης σε ράβδους με Fmoc στρατηγική προστασίας της ααμινομάδας και ενεργοποίηση της α-καρβοξυλομάδας σαν πενταφθόρο-φαινυλεστέρα (Pfp).
Στάδια (i)-(iii): αποπροστασία της α-αμινομάδας, Στάδια (iv)-(vi) σύζευξη αμινοξέος.
Σχήμα 11. Έλεγχος περάτωσης της σύζευξης αμινοξέως με τη βοήθεια του δείκτη μπλε της
βρωμοφαινόλης.
Τα στάδια πλυσίματος και αποπροστασίας γίνονται ταυτόχρονα για κάθε ομάδα
96 ράβδων σε ειδικά υδρόλουτρα. Το στάδιο του πλυσίματος, ειδικά στη μέθοδο αυτή,
είναι πολύ σημαντικό γιατί οι ράβδοι πολυαιθυλενίου δεν μπορούν να διογκώνονται
και να συρρικνώνονται με τις αλλαγές του διαλύτη (όπως οι κλασσικές ρητίνες) με
αποτέλεσμα τα προσροφούμενα μόρια να αφαιρούνται δύσκολα. Ακολουθεί η
αποπροστασία των παράπλευρων αλυσίδων και η αποδιάταξη της διαμόρφωσης των
πεπτιδίων στο χώρο με υπερήχους και την δράση διαλύματος δωδεκυλοθεικού νατρίου
(SDS). Τα πεπτίδια μπορούν έπειτα να χρησιμοποιηθούν κατευθείαν σε ELISA
πειράματα, αφού οι ράβδοι στις οποίες παρασκευάζονται είναι έτσι διευθετημένοι (σε
κατάλληλη πλαστική βάση) ώστε να ταιριάζουν απόλυτα στο κλασσικό μικροπλακίδιο
ELISA των 96 θέσεων (8 γραμμές x 12 στήλες) (Σχήμα 12).
Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό γραμμικών (70) και μη
(71,72) επιτόπων αντισωμάτων, καθώς και για τον καθορισμό του βέλτιστου μήκους
ανοσοδραστικών πεπτιδίων (73), τον εντοπισμό των κρίσιμων για τη δέσμευση
αντισώματος αμινοξέων (73), τη βελτίωση της δραστικότητας του πεπτιδικού αναλόγου
(74) και διερεύνηση της σχέσης διαμόρφωσης-δραστικότητας (75). Επίσης με τη
μέθοδο αυτή μπορούν να μελετηθούν και άλλες αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών
όπως μελέτες δέσμευσης ορμονών στους υποδοχείς τους (76). Πρόσφατα η μέθοδος
έχει τροποποιηθεί έτσι ώστε τα πεπτίδια να μπορούν και να απελευθερωθούν από τις
ράβδους και να ληφθούν σε ελεύθερη μορφή. Αυτό επιτυγχάνεται με το σχηματισμό
κυκλικού διπεπτιδίου lys-pro (δικετοπιπεραζίνη) (77,78) στο C καρβόξυ τελικό άκρο ή
απομάκρυνση πεπτιδίου με διάλυμα NaOH (για πεπτίδια με ελεύθερο καρβοξύλιο) ή
με αέρια αμμωνία (79-80) (για πεπτίδια αμίδια) (Σχήμα 13 Α, Β, Γ).
Σχήμα 12. Διάταξη των ράβδων πολυαιθυλενίου σε κατάλληλη πλαστική βάση
έτσι ώστε να ταιριάζουν απόλυτα σε μικροπλακίδιο τιτλοποιήσης
(ELISA).
Σχήμα 13.
Απομάκρυνση πεπτιδίων από τη ράβδο (Α) μέσω του σχηματισμού
δικετοπιπεραζίνης (I:TFA, II: Υπέρηχοι, III: Ρυθμιστικό διάλυμα pH=3,
IV:Ρυθμιστικό διάλυμα pH=7), (Β) με διάλυμα NaOH, (Γ) με αέρια
αμμωνία.
Έτσι οι χρήσεις της σύνθεσης σε ράβδους επεκτείνεται στην ανάλυση επιτόπων Τβοηθητικών και Τ-κυτταροτοξικών κυττάρων (81), την σύνθεση βιοτινυλιωμένων πεπτιδίων
για πειράματα σε ELISA Στρεπταβιδίνης (82), και τη μελέτη ορμονικών αναλόγων.
Ένα επιπλέον πλεονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι ότι υπάρχει η δυνατότητα
(σε ειδικές ράβδους) να προσαρμοστούν περισσότερες από μια διαφορετικές
«ροδέλες» πολυμερούς ανά ράβδο με αποτέλεσμα να είναι δυνατή η ταυτόχρονη
σύνθεση ενός πεπτιδίου με ελεύθερο καρβοξυτελικό άκρο, σε μορφή δικετοπιπεραζίνη,
Σχήμα 14.
Α: Σύνθετη ράβδος για ταυτόχρονη σύνθεση πεπτιδίου με
ελεύθερο καρβοξύλιο, σε μορφή δικετοπιπεραζίνης, με βιοτίνη και
σε σύνδεση με τη ράβδο. Β: Ράβδος για μεγαλύτερη κλίμακα
σύνθεσης πεπτιδίων (10μmoles πεπτιδίου), Γ: Απλή ράβδος
(2μmoles πεπτιδίου).
συζευγμένου με βιοτίνη και σε σύνδεση με τη ράβδο (Σχήμα 14) Έτσι μπορεί με τη
χρήση μιας μόνο ομάδας ράβδων να συντεθούν ταυτόχρονα πεπτίδια σε κατάλληλη
μορφή για αντιγονική χαρτογράφηση επιτόπων Β-λεμφοκυττάρων, CD4+ Τλεμφοκυττάρων και CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων.
Η ποσότητα του πεπτιδίου που μπορεί να συντεθεί πάνω στις ράβδους έχει
επίσης αυξηθεί σημαντικά : από 50 nmoles που ήταν αρχικά (57,73), με βελτίωση του
πολυμερούς υποστρώματος αυξήθηκε στα 2μmoles (83,84), ενώ με αλλαγή
του
μεγέθους της κεφαλής της ράβδου στα 10μmoles πεπτιδίων (85) (Σχήμα 14). Ο
κατάλογος των δημοσιεύσεων που αναφέρονται σε συνθέσεις πεπτιδίων σε ράβδους
είναι πολύ μεγάλος και ξεπερνά τις 200 εργασίες (έως το τέλος του 1995). Ενδεικτικά
αναφέρουμε την χαρτογράφηση και τον προσδιορισμό επιτόπων Τ-λεμφοκυττάρων στη
P53 πρωτείνη (86), στον ιό της ηπατίτιδας Β (87), στον ιό HIV-1 (88), στον ιό EpsteinBarr (89) και Β-λεμφοκυττάρων στον ιό των ανθρώπινων κονδυλωμάτων (90), στο HLA
B27 (91), στον υποδοχέα της ακετυλχολίνης (92), και στο SmB αυτοαντιγόνο (93).
Α.V ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΕΣ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ
Γ ια τις μελέτες διαμόρφωσης-δραστικότητας που αφορούν κυρίως τη σύνδεση αντιγόνου-αντισώματος,
πεπτιδίου-υποδοχέα ή πεπτιδίου-μεγίστου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας, καθώς και για μελέτες
διασταυρούμενης δραστικότητας απαιτείται η μελέτη χιλιάδων πεπτιδίων. Μια προσέγγιση για τη σύνθεση
ενός τόσο μεγάλου αριθμού πεπτιδίων είναι η δημιουργία βιβλιοθηκών πεπτιδίων. Τα πεπτίδια αυτά
συντίθενται σε μίγμα ή ξεχωριστά συμφώνα με διάφορες τεχνικές που συνοψίζονται στο Πίνακα 2.
Πίνακας 2 Μέθοδοι δημιουργίας βιβλιοθηκών πεπτιδίων (>1000 πεπτίδια).
Μέθοδος
Σύνθεση με
Σύνθεση με
Βιβλιοθήκη
Βιβλιοθήκη
φωτόλυση.
διαχωρισμό.
ελευθέρων
βιβλιοθηκών.
πεπτιδίων.
Πολυμερές
Στρατηγική
Έλεγχος
Ταυτοποίηση
Παραπομπή
Φιλμ γυαλιού με
Σφαιρίδια
PS-DVB
PS-DVB
αμινομάδες
πολυμερούς
Φωτοευαίσθητη
Fmoc ή Boc και
Fmoc ή Boc σε
Fmoc ή Boc και
ομάδα προστασίας
διαχωρισμός
σακουλάκια
σύζευξη μιγμάτων
της Ν α
σφαιριδίων.
τσαγιού.
αμινοξέων.
Αντισώματα
Αντισώματα με
Βιοχημικό Τεστ
Όχι απαραίτητος.
σεσημασμένα με
ένζυμο βαφούν
και επόμενος
φθορίζουσα ουσία.
τα σφαιρίδια.
κύκλος σύζευξης.
Με βάση την
Προσδιορισμός
Αλληλουχία
Καθορισμένα
τοπογραφική
αλληλουχίας
Πεπτιδίου στο
συνθετικά
εντόπιση.
πεπτιδίου.
βιοχημικό τεστ.
μίγματα
94
95
96
97
Οι πρώτες βιβλιοθήκες πεπτιδίων εμφανίστηκαν το 1990 και στηρίζονται στη
προσθήκη μιγμάτων αμινοξέων αντί του ενός στο στάδιο σύζευξης, και στον μετέπειτα
διαχωρισμό των πεπτιδίων που προκύπτουν με HPLC (98). Επειδή στις τεχνικές αυτές
τα πεπτίδια παρασκευάζονται σε διαφορετικές αποδόσεις, λόγω της διαφορετικής
ταχύτητας σύζευξης των αμινοξέων (που εξαρτάται από το είδος του κάθε αμινοξέος
και την αλληλουχία των αμινοξέων του πεπτιδίου), έγιναν τροποποιήσεις σύμφωνα με
τις οποίες το πολυμερές αναμειγνύεται τυχαία, διαχωρίζεται σε κλάσματα, για τη
σύζευξη κάθε διαφορετικού αμινοξέος, τα οποία στη συνέχεια επαναμιγνύονται (99).
Το στάδιο του διαχωρισμού των πεπτιδίων δεν είναι πλέον απαραίτητο αφού με τη
βοήθεια ειδικού πειράματος π.χ. ELISA, είναι δυνατό να χρωματιστούν και εν
συνεχεία να διαχωριστούν μόνο εκείνα τα σφαιρίδια ρητίνης που περιέχουν την
δραστική αλληλουχία ή οποία μπορεί να προσδιοριστεί αναλυτικά από τα σφαιρίδια
αυτά (95). Επειδή για λόγους αξιοπιστίας απαιτείται αριθμός σφαιριδίων τουλάχιστον
δεκαπλάσιος από τον αριθμό των πεπτιδίων (10 σφαιρίδια για κάθε αλληλουχία), η
ποσότητα ρητίνης που απαιτείται αυξάνεται απαγορευτικά σε σχέση με το μέγεθος του
πεπτιδίου (Πίνακας 3).
Πίνακας 3: Ποσότητα ρητίνης (μεγέθους σφαιριδίων 130μm) που απαιτείται για δημιουργία
βιβλιοθηκών διαφόρου πεπτιδικού μήκους.
Σφαιρίδιο-πεπτίδιο.
Βιβλιοθήκη βιβλιοθηκών με
μοτίβο 3 αμινοξέων.
Μήκος
Αριθμός σφαιριδίων
(αμινοξέα)
3
8.000
4
Ποσότητα
Αριθμός
Ποσότητα
ρητίνης
σφαιριδίων
ρητίνης
8 mg
8.000
8 mg
160.0000
160 mg
32.000
32 mg
5
3.200.000
3,2 g
80.000
80 mg
6
64.000.000
64 g
160.000
160 mg
7
1.280.000.000
1,28 kg
280.000
280 mg
8
25.600.000.000
25,6 kg
448.000
448 mg
9
512.000.000.000
512 kg
672.000
672 mg
10
10.240.000.000.000
10.2 t
960.000
960 mg
Αυτός ο περιορισμός είχε σαν αποτέλεσμα να αναπτυχθούν οι βιβλιοθήκες
βιβλιοθηκών, όπου κάθε σφαιρίδιο μπορεί να περιέχει πολλά πεπτίδια που όμως
ακολουθούν ένα προκαθορισμένο μοτίβο (π.χ. μοτίβο 3 αμινοξέων σε βιβλιοθήκες
εξαπεπτιδίων: IRxWxx (100). Με τον τρόπο αυτό η ποσότητα της ρητίνης που
απαιτείται για το σχηματισμό μιας βιβλιοθήκης διατηρείται σε λογικά πλαίσια
(Πίνακας 3).
Πρόσφατα έχει αναπτυχθεί μία νέα τεχνική ανάπτυξης βιβλιοθηκών πεπτιδίων
που στηρίζεται στις αρχές τις φωτολιθογραφίας (101). Σύμφώνα με αυτή σε επιφάνεια
1 cm2 συντίθενται 100x100 πεπτίδια και η φωτοευαίσθητη nitro-veratryloxycarbonylομάδα προστασίας της α-αμινομάδας μπορεί να αφαιρείται με φωτόλυση επιλεκτικά
(Σχήμα 15).
Εφαρμογές των βιβλιοθηκών πεπτιδίων έχουν πρόσφατα αναφερθεί για τον
καθορισμό πεπτιδίων που συνδέονται στο MHC-I (102,103), τον προσδιορισμό
μιμοτόπων αντισωμάτων κατά του ιού της ηπατίτιδας Α (104) και σε μελέτες
αλληλεπίδρασης αντιγόνου αντισώματος. (105).
Σχήμα 15. Δυαδική στρατηγική πεπτιδικής σύνθεσης με φωτόλυση (4 βήματα για
συνδυασμούς 4 μονομερών A,B,C,D)
Β΄
ΑΝΟΣΙΑ-ΑΥΤΟΑΝΟΣΙΑ
Β.Ι. Η ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΟΚΡΙΣΗ
Β.Ι.1 Γενικά
Τ ο ανοσολογικό
σύστημα έχει σαν πρωταρχικό του στόχο την προστασία του
ανθρώπινου οργανισμού από ξένους εισβολείς όπως ιούς, μικροοργανισμούς και
παράσιτα. Η απόκριση του ανοσολογικού συστήματος σε ένα εισβολέα περιλαμβάνει
δύο κύριες φάσεις: (i) την αναγνώριση των ξένων προς τον ανθρώπινο οργανισμό
μορίων-συστατικών του εισβολέα που ονομάζονται αντιγόνα και (ii) την ενεργοποίηση
ανοσοδραστικών κυττάρων ενάντια στον εισβολέα, ο οποίος αναγνωρίζεται σαν πηγή
του αντιγόνου και στη συνέχεια καταστρέφεται. Τα κύτταρα που συμμετέχουν στην
ανοσολογική απάντηση είναι κυρίως τα λεμφοκύτταρα και τα φαγοκύτταρα που
προέρχονται από τα αρχέγονα κύτταρα του μυελού των οστών (Σχήμα 16). Τα
λεμφοκύτταρα διαφοροποιούνται και ωριμάζουν στον πρωτογενή λεμφικό ιστό (στο
μυελό των οστών και στο θύμο αδένα), αναγνωρίζουν το αντιγόνο και ανταποκρίνονται
αρχικά σε αυτό στον δευτερογενή λεμφικό ιστό (λεμφαδένες, σπλήνας, αμυγδαλές,
πλάκες Peyer, σκωληκοειδής απόφυση), ενώ η δραστική φάση της απόκρισης τους
(effector phase) εμφανίζεται στο σημείο οπού ανευρίσκεται η πηγή του αντιγόνου.
Σχήμα 16.
Βασικά κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος. Α: Τ λεμφοκύτταρο,
Β: πλασματοκύτταρο, Γ: μακροφάγο
Τα λεμφοκύτταρα είναι δύο κυρίως τύπων (i) τα Β λεμφοκύτταρα που
αναπτύσσονται και ωριμάζουν στο μυελό των οστών και τα οποία μπορούν εν
συνεχεία να διαφοροποιηθούν σε πλασματοκύτταρα που παράγουν αντισώματα
(Σχήμα 16) και (ii) τα Τ-λεμφοκύτταρα που ωριμάζουν και διαφοροποιούνται στο
θύμο αδένα. Τα Τ-λεμφοκύτταρα βοηθούν τα Β-λεμφοκύτταρα να παράγουν
αντισώματα, καταστρέφουν μολυσμένα κύτταρα, ρυθμίζουν την ανοσολογική
απόκριση και ενεργοποιούν την μικροβιοκτόνα δράση άλλων κυττάρων όπως των
μακροφάγων.
Κάθε λεμφοκύτταρο από τις παραπάνω κατηγορίες διαθέτει ένα υποδοχέα
επιφανείας ικανό να αναγνωρίζει ένα ειδικό αντιγόνο. Τα Β-λεμφοκύτταρα σαν
υποδοχέα αντιγόνου έχουν την ανοσοσφαιρίνη επιφανείας τους η οποία
αναγνωρίζει το αντιγονικό μόριο στη φυσική του μορφή. Τα Τ-λεμφοκύτταρα έχουν
τον δικό τους υποδοχέα (TCR) ο οποίος όμως αναγνωρίζει τμήμα (προϊόν πέψης)
του αντιγονικού μορίου σε σύνδεση με μόρια του μεγίστου συμπλέγματος
ιστοσυμβατότητας (MHC). Τα MHC μόρια είναι δύο τάξεων Ι και ΙΙ και τα μεν
πρώτα εκφράζονται από όλα τα εμπύρηνα κύτταρα, ενώ τα δεύτερα κυρίως από τα
επαγγελματικά αντιγονο-παρουσιαστικά κύτταρα (Β-λεμφοκύτταρα, μακροφάγα
και δενδριτικά κύτταρα).
Β.Ι.2 Η Ανοσολογική απόκριση
Η ανοσολογική απόκριση περιλαμβάνει σε πρώτη φάση την αναγνώριση του
αντιγόνου
και
ανταποκρίνονται
τον
πολλαπλασιασμό
θετικά σε
των
αυτό και σε
λεμφοκυτταρικών
δεύτερη
φάση
κλώνων
που
την παραπέρα
διαφοροποίηση των κυττάρων αυτών και την ενεργοποίηση ανοσοδραστικών
μηχανισμών που περιλαμβάνουν την παραγωγή αντισωμάτων, την δραστηριοποίηση
των μακροφάγων και την ανάπτυξη κυτταροτοξικών κυττάρων ώστε να εξαλειφθεί
η πηγή του αντιγόνου.
Β.Ι.2.1 Αναγνώριση του αντιγόνου
Στην αναγνώριση του αντιγόνου εμπλέκονται 3 κατηγορίες μορίων: Ο υποδοχέας
αντιγόνου των Β-λεμφοκυττάρων (ανοσοσφαιρίνη η αντίσωμα), ο υποδοχέας
αντιγόνου των Τ-λεμφοκυττάρων (TCR) και τα μόρια του μεγίστου συμπλέγματος
ιστοσυμβατότητας (MHC).
(i) Ανοσοσφαιρίνες
Οι ανοσοσφαιρίνες παράγονται σε δύο βασικές μορφές: την μεμβρανική και
την ελεύθερη. Η μεμβρανική ανοσοσφαιρίνη αποτελεί τον αντιγονικό υποδοχέα των Βλεμφοκυττάρων, ενώ ανοσοσφαιρίνη με την ίδια αντιγονική ειδικότητα μπορεί να
εκκριθεί και σε ελεύθερη μορφή από το Β-λεμφοκύτταρο (όταν αυτό διαφοροποιηθεί
σε πλασματοκύτταρο). Το μόριο τους αποτελείται από δύο πανομοιότυπες βαριές
πολυπεπτιδικές αλυσίδες που ενώνονται με δύο όμοιες ελαφριές αλυσίδες μεσώ
δισουλφιδικών δεσμών και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Τα αμινοτελικά άκρα της
βαριάς και της ελαφριάς αλυσίδας περιέχουν περιοχές στην αλληλουχία αμινοξέων
τους που ποικίλουν πολύ ανάμεσα σε διαφορετικά αντισώματα (υπερμεταβλητές
περιοχές). Οι περιοχές αυτές σχηματίζουν την περιοχή δέσμευσης του αντιγόνου
(Σχήμα 17) και είναι υπεύθυνες για την διαφοροποίηση της αντιγονικής ειδικότητας
μεταξύ διαφορετικών αντισωμάτων. Το υπόλοιπο της δομής της ανοσοσφαιρίνης
περιλαμβάνει σταθερές περιοχές οι οποίες εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις του
αντισώματος με υποδοχείς των ανοσοσφαιρινών (Fc υποδοχείς) και με παράγοντες του
συμπληρώματος.
Σχήμα 17. Οι υπερμεταβλητές περιοχές (HV:
μαύρο χρώμα) στην αλληλουχία
της ελαφριάς αλυσίδας έρχονται
κοντά στο χώρο στη τριτοταγή
της δομή (πάνω) σχηματίζοντας
το ήμισυ της περιοχής δεσμευσής
του αντιγόνου (κάτω).
Τα αντισώματα χωρίζονται σε τάξεις ανάλογα με τον τύπο της βαριάς αλυσίδας
τους. Οι τάξεις των ανοσοσφαιρινών είναι πέντε: IgM, IgG, IgA, IgD, IgE., ενώ οι
τάξεις IgG και IgA χωρίζονται περαιτέρω σε υποτάξεις (Σχήμα 18). Η τάξη του
αντισώματος που παράγεται από ένα λεμφοκύτταρο μπορεί να αλλάξει στη πορεία
της ανοσολογικής απόκρισης με μια διαδικασία μεταλλαγής γονιδίων κάτω από τον
έλεγχο των Τ-λεμφοκυττάρων.
Σχήμα 18.
Ανοσοσφαιρίνες με 6 διαφορετικούς υποτύπους βαριάς αλυσίδας
ομαδοποιούνται στις IgG και IgA τάξεις ανάλογα με τις δομικές τους
ομοιότητες. Οι ισότυποι αυτοί παραμένουν διαμορφωτικά διακριτοί.
(ii) MHC μόρια και TCR υποδοχείς.
Τα Τ-λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν ένα αντιγόνο μεσώ του TCR υποδοχέα τους
μονό όταν αυτό παρουσιαστεί σε σύνδεση με μόρια του μέγιστου συμπλέγματος
ιστοσυμβατότητας (MHC) από κάποιο άλλο κύτταρο. Τα CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα
αναγνωρίζουν το αντιγόνο όταν αυτό συνδέεται με τα MHC μόρια τάξεως ΙΙ, ενώ
τα CD8+ όταν αυτό συνδέεται με τα MHC τάξεως Ι.
Τα MHC τάξεως Ι μόρια αποτελούνται από μια πολυμορφική βαριά αλυσίδα που
εκφράζεται από γονίδια των τόπων A, B, C και βρίσκεται σε μη ομοιοπολική
σύνδεση με τη β-μικροσφαιρίνη. Τα MHC-II αποτελούνται από ένα ετεροδιμερές
σχηματιζόμενο από μία βαριά και μία ελαφριά γλυκοπρωτεϊνική αλυσίδα που είναι
παράγωγες των DR, DQ και DP γονιδιακών τόπων. Τόσο τα MHC-I όσο και τα
MHC-II μόρια περιέχουν μια περιοχή δέσμευσης που μπορεί να δεχθεί ένα
αντιγονικό πεπτίδιο (Σχήμα 19). Η δέσμευση του αντιγόνου σε αυτά είναι πολύ
λιγότερο ειδική από αυτή στα αντισώματα ή στους TCR υποδοχείς επιτρέποντας
μεγάλο αριθμό διαφορετικών πεπτιδίων να δεσμευτούν σε αυτά και να
Σχήμα 19. Τριτοταγής
δομή
των
μορίων του μέγιστου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξεως I
και II όπως αυτή φαίνεται από
πάνω (πάνω) και από πλάγια
(κάτω).
παρουσιαστούν αποτελεσματικά στα Τ-λεμφοκύτταρα.
Ο TCR υποδοχέας είναι ένα ετεροδιμερές των πολυμορφικών αλυσίδων α, β (στα
Th και Tc κύτταρα) το οποίο συνδέεται μη ομοιοπολικά με το σύμπλεγμα μορίων
CD3. Η σύνδεση του TCR υποδοχέα με το σύμπλοκο MHC-πεπτιδίου
πραγματοποιείται με την αλληλεπίδραση του TCR υποδοχέα με το αντιγονικό
πεπτίδιο (Τ-λεμφοκυτταρικό επίτοπο) που βρίσκεται στη κοιλότητα δέσμευσης του
MHC μορίου (Σχήμα 20). Η σύνδεση αυτή σταθεροποιείται επιπρόσθετα με την
βοήθεια των μορίων CD4 ή των CD8 μέσω των οποίων μπορεί να επέλθει και
Σχήμα 20.
Ο TCR υποδοχέας (α-αλυσίδα: C αVα, β-αλυσίδα: CβVβ ) αναγνωρίζει το αντιγονικό
πεπτίδιο (P1P8) που βρίσκεται στη κοιλότητα δεσμευσής του MHC-I (α-αλυσίδα:
α1α2α3, β2-μικροσφαιρίνη: β2m).
διμερισμός-πολυμερισμός των TCR-MHC συμπλεγμάτων (106).
Ορισμένα μόρια τα οποία καλούνται υπεραντιγόνα έχουν τη δυνατότητα να
αντιδρούν με περιοχές εκτός της κοιλότητας δέσμευσης των μορίων MHC και να
προκαλούν μη ειδική διέγερση του ανοσολογικού συστήματος, κυρίως γεφυρώνοντας
τα μόρια MHC με τους TCR υποδοχείς (Σχήμα 21), αλλά και διμερίζονταςπολυμερίζοντας μόρια MHC (107, 108).
Σχήμα 21. Το υπεραντιγόνο SEA (Σταφυλοκοκκική Εντεροτοξίνη Α)
αλληλεπιδρά με περιοχή εκτός της κοιλότητας δέσμευσης
πεπτιδίου του μορίου MHC-II του αντιγονοπαρουσιαστικού
κυττάρου και το συνδέει με τον TCR υποδοχέα του Τλεμφοκυττάρου.
Β.Ι.2.2 Παρουσίαση του αντιγόνου (Σχήμα 22)
Για την αποτελεσματική έκλυση της ειδικής ανοσολογικής απόκρισης, στην
κλασσική θυμοεξαρτώμενη απάντηση, απαιτείται η παρουσίαση του αντιγόνου στα
Τ-λεμφοκύτταρα.
(i)
Τα επαγγελματικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα προσλαμβάνουν το αντιγόνο
είτε μέσω μιας διαδικασίας ενδοκύτωσης και έγκλεισης του σε φαγοσώματα
(μακροφάγα κύτταρα), είτε μέσω δέσμευσης του από μεμβρανική ανοσοσφαιρίνη
και έγκλεισης του σε ενδοκυττωτικά κυστίδια (Β-λεμφοκύτταρα). Στη συνέχεια το
αντιγόνο (που συνηθέστερα είναι πρωτεϊνικής φύσεως) πέπτεται ενζυμικά και τα
θραύσματα αυτού (πεπτίδια) έρχονται σε επαφή με κυστίδια που προέρχονται από
το ενδοπλασματικό δίκτυο και εμπεριέχουν μόρια MHC-II. Εκεί τα πεπτίδια που
έχουν τη μεγαλύτερη συγγένεια δέσμευσης με τον συγκεκριμένο MHC-απλότυπο
αντικαθιστούν την σταθερή αλυσίδα (invariant chain) που καταλαμβάνει την
περιοχή δέσμευσης αντιγόνου του MHC μορίου. Τελικά το όλο σύμπλοκο MHC-II-
πεπτιδίου μεταφέρεται στην κυτταρική μεμβράνη οπού παρουσιάζεται στα Τh
λεμφοκύτταρα.
(ii)
Στην περίπτωση μόλυνσης κάποιου ιστού π.χ. από κάποιο ιό, τα κύτταρα του ιστού
αυτού μπορούν να παρουσιάσουν ιικά αντιγόνα. Αρχικά ο ιός χρησιμοποιώντας τα
ριβοσώματα στο ενδοπλασματικό δίκτυο του κυττάρου ξενιστή παράγει ιικές
πρωτεΐνες. Κάποια μόρια από τις πρωτεΐνες αυτές πέπτονται υπό τη δράση
πρωτεασών και τα πεπτίδια που προκύπτουν δεσμεύονται στα MHC-I μόρια που
επίσης συντίθενται στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Το σύμπλοκο MHC-I - ιικό
πεπτίδιο, τέλος μεταφέρεται στη κυτταρική μεμβράνη όπου παρουσιάζεται στα Tc
λεμφοκύτταρα.
Σχήμα 22.
Μηχανισμός πρόσληψης και παρουσίασης του αντιγόνου Α: από τα μακροφάγα
κύτταρα, Β: από τα Β-λεμφοκύτταρα, Γ: από μολυσμένα με ιό ιστικά κύτταρα.
Β.Ι.2.3 Ενεργοποίηση ανοσοδραστικών κυττάρων (Σχήμα 23)
Ανάλογα με τον τρόπο παρουσίασης του αντιγόνου δραστηριοποιούνται ορισμένοι
υποπληθυσμοί των Τ-λεμφοκυττάρων:
Σχήμα 23. Παρουσίαση
αντιγόνου
και
ενεργοποίηση
ξεχωριστών
Τλεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών από Α: μακροφάγα κύτταρα, Β: Βλεμφοκύτταρα, Γ: μολυσμένα με ιό ιστικά κύτταρα.
(i)
Τα μακροφάγα κύτταρα παρουσιάζουν το αντιγόνο σε σύνδεση με τα MHC-II
μόρια στα βοηθητικά Τh1 λεμφοκύτταρα, ενώ ταυτόχρονα παράγουν IL-1. Η
σύνδεση αντιγόνου στο TCR υποδοχέα και η IL-1 προκαλούν διέγερση του
ηρεμούντος Τh1-λεμφοκύτταρου. Έτσι το Th1-λεμφοκύτταρο ενεργοποιείται και
παράγει κυτταροκίνες όπως η IL-2 που με αυτοκρινή δράση επάγει τον κλωνικό
πολλαπλασιασμό του Τ-λεμφοκυττάρου και η INF-γ η οποία προκαλεί αφενός
αύξηση της παραγωγής MHC-II μορίων από τα μακροφάγα (με αποτέλεσμα την πιο
αποτελεσματική
αντιγονοπαρουσίαση)
ενώ
αφετέρου
ενεργοποιούνται
οι
μηχανισμοί μικροβιακής καταστροφής των μακροφάγων (όπως τα συστήματα
ελευθέρων ριζών και οξειδίων του αζώτου).
(ii)
Τα Β-λεμφοκύτταρα παρουσιάζουν το αντιγόνο σε σύνδεση με τα MHC-II μόρια
στα βοηθητικά Th2 λεμφοκύτταρα. Το Th2 λεμφοκύτταρο έτσι ενεργοποιείται και
παράγει κυτταροκίνες όπως η IL-4 που επάγει τον πολλαπλασιασμό των Βλεμφοκυττάρων και οι IL-2, IL-5, IL-6 που επάγουν την διαφοροποίηση των Βλεμφοκυττάρων σε πλασματοκύτταρα ικανά για την παραγωγή αντισωμάτων. Τα
αντισώματα
που
παράγονται μέσω
του Fc
τμήματος τους μπορούν να
ενεργοποιήσουν το σύστημα του συμπληρώματος ή
δώσουν τη δυνατότητα σε
κύτταρα με Fc υποδοχείς να «δουν» τον εισβολέα με αποτέλεσμα την καταστροφή
του.
(iii)
Μολυσμένα από ιό ιστικά κύτταρα παρουσιάζουν το αντιγόνο σε σύνδεση με τα
MHC-I μόρια στα κυτταροτοξικά Tc λεμφοκύτταρα. Τα Τc λεμφοκύτταρα έτσι
ενεργοποιούνται και μέσω μορίων της επιφάνειας τους όπως ο CD95-συνδέτης
(συνδέτης για το Fas μόριο) και της παραγωγής παράγοντα βήτα νέκρωσης όγκων
(TNF) και λεμφοτοξίνης καταστρέφουν τα μολυσμένα από τον ιό κύτταρα.
Η διέγερση των Τ και Β λεμφοκυττάρων που οδηγεί στη διαφοροποίηση και τον
κλωνικό πολλαπλασιασμό τους είναι μια πολύπλοκη διαδικασία. Η σύνδεση του
MHC-πεπτιδίου είναι μεν το ισχυρότερο σήμα για την ενεργοποίηση αυτή, αλλά
από μόνη της και χωρίς τη μεσολάβηση των συνδιεγερτικών μορίων επιφανείας και
των κυτταροκινών δεν επαρκεί (Σχήμα 24). Έτσι η παρουσίαση του αντιγόνου
χωρίς τη δράση των συνδιεγερτικών παραγόντων οδηγεί μάλλον σε ανοσολογική
ανοχή αντί για ανοσολογική απόκριση.
Σχήμα 24. Η σύνδεση συνδιεγερτικών μορίων επιφανείας των Β- και Τ- λεμφοκυττάρων είναι αναγκαία
για την αποτελεσματική παρουσίαση του αντιγόνου.
B.I.2.4 Ρυθμιστικοί μηχανισμοί
Το έναυσμα της ανοσολογικής απόκρισης είναι το αντιγόνο. Όταν το αντιγόνο
εξαλειφθεί δεν έχουμε πλέον το σήμα της σύνδεσης του TCR με το MHC-πεπτίδιο με
αποτέλεσμα το Τ-λεμφοκύτταρο να παύει να παράγει κυτταροκίνες και να εκφράζει
υποδοχείς γι’ αυτές. Έτσι ο συγκεκριμένος κλώνος Τ-λεμφοκυττάρου καταστέλλεται.
Παρόμοια ένα πλασματοκύτταρο επανατροφοδοτείται με το αντίσωμα που παράγει και
όταν αυτό δεν βρίσκει το αντιγόνο-στόχο του με αποτέλεσμα την καταστολή του (Σχήμα
26). Με αυτούς τους τρόπους η ανοσολογική απάντηση (κυτταρική ή χυμική)
Σχήμα 25. Ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης με την παραγωγή κυτταροκινών από τα Th1 και Th2
λεμφοκύτταρα (Συμπαγή βέλη: διεγερτική δράση, Διακεκομένα βέλη: κατασταλτική δράση,
ADCC: κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από αντίσωμα).
καταστέλλεται με την καταστροφή της πηγής του αντιγόνου (π.χ. του μολυσματικού
παράγοντα) και παραμένουν μόνο κύτταρα μνήμης, δηλαδή κύτταρα που έχουν υποστεί
φαινοτυπικές και γονοτυπικές αλλαγές έτσι ώστε να αντιδρούν άμεσα σε μία νέα
επαφή με το αντιγόνο. Μέσα σ’ αυτό το γενικότερο πλαίσιο όμως υπάρχει μια σειρά
ρυθμιστικών μηχανισμών που προκύπτουν από το πλέγμα των αλληλεπιδράσεων
(κυρίως μέσω της παραγωγής κυτταροκινών) μεταξύ των κυττάρων του ανοσολογικού
συστήματος
(Σχήμα 25). Έτσι όταν έχουμε παραγωγή αντισωμάτων, λόγω της
ενεργοποίησης των Th2 λεμφοκυττάρων, παράγεται IL-10 από τα τελευταία η οποία
καταστέλλει τα Τh1 λεμφοκύτταρα και την κυτταρική ανοσολογική απόκριση. Όταν
αντίθετα συμβαίνει κυτταρική ανοσολογική απάντηση η INF-γ που παράγεται από τα
Τh1-λεμφοκύτταρα προκαλεί καταστολή των Τh2-λεμφοκυττάρων και της χυμικής
ανοσολογικής απάντησης (Σχήμα 25).
Άλλοι ρυθμιστικοί μηχανισμοί που βασίζονται στην ύπαρξη μιας υποομάδας CD8+
T-λεμφοκυττάρων με κατασταλτική δράση (T-suppressor cells) για τα Β και Th
λεμφοκύτταρα ή σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ αντισωμάτων και των κυττάρων που τα
παράγουν, μέσα σε ένα ιδιοτυπικό-αντιιδιοτυπικό δίκτυο (Σχήμα 26).
Σχήμα 26. Α: Τροφοδότηση με αντιγόνο διεγείρει την παραγωγή αντισωμάτων από το Β-λεμφοκύτταρο
μέσω γεφύρωσης μεμβρανικών ανοσοσφαιρινών, ενώ επανατροφοδότηση με ειδικό αντίσωμα
καταστέλλει την παραγωγή αντισωμάτων από το Β-λεμφοκύτταρο μέσω γεφύρωσης της
μεμβρανικής ανοσοσφαιρίνης με τον Fc υποδοχέα. Β: Τα αντιιδιοτυπικά αντισώματα μπορούν να
διεγείρουν ή να καταστείλουν την παραγωγή αντισωμάτων με παρόμοιο τρόπο.
Β.Ι.2.5 Θυμοανεξάρτητη ανοσολογική απάντηση
Η διέγερση των Β-λεμφοκυττάρων όπως είδαμε γίνεται έπειτα από παρουσίαση
αντιγόνου στα Th2-λεμφοκύτταρα. Διέγερση των Β-λεμφοκυττάρων όμως μπορούμε
να έχουμε και χωρίς την βοήθεια των Τh-λεμφοκυττάρων με δύο επιπλέον τρόπους.
Ο πρώτος αφορά την θυμοανεξάρτητη απάντηση τύπου 1 η οποία προκαλείται από
αντιγόνα-μιτογόνα όπως η σταφυλοκοκκική πρωτεΐνη Α και το αντιγόνο pokeweed
τα οποία προκαλούν πολυκλωνική ενεργοποίηση των Β-λεμφοκυττάρων. Ο
δεύτερος αφορά τη θυμοανεξάρτητη απάντηση τύπου 2 από μόρια που
αποτελούνται από επαναλαμβανόμενους αντιγονικούς καθοριστές όπως οι
πολυσακχαρίτες βακτηριδίων. Τα αντιγονικά αυτά μόρια μπορούν να συνδέσουν
μεταξύ τους πολλαπλές ανοσοσφαιρίνες επιφανείας των Β-λεμφοκυττάρων με
αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των τελευταίων. Η θυμοανεξάρτητη διέγερση των Βλεμφοκυττάρων γενικά οδηγεί σε παραγωγή αντισωμάτων IgM τάξεως με χαμηλή
συγγένεια προς το αντιγόνο, ενώ η ανοσολογική μνήμη που εγκαταλείπει είναι
πτωχή.
Β.ΙΙ. Η ΑΥΤΟΑΝΟΣΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΟΚΡΙΣΗ
Το ανοσολογικό σύστημα φυσιολογικά είναι ικανό να διακρίνει το ξένο εισβολέα
από τα συστατικά του ιδίου του σώματος. Η ικανότητα αυτή αναπτύσσεται κατά τη
διάρκεια ωρίμανσης του ανοσολογικού συστήματος. Στο θύμο αδένα επιλέγονται
τα Τ-λεμφοκύτταρα που έχουν τη δυνατότητα να αναγνωρίζουν αντιγόνα
συνδεδεμένα με τα MHC μόρια του οργανισμού (στάδιο θετικής επιλογής). Από
αυτά όσα κατέχουν TCR υποδοχείς με υψηλή συγγένεια για τα αντιγόνα του εαυτού
που παρουσιάζονται σε σύμπλεξη με τα MHC μόρια στο θύμο αδένα εξαλείφονται
με απόπτωση (στάδιο αρνητικής επιλογής). Ωστόσο κάποια από τα αντιγόνα του
εαυτού δεν παρουσιάζονται στο θύμο αδένα αλλά αργότερα στην περιφέρεια. Οι
αυτοδραστικοί λεμφοκυτταρικοί κλώνοι στην περίπτωση αυτή αδρανοποιούνται με
ένα μηχανισμό επαγωγής ανεργίας λόγω της έλλειψης των δευτέρων κυτταρικών
σημάτων από τα επαγγελματικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα.
Παρά τους μηχανισμούς που προαναφέραμε, το ανοσολογικό σύστημα μπορεί
να στραφεί εναντία στον ίδιο τον οργανισμό προκαλώντας σοβαρές ασθένειες γνώστες
σαν αυτοάνοσες ασθένειες. Οι αυτοάνοσες ασθένειες μπορεί να αφορούν ένα όργανο
ή ένα σύστημα οργάνων, όπως τη λευκή ουσία του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού
στη πολλαπλή σκλήρυνση (κατά πλάκας σκλήρυνση), τα β-κύτταρα του παγκρέατος στο
νεανικό σακχαρώδη διαβήτη, τη νευρομυϊκή σύναψη στη βαριά μυασθένεια και το
θυρεοειδή αδένα στη νόσο του Graves. Άλλες αυτοάνοσες νόσοι μπορεί να
προσβάλουν ταυτόχρονα πολλά συστήματα οργάνων όπως ο ερυθηματώδης λύκος, το
σκληρόδερμα και το σύνδρομο Sjogren’s (πίνακας 4).
Οι αυτοάνοσες ασθένειες γενικά προσβάλλουν το 5% των ενηλίκων στην Ευρώπη και
τη Βόρεια Αμερική (τα 2/3 των οποίων είναι γυναίκες). Το φάσμα των ασθενειών
αυτών μπορεί να διευρυνθεί σημαντικά αν προστεθούν ασθένειες στις οποίες η
αυτοανοσία συμμετέχει, αλλά με δευτερεύοντα ρόλο στη παθογένεση τους. Τέτοιες
ασθένειες είναι η αλωπεκία, αρτηριοσκλήρυνση και διάφορες νευροεκφυλιστικές
παθήσεις.
Πίνακας 4: Παραδείγματα αυτοάνοσων νοσημάτων και των στόχων τους.
Ασθένεια
Στόχος
Νόσος του Addison
Επινεφρίδια
Αυτοάνοση αιμολυτική αναιμία
Ερυθροκύτταρα
Νόσος του Crohn
Εντερικός σωλήνα;
Σύνδρομο Goodpasture
Πνεύμονες και νεφρά
Νόσος του Graves
Θυρεοειδής αδένας
Θυρεοειδίτιδα Hashimoto
Θυρεοειδής αδένας
Ιδιοπαθής θρομβοπενική πορφύρα
Αιμοπετάλια
Νεανικός ινσουλινοεξαρτώμενος διαβήτης
β-νησιδιοκύτταρα του παγκρέατος
Πολλαπλή σκλήρυνση
Εγκέφαλος και νωτιαίος μυελός
Βαριά μυασθένεια (Gravis)
Νευρομυϊκή σύναψη
Κοινή πέμφιγα (Pemphigus vulgaris)
Επιδερμίδα
Κακοήθης αναιμία
Καλυπτήρια κύτταρα του στομάχου
Μεταστεπτοκοκκική σπειραματονεφρίτιδα
Νεφρικά σπειράματα
Ψωρίαση
Δέρμα
Ρευματοειδής αρθρίτιδα
Συνδετικός ιστός
Σκληρόδερμα
Καρδία, πνεύμονες, εντερικός σωλήνας και νεφρά
Σύνδρομο Sjogren
Σιελογόνοι αδένες, ήπαρ και νεφρά
Αυτοάνοση στειρότητα
Σπερματοζωάρια
Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος
DNA, αιμοπετάλια, νεφρά και άλλα όργανα
Β.ΙΙ.1 Αιτιολογικοί μηχανισμοί
Τα αίτια των αυτοάνοσων ασθενειών σε γενικές γραμμές παραμένουν άγνωστα. Είναι
αμφίβολο το κατά πόσο τα παρατηρούμενα αυτοαντισώματα και αυτοαντιγόνα σε μία
αυτοάνοση νόσο σχετίζονται με τη παθογένεια της πρωτοπαθώς. Ακόμα και αν αυτό
συμβαίνει - όπως πιθανολογείται από πολλούς - παραμένει δύσκολο να ταυτοποιηθεί
ποιο αυτοαντιγόνο ξεκινά την αυτοδραστική ανοσολογική απόκριση λόγω της
ποικιλομορφίας και ετερογένειας της αντιγονικής ειδικότητας αυτοαντισωμάτων σε
πολλές από τις ασθένειες αυτές.
Τα σημερινά δεδομένα παρότι δεν αποσαφηνίζουν επαρκώς τον αιτιολογικό μηχανισμό
της αυτοάνοσης αντίδρασης, δίδουν σημαντικά στοιχεία για τη φύση της. Είναι γνωστό
ότι: (i) Η σύνθεση των αυτοαντισωμάτων οδηγείται από το αυτοαντιγόνο όπως
συμβαίνει σε μία φυσιολογική ανοσολογική απόκριση σε ένα εξωγενές αντιγόνο. Έτσι
τα αυτοαντισώματα είναι IgG τάξεως (109, 110) και έχουν υποστεί σωματικές
μεταλλάξεις για να αυξηθεί η συγγένεια τους προς το αντιγόνο (affinity maturation)
(111, 112). (ii) Αναγνωρίζονται πολλαπλοί επίτοποι σε κάθε πρωτεϊνικό αντιγόνο και
όταν η πρωτεΐνη αυτή αποτελεί τμήμα ενός συμπλόκου , αναγνωρίζονται περισσότερες
από μια πρωτεΐνες του συμπλόκου αυτού (113). (iii) Τα περισσότερα αυτοαντιγόνα
είναι σύμπλοκα πρωτεϊνών-νουκλεϊνικών οξέων και όταν είναι γνωστή η φυσιολογική
τους δράση αυτή έχει βρεθεί να αναστέλλεται με τη δέσμευση του αυτοαντισώματος
(114, 115). Με βάση τα στοιχεία αυτά έχουν προταθεί διάφοροι αιτιολογικοί
μηχανισμοί.
(i)
Απελευθέρωση περιχαρακωμένων ανατομικά αντιγόνων. Τέτοια αντιγόνα δεν είναι
διαθέσιμα στο ανοσολογικό σύστημα για την ανάπτυξη ανοχής και έτσι
απελευθέρωση τους μπορεί να προκαλέσει θεωρητικά αυτοάνοση ανοσολογική
απόκριση.
Σαν
παράδειγμα
αναφέρεται
η
ανάπτυξη
συμπαθητικής
οφθαλμοπάθειας στον υγιή οφθαλμό έπειτα από τραυματισμό του ετέρου οφθαλμού
με απελευθέρωση αντιγόνων του. Παρόμοιοι μηχανισμοί έχουν προταθεί για το
νεανικό διαβήτη (116) και την πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλίτιδα (ΕΑΕ) (117)
(ii)
Παρουσίαση κρυπτοτόπων στο ανοσολογικό σύστημα. Δηλαδή παρουσίαση επιτόπων
που βρίσκονταί σε μη εκτεθειμένες περιοχές της τριτοταγής δομής του φυσικού
αντιγόνου ή και γενικότερα παρουσίαση επιτόπων που φυσιολογικά λόγω είτε μη
κατάλληλης επεξεργασίας του αντιγόνου είτε ύπαρξης ανταγωνισμού στη σύνδεση
πεπτιδίων με τα MHC μόρια δεν παρουσιάζονταν επαρκώς (118).
(iii)
Ενεργοποίηση ανεργικών λεμφοκυττάρων. Όπως ήδη αναφέραμε εξωθυμικά
αυτοαντιγόνα που παρουσιάζονται στη περιφέρεια από μη επαγγελματικά
αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα προκαλούν ανέργεια (anergy) των ειδικών για τα
αντιγόνα αυτά λεμφοκυττάρων λόγω της έλλειψης των δευτέρων κυτταρικών
σημάτων. Σε ορισμένες περιπτώσεις όμως, όπως έπειτα από μόλυνση με κάποιο ιό
είναι δυνατό να υπάρξουν τα κατάλληλα κυτταρικά σήματα από τα επαγγελματικά
πλέον αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και έτσι να ενεργοποιηθούν ορισμένοι από
τους αυτοδραστικούς λεμφοκυτταρικούς πληθυσμούς που προαναφέραμε (119)
(iv)
Η υπόθεση της μοριακής μίμησης. Η ομοιότητα διαμόρφωσης (χωροδιάταξης
δραστικών ομάδων) μεταξύ αυτοαντιγόνων και άσχετων εξωγενών αντιγόνων,
συνήθως βακτηριακής ή ιικής προέλευσης, είναι μια υπόθεση που μπορεί να
εξηγήσει
την
διασταυρούμενης
ανάπτυξη
χυμικής
αυτοαντισωμάτων.
απόκρισης
ενάντια
Κλασσικά
σε
παραδείγματα
εξωγενή
αντιγόνα
και
αυτοαντιγόνα είναι: (i) Μια στρεπτοκοκκική λοίμωξη μπορεί να οδηγήσει στο
σχηματισμό αντισωμάτων ενάντια των Μ-πρωτεϊνών του βακτηριακού τοιχώματος
τα οποία, ανάλογα με το στέλεχος του στρεπτόκοκκου, μπορούν να αντιδράσουν
διασταυρωτά με τη καρδιακή μυοσίνη ή με τη λαμιμίνη και το κολλαγόνο στις
βασικές μεμβράνες των νεφρικών σπειραμάτων προκαλώντας σοβαρές βλάβες
στους αντιστοίχους ιστούς. (ii) Ασθενείς με αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα και
σύνδρομό Reiter συχνά έχουν MHC απλότυπο θετικό για
HLA-B27. Στους
ασθενείς αυτούς επίσης συχνά ανευρίσκονται αυτοαντισώματα για την περιοχή 6984 του HLA-B27 τα οποία επιπρόσθετα αντιδρούν διασταυρωτά με την ομόλογη
περιοχή 188-193 στη νιτρογενάση της κλεμπσιέλας της πνευμονίας (Klebsiella
Pneumoniae). Έτσι η κλεμπσιέλα φαίνεται να συσχετίζεται παθογενετικά με τις
νόσους αυτές (120). Τα τελευταία χρόνια έχουν βρεθεί διαφόρου βαθμού ομολογίες
στην πρωτοταγή δομή μεταξύ αυτοαντιγόνων και μικροβιακών ή ιικών αντιγόνων
(121). Σε αρκετές περιπτώσεις από αυτές έχει πειραματικά αποδειχθεί η
δυνατότητα διασταυρούμενης αντίδρασης αντισωμάτων με τα αντιγόνα αυτά, η
παθογενετική ικανότητα τους όμως δεν έχει ακόμα εξακριβωθεί. Θα πρέπει να
σημειώσουμε ότι οι μολυσματικοί παράγοντες μπορούν να συμμετάσχουν στην
παθογένεση μιας αυτοάνοσης νόσου έκτος από τη μοριακή μίμηση και με τρόπους
που περιλαμβάνουν (α) καταστροφή ιστών και απελευθέρωση αντιγόνων, (β)
αποκάλυψη κρυπτοτόπων (λόγω αυξημένης έκφρασης MHC), (γ) έκτοπη έκφραση
πρωτεϊνικών μορίων και (δ) ευόδωση της παραγωγής κυτταροκινών.
(v)
Αναγνώριση τροποποιημένων αντιγόνων του εαυτού (νεοαυτοαντιγόνων). Πρωτεϊνικά
μόρια του εαυτού μπορούν να τροποποιηθούν είτε μέσω μετάλλαξης γονιδίων είτε
μέσω μεταμεταγραφικών αλλαγών που περιλαμβάνουν γλυκοσυλιώσεις και
φωσφορυλιώσεις, μετατρεπόμενα σε νεοαυτοαντιγόνα στα οποία το ανοσολογικό
σύστημα δεν έχει αποκτήσει ανοχή. Έτσι έχει προταθεί ότι η γλυκοσυλίωση
αντισωμάτων IgG τάξεως στη ρευματοειδή αρθρίτιδα επάγει την παραγωγή
ρευματοειδούς
παράγοντα
(αντί-IgG
Fc
αυτοαντισωμάτων)
(122).
Νεοαυτοαντιγόνα μπορούν να δημιουργηθούν και με τη δέσμευση φαρμάκων ή
άλλων απτινικών μορίων σε πρωτεϊνικά μόρια του εαυτού. Μια τέτοια δυνατότητα
μπορεί
να
εξηγήσει
την
επαγωγή
κλινικών
εκδηλώσεων
Συστηματικού
Ερυθηματώδους Λύκου (ΣΕΛ) από αρκετά φάρμακα. Τέλος πρέπει να αναφέρουμε
ότι νέοαυτοαντιγόνα
αποτελούν και τα αντισώματα που περνούν από μια
διαδικασία σωματικών μεταλλάξεων κατά την ωρίμανση της ανοσολογικής
απόκρισης. Έτσι αναπτύσσονται αντιιδιοτυπικά αυτοαντισώματα τα οποία ωστόσο
δεν φαίνεται να έχουν να έχουν ιδιαίτερη παθογενετική ικανότητα.
(vi)
Λάθη στην ανάπτυξη ανοσολογικής ανοχής. Παράδειγμα τέτοιων
μηχανισμών
αποτελεί η ανάπτυξη συστηματικών αυτοάνοσων εκδηλώσεων σε ποντικούς στους
οποίους έχει αφαιρεθεί ο θύμος αδένας στην αρχή της ζωής τους. Στην περίπτωση
αυτή έχει παρατηρηθεί διαφυγή στην περιφέρεια αυτοδραστικών λεμφοκυτταρικών
κλώνων (123).
(vii)
Πολυκλωνικοί ενεργοποιητές. Έχει θεωρηθεί ότι πολυκλωνικοί ενεργοποιητές Β ή
Τ-λεμφοκυττάρων μπορούν να συμμετέχουν στην αυτοάνοση ανοσολογική
απόκριση ενεργοποιώντας κυρίως ανεργικούς λεμφοκυτταρικούς κλώνους. Τέτοια
μόρια (μικροβιακής κυρίως προέλευσης) έχουν βρεθεί να επάγουν μια αυτοάνοση
ασθένεια. Πειραματικά τέτοιοι Τ-λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί έχουν βρεθεί να
επάγουν την παραγωγή αυτοαντισωμάτων (124) προκαλώντας επιπλέον και
παθολογική συμπτωματολογία σε ορισμένες περιπτώσεις όπως στην πειραματική
αυτοάνοση εγκεφαλίτιδα (125). Ωστόσο η πολυκλωνική ενεργοποίηση προκαλεί την
επαγωγή αυτοαντισωμάτων IgM τάξεως, χαμηλής συγγένειας προς το αντιγόνο που
δεν έχουν υποστεί σωματικές μεταλλάξεις (όπως σε μία αντιγόνο-οδηγούμενη
ανοσολογική απόκριση). Τα χαρακτηριστικά αυτά διαφέρουν από αυτά της
αυτοανοσίας.
(viii) Ανοσορυθμιστικές
λεμφοκυτταρικές
διαταραχές.
υποομάδες
Έχει
υποστηριχθεί
μπορούν
μέσω
ότι
κάποιες
παραγωγής
διακριτές
κυτταροκινών
να
διαταράξουν το όλο πλέγμα ανοσορύθμισης και να προκαλέσουν μια αυτοάνοση
ασθένεια. Πειραματικά τέτοιοι Τ λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί έχουν ανεβρεθεί
στον νεανικό διαβήτη (126), χωρίς ωστόσο να μπορούν να εξηγήσουν ικανοποιητικά
την παθογένεση του.
(ix)
Αποπτώση κυττάρων. Η απόπτωση είναι ένας μηχανισμός προγραμματισμένου
κυτταρικού θανάτου ο οποίος εξυπηρετεί διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες όπως
την εξισορρόπηση της μιτωτικής αύξησης του μεγέθους διάφορων ζωικών ιστών, την
εξάλειψη των αυτοδραστικών Τ-λεμφοκυττάρων στο θύμο αδένα και την
καταστροφή ορισμένων παθολογικών κυττάρων όπως τα μολυσμένα από ιό ιστικά
κύτταρα. Έχει βρεθεί ότι η απόπτωση κύτταρων που προκαλείται από τη δράση ιών
από
τη
δράση
της
υπεριώδους
ριβονουκλεοπρωτεϊνικών
ακτινοβολίας
οδηγεί
αυτοαντιγόνων από τα κύτταρα
σε
απελευθέρωση
(127,
128). Τα
αυτοαντιγόνα αυτά είναι δυνατόν να ενεργοποιήσουν ανεργικούς αυτοδραστικούς
λεμφοκυτταρικούς κλώνους που ήδη προϋπάρχουν (119, 129-131) με επακόλουθη
εμφάνιση αυτοανοσίας.
B.II.2 Γενετικές Συσχετίσεις
Α νεξάρτητα
από τον ακριβή αιτιολογικό μηχανισμό της αυτοανοσίας, οι
γενετικοί παράγοντες αποτελούν σημαντικούς προδιαθεσικούς παράγοντες για τις
αυτοάνοσες ασθένειες. Επειδή όμως η συμφωνία εμφάνισης αυτοάνοσων ασθενειών σε
μονοζυγωτικά δίδυμα κυμαίνεται από 25-70% ανάλογα με τη νόσο, θα πρέπει
περιβαλλοντολογικοί ή και άλλοι παράγοντες να συμμετέχουν στη παθογένεση της
νόσου. Οι κυριότερες γενετικές συσχετίσεις έχουν γίνει για:
(i)
Γονίδια των μορίων του μεγίστου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας. Η αυτοάνοση
απόκριση σαν θυμοεξαρτώμενη ανοσολογική απόκριση, εξαρτάται από τον MHC
απλότυπο του κάθε ανθρώπου. Τα MHC μόρια καθορίζουν το ρεπερτόριο των
πεπτιδίων που μπορούν να παρουσιαστούν αποτελεσματικά στους TCR υποδοχείς,
επηρεάζοντας έτσι τον ανοσολογικό μηχανισμό. Πολλές μελέτες έχουν συσχετίσει
αυτοάνοσες ασθένειες με ορισμένους HLA απλοτύπους, όπως για παράδειγμα την
Ρευματοειδή Αρθρίτιδα με τους HLA τάξεως II DR1 και DR4 και τον ΣΕΛ με τους
DR3, DRw53 απλοτύπους (βλέπε κεφάλαιο Δ.ΙΙΙ.1.3.4) (Πίνακας 5).
Πίνακας 5: Συσχετίσεις αυτοάνοσων ασθενειών με HLA απλοτύπους
Αυτοάνοση ασθένεια
HLA απλότυπος
Επικινδυνότητα
(&/%)
Αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα
B27
87,4
0,3
Σύνδρομο Goodpasture
DR2
10
1
Πολλαπλή σκλήρυνση
DR2
15,9
10
Νόσος του Graves
DR3
4,8
4-5
Βαριά μυασθένεια (Gravis)
DR3
3,7
1
DR3, DRw53
2,5
10-20
DR3, DR4
5,8
1
Ρευματοειδής αρθρίτιδα
DR4
3,2
3
Κοινή πέμφιγα
DR4
14,4
1
Θυρεοειδίτιδα Hashimoto
DR5
3,2
4-5
Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος
Νεανικός διαβήτης
Ειδικά για τους Έλληνες ασθενείς έχουν παρατηρηθεί ιδιαιτερότητες όσον αφορά
τις συσχετίσεις με απλοτύπους HLA. Έτσι ο ΣΕΛ στην Ελλάδα δεν συσχετίζεται με
τον απλότυπο HLA-DR3, ενώ το πρωτοπαθές ΣΣ συσχετίζεται με τον απλότυπο
HLA-DR5 και όχι με τον HLA-DR3 (132-135). Στα ποντίκια NZB εισαγωγή της
bm12 μετάλλαξης, που αφορά τα αμινοξέα 67, 70 και 71 της I-Aβ αλυσίδας, οδηγεί
σε σοβαρή αυτοάνοση απόκριση με εμφάνιση αντισωμάτων κατά DNA (136). Έτσι
τα αμινοξέα αυτά έχουν θεωρηθεί ότι είναι σημαντικά για την εμφάνιση
αυτοάνοσης ασθένειας.
(ii)
Γονίδια που επηρεάζουν τον μηχανισμό απόπτωσης. Κατά την διαδικασία του
προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωσης) εμπλέκονται μια σειρά από
γονίδια (bax, ICE, c-myc, Fas, p53, bcl2). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι
αυτοσωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια του Fas (CD95) ή του συνδέτη του (FasL)
στα lpr, lpr19 και gld ποντίκια, οδήγησαν σε παθολογική συμπτωματολογία
ανάλογη με αυτή του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου (137-141). Όπως έχουμε
ήδη αναφέρει η Fas πρωτεΐνη ενεργοποιεί τον μηχανισμό απόπτωσης σε ένα
κύτταρο (π.χ. Τ-λεμφοκύτταρο), όταν αυτή συνδεθεί με τον FasL συνδέτη ενός
άλλου κυττάρου (π.χ. θυμοκύτταρο). Δυσλειτουργία του Fas/FasL συστήματος
μπορεί να οδηγήσει σε μη αποτελεσματική καταστροφή των αυτοδραστικών
λεμφοκυτταρικών κλώνων κατά την ωρίμανση τους στο θύμο αδένα, με αποτέλεσμα
τη διαφυγή τους στη περιφέρεια και την εμφάνιση αυτοανοσίας. Θα πρέπει να
σημειωθεί όμως ότι τα ελαττώματα στα Fas/FasL γονίδια δεν μπορούν να
εξηγήσουν από μόνα τους την εμφάνιση ΣΕΛ, αφού ο ΣΕΛ εμφανίζεται και σε
άτομα με φυσιολογικά Fas/FasL γονίδια. Έτσι θα πρέπει να αποτελούν γενετικούς
συμπαράγοντες ή επιταχυντικούς παράγοντες στην εμφάνιση αυτοανοσίας.
(iii) Άλλα
γονίδια. Διάφορα άλλα γονίδια έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση
αυτοάνοσων νόσων. Τα γονίδια αυτά ωστόσο δεν φαίνονται από μόνα τους να
ευθύνονται για τις ασθένειες αυτές. Και γι’ αυτό αναφέρονται ως γενετικοί
προδιαθεσικοί παράγοντες για την εμφάνιση αυτοανοσίας. Τέτοια γονίδια είναι:
(α) Γονίδια ανοσοσφαιρινών (142)
(β) Γονίδια του υποδοχέα Τ-λεμφοκυττάρων (143, 144)
(γ) Γονίδια κυτταροκινών (145-147)
(δ) Φυλετικά γονίδια (145, 148)
Γ΄
ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΗ
ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗ
Γ.I ΑΝΤΙΓΟΝΑ ΚΑΙ Η ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥΣ ΜΕ
ΤΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ
Σαν αντιγόνο μπορεί να οριστεί μια ουσία που δεσμεύεται ειδικά από ένα μόριο
αντισώματος. Η ουσία αυτή μπορεί να είναι σχεδόν κάθε είδος βιομορίου, όπως
πρωτεΐνη, νουκλεϊκό οξύ, φωσφολιπίδιο, ορμόνη και λιπίδιο.
Σε μοριακό επίπεδο η αλληλεπίδραση αντιγόνου αντισώματος συνίσταται στην υψηλής
συγγένειας μη ομοιπολική δέσμευση ενός τμήματος του αντιγόνου που καλείται
επίτοπος ή αντιγονικός καθοριστής στην περιοχή δέσμευσης αντιγόνου ή παράτοπο του
αντισώματος.
Ο παράτοπος σχηματίζεται από τις υπερμεταβλητές περιοχές της ελαφριάς και
βαριάς αλυσίδας, οι οποίες καλούνται και συμπληρωματικές καθορίζουσες την
αντιγονικότητα περιοχές (Complementarity Determining Regions: CDRs) και είναι 3
Σχήμα 27. Τα αμινοξέα των υπερμεταβλητών περιοχών της ελαφριάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης έρχονται
κοντά στο χώρο και σχηματίζουν το ήμισυ της περιοχής δέσμευσης αντιγόνου.
για την κάθε αλυσίδα. Στη τριτοταγή δομή του αντισώματος οι περιοχές αυτές
Σχήμα 28. Οι μεταβλητές περιοχές της βαριάς και
ελαφριάς αλυσίδας (ανοιχτό
γκρι)
σχηματίζουν κοιλότητα που υποδέχεται
το αντιγόνο (σκούρο γκρί).
φέρνονται κοντά στο χώρο (Σχήμα 27), και σχηματίζουν μια κοιλότητα ανάμεσα στη
βαριά και στη ελαφριά αλυσίδα η οποία υποδέχεται το αντιγόνο (Σχήμα 28).
To αντιγόνο συγκρατείται στη κοιλότητα αυτή μέσω ετεροπολικών δεσμών,
δεσμών υδρογόνου, δυνάμεων Van der Waals και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων με τις
παράπλευρες αλυσίδες των αμινοξέων και τον σκελετό των CDRs (Σχήμα 29).
Ο επίτοπος στις πρωτεΐνες όταν σχηματίζεται από συνεχόμενα στη σειρά
αμινοξέα λέγεται γραμμικός. Το μήκος ενός τέτοιου επιτόπου είναι συνήθως γύρω στα
Σχήμα 29. Το αντιγόνο συγκρατείται στη κοιλότητα μέσω
αλληλεπιδράσεων με τα αμινοξέα των CDR
περιοχών του αντισώματος.
6 αμινοξέα. Κάποιες φορές ένας γραμμικός επίτοπος γίνεται διαθέσιμος στα
αντισώματα μόνο όταν η πρωτεΐνη μετουσιωθεί (ξεδιπλωθεί), ενώ άλλες φορές είναι
διαθέσιμος και στη φυσική πρωτεΐνη (Σχήμα 30Β).
Όταν ένας επίτοπος σχηματίζεται από αμινοξέα τα οποία στη πρωτοταγή δομή της
πρωτεΐνης είναι απομακρυσμένα μεταξύ τους και φέρνονται κοντά στο χώρο όταν η
πρωτεΐνη παίρνει την τριτοταγή της δομή, τότε ο επίτοπος αυτός καλείται
Σχήμα 30. Τύποι επιτόπων σε πρωτεΐνες.
διαμορφωτικός η μη γραμμικός επίτοπος. Οι επίτοποι αυτοί αποτελούν το 90% των
επιτόπων (149) και συνήθως καταστρέφονται όταν η πρωτεΐνη μετουσιωθεί
(ξεδιπλωθεί) (Σχήμα 30Α).
Οι
πρωτεΐνες
επίσης
είναι
δυνατόν
να
υποστούν
μέτα-μεταγραφικές
τροποποιήσεις που περιλαμβάνουν από φωσφορυλιώσεις και γλυκοζυλιώσεις έως
τεμαχισμό και χημικές τροποποιήσεις των αμινοξέων τους από δράση ενζύμων και
ελεύθερων ριζών (150). Οι τροποποιήσεις αυτές δίνουν γένεση σε νέους αντιγονικούς
επιτόπους οι οποίοι καλούνται νεοαντιγονικοί επίτοποι (Σχήμα 30Γ).
Στο σημείο αυτό πρέπει να σημειώσουμε ότι η ταξινόμηση αυτή των επιτόπων δεν είναι
απόλυτη. Έτσι αντισώματα κατά μη γραμμικών (διαμορφωτικών) επιτόπων συχνά
αντιδρούν (με χαμηλότερη όμως συγγένεια)
και με τα επιμέρους τμήματα των
επιτόπων αυτών, τα οποία αποτελούν ουσιαστικά γραμμικούς επιτόπους (151). Από την
άλλη πλευρά συχνά σε ένα γραμμικό επίτοπο κάποια αμινοξέα του μπορούν να
αντικατασταθούν από κάθε άλλο αμινοξύ, χωρίς το γεγονός αυτό να επιδρά στη
συγγένεια της δέσμευσης. Τα αμινοξέα αυτά δεν αλληλεπιδρούν με το αντίσωμα και
έτσι ο επίτοπος είναι στην πραγματικότητα μη γραμμικός (152).
Αν μελετήσουμε την αλληλεπίδραση αντισώματος - αντιγόνου σε μοριακό
Σχήμα 31.
Επαγωγική προσαρμογή της επιφάνειας του αντιγόνου myohemerythrin κατά τη συνδεσή
του με το αντίσωμα: (Α) διασπάται η ιονική αλληλεπίδραση μεταξύ των παραπλεύρων
αλυσίδων των αμινοξέων Glu6 και Lys100 στην επιφάνεια του αντιγόνου και (Β) η Tyr8 που
ήταν προσανατολισμένη προς το εσωτερικό του μορίου στρέφεται προς την επιφάνεια για
να αλληλεπιδράσει με το αντίσωμα (155).
επίπεδο μπορούμε να διαπιστώσουμε ότι αυτό που τελικά
αντισώματα
είναι
μια
συγκεκριμένη
χωροδιάταξη
αναγνωρίζεται από τα
χημικών
ομάδων
και
ηλεκτροστατικών φορτίων στο αντιγόνο (153). Η χωροδιάταξη αυτή μάλιστα μπορεί να
μην προϋπάρχει στο αντιγόνο αλλά να σχηματίζεται τη στιγμή της σύνδεσης του με το
αντίσωμα μέσω ενός μηχανισμού επαγωγικής προσαρμογής (induced fit) (Σχήμα 31).
Σύμφωνα με τον μηχανισμό αυτό τμήμα της ολικής ενέργειας που κερδίζει το
Σχήμα 51. Επαγωγική προσαρμογή της επιφάνειας του αντισώματος, ώστε να ταιριάξει
καλύτερα με το αντιγόνο (πεπτίδιο της hemagglutinin του ιού της γρίπης). Α: Η
επιφάνεια του ελευθέρου αντισώματος. Β: Η επιφάνεια του αντισώματος σε
σύμπλεξη με το αντιγόνο. Το αντιγόνο και στις δύο περιπτώσεις παρουσιάζεται
στη διαμόρφωση δέσμευσης (156).
σύστημα αντιγόνου - αντισώματος από την μεταξύ τους αλληλεπίδραση δαπανάται
σε επαναδιευθετήσεις των παράπλευρων αλυσίδων των αμινοξέων τόσο στο
αντιγόνο όσο και στο αντίσωμα (154-156). Οι επαναδιευθετήσεις αυτές σαν σκοπό
έχουν το καλύτερο ταίριασμα μεταξύ αντιγόνου και αντισώματος (Σχήμα 32).
Μια άλλη παράμετρος της αλληλεπίδρασης αντιγόνου αντισώματος είναι η
συγγένεια δέσμευσης (affinity). Κατά τη δέσμευση του αντιγόνου στο αντίσωμα
εγκαθίσταται μια δυναμική ισορροπία μεταξύ του συμπλόκου αντιγόνου – αντισώματος
και των ελεύθερων μορφών του αντιγόνου και του αντισώματος. Όσο μεγαλύτερη είναι
η συγγένεια δέσμευσης, τόσο περισσότερο η ισορροπία αυτή θα είναι μετατοπισμένη
προς τη μεριά του συμπλόκου και τόσο μικρότερη θα είναι η σταθερά διάστασης του
(kd). Η σταθερά διάστασης συνήθως ποικίλει από 10-7 έως 10-11 Μ και υποδεικνύει
ισχυρή δέσμευση του αντιγόνου από το αντίσωμα. Όταν η σύνδεση αυτή είναι πιο
ασθενής και επιπλέον το αντίσωμα είναι ικανό να σταθεροποιήσει μια μεταβατική
κατάσταση μιας αντίδρασης, τότε το αντίσωμα μπορεί να δρα σαν ένζυμο. Τέτοια
καταλυτικά αντισώματα έχουν πρόσφατα ταυτοποιηθεί (157-159) και εμφανίζονται και
στον ορό αίματος ασθενών με ΣΕΛ (160-162).
Σε περιπτώσεις όπου υπάρχουν πολλαπλά αντίγραφα ενός επιτόπου όπως σε
ένα πολυμερές μακρομόριο, στην επιφάνεια ενός κυττάρου ή σε μια στερεή
επιφάνεια (π.χ. στήλη ανοσοσυγγένειας) δίνεται η δυνατότητα στο αντίσωμα να
αλληλεπιδράσει ταυτόχρονα με περισσότερες από μια περιοχές δέσμευσης με
το αντιγόνο. Έτσι μια ανοσοσφαιρίνη τάξεως IgG μπορεί να αλληλεπιδράσει
ταυτόχρονα με τα 2 Fab τμήματα της, μια διμερής IgA με τα 4 Fab τμήματα της,
ενώ μια πενταμερής IgM μπορεί να διαθέσει έως και 10 τμήματα Fab για την
δέσμευση του αντιγόνου. Η ολική συγγένεια του αντισώματος προς το αντιγόνο
που καλείται ισχύς σύνδεσης αντισώματος αντιγόνου (avidity) αυξάνει κατά
πολύ σε σχέση με αυτή μιας μεμονωμένης περιοχής σύνδεσης αντιγόνου με ένα
αντιγονικό καθοριστή (που εκφράζεται με την συγγένεια δέσμευσης (affinity)).
Με τον τρόπο αυτό είναι δυνατό σε τεχνικές στερεάς φάσης (όπως ELISA ή
ανοσοαποτύπωση), λόγω της τοπικής υψηλής πυκνότητας επιτόπων, να ευνοηθεί
η πολυσθενής δέσμευση των αντισωμάτων και να ισχυροποιηθούν έτσι μη
ειδικές – ασθενείς αλληλεπιδράσεις αντιγόνου – αντισώματος, οδηγώντας σε
ψευδή αποτελέσματα (163-165)
Γ.II ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΗΣ ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗΣ
Γ.II.1 Γενικά
Για
την
αντιγονική
προσδιορισμό
των
χαρτογράφηση
Β-λεμφοκυτταρικών
πρωτεϊνικών
επιτόπων
αντιγόνων
έχουν
και
εφαρμοστεί
τον
τα
τελευταία χρόνια διάφορες μέθοδοι και τεχνικές. Όταν αυτές εφαρμόζονται για
την αντιγονική χαρτογράφηση του ίδιου αντιγόνου, δεν υπάρχει πάντα
συμφωνία μεταξύ τους για τον ακριβή εντοπισμό των επιτόπων (166). Το
γεγονός αυτό οφείλεται στις ιδιαιτερότητες της κάθε μεθόδου τις οποίες και θα
εξετάσουμε.
Γ.II.2
Αντιγονική χαρτογράφηση με αλγόριθμους
πρόβλεψης αντιγονικότητας
Διάφοροι αλγόριθμοι έχουν προταθεί για την πρόβλεψη της θέσεως
των
επιτόπων με βάση την πρωτοταγή δομή της πρωτεΐνης (167-174). Με τους
αλγορίθμους αυτούς επιχειρείται να δοθεί μονοδιάστατη λύση (πρόβλεψη με
βάση την αλληλουχία) σε ένα πρόβλημα που είναι τετραδιάστατο, αφού αυτό
που τελικά ζητείται είναι εάν υπάρχει η δυνατότητα από ένα αντιγόνο (που
βρίσκεται σε ισορροπία διαμορφώσεων σε κάποιο διάλυμα) να φέρει τη
χρονική στιγμή της συνάντησης του με το αντίσωμα τις δραστικές ομάδες μιας
περιοχής (ή περιοχών) του σε συγκεκριμένη χωροδιάταξη και γεωμετρία η
οποία να αναγνωρίζεται από το αντίσωμα (βλέπε κεφάλαιο Γ.I). Με τη
θεώρηση αυτή φαίνεται παράδοξο πως μπορεί κάποιος με μόνο δεδομένο την
πρωτοταγή δομή μιας πρωτεΐνης να προσδιορίσει την θέση των επιτόπων της.
Επειδή όμως τόσο η διαμόρφωση ενός πρωτεϊνικού τμήματος όσο και η
ευκαμπτότητα και η ευκινησία του εξαρτάται σε κάποιο βαθμό από την
αλληλουχία αμινοξέων του, είναι δυνατό να γίνει κάποια πρόβλεψη για
την αντιγονικότητα του. Οι αλγόριθμοί που κυρίως χρησιμοποιούνται
σήμερα είναι τρεις.
(i) Αλγόριθμος υδροφιλικότητας [των Hopp και Woods (167)]
Στον αλγόριθμό αυτό γίνονται οι εξής παραδοχές:
(α) ο επίτοπος είναι γραμμικός και περιλαμβάνει 5-8 αμινοξέα
(β) οι επίτοποι βρίσκονται στην επιφάνεια της πρωτεΐνης
(γ) τα πιο υδρόφιλα τμήματα της πρωτεΐνης βρίσκονται στην επιφάνεια της
Με βάση τις παραδοχές αυτές υπολογίζεται η κλίμακα υδροφιλικότητας η οποία
δίνει το βαθμό έκθεσης των αμινοξέων στην επιφάνεια του μορίου και συνεπώς
τη δυνατότητα τους να αλληλεπιδράσουν με το αντίσωμα.
(ii) Αλγόριθμος ευκαμπτότητας [των Karplus και Schulz (168)]
Ο αλγόριθμός αυτός χρησιμοποιεί τους συντελεστές θερμοκρασίας (B-values)
από κρυσταλλογραφικά δεδομένα για να προβλέψει τον βαθμό ευκινησίας των
C α ατόμων
των αμινοξέων και την
ευκαμπτότητα ενός συγκεκριμένου
πρωτεϊνικού τμήματος. Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι τα εύκαμπτα
τμήματα μιας πρωτεΐνης είναι πιο αντιγονικά, αφού μπορούν εύκολα να
τροποποιήσουν την χωροδιάταξη των δραστικών τους ομάδων ώστε να
ταιριάξουν καλύτερα με το αντίσωμα (174-176).
(iii) Αλγόριθμος αντιγονικότητας [των Welling και συν (169)]
Εξέταση των μέχρι σήμερα γνωστών επιτόπων έδειξε ότι αυτοί εμπεριέχουν
ορισμένα αμινοξέα σε πολύ μεγαλύτερη αναλογία από αυτή που γενικά
παρατηρείται στις πρωτεΐνες
(169). Έτσι ένα τμήμα μίας πρωτεΐνης που
κατέχει σε μεγάλο ποσοστό τα αντιγονικά αυτά αμινοξέα είναι πιο πιθανό να
είναι επίτοπος. Ο αλγόριθμος
αμινοξέος
υπολογίζει την αντιγονικότητα του κάθε
και με βάση αυτή προσδιορίζει τη μέση αντιγονικότητα ενός
πρωτεϊνικού τμήματος.
Οι αλγόριθμοι που περιγράψαμε έχουν το πλεονέκτημα της εύκολης χρήσης, σε
αντίθεση με τις υπόλοιπες μεθόδους αντιγονικής χαρτογράφησης που είναι επίπονες,
χρονοβόρες και δαπανηρές. Τα αποτελέσματα όμως που λαμβάνονται είναι ασαφή και
ο επίτοπος δεν προσδιορίζεται επακριβώς και με βεβαιότητα (Σχήμα 52). Για το λόγο
αυτό η χρήση των αλγορίθμων σήμερα περιορίζεται στην επιλογή αντιγονικών
περιοχών μιας πρωτεΐνης οι οποίες χαρτογραφούνται στη συνέχεια λεπτομερώς με
κάποια άλλη μέθοδο
Δ.II.3 Αντιγονική χαρτογράφηση με ενζυματική πέψη
Η τεχνική αυτή περιλαμβάνει:
(α) την απομόνωση και τον καθαρισμό του αντιγόνου
(β) την ενζυματική πέψη του πρωτεϊνικού αντιγόνου (π.χ. με σταφυλοκοκκική πρωτεάση
V8)
(γ) τον διαχωρισμό των τμημάτων της πρωτεΐνης που προέκυψαν με ηλεκτροφόρηση γέλης
αγαρόζης
Σχήμα 33.
Οι
αλγόριθμοι
ευκαμπτότητας,
υδροφιλικότητας
και
αντιγονικότητας δίνουν ασαφή αποτελέσματα για την εντόπιση
των επιτόπων στο Ro/SSA 60KD αυτοαντιγόνο σε σχέση με την
αντιγονική χαρτογράφηση με συνθετικά πεπτίδια (γραμμές S1S5: οροί ασθενών με ΣΕΛ, S6-S9: οροί ασθενών με ΣΣ)
(δ) τον εντοπισμό του αντιγονικού πολυπεπτιδίου με ανοσοαποτύπωση
(ε) τον προσδιορισμό της αλληλοδιαδοχής αμινοξέων του αντιγονικού πολυπεπτιδίου ή
τμήματος του ώστε να γίνει δυνατός ο εντοπισμός της θέσης του στην αλληλουχία
αμινοξέων της πρωτεΐνης
Η
μέθοδος αυτή
είναι επίπονη
και δεν προσφέρει λεπτομερή
αντιγονική
χαρτογράφηση αφού τα αντιγονικά πολυπεπτίδια που τελικά προσδιορίζονται είναι
συνήθως μεγάλου μεγέθους (15-35 KD).
Η τεχνική αυτή έχει εφαρμοστεί για την εύρεση αντιγονικών τμημάτων στα
αυτοαντιγόνα Ro 60KD (177), La (178) και καλρετικουλίνη (179).
Γ.II.4 Αντιγονική χαρτογράφηση με ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες
Τα περισσότερα αυτοαντιγόνα έχουν παρασκευαστεί σαν πρωτεΐνες σύντηξης με
βήτα-γαλακτοσιδάση δηλαδή σαν χιμαιρικά μόρια μιας πρωτεΐνης που κωδικοποιείται
από τον φορέα
(βήτα-γαλακτοσιδάση) και μιας αντιγονικής πρωτεΐνης που
κωδικοποιείται από το cDNA του αυτοαντιγόνου (Σχήμα 34). Για να προσδιοριστούν
τα αντιγονικά τμήματα χρησιμοποιούνται οι φυσικά απαντώμενες θέσεις περιορισμού
(restriction sites) στο cDNA έτσι ώστε με τη βοήθεια περιοριστικών ενζύμων να
παραχθούν αλληλεπικαλυπτόμενα τμήματα cDNA. Οι αντίστοιχες ανασυνδιασμένες
πρωτεΐνες που προκύπτουν εξετάζονται στη συνέχεια για την αντιγονικότητα τους. Για
λεπτομερέστερη χαρτογράφηση μπορεί να χρησιμοποιηθεί περαιτέρω πέψη των
τμημάτων του cDNA με εξωνουκλεάση. Η μέθοδος αυτή παρουσιάζει κάποια
μειονεκτήματα.
(i) Οι θέσεις περιορισμού μπορεί να είναι πολύ λίγες ή ανομοιόμορφα κατανεμημένες
κατά μήκος του cDNA. Επίσης υπάρχει η ανάγκη να εκφραστούν τμήματα του
cDNA με
διαφορετικά
πλαίσια
ανάγνωσης.
Για την
αντιμετώπιση
των
προβλημάτων αυτών πολλοί χρησιμοποιούν την τεχνολογία PCR (Polymerase
Chain Reaction) για την δημιουργία τμημάτων cDNA στο ίδιο πλαίσιο ανάγνωσης
με προκαθορισμένη επικάλυψη.
(ii)
Το πρωτεϊνικό τμήμα που κωδικοποιείται από τον φορέα (π.χ. βήταγαλακτοσιδάση) μπορεί να επηρεάσει την αντιγονικότητα της πρωτεΐνης
σύντηξης. Επιπλέον το τμήμα αυτό μπορεί να δράσει και το ίδιο σαν αντιγόνο
Σχήμα 34. Πορεία παρασκευής ανασυνδυασμένου πρωτεϊνικού αυτοαντιγόνου.
δημιουργώντας προβλήματα στις μεθόδους εξέτασης της αντιγονικότητας (396).
(iii) Λόγω του υψηλού μοριακού βάρους της πρωτεΐνης σύντηξης παρουσιάζονται
συχνά προβλήματα διαλυτότητας που την κάνουν ακατάλληλη για τεχνικές που
απαιτούν διαλυτά αντιγόνα όπως η ELISA.
(iv) Όλα τα τμήματα του cDNA δεν εκφράζονται επαρκώς και στον ίδιο βαθμό σαν
ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, γεγονός που δημιουργεί προβλήματα στην
αντιγονική χαρτογράφηση (181).
(v)
Με τη μέθοδο των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών συνήθως προσδιορίζονται
μεγάλα αντιγονικά τμήματα χωρίς να εντοπίζεται επακριβώς ο επίτοπος μέσα σε αυτά. Έτσι
η αντιγονική χαρτογράφηση ναι μεν στερείται λεπτομέρειας, αλλά επιπρόσθετα δίνεται η
δυνατότητα ανίχνευσης τόσο των γραμμικών επιτόπων όσο
και πολλών από τους επιτόπους
διαμόρφωσης.
Γ.II.5 Αντιγονική χαρτογράφηση με συνθετικά πεπτίδια
Τα
συνθετικά πεπτίδια σαν εργαλεία για την αντιγονική χαρτογράφηση διαθέτουν σημαντικά
πλεονεκτήματα έναντι των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών.
(i) Με τα συνθετικά πεπτίδια είναι δυνατόν να εντοπισθεί με ακρίβεια ο αντιγονικός
επίτοπος, να προσδιοριστεί το ελάχιστο αντιγονικό μήκος του και να εκτιμηθεί η
συνεισφορά του κάθε αμινοξέος στη αλληλεπίδραση με το αντίσωμα (Σχήμα 35)
(73).
(ii)
Η πεπτιδική σύνθεση είναι μια χημική διαδικασία η οποία μπορεί να ελεγχθεί
καλύτερα από την in vivo παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών.
(iii) Τα συνθετικά πεπτίδια είναι σταθερά μόρια και μπορούν να τροποποιηθούν
Σχήμα 35. Η αντιγονική
χαρτογράφηση του Ro/SSA 60kD αυτοαντιγόνου με
ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες (182) υπέδειξε ως αντιγονικά τα τμήματα
2:(139-326) και 4:(410-538) (Α). Η αντιγονική χαρτογράφηση με συνθετικά
πεπτίδια (183, βλέπε κεφάλαιο Ε.III) αποκάλυψε την ακριβή εντόπιση των
επιτόπων (Β) (τα βέλη δείχνουν τα δραστικά πεπτίδια).
χημικά ώστε να είναι κατάλληλα για διάφορες χρήσεις. Έτσι μπορούν να
βιοτινυλιωθούν, να κυκλοποιηθούν και να συνδεθούν ομοιοπολικά -με
ελεγχόμενο και προκαθορισμένο τρόπο- σε δένδρο πολυλυσίνης, σε ράβδους
πολυαιθυλενίου, σε μικροπλακίδια ELISA και σε στήλη σεφαρόζης.
Η χρήση συνθετικών πεπτιδίων για αντιγονική χαρτογράφηση παρουσιάζει όμως
και κάποια μειονεκτήματα.
(i)
Οικονομικοί κυρίως αλλά και τεχνικοί λόγοι κάποιες φορές περιορίζουν την
χρήση των συνθετικών πεπτιδίων στη χαρτογράφηση μόνο ενός επιμέρους
τμήματος της αντιγονικής πρωτεΐνης το οποίο
προσδιορίζεται
είτε
με
ανασυνδυασμένα πολυπεπτίδια είτε με αλγορίθμους αντιγονικότητας είτε με
ενζυματική πέψη του αντιγόνου.
(ii)
Τα πεπτίδια που συντίθονται με τεχνικές πολλαπλής πεπτιδικής σύνθεσης (π.χ. με
pepscan) είναι μικρού σχετικά μήκους (8-20 αμινοξέα). Λόγω του μεγέθους τους
τα πεπτίδια αυτά δεν προσφέρονται για την ανίχνευση επιτόπων διαμόρφωσης.
Μια προσέγγιση των επιτόπων διαμόρφωσής μπορεί βέβαια να γίνει με τη χρήση
μιμοτόπων (398), αλλά η τεχνική αυτή δεν μπορεί να εφαρμοστεί για
προσδιορισμό επιτόπων πολυκλωνικών - πολυειδικών αντισωμάτων όπως αυτά
που απαντώνται στις αυτοάνοσες παθήσεις.
(iii) Μικρά συνθετικά πεπτίδια μήκους 6-10 αμινοξέων, λόγω της διαμορφωτικής τους
ελευθερίας είναι πιθανό να αναγνωρίζονται μη ειδικά (με χαμηλή συγγένεια
δέσμευσης) από διάφορα αντισώματα (βλέπε κεφάλαιο Γ.I)(184). Η μη ειδική
αυτή αναγνώριση οδηγεί σε υψηλό θόρυβο (background) στις τεχνικές ανίχνευσης
των αντισωμάτων (ELISA) και η διάκριση της ειδικής αντίδρασης καθίσταται
δύσκολη. Το πρόβλημα αυτό λύνεται, τις πιο πολλές φορές με σύνθεση
μεγαλύτερων πεπτιδίων (20-30 αμινοξέων) ή με χρήση δραστικότερων συνθηκών
στην ELISA (όταν βέβαια τα πεπτίδια βρίσκονται σε ομοιοπολική σύνδεση με τη
στερεή επιφάνεια και δεν υπάρχει κίνδυνος αποκόλλησης τους από αυτή).
Η αντιγονική χαρτογράφηση απαιτεί τη σύνθεση μεγάλου αριθμού συνθετικών
πεπτιδίων και γι αυτό χρησιμοποιούνται οι τεχνικές πολλαπλής πεπτιδικής
σύνθεσης (MPS, βλέπε κεφάλαιο Α.IV) και κυρίως η σύνθεση σε ράβδους
πολυαιθυλενίου του Mario Geysen [pepscan (73)].
Για την επιλογή των αλληλουχιών των πεπτιδίων που τελικά θα συντεθούν
ακολουθούνται διάφορες στρατηγικές ανάλογα με το αν ο σκοπός είναι ο
εντοπισμός των επιτόπων, ο περιορισμός του μήκους τους ή η μελέτη των
χαρακτηριστικών τους.
Γ.II.5.1 Εντοπισμός των επιτόπων
Ο εντοπισμός γραμμικών επιτόπων ενός αντιγόνου πραγματοποιείται συνθέτοντας
και εξετάζοντας μια πλήρη σειρά όλων των δυνατών
αλληλοεπικαλυπτόμενών
πεπτιδίων δεδομένου μήκους, που κατέχουν αλληλουχία ομόλογη με το αντιγόνο
που μας ενδιαφέρει (Σχήμα 36). Τόσο το μήκος των συνθετικών πεπτιδίων όσο και
η αλληλεπικάλυψη τους πρέπει να είναι ίσα ή μεγαλύτερα από το μήκος του
Σχήμα 36. Αντιγονική χαρτογράφηση του Ro/SSA 60kD με
αλληλοεπικαλυπτόμενα συνθετικά πεπτίδια (183, βλέπε
κεφάλαιο Ε.III). Οι θέσεις των πεπτιδίων φαίνονται στο
επάνω τμήμα ενώ η δραστικότητα τους με ορό αίματος
ασθενούς με ΣΣ φαίνεται στο κάτω τμήμα.
μεγαλύτερου γραμμικού επιτόπου που θέλουμε να προσδιορίσουμε.
Το μέγεθος των αυστηρά γραμμικών επιτόπων είναι 5-8 αμινοξέα (185, 186) ενώ
στα αυτοαντιγόνα έχουν βρεθεί και επίτοποι 17-18 αμινοξέων (183, 187) (μερικώς
γραμμικοί – μερικώς διαμορφωτικοί επίτοποι). Έτσι αν χρησιμοποιηθούν
οκταπεπτίδια
με
επικάλυψη
επτά
αμινοξέων,
μπορούν
θεωρητικά
να
προσδιοριστούν όλοι οι αυστηρά γραμμικοί επίτοποι, ενώ για μερικώς γραμμικούς
επιτόπους απαιτούνται συνθετικά πεπτίδια μεγέθους περίπου 18 αμινοξέων.
Ο αριθμός των πεπτιδίων που πρέπει να συντεθούν υπολογίζεται με βάση τον τύπο:
⎛ μήκος πρωτεϊνης - μήκος πεπτιδίου
⎞
Αριθμός πεπτιδίων = INT ⎜⎜
+ 1 ⎟⎟
⎝ μήκος πεπτιδίου - αλληλεπικάλυψη ⎠
Γ.II.5.2 Περιορισμός του μήκους των επιτόπων
Για τον περιορισμό του μήκους των επιτόπων μπορούν να χρησιμοποιηθούν δύο
τεχνικές
(i)
των Geysen και συν (73): Το πλήρες μήκος της αντιγονικής περιοχής καλύπτεται
με τη σύνθεση σειρών από ομόλογα αλληλοεπικαλυπτόμενα πεπτίδια συνεχώς
μικρότερου μήκους. Οι σειρές των πεπτιδίων εξετάζονται ακολούθως για την
δραστικότητα τους. Διαπιστώνεται το μήκος των πεπτιδίων κάτω από το οποίο
χάνεται η ικανότητα για τη δέσμευση του αντισώματος. Το μήκος αυτό αποτελεί
το μήκος του περιορισμένου επιτόπου και η ανάλυση της δραστικότητας της
Σχήμα 37. Περιορισμός μήκους επιτόπου
με τη τεχνική του Geysen. Ο
περιορισμένος επίτοπος είναι
το πενταπεπτίδιο DFGAD (73).
σειράς πεπτιδίων αυτού του μήκους αποκαλύπτει την αλληλουχία του (Σχήμα 37).
Ο αριθμός των πεπτιδίων που απαιτούνται να συντεθούν με τη μέθοδο αυτή
⎞
⎛ (ν + 1) ν
Αριθμός πεπτιδίων = ⎜
− 1 ⎟ , όπου ν = μήκος αντιγονικής περιοχής
2
⎠
⎝
υπολογίζεται από τον τύπο:
(ii)
των Ρούτσια και συν (183): Συνθέτονται δύο σειρές πεπτιδίων μεταβλητού
μήκους. Η πρώτη σειρά αποτελείται από πεπτίδια συνεχώς μειούμενου μήκους
με αλληλουχία που προκύπτει με αφαίρεση ενός αμινοξέος κάθε φορά από το
αμινοτελικό άκρο της αντιγονικής περιοχής. Όμοια η δεύτερη σειρά προκύπτει
με αφαίρεση αμινοξέων από το καρβοξυτελικό άκρο της αντιγονικής περιοχής
(Σχήμα 38). Ανάλυση της δραστικότητας των πεπτιδίων της πρώτης σειράς μας
αποκαλύπτει το αμινοξύ το οποίο είναι κρίσιμο για τη δέσμευση του
αντισώματος και το οποίο αποτελεί το αμινοτελικό όριο του περιορισμένου
επιτόπου. Όμοια ανάλυση της δραστικότητας των πεπτιδίων της δεύτερης
σειράς μας δίνει το καρβοξυτελικό όριο του περιορισμένου επιτόπου.
Ο αριθμός των πεπτιδίων που απαιτούνται με τη μέθοδο αυτή είναι:
Αριθμός πεπτιδίων = 2ν - 2 , όπου ν = μήκος αντιγονικής περιοχής
Σχήμα 38. Περιορισμός μήκους με τη τεχνική των Ρούτσια και συν.
(183). Τα δραστικά πεπτίδια είναι χρωματισμένα με
σκούρο γκρι.
Γ.II.5.3 Καθορισμός των σημαντικών για τη δέσμευση του αντισώματος
αμινοξέων.
Η συνεισφορά κάθε αμινοξέος του επιτόπου στη δέσμευση του αντισώματος μπορεί
να εξακριβωθεί με τη σύνθεση πεπτιδίων όπου το αμινοξύ αντικαθίσταται
διαδοχικά από τα 20 φυσικά αμινοξέα (57). Εάν η αντικατάσταση ενός αμινοξέος
οδηγεί σε απώλεια της ικανότητας δέσμευσης του αντισώματος από τον επίτοπο
τότε θεωρείται ότι το αμινοξύ αυτό αλληλεπιδρά άμεσα με το αντίσωμα και είναι
σημαντικό για την δέσμευση του τελευταίου (Σχήμα 39).
Η μέθοδος αυτή απαιτεί τη σύνθεση πεπτιδίων:
Αριθμός πεπτιδίων = 20ν , όπου ν = μήκος επιτόπου
Σχήμα 39. Ικανότητα δέσμευσης αντισώματος του επιτόπου GDLQVL όταν κάθε
αμινοξύ του αντικαθίσταται από τα 20 φυσικά αμινοξέα. (57).
Γ.II.5.4 Η στρατηγική των μιμοτόπων
Για την επιτυχή αντιγονική χαρτογράφηση με τις τεχνικές που προαναφέραμε
πρέπει να πληρούνται δύο προϋποθέσεις (i) να υπάρχει τουλάχιστον ένας
γραμμικός επίτοπος στο αντιγόνο που να αναγνωρίζεται από τα αντισώματα και (ii)
να είναι γνωστό το αντιγόνο που στοχεύουν τα αντισώματα, να είναι πρωτεϊνικό και
να είναι γνωστή αλληλοδιαδοχή αμινοξέων του. Οι προϋποθέσεις αυτές δεν
υπάρχουν πάντα αφού είναι γνωστό ότι η πλειοψηφία των αντισωμάτων (περίπου το
90%) αναγνωρίζει επιτόπους διαμόρφωσής (149), ενώ κάποιες φορές το αντιγόνο ή
η πρωτοταγής του δομή είναι άγνωστα.
Για ξεπεραστούν οι περιορισμοί αυτοί αναπτύχθηκε το 1986 από τον Mario Geysen
η τεχνική των μιμοτόπων (50), σύμφωνα με την οποία «δημιουργείται» ένας
γραμμικός επίτοπος ο οποίος μπορεί να μιμηθεί τον άγνωστο επίτοπο
(διαμορφωτικό ή μη) που αναγνωρίζεται από το αντίσωμα. Η τεχνική αυτή έχει το
μειονέκτημα ότι ενώ προσφέρεται για τον προσδιορισμό επιτόπων μονοκλωνικών
αντισωμάτων, δεν μπορεί να εφαρμοστεί για πολυκλωνικά – πολυειδικά
αντισώματα όπως αυτά που απαντώνται στις αυτοάνοσες ασθένειες.
Θεωρητικά για να προσδιοριστεί ο μιμότοπος ενός αντισώματος πρέπει να
εξετασθούν για αλληλεπίδραση με το αντίσωμα όλα τα πιθανά πεπτίδια μήκους 8
αμινοξέων (μέγιστο
μέγεθος γραμμικού επιτόπου)
που
προκύπτουν
από
συνδυασμούς των 20 αμινοξέων που κωδικοποιούνται στον άνθρωπο. Έτσι
απαιτούνται 208 οκταπεπτίδια τα οποία ακόμα και αν ήταν δυνατό να συντεθούν, η
εξέταση της δραστικότητας τους θα απαιτούσε απαγορευτικά μεγάλη ποσότητα
αντισώματος. Για να ξεπεραστεί το πρόβλημα που προκύπτει από τον τεράστιο
αριθμό πεπτιδίων που απαιτούνται χρησιμοποιούνται είτε βιβλιοθήκες πεπτιδίων
(βλέπε κεφάλαιο Α.V) είτε η τεχνική του Geysen (188).
Οι Mario Geysen και συν (189) απέδειξαν ότι μονοκλωνικά αντισώματα μπορούν
να αλληλεπιδράσουν ειδικά και επαναλήψιμα με πεπτίδια μήκους μόλις δύο
αμινοξέων (διπεπτίδια). Έτσι είναι δυνατό ένα ισχυρά αντιγονικό πεπτίδιο να
«κτιστεί» με βάση το διπεπτίδιο που αρχικά παρουσιάζει την βέλτιστη δέσμευση
αντισώματος. Αν επιπλέον ληφθεί υπόψη ότι ο οπτικός ισομερισμός των αμινοξέων
έχει ισχυρή επίδραση στη συγγένεια δέσμευσης του αντισώματος, τότε η εισαγωγή
και D-ισομερών των αμινοξέων μπορεί να βελτιώσει περαιτέρω την αντιγονικότητα
του μιμοτόπου.
Σύμφωνα με την τεχνική των μιμοτόπων του Geysen αρχικά επιλέγεται το πιο
δραστικό διπεπτίδιο από το ρεπερτόριο των 400 διπεπτιδίων που κωδικοποιούνται
στον άνθρωπο (202 διπεπτίδια). Στη συνέχεια δημιουργούνται δυο σειρές
τριπεπτιδίων όπου το δραστικό διπεπτίδιο επιμηκύνεται από το άμινο- ή το
καρβόξυ-τελικό του άκρο με τα 40 δυνατά αμινοξέα (20 L-ισομερή και 20 Dισομερή). Ακολουθεί νέος έλεγχος αντιγονικότητας και επιλογή του βέλτιστου
τριπεπτιδίου το οποίο με την προηγούμενη διαδικασία επιμηκύνεται σε
τετραπεπτίδιο, πενταπεπτίδιο κ.ο.κ. (Σχήμα 40).
Ο αριθμός πεπτιδίων που απαιτούνται στη μέθοδο αυτή υπολογίζεται από τον τύπο:
Αριθμός πεπτιδίων = 400 + 80(ν - 2) όπου ν = τελικό μήκος μιμοτόπου
Σχήμα 40. Σχηματισμός ενός μιμοτόπου για ένα μονοκλωνικό αντίσωμα
κατά του ιού της λύσσας (398).
ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-
Δ΄
ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ Ro/SSA ΚΑΙ
ΚΑΛΡΕΤΙΚΟΥΛΙΝΗΣ
Δ.I. ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ
Δ.I.1 Γενικά
Η
φυσιολογική ανοσολογική απόκριση, όπως είδαμε, έχει ως έναυσμα το
αντιγόνο και καταστέλλεται όταν αυτό εξαλειφθεί. Στην περίπτωση της αυτοανοσίας
όμως το ανοσολογικό σύστημα στρέφεται κατά αντιγόνων του εαυτού τα οποία δεν
μπορεί να εξαλείψει από το ανθρώπινο σώμα. Έτσι υπάρχει μια συνεχής
επανατροφοδότηση με αυτοαντιγόνο η οποία διατηρεί την ανοσολογική απόκριση και
επιτείνει την ιστική καταστροφή.
Οι μηχανισμοί με τους οποίους επέρχεται η ιστική βλάβη στην αυτοάνοση
απόκριση ουσιαστικά δεν διαφέρουν από αυτούς που απαντώνται στη φυσιολογική
ανοσολογική απόκριση. Έτσι μπορεί να έχουμε (i) αντίδραση τύπου II όπως στην
αυτοάνοση αιμολυτική αναιμία ή στο σύνδρομο Goodpasture όπου τα αυτοαντισώματα
στοχεύουν αντιγόνα της επιφάνειας των ερυθρών αιμοσφαιρίων ή της βασικής
μεμβράνης των νεφρικών σπειραμάτων και των πνευμονικών κυψελίδων αντίστοιχα,
ασκώντας κυτταροτοξική δράση, (ii) αντίδραση
τύπου III όπως στη μικτή
κρυοσφαιριναιμία και στο Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο όπου αυτοαντισώματα
κατά της IgG (Ρευματοειδής Παράγοντας) ή κατά DNA, ριβονουκλεοπρωτεϊνών, και
ιστονών
αντίστοιχα
προκαλούν
μέσω
ανοσοσυμπλεγμάτων
αγγειίτιδα
και
σπειραματονεφρίτιδα και (iii) αντίδραση τύπου IV όπως στο νεανικό διαβήτη και στην
κατά πλάκας σκλήρυνση όπου τα Τ-λεμφοκύτταρα
στοχεύουν αντιγόνα των β-
νησιδιοκυττάρων του παγκρέατος ή τη βασική πρωτεΐνη της μυελίνης αντίστοιχα και
ασκούν κυτταροτοξική δράση.
Στη συνέχεια θα ασχοληθούμε με την χυμική αυτοάνοση απόκριση, δηλαδή με την
ανοσολογική αυτοάνοση απόκριση που σχετίζεται με τα αυτοαντισώματα.
Δ.Ι.2 Η ποικιλομορφία των αυτοαντισωμάτων
Τα αυτοάνοσα νοσήματα χαρακτηρίζονται, παράλληλα με την ποικιλομορφία της
κλινικής τους έκφρασης , από μια πληθώρα αυτοαντισωμάτων που στρέφονται κατά
οργανοειδικών και μη αυτοαντιγόνων (Πίνακας 6)
Πίνακας 6: Η ποικιλομορφία των αυτοαντισωμάτων
Αντισώματα κατά:
•
•
Κυτταρικών στοιχείων
-
DNA
-
πυρηνικών αντιγόνων
-
κυτταροπλασματικών αντιγόνων
-
μεμβρανικών αντιγόνων
Πρωτεϊνών ορού
-
ανοσοσφαιρινών (Ρευματοειδής Παράγοντας)
Μη οργανοειδικά
•
Κυττάρων αίματος
•
Κύτταρων οργάνων
•
Υποδοχέων
Οργανοειδικά
Μεταξύ των αυτοαντισωμάτων υπάρχει μεγάλη ποικιλομορφία και ετερογένεια
Υπάρχουν δύο μεγάλες κατηγορίες. Η πρώτη αφορά τα «φυσικά» αυτοαντισώματα. Τα
αντισώματα αυτά βρίσκονται σε υγιείς ανθρώπους, δεν είναι παθογενετικά και
παρουσιάζουν τα εξής χαρακτηριστικά (i) συνήθως είναι αντισώματα τάξεως IgM, (ii)
η συγγένεια τους με το αντιγόνο είναι μικρή και (iii) αντιδρούν διασταυρωτά με πολλά
αντιγόνα (190). Η
δεύτερη
κατηγορία περιλαμβάνει
αυτοαντισώματα που
ανευρίσκονται σε ασθενείς, είναι «εν δυνάμει» παθογονικά και χαρακτηρίζονται από
τα εξής (i) είναι συνήθως τάξεως IgG
(ii) η συγγένειά τους με το αντιγόνο είναι
μεγάλη και (iii) είναι ειδικά για ένα αυτοαντιγόνο (191).
Κύριοι εκπρόσωποι μη οργανοειδικών αυτοαντισωμάτων της κατηγορίας αυτής
είναι τα αντισώματα κατά ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων.
Δ.I.3 Αυτοντισώματα κατά ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων
Κυκλοφορούντα
αυτοαντισώματα
κατά
μικρών
ριβονουκλεοπρωτεϊνικών
συμπλόκων (RNP) απαντώνται σε ασθενείς με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο
(ΣΕΛ), πρωτοπαθές Σύνδρομο Sjogren (πΣΣ) και Μικτή Νόσο του Συνδετικού Ιστού
(ΜΝΣΙ). Τα ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα αποτελούνται από ένα μικρό μόριο
RNA σε μη ομοιοπολική σύμπλεξη με ένα αριθμό πρωτεϊνών. Τα δύο κύρια RNPs είναι
(i) το Ro/La RNP, που είναι στόχος των αυτοαντισωμάτων στο Συστηματικό
Ερυθηματώδη Λύκο και στο Σύνδρομο Sjogren και (ii) το Sm/nRNP RNP, αντισώματα
κατά του οποίου απαντώνται στο Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο και στη Μικτή
Νόσο του Συνδετικού Ιστού.
Το Ro/La (hY5) RNP αποτελείται από ένα μόριο RNA (hY5) και τουλάχιστον 3
πρωτεϊνες τις Ro 60KD, Ro 52KD και La 48KD (Σχήμα 41Α), ενώ μία τετάρτη η
καλρετικουλίνη (46KD) έχει πρόσφατα ταυτοποιηθεί σαν μέλος του ιδίου συμπλόκου
Σχήμα 41. Δομή των ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων Ro/La(hY5) RNP και Sm/nRNP(U1) RNP.
(192, 193). Το Sm/nRNP (U1) RNP αποτελείται από τις πρωτείνες nRNP 70KD, nRNP
A (32KD), nRNP C (18,5KD), Sm B´ (27KD), Sm B (26KD), Sm D (13KD), Sm E/F
(11KD) και Sm G (10KD) (Σχήμα 41Β).
Χαρακτηριστικά της αυτοάνοσης απόκρισης κατά αυτών των συμπλόκων είναι
(i) τα αυτοαντισώματα στοχεύουν κυρίως το πρωτεϊνικό τμήμα των συμπλόκων και όχι
το RNA, (ii) ορισμένα αυτοαντισώματα όπως τα αντί-Ro ή τα αντί-nRNP μπορούν να
εμφανίζονται μεμονωμένα σε ένα ορό ασθενούς, χωρίς να συνυπάρχουν με άλλα
αυτοαντισώματα, ενώ άλλα όπως τα αντί-La και αντί-Sm εμφανίζονται πάντα σε ζεύγη
με αντί-Ro (194) ή αντί-nRNP (195) αντίστοιχα.
Στη συνέχεια θα εξετάσουμε λεπτομερώς το ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο
Ro RNP και τις ιδιότητες των αυτοαντισωμάτων που στρέφονται εναντίον του.
Δ.II ΤΟ ΡΙΒΟΝΟΥΚΛΕOΠΡΩΤΕΪΝΙΚΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ Ro RNP
Δ.ΙΙ.1 Δομή του συμπλόκου Ro RNP
Τo Ro είναι ένα μικρό κυτταροπλασματικό σύμπλοκο RNA – πρωτεϊνών με
άγνωστη λειτουργία που απαντάται στα κύτταρα όλων των ειδών.
Το RNA συστατικό του συμπλόκου αποτελείται από ένα hY RNA. Στο ανθρώπινο
είδος υπάρχουν 4 διαφορετικά hY RNA μήκους περίπου 100 νουκλεοτιδίων, τα
hY1, hY3, hY4 και hY5 (196) (το hY2 RNA είναι ένα προϊόν αποδόμησης του hY1
RNA (197) και έτσι δεν αναφέρεται ξεχωριστά).
Το πρωτεϊνικό τμήμα του συμπλόκου αποτελείται από τις πρωτεΐνες Ro 60KD, Ro
52KD, La 48KD και πιθανών την καλρετικουλίνη 46KD. Η καλρετικουλίνη αρχικά
παρουσιάστηκε σαν μέλος του Ro RNP συμπλόκου (198, 199, 200). Στη συνέχεια
αμφισβητήθηκε ο ρόλος της αυτός (201, 202), όμως πιο πρόσφατα δεδομένα
υποστηρίζουν την ικανότητα της να αλληλεπιδρά τόσο με τα hY RNA όσο και την
Ro 52KD πρωτεΐνη (192, 193, 203).
Η πιθανή δομή του hY1 Ro RNP παρουσιάζεται στο Σχήμα 42. Από τη δομή αυτή
Σχήμα 42. Μοντέλο για το ανθρώπινο Y1 Ro-RNP.
πιθανόν να απουσιάζουν κάποια μέλη του συμπλόκου αφού το μοριακό βάρος που
υποδηλώνει για το σύμπλοκο, υπολείπεται κατά πολύ από το πειραματικά
προσδιορισμένο (με μοριακή διήθηση), που είναι 300-400 KD (204, 205). Επιπλέον
μελέτες επανασύνταξης του συμπλόκου με σεσημασμένο hY5 RNA έδειξαν οτί ακόμα και
ελλειματικό hY5 RNA, από το οποίο λείπουν οι θέσεις πρόσδεσής των Ro 60KD και La πρωτεϊνών
είναι σε θέση να σχηματίζει μία μορφή RNP συμπλόκου (πιθανόν με κάποια άλλη πρωτεΐνη που
συμμετέχει στο σύμπλοκο αυτό) (206).
Δ.II.1.1 Τα hY RNAs
Τα γονίδια των hY RNAs (human cYtoplasmic RNAs) βρίσκονται στο ανθρώπινο
χρωμόσωμα 7 και κωδικοποιούν 4 RNA (hY1, hY3, hY4 και hY5 RNA) με μήκος
Σχήμα 43. Δευτεροταγής δομή των ανθρώπινων Y RNAs. Οι πιο διατηρημένες περιοχές τους βρίσκονται
μεσά σε πλαίσιο.
83, 93,101 και 112 νουκλεοτίδια αντίστοιχα (Σχήμα 43)(207-209).
Στα λεμφοκύτταρα και στα άλλα εμπύρηνα κύτταρα του ανθρώπινου οργανισμού
απαντούνται και τα 4 hY RNAs, ενώ στα ερυθροκύτταρα εμφανίζονται κυρίως τα
hY1 και hY4 RNA (209-211) και στα θρομβοκύτταρα μόνο τα hY3 και hY4 (212).
Σε άλλα ζωικά είδη ο αριθμός των Y RNAs ποικίλει από 1 στο caenorhabditis
elegans (213) έως 4 στον άνθρωπο, πίθηκο, σκύλο, γάτα, χοίρο, ινδικό χοιρίδιο,
xenopus laevis (211, 214, 215) (Πίνακας 7).
Πίνακας 7: Έκφραση των hY RNAs σε κύτταρα διαφόρου προελεύσεως
Ζωικό είδος
Y1
Y3
Y4
Y5
Άνθρωπος
+
+
+
+
Πίθηκος
+
+
+
+
Σκύλος
+
+
+
+
Γάτα
+
+
+
+
Χοίρος
+
+
+
+
Αγελάδα
+
+
+
Κουνέλι
+
+
+
+
Ποντικός
+
+
Hamster
+
+
Αρουραίος
+
+
Ινδικό χοιρίδιο
+
+
+
+
Xenopus Laevis
+
+
+
+
+
+
Ιγκουάνα
Πάπια
+
+
Πέστροφα
+
+
C. elegans
+
Οι περιοχές των RNA που είναι υπεύθυνες για την δέσμευση της Ro 60KD
πρωτεΐνης έχει προσδιοριστεί στη διατηρημένη στα 4 hYRNA ελικοειδή δομή
γύρω από την κυτοσίνη 9 (197, 216). Η La πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με τα hYRNA,
μέσω της περιοχής πολυουρακίλης στο 3΄ άκρο τους (216).
Δ.II.1.2 Η πρωτεΐνη Ro60KD
Το γονίδιο της πρωτεΐνης Ro 60KD βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1 (217, 218). Έχουν
Σχήμα 44. Σχηματική αναπαράσταση της δομής των πρωτεϊνών
Ro60 kD.
απομονωθεί δυο κλώνοι cDNA που κωδικοποιούν δύο Ro 60 πρωτεΐνες (i) την
Ro60α 538 αμινοξέων και μοριακού βάρους 60.6 KD (Σχήμα 44α)(219,216) και (ii)
τη Ro60β 525 αμινοξέων και μοριακού βάρους 59.3 KD ( Σχήμα 44β)(220). Οι δύο
αυτές πρωτεΐνες προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα (splicing) του mRNA το
οποίο οδηγεί σε αντικατάσταση 25 αμινοξέων της Ro60α με 11 διαφορετικά για την
Ro60β (217). Η επικρατούσα πρωτεΐνη στα ανθρώπινα κύτταρα είναι η Ro60α
(217).
Στη πρωτοταγή της δομή η πρωτεΐνη Ro60 (Σχήμα 44) περιλαμβάνει ένα μοτίβο
RNP (αμινοξέα 92-161) το οποίο απαντάται συχνά σε πρωτεΐνες που δεσμεύουν
RNA (221) (Σχήμα 45). Το μοτίβο αυτό είναι απαραίτητο για τη σωστή σύνδεση της
Ro60 με τα hYRNAs όπως απαραίτητη είναι και η σωστή διαμόρφωση της
πρωτεΐνης, αφού ακόμα και μικρά σχετικά ελλείμματα είτε στο αμινοτελικό είτε στο
καρβοξυτελικό άκρο της Ro60 πρωτεΐνης επηρεάζουν την ικανότητα της για
δέσμευση των hYRNA (216). Επιπλέον στο τμήμα 132-150 μπορεί να θεωρηθεί ότι
υπάρχει και ένα διμερές σήμα πυρηνικής εντόπισης NLS.
Σχήμα 46. Δάκτυλος ψευδαργύρου Α: στη πρωτεΐνη SW15, Β: στη πρωτεΐνη
Zif268 (σε σύμπλεξη με το DNA).
Μεταξύ των αμινοξέων 305-323 υπάρχει μια αλληλουχία δακτύλου ψευδαργύρου
που είναι χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών που δεσμεύουν DNA (Σχήμα 46). Η
αλληλουχία αυτή αποτελεί τμήμα της περιοχής 276-318 που έχει υποδειχθεί σαν
υπεύθυνη για τη δέσμευση της Ro 52 πρωτεΐνης [η πρωτεΐνη Ro52 δεν συνδέεται
άμεσα με τα hYRNA αλλά έμμεσα μέσω της Ro60KD πρωτεΐνης (222)]. Επίσης η
ίδια περίπου περιοχή (αμινοξέα 274-327) έχει βρεθεί να κατέχει ομολογία
αλληλουχίας με την πρωτεΐνη p80 του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της
τελομεράσης στον άνθρωπο [ομολογία 18% (223)] και στο Tetrahymena [ομολογία
29% (224)].
Ομόλογα της Ro60 πρωτεΐνης έχουν ανιχνευθεί σε κύτταρα πιθήκου, χοίρου,
αγελάδας, σκύλου, γάτας, κουνελιού, ποντικού, αρουραίου και ινδικού χοιριδίου
(214, 225). Συμπληρωματικά DNA που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη Ro60KD έχουν
κλωνοποιηθεί από τα ζωικά είδη Xenopus laevis (είδος βατράχου), Caenorhabditis
elegans (νηματόζωο) και ποντικό (213, 215, 226). Η Ro60 από τον Xenopus laevis
και από τον ποντικό είναι ιδίου μήκους με τη Ro60α με την οποία έχουν ταυτότητα
αλληλουχίας 78% και 95% αντίστοιχα. H Ro60 από το Caenorhabditis elegans (643
αμινοξέα) είναι 105 αμινοξέα μεγαλύτερη από τη Ro60a λόγω 47 επιπλέον
αμινοξέων στο αμινοτελικό της άκρο και έχει ομολογία 36% με τις δύο ανθρώπινες
πρωτεΐνες Ro60. Το μοτίβο RNP είναι διατηρημένο και στις τρεις πρωτεΐνες αλλά
όχι και ο δάκτυλος ψευδαργύρου ο οποίος απουσιάζει από τον Xenopus laevis και
το Caenorhabditis elegans.
Δ.II.1.3 Η πρωτεΐνη Ro52KD
Το γονίδιο που κωδικοποιεί την Ro52KD πρωτεΐνη έχει χαρτογραφηθεί στο
Σχήμα 47. Σχηματική αναπαράσταση της δομής των πρωτεϊνών
Ro52 kD.
χρωμόσωμα 11 (227). Έχουν απομονωθεί δύο κλώνοι cDNA που κωδικοποιούν την
Ro52KD (212, 228). Οι δύο αυτοί κλώνοι είναι σχεδόν ταυτόσημοι, διαφέροντας
μόνο σε ένα νουκλεοτίδιο και κωδικοποιούν την Ro52α πρωτεΐνη με 475 αμινοξέα
και μοριακό βάρος 54.1 KD (Σχήμα 47α). Ένας ακόμα κλώνος cDNA έχει
απομονωθεί, ο οποίος προκύπτει από εναλλακτικό μάτισμα (splicing) του mRNA
και δίνει τη Ro52β πρωτεΐνη με 398 αμινοξέα (Σχήμα 47β) (229).
Το 1988 προσδιορίστηκε η Ro52KD σαν μέλος του RoRNP (230). Η πρωτεΐνη αυτή
δεν ενώνεται άμεσα με τα hYRNAs αλλά έμμεσα μέσω αλληλεπιδράσεων
πρωτεΐνης-πρωτεΐνης με τη Ro60KD (222). Η συμμετοχή της Ro52KD στο RoRNP
έχει αμφισβητηθεί από ορισμένους (205, 231, 232), αλλά νεότερα δεδομένα (233,
234) υποδεικνύουν οτι η Ro52 αποτελεί μέλος του RoRNP.
Σχήμα 48. Τρισδιάστατη δομή του μοτίβου φερμουάρ λευκίνης
στις Fos και Jun πρωτεΐνες. Η δομή περιελιγμένου
σπειράματος (πάνω) χρησιμεύει για τη σύνδεση των
Fos και Jun πρωτεϊνών, ενώ το βασικό τμήμα (κάτω)
για την αλληλεπίδραση με το DNA.
Στην πρωτοταγή της δομή η πρωτεΐνη Ro52 (Σχήμα 47) περιλαμβάνει στο
αμινοτελικό της άκρο μια περιοχή του τύπου δακτύλου-ψευδαργύρου η οποία
αναφέρεται στη βιβλιογραφία σαν περιοχή RING finger - B box (235). Στο κεντρικό
τμήμα της πρωτεΐνης βρίσκεται μια ελικοειδής δομή που εμπεριέχει ένα μοτίβο
φερμουάρ
λευκίνης
(leucine
zipper).
Το
μοτίβο
αυτό
χρησιμεύει
για
αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης καθώς και για δέσμευση του DNA
(236)(Σχήμα 48). Το καρβοξυτελικό άκρο της Ro52 παρουσιάζει μεγάλη ομολογία
με την ανθρώπινη πρωτεΐνη rfp (human transforming protein) και την πρωτεΐνη rpt1 ποντικού. Οι πρωτεΐνες αυτές, όπως και η Ro52 είναι μέλη της οικογένειας
πρωτεϊνών rfp, οι οποίες είναι κυρίως πρωτεϊνες δέσμευσης του DNA και
ρυθμιστές της μεταγραφής (237).
Σε αντίθεση με τις La και Ro60 πρωτεΐνες που ανιχνεύονται σε μια πληθώρα
ζωικών ειδών, η Ro52 εμφανίζεται μόνο στον άνθρωπο, στον πίθηκο και στο ινδικό
χοιρίδιο (214, 225).
Δ.II.1.4 Η πρωτεΐνη La48KD
Το γονίδιο της La πρωτεΐνης βρίσκεται στο χρωμόσωμα 2. Έχουν απομονωθεί
κλώνοι cDNA που κωδικοποιούν τη La πρωτεΐνη μήκους 408 αμινοξέων και
μοριακού βάρους 46.7 KD (216, 238, 239) (Σχήμα 49).
Σχήμα 49.
Σχηματική αναπαράσταση της δομής της
πρωτεΐνης La 48kD.
Η La πρωτεΐνη αλληλεπιδρά άμεσα με όλα τα RNA που είναι προϊόντα μεταγραφής
της RNA πολυμεράσης III (συμπεριλαμβανόμενων και των hΥRNAs). Κατά την
αλληλεπίδραση αυτή η La πρωτεΐνη δεσμεύει μια αλληλουχία πολυουρακίλης που
βρίσκεται στο 3' άκρο των νεοσυντεθέντων RNA (240-242). Η αλληλουχία αυτή
χάνεται από το 3' άκρο των περισσότερων RNA κατά την ωρίμανση τους, γι αυτό
και η La προσδένεται σ’ αυτά μόνο παροδικά (αμέσως μετά τη σύνθεση τους).
Εξαίρεση αποτελούν τα hY RNA και τα ιικά RNA EBER (του ιού Epstein-Barr)
και VA (του αδενοϊού) (243) τα οποία διατηρούν τη περιοχή δέσμευσης για τη La
πρωτεΐνη και μετά από την ωρίμανση τους.
Στην πρωτοταγή της δομή η La περιέχει δύο μοτίβα RNP [αναγνώρισης RNA
(221)], ένα μοτίβο δέσμευσης ATP (244), 3 περιοχές PEST [πλούσιες σε αμινοξέα
P (προλίνη), E (γλουταμινικό οξύ), S (σερίνη), T (θρεονίνη) που είναι ευαίσθητες
σε πρωτεολυτική πέψη (245)], δύο ομόλογες περιοχές με την πρωτεϊνική κινάση
PKR (246) και ένα σήμα πυρηνικής εντόπισης NLS (Nuclear Localization Signal)
(448) (Σχήμα 49). Η La πρωτεΐνη είναι φωσφορυλιωμένη σε υψηλό βαθμό κυρίως
στο καρβοξυτελικό της τμήμα (248, 249).
Εξελικτικά η La είναι καλά διατηρημένη αφού έχει ανιχνευθεί σε κύτταρα πιθήκου,
χοίρου, αγελάδας, σκύλου, γάτας, κουνελιού, αρουραίου, ποντικού και στο
πλασμώδιο το μηνοειδές (Plasmodium falciparum) (225, 250-252). Συμπληρωματικά
DNA που την κωδικοποιούν έχουν απομονωθεί από Xenopus laevis (είδος
βατράχου), Drosophila melanogaster (είδος μύγας) και Saccharomyces cerevisiae
(μύκητας) (244,245, 253-257).
Δ.II.1.5 Η πρωτεΐνη καλρετικουλίνη 46KD
Η καλρετικουλίνη είναι μια πρωτεΐνη που δεσμεύει το Ca2+. Στην πρωτεΐνη αυτή
πριν την απομόνωση του cDNA της είχαν δοθεί διάφορα ονόματα όπως HACBP
(258), Calregulin (259), CRP55 (260), CAPB3 (261), Erp60 (262) και Ro60KD
(198). Με την απομόνωση των cDNA κλώνων κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες αυτές
έγινε δυνατό να αποδειχθεί ότι όλες οι παραπάνω πρωτεΐνες ήταν ουσιαστικά μια η
οποία ονομάστηκε καλρετικουλίνη (calreticulin: Calcium binding protein localized
to the endoplasmic / sarcoplasmic reticulum membranes) (179, 263-265).
Το γονίδιο της καλρετικουλίνη έχει χαρτογραφηθεί στο χρωμόσωμα 19 και
κωδικοποιεί πρωτεΐνη 401 αμινοξέων και μοριακού βάρους 46KD (179, 263, 264)
Σχήμα
50. υψηλά
Σχηματική
αναπαράσταση
της δομής
της
(Σχήμα 50). Λόγω
του
αρνητικά
φορτισμένου
καρβοξυτελικού
της άκρου
πρωτεΐνης καλρετικουλίνη 46kD.
στην ηλεκτροφόρηση πολυακρυλαμιδίου εμφανίζεται σαν πρωτεΐνη μοριακού
βάρους 60KD (179). Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η καλρετικουλίνη δεσμεύει Ca2+.
Οι περιοχές δέσμευσης Ca2+ είναι δύο: μια υψηλής συγγένειας – χαμηλής
χωρητικότητας στο κεντρικό τμήμα του μορίου και μια χαμηλής συγγένειας –
υψηλής χωρητικότητας στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης (266). Επιπλέον η
καλρετικουλίνη είναι σε θέση να δεσμεύσει Zn2+ (267, 268). Η δέσμευση του Zn2+
είναι άγνωστο που ακριβώς συμβαίνει στο μόριο, μιας και αυτό δεν περιέχει
δάκτυλους ψευδαργύρου, αλλά είναι γνωστό ότι όταν συμβεί - σε αντίθεση με η
δέσμευση Ca2+ - προκαλεί δραματικές αλλαγές στη διαμόρφωσή της πρωτεΐνης
(267).
Στην πρωτοταγή δομή της (Σχήμα 50) η καλρετικουλίνη περιλαμβάνει την
επαναλαμβανόμενη αλληλουχία PxxIxDPDAxKPEDWD, περιοχές PEST(269),
σήμα πυρηνικής εντόπισης NLS (267) και την αλληλουχία παραμονής στο
ενδοπλασματικό δίκτυο KDEL (270).
Εξελικτικά η καλρετικουλίνη είναι καλά διατηρημένη και η ύπαρξη της έχει
ταυτοποιηθεί σε κουνέλι, χοίρο, αγελάδα, ποντικό, σκύλο, κοτόπουλο, αρουραίο και
το παράσιτο aplysia (264, 271-275).
Δ.II.2 Πιθανός λειτουργικός ρόλος του RoRNP
Τα περισσότερα συστατικά του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου RoRNP είναι
καλά διατηρημένα κατά την εξέλιξη των ζωικών ειδών και εκφράζονται σε μεγάλη
ποικιλία οργανισμών από το C. elegans έως τον άνθρωπο, υποδηλώνοντας ένα
σημαντικό λειτουργικό ρόλο για το RoRNP. Ο ρόλος αυτός μέχρι στιγμής
παραμένει άγνωστος παρόλο που διάφορες πυρηνικές και κυτταροπλασματικές
λειτουργίες έχουν προταθεί για καθένα από τα επιμέρους συστατικά του.
Δ.II.2.1 Πιθανός βιολογικός ρόλος της La πρωτεΐνης
Με βάση το γεγονός ότι η La πρωτεΐνη συνδέεται προσωρινά με όλα τα
νεοσυντεθέντα RNA που είναι προϊόντα μεταγραφής της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ,
έχει δειχθεί ότι η La ενέχεται ενεργά στη διαδικασία μεταγραφής των RNA αυτών.
Έτσι η La πρωτεΐνη είναι απαραίτητη για τη σωστή και αποτελεσματική έναρξη
καθώς και για τον τερματισμό της μεταγραφής των RNA από την RNA πολυμεράση
ΙΙΙ (276-279). Σχετιζόμενη με τη λειτουργία της αυτή φαίνεται να είναι και η
ικανότητα της La πρωτεΐνης να διαχωρίζει (να ξεδιπλώνει) υβρίδια DNA-RNA
καθώς και RNA
διπλής έλικας με εξαρτώμενο από ATP τρόπο (280-282).
Σχήμα 51. Δευτεροταγής δομή του ελαττωματικού 5S RNA
που συνδεέται με το Ro60KD (482). Τα βέλη
δείχνουν τις μεταλλάξεις νουκλεοτιδίων.
Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι επιπρόσθετα η La δεσμεύεται άμεσα στο 18S
rRNA και σε μια υποτάξη των ριβοσωματικών σωματίων 40S (283).
Δ.II.2.2 Πιθανός βιολογικός ρόλος της Ro60 πρωτεΐνης
Για τη Ro 60KD πρωτεΐνη έχει προταθεί ένας λειτουργικός ρόλος στον ποιοτικό
έλεγχο της βιοσύνθεσης των 5S RNA (284, 285). Η σύνθεση των ελαττωματικών 5S
rRNA που κατέχουν σωματικές μεταλλάξεις συνδέεται με αποτυχία της RNA
πολυμεράσης ΙΙΙ να τερματίσει τη μεταγραφή τους στο πρώτο σήμα τερματισμού.
Αποτέλεσμα του γεγονότος αυτού είναι να εμφανίζονται επιπρόσθετα νουκλεοτίδια
στο 3΄άκρο των 5S rRNA (Σχήμα 51). Τα νουκλεοτίδια αυτά αναγνωρίζονται ειδικά
από τη Ro 60KD πρωτεΐνη η οποία έτσι συνδέεται με τα ελαττωματικά 5S rRNA. Η
σύνδεση αυτή οδηγεί τελικά σε μη αποτελεσματική ωρίμανση και αποικοδόμηση
των ελλατωματικών 5S rRNA (284, 285).
Πρόσφατα βρέθηκε ομολογία της Ro 60KD πρωτεΐνης με την p80 υπομονάδα του
ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της τελομεράσης (223, 224). Η τελομεράση
είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικο σύμπλοκο που προσθέτει επαναλαμβανόμενες
αλληλουχίες στο τέλος των χρωμοσωμάτων σε κάθε διπλασιασμό του DNA οι
οποίες καλούνται τελομερή και σχετίζονται με τη γήρανση, το θάνατο και την
αθανασία διάφορων κυτταρικών σειρών (286). Έτσι η ομολογία αυτή είναι πιθανό
να υποδηλώνει ένα παρόμοιο ρόλο για την πρωτεΐνη Ro60KD, ενδεχόμενο που
απαιτεί περαιτέρω μελέτες για τη διευκρίνιση του.
Δ.II.2.3 Πιθανός βιολογικός ρόλος της Ro52 πρωτεΐνης
Η πρωτεΐνη Ro52 ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνων rfp, οι οποίες όλες
περιέχουν δάκτυλο ψευδαργύρου, φερμουάρ λευκίνης και την ομόλογη rfp περιοχή.
Οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες αυτές αλληλεπιδρούν με το DNA και παίζουν
ενεργό ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής (237). Πρόσφατα έχει δειχθεί ότι η Ro52
πρωτεΐνη είναι σε θέση να δεσμεύει DNA (287) και έτσι ένας λειτουργικός ρόλος
παρόμοιος με αυτόν των rfp πρωτεϊνών καθίσταται πιθανός για αυτή.
Δ.II.2.4 Πιθανός βιολογικός ρόλος της καλρετικουλίνης
Η καλρετικουλίνη είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη και διάφορες σημαντικές
βιολογικές λειτουργίες έχουν αποδοθεί σ’ αυτήν.
(i)
Η καλρετικουλίνη δεσμεύοντας το ασβέστιο παίζει σημαντικό ρόλο στην
αποθήκευση του στο ενδοπλασματικό δίκτυο των κυττάρων (271, 288, 289). Ο
ρόλος της σαν αποθήκη Ca2+ στα μη μυικά κύτταρα είναι ανάλογος με αυτόν της
καλσεκουεστρίνης (calsequestrin) με την οποία μοιράζεται σημαντική ομολογία
αλληλουχίας (263, 290) και είναι ο κύριος αποθηκευτικός παράγοντας Ca2+ στο
σαρκοπλασματικό δίκτυο των μυϊκών κυττάρων (291). Εκτός από το Ca2+ η
καλρετικουλίνη είναι σε θέση να δεσμεύει Zn2+ (267, 268) καθώς και Fe και
διάφορα μέταλλα μετάπτωσης τόσο in vivo όσο και in vitro (292).
(ii)
Ένας άλλος σημαντικός ρόλος της καλρετικουλίνης είναι στο έλεγχο του
«διπλώματος» και της συναρμολόγησης των υποομάδων νεοσυντεθέντων
γλυκοπρωτεϊνων στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Η καλρετικουλίνη είναι απαραίτητη
για το σωστό «δίπλωμα» των γλυκοπρωτεϊνων που συντίθονται έτσι ώστε αυτές να
πάρουν τη σωστή διαμόρφωση τους (τριτοταγή δομή) και να ενωθούν
αποτελεσματικά οι διάφορες υπομονάδες τους (τεταρτοταγή δομή). Για το σκοπό
αυτό αλληλεπιδρά με την νεοσυντεθιμένη γλυκοπρωτεΐνη σαν συνοδό μόριο
(molecular chaperone) εμοδίζοντας τη συσσωμάτωση, προλαμβάνοντας την
οξείδωση και τον ολιγομερισμό και καταστέλωντας την αποδομισή της (293-297).
(iii) Στο ανοσολογικό σύστημα η καλρετικουλίνη βοηθά στη δέσμευση του πεπτιδίου
από τα MHC μόρια τάξεως I (Σχήμα 52). Αρχικά η νεοσυντεθιμένη α αλυσίδα
των MHC-I μορίων συνδέεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο με την καλνεξίνη
(calnexin), μια πρωτεΐνη με σημαντική ομολογία πρωτοταγούς δομής με την
καλρετικουλίνη (293). Έπειτα συναρμολογείται το MHC-I μόριο με τη δέσμευση
της β2-μικροσφαιρίνης στην α αλυσίδα του MHC-I και η
καλνεξίνη
αντικαθίσταται από τις πρωτεΐνες καλρετικουλίνη και ταπασίνη (tapasin). Η
καλρετικουλίνη συγκρατεί το MHC-I μόριο στη σωστή διαμόρφωση ενώ η
ταπασίνη ενώνεται με τον μεταφορέα TAP1:TAP2 ο οποίος μεταφέρει πεπτίδια
(που προκύπτουν από πέψη πρωτεϊνών στο πρωτεόσωμα) στο ενδοπλασματικό
δίκτυο. Τελικά με τη βοήθεια της καλρετικουλίνης και της ταπασίνης το πεπτίδιο
τοποθετείται στη κοιλότητα δέσμευσης του MHC-I (Σχήμα 52) (298, 299). Θα
πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι στον ρόλο της αυτό η καλρετικουλίνη έρχεται σε
στενή σχέση με τον μεταφορέα TAP1:TAP2 του οποίου η μετάλλαξη TAP2*Bky2
έχει συσχετισθεί ισχυρά με την ύπαρξη των αντί-Ro60KD αυτοαντισωμάτων
Σχήμα 52. Τα MHC-I μόρια δεσμεύουν το αντιγονικό πεπτίδιο στο ενδοπλασματικό δίκτυο με
τη βοήθεια των πρωτεϊνών καλνεξίνη, καλρετικουλίνη, ταπασίνη και του
μεταφορέα TAP1:TAP2.
(300).
(iv)
Η καλρετικουλίνη έχει ταυτοποιηθεί σαν πρωτεΐνη θερμικού σοκ - στρες και
είναι σε θέση να προλαμβάνει (α) διακυμάνσεις του ενδοκυττάριου Ca2+, (β) το
οξειδωτικό στρες και (γ) τον κυτταρικό θάνατο (301-303).
(v)
Η καλρετικουλίνη έχει ακόμα ταυτοποιηθεί σαν ένα κύριο συστατικό των λυτικών
κοκκίων στα κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα. Πιστεύεται πως ο ρόλος της εκεί
είναι να προλαμβάνει την αυτόλυση αφού η παρουσία Ca2+ ενεργοποιεί διάφορα
ένζυμα (304).
(vi) Εκτός από την παρουσία της καλρετικουλίνης στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στα
λυτικά κοκκία, η καλρετικουλίνη εντοπίζεται και στον πυρήνα των κυττάρων
(305). Εκεί είναι σε θέση να ρυθμίζει την έκφραση διαφόρων γονιδίων (306-309).
Η ρύθμιση αυτή γίνεται με απευθείας ένωση της στο μοτίβο KxFF(K/R)P που
εμπεριέχεται στην περιοχή δέσμευσης του DNA διαφόρων πυρηνικών υποδοχέων
(306, 308).
(vii) Η καλρετικουλίνη εμφανίζει επίσης αντιθρομβωτική και θρομβολυτική δράση.
Έτσι έχει προταθεί η χρήση της, σε συνδυασμό με κάποιον άλλον αντιθρομβωτικό
παράγοντα, ως φάρμακο που προλαμβάνει και παρεμποδίζει την θρόμβωση
(Stern και συν, U.S. Patent 5,426,097, 1995).
(viii) Ένα πεπτιδικό τμήμα της καλρετικουλίνης αποτελεί το συνηθέστερο μόριο του
εαυτού που συνδέεται στη περιοχή δέσμευσης του αντιγόνου των MHC-II μορίων
DR4 (310, 311). Επιπλέον το πεπτίδιο αυτό έχει απομονωθεί και από τα DR4
μόρια Β-λεμφοκυττάρων ασθενούς με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα (312). Για τα
MHC-I μόρια έχει προσδιοριστεί επίσης ένα πεπτιδικό τμήμα από την οδηγό
αλληλουχία (leader sequence) της καλρετικουλίνης, το οποίο συνδέεται ειδικά με
αυτά (313).
(ix) Έχει τέλος δειχθεί ότι η καλρετικουλίνη αλληλεπιδρά με ιικό RNA του ιού της
ερυθράς
και
συγκεκριμένα
με
το
3'
άκρο
του
σχηματίζοντας
ένα
ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο στο οποίο συμμετέχει και η Ro60 πρωτεΐνη
συνδεόμενη στο 5' άκρο του ίδιου ιικού RNA (314, 315). Ο ρόλος και το
παθογονικό
διευκρινιστεί.
δυναμικό
τέτοιων υβριδικών συμπλόκων δεν έχει ακόμα
Δ.II.3 Σχηματισμός των RoRNP συμπλόκων
Τα πλήρη σύμπλοκα Ro RNP βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων (σε 105
αντίγραφα / κύτταρο) όπου και πιθανότατα ασκούν τον λειτουργικό τους ρόλο (215,
316, 317). Τα επιμέρους συστατικά του συμπλόκου ωστόσο, εμφανίζονται και στο
πυρήνα των κυττάρων, οπού φαίνεται να είναι και η θέση σχηματισμού και
συναρμολόγησης του συμπλόκου (Σχήμα 53). Αναλυτικότερα, οι πρωτεΐνες La,
Ro60 και Ro52 συντίθονται στο κυτταρόπλασμα και εν συνεχεία εισάγονται στον
πυρήνα (318). Η είσοδος της La πρωτεΐνης γίνεται με τη βοήθεια του διμερούς
σήματος πυρηνικής εντόπισης που κατέχει. Η Ro60 πρωτεΐνη έχει και αυτή μια
πιθανή διμερή NLS περιοχή η οποία της δίνει τη δυνατότητα να εισαχθεί στον
πυρήνα. Αντίθετα η Ro52 δεν διαθέτει ανάλογη περιοχή κα η είσοδος της στο
πυρήνα πιθανώς να γίνεται με τη βοήθεια της Ro60 πρωτεΐνης (μηχανισμός "piggyback") με την οποία συνδέεται με αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (Σχήμα
53) (222).
Το hY1 RNA παράγεται από την RNA-πολυμεράση III στο πυρήνα και
απελευθερώνεται από το σύμπλοκο μεταγραφής σε σύμπλεξη με τη La πρωτεΐνη
(276, 277, 279). Λόγω της σύνδεσης με τη La πρωτεΐνη, το hY1 RNA παραμένει
προσωρινά στο πυρήνα (319) έως ότου στο σύμπλοκο προστεθούν η Ro60 πρωτεΐνη,
ένας άγνωστος παράγοντας εξόδου και ίσως η Ro52 πρωτεΐνη. Τότε το σύμπλοκο
εξέρχεται από το πυρήνα στο κυτταρόπλασμα μέσο του πυρηνικού πόρου (NPC)
(Σχήμα 53)(320).
Η καλρετικουλίνη κατέχει αλληλουχία σήματος πυρηνικής εντόπισης (NLS) και η
παρουσία της στο πυρήνα των κυττάρων έχει εξακριβωθεί (305). Παραμένει όμως
άγνωστο αν η σύνδεση της στο Ro RNP πραγματοποιείται κατά το σχηματισμό του
τελευταίου στον πυρήνα ή συνδέεται μαζί του μετά από την είσοδο του στο
κυτταρόπλασμα.
Σχήμα 53. Συναρμολόγηση του hY1 Ro-RNP στο κύτταρο.
Δ.ΙΙΙ. ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΚΑΤΑ Ro/SSA ΚΑΙ ΚΑΛΡΕΤΙΚΟΥΛΙΝΗΣ
Δ.IIΙ.1 Τα αυτοαντισώματα αντί-Ro/SSA
Δ.ΙΙΙ.1.1 Ιστορική αναδρομή – Ποσοστά εμφάνισης
Γ ια
πρώτη φορά ο Anderson περιέγραψε το 1961 (321) σε ασθενείς με
σύνδρομο Sjogren την ύπαρξη δύο συστημάτων αντισωμάτων που αντιδρούσαν
με διακριτά αντιγόνα σε μία ποικιλία ανθρώπινων ιστών. Τα αντιγόνα αυτά
ονομάστηκαν SjD και SjT. Μερικά χρόνια αργότερα (το 1969) οι Clarck και
συν. (322) απομόνωσαν ένα πρωτεϊνικό κυτταροπλασματικό αντιγόνο το οποίο
ήταν στόχος αυτοαντισωμάτων σε ασθενείς με ΣΕΛ και ονομάστηκε Ro από τα
αρχικά του αρρώστου στον ορό του οποίου βρέθηκαν αντισώματα κατά του
αντιγόνου αυτού. Μια πενταετία αργότερα περιγράφτηκε και το αντιγόνο La σε
ασθενείς με ΣΕΛ (323). Το 1975 και 1976 οι Asplaugh και συν. (324, 325)
περιέγραψαν σε ασθενείς με σύνδρομο Sjogren τα αυτοαντιγόνα SS-A και SS-B
(Sicca Syndrome antigens A, B), τα οποία αναφέρθηκαν ως ειδικά για το ΣΣ
πυρηνικά αντιγόνα. Η σύγχυση που είχε δημιουργηθεί λόγω της ποικίλης
ονοματολογίας και των φερόμενων διαφορετικών βιοχημικών ιδιοτήτων των
αυτοαντιγόνων αυτών λύθηκε όταν το 1979 αποδείχθηκε με ανταλλαγή ορών
μεταξύ των εργαστηρίων (326) ότι τα
Ro, SS-A και SjT
είναι ταυτόσημα
μεταξύ τους όπως και τα La, SS-B και SjT.
Αυτοαντισώματα κατά του Ro αυτοαντιγόνου ανευρίσκονται κατεξοχήν
σε ασθενείς με ΣΣ ή ΣΕΛ και εμφανίζονται σε αυξημένη συχνότητα σε
ορισμένες υποομάδες των ασθενειών αυτών (πίνακας 8).
Πινακας 8:
Ποσοστά εμφάνισης των αντί-Ro/SSA αντισωμάτων σε Ρευματικές παθήσεις και
τις υποομάδες τους (327).
Πάθηση / Κλινικό σύνδρομο
Ποσοστό εμφάνισης αντίRo/SSA αντισωμάτων
Συνδρομό Sjogren
70-90%
Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος
40-60%
Υποξύς Δερματικός Λύκος
70-90%
Νεογνικός Λύκος
>90%
Ανεπάρκεια των C2, C4
90%
Σκληρόδερμα
15-20%
Ρευματοειδή Αρθρίτιδα
10%
Πολυμυοσίτιδα
<10%
Δ.IIΙ.1.2 Ετερογένεια της αντί-Ro ανοσολογικής απόκρισης
Τα
αντί-Ro
αυτοαντισώματα
χαρακτηρίζονται
από
ποικιλομορφία.
Η
ετρογένεια τους αυτή αντικατοπτρίζει την ετερογένεια στις αντιγονικές μορφές του Ro
αυτοαντιγόνου. Έτσι έχουν αναφερθεί αντί-Ro αυτοαντισώματα που αντιδρούν μόνο
με την φυσική μορφή και όχι με την μετουσιωμένη μορφή της Ro πρωτεΐνης απαιτώντας
ορισμένα διαμορφωτικά χαρακτηριστικά για τη δέσμευση τους (328-331). Μάλιστα
ορισμένα από τα αυτοαντισώματα αυτά αναγνωρίζουν το Ro μόνο όταν βρίσκεται σε
σύμπλεξη με το hY5 RNA (332), ενώ άλλα αναγνωρίζουν μόνο το ολικό σύμπλοκο RoLa RNP χωρίς να αντιδρούν με τις μεμονωμένες επιμέρους πρωτεΐνες του (333). Ακόμα
μία υποκατηγορία των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων που αναγνωρίζει το «φυσικό» Ro
60KD, φέρεται να αντιδρά διασταυρωτά με το μετουσιωμένο Ro 52KD (334).
Με την βοήθεια των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων από ασθενείς με ΣΕΛ και ΣΣ
έχει επίσης δειχθεί ότι είναι δυνατόν να διαχωριστούν αντιγονικά οι μορφές της Ro
60KD πρωτεΐνης που περιέχονται στα λεμφοκύτταρα και στα ερυθροκύτταρα (335,
210), υποδεικνύοντας διαφορές στο Ro αντιγόνο ανάλογα με το είδος του κυττάρου.
Ακόμα διαφορές έχουν παρατηρηθεί στην αντιγονικότητα της Ro πρωτεΐνης ανάλογα
με το ζωικό είδος. Έτσι τα αντί-Ro αυτοαντισώματα που συναντώνται στις αυτοάνοσες
ασθένειες δείχνουν μία προτίμηση για την ανθρώπινη Ro πρωτεΐνη, και αντιδρούν
λιγότερο με τη Ro από άλλα ζωικά είδη όπως τη Ro βοός, ποντικού ή αρουραίου. (194,
336, 337).
Δ.IIΙ.1.3 Γένεση των αυτοαντισωμάτων αντί-Ro
Παρόλο που μέχρι σήμερα έχουν δημοσιευθεί περισσότερες από 1000
ερευνητικές εργασίες με κεντρικό αντικείμενο τα αντί-Ro αυτοαντισώματα, δεν έχει
γίνει ακόμα γνωστός ο μηχανισμός ο οποίος δίνει γένεση στα αντί-Ro αυτοαντισώματα.
Έχουν προταθεί βέβαια διάφορες θεωρίες οι οποίες όμως αδυνατούν από μόνες τους
να εξηγήσουν όλα τα χαρακτηριστικά της αντί-Ro απόκρισης.
Δ.IIΙ.1.3.1 Μοριακή μίμηση με τον ιό της Φυσσαλιδώδους Στοματίτιδας
Η μοριακή μίμηση μεταξύ αυτοαντιγόνων και εξωγενών πρωτεϊνών, συνήθως
βακτηριακής ή ιικής προέλευσης, αποτελεί μια ελκυστική υπόθεση η οποία μπορεί να
εξηγήσει πως γεννιούνται τα αυτοαντισώματα κατά πρωτεϊνών του εαυτού και πώς
διασπάται η ανοσολογική ανοχή με αποτέλεσμα την αυτοάνοση ασθένεια. Κλασσικό
παράδειγμα μοριακής μίμησης είναι αυτό της λοίμωξης με ορισμένα στελέχη
στρεπτόκοκκου. Κατά την λοίμωξη αυτή παράγονται αντισώματα κατά των Μπρωτεϊνών του βακτηριακού τοιχώματος τα οποία, ανάλογα με το στέλεχος, αντιδρούν
διασταυρωτά με τον ανθρώπινο καρδιακό ιστό (την καρδιακή μυοσίνη) ή την βασική
μεμβράνη των νεφρικών σπειραμάτων (την λαμιμίνη και το κολλαγόνο) προκαλώντας
μεταστρεπτοκοκκική ενδοκαρδίτιδα ή σπειραματονεφρίτιδα αντίστοιχα.
Το 1991 οι Scofield και συν (177) χρησιμοποιώντας πρωτεολυτική πέψη βοείου
Ro60KD προσδιόρισε το 13KD καρβοξυτελικό άκρο ως το κυρίως αντιγονικό τμήμα
της πρωτεΐνης. Η αλληλουχία αυτή καλύφθηκε με αλληλοεπικαλυπτόμενα συνθετικά
οκταπεπτίδια, τα οποία εξετάσθηκαν με αυτοάνοσους ορούς, χωρίς ωστόσο να
μπορέσει να προσδιοριστεί ένας κύριος αντιγονικός επίτοπος. Ένα από τα δραστικά
πεπτίδια το EYRKKMDI (485-492) τμήμα του Ro αυτοαντιγόνου βρέθηκε ότι έχει
σημαντική ομολογία αλληλοδιαδοχής με το EYRKKLMD τμήμα της N-πρωτεϊνης του
ιού της Φυσσαλιδώδους Στοματίτιδας (Vesicular Stomatitis Virus: VSV). Σε επόμενη
μελέτη των Scofield και συν βρέθηκε ότι ατιοροί αντί-Ro αναγνωρίζουν τουλάχιστον 19
ομάδες συνθετικών πεπτιδίων σε όλο το μήκος της Ro 60KD πρωτεΐνης. Το 13KD
τμήμα εμπεριείχε 2 από αυτές, συμπεριλαμβανομένων και των ομολόγων με το VSV
πεπτιδίων (338, 339). Από τα παραπάνω δεδομένα προτάθηκε ότι η αυτοάνοση
απόκριση στο Ro/SSA αντιγόνο σχετίζεται με την ιική N-πρωτεϊνη του VSV. Παρόλο
που η πρωτεΐνη αυτή βρέθηκε να αντιδρά με ΣΕΛ όρους (25/80 των ορών) καθώς και
με φυσιολογικούς (16/80 των ορών), έγινε προσπάθεια συσχέτισης μεταξύ των αντί-NVSV-πρωτεΐνης και των αντί-Ro αντισωμάτων (340, 341). Η άποψη αυτή ενισχύθηκε
όταν αρουραίων NZW με την Ν-πρωτεΐνη του VSV οδήγησε σε παραγωγή αντίRo60KD αυτοαντισωμάτων (342). Δικές μας μελέτες ωστόσο (343, βλέπε κεφάλαιο
Ε.II) απέδειξαν ότι ενώ πράγματι υπάρχουν αντί-VSV αντισώματα (σε χαμηλό
ποσοστό) σε ασθενείς με αυτοάνοσες ρευματικές παθήσεις τα αντισώματα αυτά δεν
αντιπροσωπεύουν
παρά
μόνο
μια
περιορισμένη
υποομάδα
των
αντί-Ro
αυτοαντισωμάτων και έτσι είναι μάλλον απίθανο ο ιός της Φυσσαλιδώδους
Στοματίτιδας να ευθύνεται για την αντί-Ro ανοσολογική απόκριση.
Δ.IIΙ.1.3.2 Αλλαγές στην ποσοτική και ποιοτική έκφραση του Ro αντιγόνου λόγω
μόλυνσης με ιό ή κάτω από συνθήκες στρές και ορμονικής διέγερσης
Μία άλλη θεωρία που έχει προταθεί για να εξηγήσει την δημιουργία των αντίRo/SSA αυτοαντισωμάτων στηρίζεται στο γεγονός ότι όταν κυτταρικές σειρές
μολυνθούν με ιό, ακτινοβοληθούν με υπεριώδη ακτινοβολία ή βρεθούν κάτω από
περιβάλλον ορμονικής διέγερσης με β-οιστραδιόλη παρουσιάζουν μια υπερέκφραση
της Ro πρωτεΐνης καθώς και μία επανακατανομή της από τον πυρήνα προς την
μεμβράνη. Οι παρατηρήσεις αυτές όταν συνδυαστούν με τις θεωρίες για ιογενή
προέλευση των αυτοάνοσων ασθενειών καθώς και με το γεγονός ότι τα αντί-Ro
αυτοαντισώματα εμφανίζονται σε αυξημένη συχνότητα στον Υποξύ Δερματικό Λύκο
(όπου η ηλιακή ακτινοβολία παίζει κάποιο ρόλο) και σε γυναίκες (όπου η βοιστραδιόλη είναι αυξημένη), ίσως να μπορούν να προσφέρουν μια ικανοποιητική
εξήγηση για την εμφάνιση της αυτοανοσίας. Είναι πιθανό μάλιστα να απαιτείται
ταυτόχρονη δράση περισσότερων του ενός παραγόντων για την διάσπαση της
ανοσολογικής ανοχής και την αυτοάνοση αντίδραση.
(i) Δράση ιών: Μόλυνση ανθρωπίνων κερατινοκυττάρων με τον κυτταρομεγαλοϊό
(CMV) οδήγησε σε υπερέκφραση της Ro πρωτεΐνης και επανακατανομή της από
τον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα προς την κυτταρική μεμβράνη (344).
Επανακατανομή της Ro πρωτεΐνης βρέθηκε να συμβαίνει και έπειτα από μόλυνση
με ιό Toga (345). Τέλος σε μία ενδιαφέρουσα μελέτη των Rosen και συν (127)
βρέθηκε ότι απόπτωση κυττάρων οφειλόμενη σε μόλυνση με ιό Sindbis προκαλεί
την δημιουργία υποκυτταρικών πακέτων με υψηλή συγκέντρωση αυτοαντιγόνων,
ιικών σωματιδίων και ιικών γλυκοπρωτεϊνων τα οποία σχηματίζουν εν συνεχεία
μεμβρανικές φυσαλίδες με την παραπάνω σύνθεση. Οι δομές αυτές περιέχουν ένα
μίγμα ξένων αντιγόνων και αυτοαντιγόνων το οποίο ίσως να μπορεί να διασπάσει
την ανοσολογική ανοχή.
(ii) Υπεριώδης ακτινοβολία: Είναι από καιρό γνωστό ότι η ηλιακή ακτινοβολία μπορεί
να προκαλέσει εξάρσεις του ΣΕΛ, όπως και το ότι τα αντί-Ro αντισώματα
βρίσκονται σε ιδιαίτερα υψηλό ποσοστό στον Υποξύ Δερματικό Λύκο. Μία σειρά
μελετών έχει αποδείξει ότι η UVB ακτινοβολία επάγει την υπερέκφραση της Ro
πρωτεΐνης καθώς και την μεμβρανική επανακατανομή της (346-349). Μάλιστα σε
μία μελέτη των Casciola-Rosen LA και συν. βρέθηκε ότι απόπτωση κύτταρων
οφειλόμενη σε ακτινοβόληση με UVB προκαλεί την δημιουργία δύο διακριτών
πληθυσμών υποκυτταρικών μεμβρανικών δομών (φυσαλίδων) που εμπεριέχουν την
Ro πρωτεΐνη σε υψηλή συγκέντρωση και μπορούν να την κάνουν διαθέσιμη στο
ανοσολογικό
σύστημα
(128).
Επιπρόσθετα
οι
δομές
που
εμπεριέχουν
κυτταροπλασματικό Ro αντιγόνο και RNA εμφανίζονται από τα αρχικά στάδια της
απόπτωσης και μεταφέρονται στην κυτταρική μεμβράνη, ενώ οι δομές που
περιέχουν πυρηνικό Ro, La, snRNPs και DNA εμφανίζονται σε μετέπειτα στάδια
(128).
(iii) Β-οιστραδιόλη: Οι αυτοάνοσες ασθένειες όπου εμφανίζονται τα αντί-Ro
αυτοντισώματα (ΣΕΛ,ΣΣ) απαντώνται πολύ συχνότερα σε γυναίκες παρά σε
άνδρες, υποδηλώνοντας κάποια ορμονική εξάρτηση. Μία σειρά μελετών έχει
δείξει ότι η β-οιστραδιόλη μπορεί να προκαλέσει υπερέκφραση και μεμβρανική
επανακατανομή της Ro πρωτεΐνης (350-353).
(iv) Άλλοι παράγοντες: Εκτός από τους παράγοντες που αναφέραμε, διάφοροι άλλοι
παράγοντες που προκαλούν καταστάσεις στρές στα κύτταρα, μπορούν να επάγουν
την έκφραση του Ro/SSA αυτοαντιγόνου. Έτσι έχει βρεθεί ότι επώαση κυττάρων
με την κυτταροτοξική προσταγλαδίνη 12-PGJ2 επάγει τόσο την παραγωγή
πρωτεΐνης θερμικού στρες HSP72 όσο και την παραγωγή Ro/SSA κερατινοκύτταρα
(354).
Δ.IIΙ.1.3.3 Τα αντί-Ro/SSA αυτοαντισώματα σαν αντί-ιδιότυποι των αντί-DNA
αυτοαντισωμάτων
Το 1988
οι
Medlovic
και συν
πέτυχαν
την επαγωγή
πειραματικού
Ερυθηματώδους Λύκου σε ποντίκια χρησιμοποιώντας ένα ιδιότυπο ενός αντί-DNA
αντισώματος (355). Τα πειραματόζωα εμφάνισαν αυτοαντισώματα κατά του Ro/SSA
και άλλων αυτοαντιγόνων, καθώς και κλινικές εκδηλώσεις του ΣΕΛ όπως λευκοπενία,
πρωτεϊνουρία και νεφρική βλάβη (356-358). Η νόσος μάλιστα βρέθηκε να εμφανίζεται
εντονότερα όταν στα πειραματόζωα χορηγούνταν οιστρογόνα ενώ περιοριζόταν μόνο
στην ύπαρξη αυτοαντισωμάτων χωρίς κλινικές εκδηλώσεις όταν χορηγούνταν
τεστοστερόνη (359). Επιπλέον οι γόνοι των ποντικών αυτών εμφάνισαν συμπτώματα
Νεογνικού Λύκου με μεταφορά αυτοαντισωμάτων αντί-Ro/SSA στο νεογνό και
καρδιακές διαταραχές αγωγιμότητας (360, 361).
Από την άλλη πλευρά το 1986 έγινε γνωστή η ικανότητα ορισμένων αντί-Ro
αυτοαντισωμάτων να αντιδρούν με το Fab τμήμα ανοσοσφαιρινών τάξεως IgG (362),
υποδεικνύοντας ένα ρόλο τους σαν αντί-ιδιοτυπικά αντισώματα. Το 1996 σε μία
ενδιαφέρουσα μελέτη των Zhand και Reiclin βρέθηκε μια υποομάδα των αντί-Ro
αυτοαντισωμάτων που αντιδρά με τα αντί-DNA αυτοαντισώματα. Τα αντί-Ro αυτά
αντισώματα είναι ουσιαστικά αντί-ιδιοτυπικά αντισώματα ενάντια σε ιδιότυπους των
αντί-dsDNA αντισωμάτων (363). Το εύρημα αυτό θα μπορούσε πιθανόν να εξηγήσει
την εμφάνιση των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων μετά από ανοσοποίηση με ιδιότυπο αντίDNA αντισώματος που παρατήρησαν οι Mendlovic και συν και να υποδείξει κάποιο
παθογενετικό μηχανισμό.
Ο ρόλος των αυτοαντισωμάτων αυτών στην παθογένεση της αυτοάνοσης νόσου ή
στην πιθανή ανοσορυθμισή της μέσα από ένα ιδιοτυπικό-αντιιδιοτυπικό πλέγμα (βλέπε
κεφάλαιο Β.I.2.4, Σχήμα 26) δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί.
Δ.IIΙ.1.3.4 Τα αντί-Ro αυτοαντισώματα σαν αντί-HLA αυτοαντισώματα
Η ύπαρξη των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων έχει συσχετιστεί σε μια σειρά μελετών
με συγκεκριμένους HLA απλότυπους του Μεγίστου Συμπλέγματος Ιστοσυμβατότητας
(MHC). Τα αντί-Ro αυτοαντισώματα συσχετίζονται κυρίως (i) με τον HLA-DR3
απλότυπο τόσο σε ασθενείς με ΣΣ (364-370) όσο σε ασθενείς με ΣΕΛ (371-378) και (ii)
με τους DRw52/DRw53 απλότυπους σε ασθενείς με ΣΣ (379-382) και ΣΕΛ (383-385).
Επίσης έχουν αναφερθεί σε κάποιες μελέτες και επιπλέον συσχετίσεις των αντί-Ro (i)
με ετεροζυγωτισμό DQ1/DQ2 στον ΣΕΛ (386-388) και στο ΣΣ (389), (ii) με τον
απλότυπο DQ2 στον ΣΕΛ (372, 364, 383, 385) και (iii) με τον απλότυπο DR4 στην
Ρευματοειδή Αρθρίτιδα (ΡΑ) (390). Από τις συσχετίσεις αυτές ισχυρότερες και γενικά
αποδεκτές είναι αυτές μεταξύ των αντί-Ro και των HLA DR3 και DRw52/DRw53.
Κατά την αντιγονική χαρτογράφιση του Ro αντιγόνου που έγινε στο εργαστήριο
μας (183, βλέπε κεφάλαιο Ε.III) προσδιορίστηκαν δύο κύριοι επίτοποι-στόχοι των αντίRo αυτοαντισωμάτων, ο ένας εκ των οποίων (NGWSHKDLLR) παρουσιάζει ομολογία
της τάξεως του 70% με την περιοχή 63-72 της β-αλυσίδας του μεγίστου συμπλέγματος
ιστοσυμβατότητας.
Η ομολογία αυτή εντοπίσθηκε κυρίως στα αλληλόμορφα των απλοτύπων DR3
και DRw53, οι οποίοι συσχετίζονται ισχυρά με την αντί-Ro απόκριση, ενώ σε
μικρότερο ποσοστό βρέθηκε σε αλληλόμορφα των απλοτύπων DR1,DR4 και DRw52
(Πίνακας 9)
Πινακας 9: Ποσοστό HLA αλληλόμορφων, που κατέχουν ομόλογη περιοχή (63-72 β-αλυσίδας)
με τον επίτοπο 175-184 της Ro πρωτεϊνης, για κάθε DR απλότυπο.
Απλότυπος
Ποσοστό
Απλότυπος
Ποσοστό
DR1
75%
DR8
-
DR2
9%
DR9
-
DR3
100%
DR10
-
DR4
74%
DRw52
DR5
25%
DRw53
100% Å
DR6
10%
DRw15
-
DR7
-
DRw16
-
Å
50%
Επιπλέον τα αντί-Ro αντισώματα βρέθηκαν να αντιδρούν με πεπτιδικά ανάλογα
της περιοχής 59-77 της β-αλυσίδας του MHC στους ομόλογους απλοτύπους (DR1, DR3
και DRw53), ενώ πεπτιδικά ανάλογα της ίδιας περιοχής σε μή ομόλογους απλοτύπους
(DR5, DQ2 και DQw6) δεν ήταν δραστικά (391, βλέπε κεφάλαιο Ε.IV)
Η περιοχή 63-72 του MHC-II είναι η πλέον εκτεθειμένη περιοχή του MHC στα
αντισώματα, όπως φαίνεται από ανάλυση της δομής του ομοδιμερούς HLA-DR1 με
κρυσταλλογραφία ακτινών Χ (Σχήμα 54)(392). Μετάλλαξη στην περιοχή αυτή στα
ποντίκια NZB-H-2, που αφορά τα αμινοξέα 67,70 και 71 και είναι γνωστή σαν η
μετάλλαξη bm12 (393), προκαλεί εμφάνιση αυτοανοσίας με υψηλούς τίτλους
αυτοαντισωμάτων αντί-DNA και πρωτεϊνουρίας (394).
Τα αντί-Ro αυτοαντισώματα , εφόσον αντιδρούν διασταυρωτά με τα μόρια του
MHC, μπορούν θεωρητικά να έχουν παθογενετικό χαρακτήρα αφού είναι γνωστό ότι
διμερισμός - πολυμερισμός μορίων ιστοσυμβατότητας τάξεως II μέσω αντισωμάτων
προκαλεί ενεργοποίηση των μακροφάγων, των Β-λεμφοκυττάρων και των Τλεμφοκυττάρων που τα εκφράζουν (395-398). Η σύζευξη αυτή μάλιστα, όταν
Σχήμα 54. Η περιοχή 63-72 της β-αλυσίδας του διμερούς HLA-II είναι
εκτεθιμένη στη επιφάνεια του μορίου (220).
συνδυαστεί με τις κατάλληλες ιντερλευκίνες, μπορεί εκτός από ενεργοποίηση να
προκαλέσει κλωνικό πολλαπλασιασμό των Β-λεμφοκυττάρων και διαφοροποίηση τους
σε πλασματοκύτταρα με επακόλουθη έκκριση IgG (399). Επίσης ο διμερισμός –
πολυμερισμός των αντιγόνων ιστοσυμβατότητας τάξεως II είναι ο μηχανισμός με τον
οποίο δρουν ορισμένα υπεραντιγόνα όπως η σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Α και το
μιτογόνο του μυκοπλάσματος Arthritidis (400, 401).
Δ.ΙΙΙ.1.4 Μοριακή δομή των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων
Πληροφορίες για την μοριακή δομή των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων και για τα
γονίδια που τα κωδικοποιούν δίνονται σε μια πρόσφατη μελέτη των Suzuki και συν
(402). Στη μελέτη αυτή κλωνοποιήθηκαν ανθρώπινα αντί-Ro/SSA αυτοαντισώματα από
το mRNA τους σε βιοψία χείλους ασθενών με ΣΣ. Τα αυτοαντισώματα αυτά βρέθηκαν
να κατέχουν υψηλό αριθμό σωματικών μεταλλάξεων που έχουν επέλθει για να αυξηθεί
η συγγένεια τους προς το αντιγόνο όπως συμβαίνει στις οδηγούμενες από το αντιγόνο
ανοσολογικές απαντήσεις. Τα γονίδια που τα κωδικοποιούν βρέθηκαν να είναι το
Dp73/VH251 της οικογένειας VH5 για την βαριά αλυσίδα και το L6/Vg της
οικογένειας κ3 για την ελαφριά αλυσίδα για τα 2 από τα 3 κλωνοποιημένα αντί-Ro
αυτοαντισώματα.
Επίσης
προσδιορίστηκαν
οι
αλληλουχίες
αμινοξέων
στις
υπερμεταβλητές περιοχές δέσμευσης του αντιγόνου της βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας
(402).
Δ.IIΙ.1.5 Κλινικές συσχετίσεις των αυτοαντισωμάτων αντί-Ro
Η παρουσία αντί-Ro αντισώματος συνδέεται με ορισμένα ειδικά κλινικά
σύνδρομα (i) στο ΣΕΛ συνδέεται με τον Νεογνικό Λύκο και το Συγγενές έμφραγμά του
μυοκαρδίου, με τον Υποξύ Δερματικό Λύκο, με τον ΑΝΑ αρνητικό Λύκο και με
ορισμένες ανοσοανεπάρκειες του συμπληρώματος, (ii) στο ΣΣ συσχετίζεται με κλινικές
εκδηλώσεις όπως με δακτυλιοειδές ερύθημα και δερματικές αγγειίτιδες, με
υπεργαμασφαιριναιμία, με κρυοσφαιριναιμία και με θετικό ρευματοειδή παράγοντα
και (iii) στη ΡΑ συνδέεται με δερματικές εκδηλώσεις , αγγειίτιδα, αυξημένη συχνότητα
δευτεροπαθούς ΣΣ και με παρενέργειες στη θεραπεία με πενικιλλαμίνη.
Δ.IIΙ.1.5.1 Συσχετίσεις στον Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο
(i) Νεογνικός Λύκος
Δεν υπάρχει ίσως πιο σίγουρη κλινική συσχέτιση των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων
από αυτή με τον Νεογνικό Λύκο , όπου τα αντί-Ro αυτοαντισώματα φαίνεται να έχουν
παθογενετικό χαρακτήρα. Περισσότερες από 50 μελέτες ταυτοποιούν τη σύνδεση αυτή
(331, 403-454).
Το σύνδρομο του Νεογνικού Λύκου είναι ένα σπάνιο σύνδρομο. Η συχνότητα
εμφάνισης του ποικίλει από 1:2500-1:20000 γεννήσεις (377). Τα νεογνά που πάσχουν
έχουν υγιή πατέρα, αλλά οι μητέρες τους σχεδόν πάντα (90-100%) εμφανίζουν ΣΕΛ ή
κάποια άλλη αυτοάνοση πάθηση η οποία συνοδεύεται από αντί-Ro αυτοαντισώματα
(329, 330). Τα αυτοαντισώματα αυτά διέρχονται τον πλακούντα και ανιχνεύονται στα
νεογνά μέχρι τον έκτο μήνα οπότε εξαφανίζονται εφόσον βέβαια το βρέφος επιζήσει
(331, 332).
Οι
βλάβες
που
παρουσιάζονται
μπορεί
να
είναι
δερματικές
όπως
φωτοευαισθησία και δακτυλιοειδές εξάνθημα ή καρδιακές, οι οποίες είναι και οι πιο
σοβαρές. Οι καρδιακές βλάβες περιλαμβάνουν από διαταραχές της αγωγιμότητας έως
συγγενές έμφραγμα του μυοκαρδίου, το οποίο συνήθως είναι θανατηφόρο για το
νεογνό.
Το Ro αντιγόνο εκφράζεται στα κύτταρα του μυοκαρδίου και στο καρδιακό
σύστημα αγωγιμότητας (455). Εναπόθεση αυτοαντισωμάτων στη καρδιά νεογνών με
νεογνικό λύκο και πλήρη κολποκοιλιακό αποκλεισμό έχει καταγραφεί (456-458), ενώ
έγινε δυνατή η έκλουση ειδικών αντί-Ro αυτοαντισωμάτων για την «φυσική» Ro 60KD
πρωτεΐνη από την καρδία ενός παιδιού που πέθανε από τον ίδιο λόγο (331).
Λεπτομερέστερες μελέτες απέδειξαν ότι αντί-Ro αυτοαντισώματα από μητέρες
παιδιών με Νεογνικό Λύκο δεσμεύονται ειδικά στην καρδιά νεογνών κουνελιών (αλλά
όχι στην καρδιά ενηλίκων κουνελιών), αναστέλλοντας μερικώς την επαναπόλωση και
μεταβάλλοντας
το δυναμικό ενέργειας στα κύτταρα του καρδιακού συστήματος
αγωγιμότητας (403, 404). Ακόμα οι διαταραχές αγωγιμότητας στη καρδιά κουνελιών
βρέθηκαν να προκαλούνται ειδικά από τα αντί-Ro αυτοαντισώματα και όχι από άλλα
αυτοαντισώματα όπως τα αντί-RNP (420).
Από τα παραπάνω είναι εμφανής η ενοχοποίηση των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων
για την καρδιακή προσβολή στον Νεογνικό Λύκο. Επειδή όμως μόνο ένα 2-5% των
γυναικών με αυτοάνοση νόσο και αντί-Ro αυτοαντισώματα τελικά καταλήγει να
αποκτά παιδί με πλήρη κολποκοιλιακό αποκλεισμό (331), έχει δειχτεί η αναγκαιότητα
συνύπαρξης και άλλων παραγόντων. Ένας τέτοιος παράγοντας είναι το HLA-DR3, η
ύπαρξη του οποίου έχει συσχετισθεί ισχυρά με το συγγενές έμφραγμα του μυοκαρδίου
και έχει βρεθεί σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις
συγγενούς εμφράγματος του
μυοκαρδίου που έχουν εξετασθεί για αντιγόνα ιστοσυμβατότητας (368, 447, 374, 377,
413).
(ii) Υποξύς Δερματικός Λύκος
Ο Υποξύς Δερματικός Λύκος, αποτελεί μια κλινική ομάδα με
δερματικές
εκδηλώσεις και ήπια κλινική εικόνα με χαμηλή συχνότητα προσβολής των νεφρών και
του κεντρικού νευρικού συστήματος. Η συσχέτιση της κλινικής αυτής οντότητας με τα
αντί-Ro αυτοαντισώματα έχει επαρκώς καταδειχθεί (459-472).
Το Ro αντιγόνο εκφράζεται στα κύτταρα της ανθρώπινης επιδερμίδας (473,
474). Όταν ανθρώπινο δέρμα μεταμοσχευτεί σε ποντίκια και ενεθούν αντί-Ro
αυτοαντισώματα παρατηρείται εκλεκτική εναπόθεση των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων
στο μόσχευμα με ιστολογική εικόνα ταυτόσημη με αυτή που παρατηρείται σε ασθενείς
με Υποξύ Δερματικό Λύκο (475, 476). Η εναπόθεση αυτή δεν είναι εφικτή με άλλα
αυτοαντισώματα όπως τα αντί-DNA (476). Πρέπει επίσης να σημειώσουμε ότι στην
παθογένεια της νόσου πρέπει να ενέχονται και συμπαράγοντες όπως η UV
ακτινοβολία η οποία επάγει υπερέκφραση και μεμβρανική επανακατανομή της Ro
πρωτεΐνης στα κύτταρα της επιδερμίδας (128, 346-349) και ορμονικοί παράγοντες
όπως η β-οιστραδιόλη η οποία ευοδώνει την δέσμευση αντί-Ro αυτοαντισωμάτων στην
επιφάνεια των κερατινοκυττάρων, δέσμευση η οποία μάλιστα αναστέλλεται από αντίοιστρογόνα (350). Τέλος οι γενετικές συσχετίσεις όπως και στο ΣΕΛ είναι κυρίως με το
HLA-DR3 (378).
(iii) ΑΝΑ-αρνητικός Λύκος
Την ομάδα του ΑΝΑ αρνητικού Λύκου απαρτίζουν ασθενείς με ΣΕΛ που
χαρακτηριστικά τους είναι η αρνητική εξέταση για αντιπυρηνικά αντισώματα με τη
μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού (477). Τα κύρια κλινικά ευρήματα σ’ αυτή την
ομάδα είναι η φωτοευαισθησία και το διάχυτο ερυθηματώδες εξάνθημα, ενώ η
προσβολή άλλων οργάνων – συστημάτων είναι χαμηλή. Στην ομάδα αυτή τα αντί-Ro
αυτοαντισώματα ανιχνεύονται σε υψηλό ποσοστό.
Το Ro αυτοαντιγόνο βρίσκεται στα κύτταρα σε χαμηλή συγκέντρωση η οποία
είναι 100 φορές χαμηλότερη από αυτή της πρωτεΐνης La (< 100000 αντίγραφα /
κύτταρο) και για αυτό η ανίχνευση των αντί-Ro αντισωμάτων είναι δυσκολότερη από
άλλων αυτοαντισωμάτων, όταν χρησιμοποιούνται κύτταρα σαν υπόστρωμα στην
τεχνική ανίχνευσης (π.χ. στον έμμεσο ανοσοφθορισμό). Η αρνητική εξέταση για αντίπυρηνικά αντισώματα με έμμεσο ανοσοφθορισμό πιθανόν να δικαιολογείται από το
γεγονός αυτό, όταν τα αντί-Ro είναι τα μοναδικά αυτοαντισώματα στον ορό του
ασθενή. Όταν στη ίδια εξέταση χρησιμοποιηθούν κυτταρικές σειρές που είναι πιο
«πλούσιες» στη Ro πρωτεΐνη, όπως γενετικά μετασχηματισμένες σειρές HEP-2
κυττάρων που την υπερεκφράζουν, τότε οι περισσότερες περιπτώσεις ΑΝΑ αρνητικού
Λύκου τελικά βρίσκονται ΑΝΑ θετικοί (478-480).
(iv) Ανοσοανεπάρκειες συμπληρώματος
Οι ανοσοανεπάρκειες του συμπληρώματος μπορεί να συνοδεύουν ΣΕΛ ή
παρόμοιο σύνδρομα. Οι ανοσοανεπάρκειές αφορούν κυρίως την κλασσική οδό
ενεργοποίησης του συμπληρώματος και κυρίως τα συστατικά C2 και C4. Η κλινική
εικόνα διαφέρει από αυτή του κλασσικού ΣΕΛ. Υπάρχει αυξημένη συχνότητα
δερματικής προσβολής, χαμηλή συχνότητα νεφρικής προσβολής, χαμηλά ή απόντα αντίDNA αυτοαντισώματα και αυξημένα επίπεδα αντί-Ro αυτοαντισωμάτων (481, 482). Τα
αντί-Ro αυτοαντισώματα στον ΣΕΛ έχουν συσχετισθεί με την ανοσοανεπάρκεια των
C2 και C4 συστατικών του συμπληρώματος σε αρκετές μελέτες (483-487).
Δ.IIΙ.1.5.2 Συσχετίσεις στο Σύνδρομο Sjogren
Στο σύνδρομο Sjogren οι ασθενείς που είναι θετικοί για αντί-Ro ή/και αντί-La
αυτοαντισώματα
παρουσιάζουν σε αυξημένη συχνότητα ορισμένα κλινικά και
εργαστηριακά ευρήματα. Τα ευρήματα αυτά είναι το δακτυλιοειδές ερύθημα (488-490)
και άλλες δερματικές αγγειίτιδες (442, 491, 492), η υπεργαμασφαιριναιμία, η
κρυοσφαιριναιμία, η υπολευκοκυτταραιμία και ο θετικός ρευματοειδής παράγοντας
(493-495).
Δ.IIΙ.1.5.3 Συσχετίσεις Ρευματοειδή Αρθρίτιδα
Στη ΡΑ οι ασθενείς με αυτοαντισώματα αντί-Ro/SSA έχουν ορισμένα κοινά
χαρακτηριστικά. Καταρχήν οι ασθενείς αυτές είναι σχεδόν αποκλειστικά γυναίκες ενώ
στη ΡΑ η αναλογία των γυναικών προς άνδρες είναι 3:1 (496, 497). Όσον αφορά την
κλινική εικόνα, οι ασθενείς αυτοί σε αυξημένη συχνότητα εμφανίζουν δερματικές
εκδηλώσεις (498), δευτεροπαθές σύνδρομο ΣΣ και παρενέργειες στη θεραπεία με Dπενικιλλαμίνη (496, 497, 499-501). Από μελέτες της ερευνητικής ομάδας του καθηγητή
Χ. Μ. Μουτσόπουλου δείχθηκε ότι τα αντί-Ro αυτοαντισώματα μπορούν να
χρησιμοποιηθούν σαν προγνωστικός δείκτης δυσανεξίας στη D-πενικιλλαμίνη (500,
501).
Δ.IIΙ.2 Τα αυτοαντισώματα αντί-καλρετικουλίνης
Δ.ΙΙΙ.2.1 Ιστορική αναδρομή – Ποσοστά εμφάνισης
Το
1988 από τους
Lieu, Sontheimer και συν απομονώθηκε από Wil-2
λεμφοκυτταρική σειρά μια 60KD πρωτεΐνη που αντιδρούσε με αντί-Ro θετικούς ορούς
ασθενών με ΣΣ, ΣΕΛ, Υποξύ Δερματικό Λύκο, και Νεογνικό Λύκο τόσο σε ELISA όσο
και σε ανοσοαποτύπωση. Η πρωτεΐνη αυτή θεωρήθηκε ότι ήταν η Ro 60KD πρωτεΐνη
και προσδιορίστηκε η αλληλουχία ενός πεπτιδίου στο αμινοτελικό της άκρο που ήταν
στόχος των αυτοαντισωμάτων (πίνακας 10)(502, 198, 199). Ωστόσο όταν το c-DNA που
κωδικοποιούσε την πρωτεΐνη αυτή απομονώθηκε (503, 179), διαπιστώθηκε ότι
επρόκειτο για την ανθρώπινη καλρετικουλίνη, μια πρωτεΐνη που δεσμεύει το ασβέστιο
και είχε ήδη κλωνοποιηθεί (263, 264).
Πινακάς 10: Ποσοστά εμφάνισης των αντισωμάτων κατά του αμινοτελικού επιτόπου
της καλρετικουλίνης (333).
Πάθηση / Κλινικό Σύνδρομο
Ποσοστό εμφάνισης
Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος
38%
Νεογνικός Λύκος
50%
Σύνδρομο Sjogren
36%
Έτσι δείχθηκε ότι η καλρετικουλίνη δεν είναι το πραγματικό Ro60KD
αυτοαντιγόνο (201, 202) το οποίο εξάλλου είχε ήδη απομονωθεί και κλωνοποιηθεί
(219, 220). Νεότερες μελέτες υποστηρίζουν την συμμετοχή της καλρετικουλίνης σαν
ανεξάρτητο - από τη Ro 60KD πρωτεΐνη - παράγοντα στο συνολικό Ro
ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο (192, 193, 203) δικαιολογώντας έτσι την ύπαρξη
αυτοαντισωμάτων κατά αυτής. Επιπρόσθετα η καλρετικουλίνη φαίνεται να δεσμεύεται
στο 3΄ άκρο του ιικού RNA του ιού της ερυθράς, ταυτόχρονα με τη Ro 60KD πρωτεΐνη
η οποία δεσμεύεται στο 5΄ άκρο (314, 315). Έτσι δημιουργείται ένα υβριδικό
ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο από ιικό RNA και πρωτεΐνες του εαυτού, το οποίο
θα μπορούσε να επάγει την παραγωγή αυτοαντισωμάτων διασπώντας την ανοσολογική
ανοχή. Τα αυτοαντισώματα κατά της καλρετικουλίνης (201, 202) και του συνθετικού
πεπτιδικού αναλόγου του αμινοτελικού της άκρου (504, 502, 198, 199) αποτελούν μία
διακριτή, από τα αντί-Ro 60KD, κατηγορία αυτοαντισωμάτων που ανιχνευόνται σε
ασθενείς με ΣΕΛ, ΣΣ και ΡΑ.
Δ.IIΙ.2.2 Γένεση των αυτοαντισωμάτων αντί-καλρετικουλίνης
Για την δημιουργία των αυτοαντισωμάτων που στρέφονται κατά της
καλρετικουλίνης δεν έχει δοθεί μέχρι σήμερα ικανοποιητική εξήγηση. Οι
μηχανισμοί που έχουν προταθεί για να εξηγήσουν την ύπαρξη των
αυτοαντισωμάτων αυτών είναι οι εξής:
Δ.IIΙ.2.2.1 Μοριακή μίμιση
Η καλρετικουλίνη έχει αξιοσημείωτη ομολογία με το αντιγόνο λRAL-1 του
νηματώδους παρασίτου Onchocerca Volvulus που είναι αιτιολογικός παράγοντας της
onchorciasis (river blindness) (200, 179). Ασθενείς με ochocerciasis εμφανίζουν σε
υψηλό ποσοστό αυτοαντισώματα κατά της καλρετικουλίνης (505, 506, 201). Τα
αυτοαντισώματα αυτά είναι αντισώματα που πρωταρχικά στρέφονται κατά του RAL-1
αντιγόνου του παρασίτου και αντιδρούν διασταυρωτά με την καλρετικουλίνη. Σε μία
μελέτη των Lux και συν (507) βρέθηκε ότι 20 από τους 22 ασθενείς με onchocerciasis
είχαν αντισώματα κατά της καλρετικουλίνης ενώ κάποιοι από τους ορούς των ασθενών
αυτών ήταν σε θέση να ανοσοκαταβυθίζουν hYRNAs. Επιπλέον μονοκλωνικό
αντίσωμα κατά του μικροοργανισμού Onchocerca
Volvulus αναγνώριζε
την
καλετικουλίνη.
Στους ασθενείς με ΣΕΛ, όπως αναφέραμε, συχνά εμφανίζονται αυτοαντισώματα
κατά της καλρετικουλίνης (179, 202, 504) και έχει υποτεθεί οτί πιθανόν για αυτά να
ευθύνεται το νηματόζωο Onchocerca Volvulus (507). Ωστόσο, η κλινική και ιστολογική
εικόνα της onchocerciasis δεν έχει περιγραφτεί ποτέ σε ασθενείς με ΣΕΛ. Το μόνο
κοινό που φαίνεται να έχει η onchocerciasis με τον ΣΕΛ είναι η συσχέτιση της με τα
HLA-DRw52 αντιγόνα ιστοσυμβατότητας τάξεως II (508), αντιγόνα τα οποία έχουν
συσχετισθεί με τον ΣΕΛ και την ύπαρξη των αυτοαντισωμάτων αντί-Ro/SSA (383-385).
Στο ίδιο πλαίσιο, της μοριακής μίμησης, έχει αναφερθεί και διασταυρωτή
αντίδραση μεταξύ αντιγόνου του σχιστοσώματος Mansoni και της καλρετικουλίνης
λόγω της ομολογίας που υπάρχει μεταξύ των δύο αντιγόνων (52%) (509). Η
διασταυρούμενη αυτή αντίδραση δεν έχει περαιτέρω μελετηθεί.
Γ.II.3.2.2 Αλλαγές στην ποσοτική και ποιοτική έκφραση της καλρετικουλίνης κάτω
από συνθήκες στρές
Μια άλλη θεωρία που θα μπορούσε να εξηγήσει την εμφάνιση των
αυτοαντισωμάτων κατά της καλρετικουλίνης, στηρίζεται στο ότι κυτταρικές σειρές
που ακτινοβολούνται, μολύνονται με ιό ή υποβάλλονται σε θερμικό σοκ,
παρουσιάζουν μία υπερέκφραση της καλρετικουλίνης τόσο στο κυτταρόπλασμα,
όσο και στη κυτταρική μεμβράνη, γεγονός που θα μπορούσε να οδηγήσει στη
γένεση των αυτοαντισωμάτων κατά της καλρετικουλίνης.
(i)
Δράση ιών: Σε μία μελέτη των Zhu και συν χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα συνδετικού
ιστού τα οποία μολύνθηκαν με τον κυτταρομεγαλοϊό (CMV). Η μόλυνση αυτή
οδήγησε σε επαγωγή της έκφρασης της καλρετικουλίνης καθώς και αντιγόνων
ιστοσυμβατότητας τάξεως I (510).
(ii)
Υπεριώδης ακτινοβολία: Το 1994 σε δύο μελέτες των Kawashima, Sontheimeir και
συν (511, 512) βρέθηκε ότι ακτινοβόληση επιδερμικών κερατινοκυττάρων
προκαλεί υπερέκφραση της καλρετικουλίνης στο κύτταρο και μεμβρανική
επανακατονομή της. Η καλρετικουλίνη μάλιστα υπερεκφράζεται σε βαθμό
μεγαλύτερο από ότι τα Ro 60KD και Ro 52 KD αντιγόνα. Έτσι υποστηρίχθηκε
πώς η καλρετικουλίνη είναι ένα ιδιαίτερα σημαντικό συστατικό στοιχείο
του
ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου Ro RNP, που θα μπορούσε να εμπλέκεται
στη παθογένεση των σχετιζόμενων με τα αντί-Ro δερματικών εκδηλώσεων
φωτοευαισθησίας που απαντώνται στον Ερυθηματώδη Λύκο.
(iii) Παράγοντες που προκαλούν στρές: Η καλρετικουλίνη υπερεκφράζεται στη
κυτταρική σειρά Α431 (επιδερμοειδούς καρκίνου) όταν χρησιμοποιηθούν
παράγοντες που προκαλούν στρες, όπως θερμικό σοκ, βαριά μέταλλα
(ψευδάργυρος και κάδμιο) και το ασβέστιο (513). Επιπλέον έχει υποστηριχτεί ότι
η ίδια η καλρετικουλίνη είναι μια πρωτεΐνη θερμικού σοκ (263) και σαν τέτοια θα
μπορούσε να έχει ενεργό ρόλο στη παθογένεση της αυτοανοσίας (514).
Δ.IIΙ.2.3 Κλινικές συσχετίσεις των αυτοαντισωμάτων αντί-καλρετικουλίνης
Το 1990 όταν ακόμα η καλρετικουλίνη θεωρούνταν ως η Ro 60KD πρωτεΐνη,
ένα
συνθετικό
πεπτίδιο
που
αντιστοιχούσε
στον
αμινοτελικό
της
επίτοπο
χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία στον προσδιορισμό των υποτάξεων της IgG που
απαντώνται στον Υποξύ Δερματικό και στο Νεογνικό Λύκο. Έτσι οι Bennion και συν
πιστεύοντας
ότι
προσδιορίζουν
αντί-Ro
60KD
αυτοαντισώματα,
ουσιαστικά
παρουσίασαν την ύπαρξη αυτοαντισωμάτων αντί-καλρετικουλίνης στα δύο παραπάνω
κλινικά σύνδρομα (502). Ειδικά στο σύνδρομο του Νεογνικού Λύκου, μια πρόσφατη
μελέτη των Orth και συν παρουσίασε την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης των
αυτοαντισωμάτων αντί-καλρετικουλίνης σε νεογνά που είχαν υποστεί συγγενές
έμφραγμα του μυοκαρδίου (515). Τα αυτοαντισώματα αυτά δεν βρέθηκαν σε υγιή
νεογνά, ενώ σε νεογνά με αντί-Ro και αντί-La αυτοαντισώματα που όμως δεν είχαν
υποστεί συγγενές έμφραγμα του μυοκαρδίου βρέθηκαν σε πολύ χαμηλότερα ποσοστά.
Έτσι τα αντισώματα αντί-καλρετικουλίνης στη συγκεκριμένη μελέτη συσχετίστικαν με
το συγγενές έμφραγμα του μυοκαρδίου και διατυπώθηκε η σκέψη ότι θα μπορούσαν να
συμμετέχουν και στη παθογένεση του, αφού στοχεύουν την καλρετικουλίνη, η οποία
έχει λειτουργικό ρόλο στην αποθήκευση του ασβεστίου (515).
Ενδιαφέρον
επίσης
στη
μελέτη
αυτή
προκαλεί
και
η
ανίχνευση
αυτοαντισωμάτων κατά της καλρετικουλίνης όχι μόνο τάξεως IgG, αλλά και τάξεως
IgM στο νεογνό, τα οποία δεν περνούν τον αιμοπλακουντιακό φραγμό και για αυτό τον
λόγο πιθανολογείται ότι δεν είναι μητρικής προέλευσης αλλά παράγονται κατευθείαν
από το νεογνό. Θα πρέπει ωστόσο να επισημάνουμε πως τα αυτοαντισώματα αντίκαλρετικουλίνης δεν εμφανίζονται μόνο στο νεογνικό αλλά σε μία ποικιλία
αυτοάνοσων παθήσεων όπως ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος, το σύνδρομο
Sjogren η Ρευματοειδής Αρθρίτιδα και η Μικτή Νόσος του Συνδετικού Ιστού (504, 202,
179). Με αυτή την έννοια δεν φαίνεται να υπάρχει ειδική συσχέτιση τους με κάποια
νόσο, ενώ ο παθογενετικός τους ρόλος σε κάποιο κλινικό σύνδρομο, δεν έχει μέχρι
στιγμής επιβεβαιωθεί.
Δ.ΙV ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ
Δ.IV.1 Γενικά
Η πρώτη μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση και τιτλοποίηση
αυτοαντισωμάτων ήταν ο έμμεσος ανοσοφθορισμός για αντιπυρηνικά αντισώματα,
ο οποίος εισήχθη το 1957 (516, 517). Οι διάφοροι τύποι ανοσοφθορισμού όμως, δεν
μπορούν να προσδιορίσουν επακριβώς τη φύση του αυτοαντιγόνου και συνεπώς τη
φύση του αυτοαντισώματος. Για το λόγο αυτό αναπτύχθηκαν ειδικές μέθοδοι
ανίχνευσης αυτοαντισωμάτων με τη χρήση των τεχνικών ELISA, ανοσοδιάχυσης,
αντίθετης ανοσοηλεκτοφόρησης και ανοσοαποτύπωσης οι οποίες είναι σε θέση να
προσδιορίσουν τον τύπο και τον τίτλο ειδικών αυτοαντισωμάτων.
Σήμερα ο έμμεσος ανοσοφθορισμός για αντιπυρηνικά αντισώματα (ΑΝΑ)
χρησιμοποιείται σαν αρχική εξέταση ρουτίνας (screening test) για κάθε άρρωστο με
υπόνοια ρευματικού νοσήματος. Οι οροί που βρίσκονται ΑΝΑ θετικοί εξετάζονται
περαιτέρω με τις ειδικές μέθοδοι που προαναφέραμε. Στη συνέχεια θα
περιγράψουμε τις τεχνικές αυτές με έμφαση στη τεχνική ELISA.
Δ.IV.2 Ανοσοδιάχυση και αντίθετή ανοσοηλεκτροφόρηση
Η διπλή ανοσοδιάχυση επινοήθηκε το 1958 από τον Ouchterlony (518) και έχει βρει
ευρεία εφαρμογή για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων κατά εκχυλισμάτων πυρήνα
(ENA). Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην αρχή ότι όταν αντίσωμα και αντιγόνο
αφεθούν να διαχυθούν, σε κοντινές μεταξύ τους θέσεις σε γέλη αγαρόζης, τότε στο
σημείο εξίσωσης των συγκεντρώσεων τους σχηματίζεται ιζηματική γραμμή από
δυσδιάλυτα ανοσοσυμπλέγματα. (Σχήμα 55).
Σχήμα 55. Διπλή ανοσοδιάχυση. Η διάχυση του αντισώματος και αντιγόνου
οδηγεί σε μια ζώνη εξίσωσης συγκεντρώσεων, όπου τα
δυσδιάλυτα ανοσοσυμπλέγματα εμφανίζονται σαν ιζηματική
γραμμή.
Οι οροί τοποθετούνται σε διπλανά φρεάτια με κυκλοτερή διάταξη και η πηγή του
αντιγόνου σε ένα κεντρικό φρεάτιο που βρίσκεται σε ίση απόσταση από τα φρεάτια
των ορών. Οι ιζηματικές γραμμές που δημιουργούνται από τους προς εξέταση
ορούς συγκρίνονται με τις ιζηματικές γραμμές που παράγει ορός γνωστής
ειδικότητας. Έτσι όταν αυτές ενώνονται σε μια συνεχή γραμμή τότε τα
αυτοαντισώματα των ορών αναγνωρίζουν το ίδιο αυτοαντιγόνο (Σχήμα 56.I), όταν
αυτές τέμνονται οι οροί έχουν αντισώματα διαφορετικών ειδικοτήτων (Σχήμα 56.II)
ενώ όταν τέμνονται μερικώς, τότε υπάρχει μερική ομοιότητα των αντισωμάτων τα
οποία είτε αντιδρούν με διαφορετικούς αντιγονικούς καθαριστές στο ίδιο
μακρομόριο (Σχήμα 56.III) είτε αναγνωρίζουν διασταυρωτά διαφορετικά αντιγόνα
(Σχήμα 56.IV).
Η αντίθετη ανοσοηλεκτοφόρηση είναι μια μορφή διπλής ανοσοδιάχυσης, στην
οποία η διάχυση των μορίων αντιγόνου και αντισώματος υποβοηθείται από
ηλεκτρικό πεδίο. Ο ορός τοποθετείται στη άνοδο και η πηγή του αντιγόνου στη
κάθοδο έτσι ώστε τα ηλεκτραρνητικά φορτισμένα αντιγόνα να οδεύουν προς τις
ανοσοσφαιρίνες. Οι ιζηματικές γραμμές που δημιουργούνται εξετάζονται με
παρόμοιο με την διπλή ανοσοδιάχυση τρόπο (Σχήμα 57).
Σχήμα 56. Βασικοί τύποι ιζηματικών γραμμών στη διπλή
ανοσοδιάχυση.
Σχήμα 57. Βασικοί τύποι ιζηματικών γραμμών στη αντίθετη
ανοσοηλεκτροφόρηση. I: ταυτότητα αντισωμάτων,
II:διαφορετικά αντισώματα, III, IV: μερική ομοιότητα
αντισωμάτων.
Σχήμα 58. Διάφοροι τύποι και παραλλαγές της τεχνικής ELISA.
Δ.IV.3 ELISA
Η ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) είναι μια ανοσοενζυμική
μέθοδος στερεής φάσεως (519). Η μέθοδος αυτή περιλαμβάνει (i) την προσρόφηση
ενός αντιγόνου η αντισώματος σε στερεή επιφάνεια, (ii) την αντίδραση αντιγόνου αντισώματος και (iii) την μέτρηση της ενζυμικής δράσης ενός συζεύγματος ενζύμου
– αντισώματος ή ενζύμου – αντιγόνου με τη χρήση ειδικών υποστρωμάτων που
δίνουν έγχρωμα προϊόντα αντίδρασης.
Υπάρχουν πολλές παραλλαγές της μεθόδου οι οποίες ταξινομούνται σε
ανταγωνιστικού και μη ανταγωνιστικού τύπου (Σχήμα 58).
Η συχνότερα χρησιμοποιούμενη για τον ποσοτικό προσδιορισμό των
αυτοαντισωμάτων είναι η μη ανταγωνιστική – έμμεση ELISA για τον προσδιορισμό
αντισώματος (Σχήμα 58Α), την οποία θα μελετήσουμε περαιτέρω.
Δ.ΙV.3.1 Μη ανταγωνιστική έμμεση ELISA για τον προσδιορισμό αντισώματος
Δ.IV.3.1.1 Κάλυψη του πλακιδίου
Η στερεή επιφάνεια που χρησιμοποιείται είναι πολυστυρόλιο (Polysorp) ή
πολυστυρόλιο με προσθήκη υδρόφιλων ομάδων (Maxisorp) ανάλογα με το
αντιγόνο που θέλουμε να προσροφηθεί (Πίνακας 11).
Πίνακας 11: Επιλογή της στερεής επιφάνειας ανάλογα με το είδος του βιομορίου που
πρόκειται να προσροφηθεί.
Polysorp
Maxisorp
Å
Æ
Πρωτεΐνε
Λιποπρωτεΐν
Λιπίδι
ς,
πεπτίδι
Γλυκοπρωτεΐνες
Σύνθετα
Σύνθετα
λιπίδια
σάκχαρα
Πολυσακχαρίτε
Σχήμα 59. Α: Οι 4 πιθανοί δεσμοί μεταξύ μακρομορίων (i) δεσμός υδρογόνου, (ii) ομοιπολικός δεσμός,
(iii) ετεροπολικός δεσμός, (iv) δεσμός Van der Waals. Η προσρόφηση στην ELISA γίνεται
μεσώ των δεσμών (i) + (iv). Β: Ο δεσμός Van der Waals σχηματίζεται από τοπικές εναλλαγές
ηλεκτρικών διπόλων.
Σχήμα 60. Το μακρομόριο προσροφάται στη Maxisorp επιφάνεια μέσω υδρόφοβων
αλληλεπιδράσεων (δεσμών Van der Waals) και δεσμών υδρογόνου.
Η πρόσδεση του αντιγόνου στη στερεή επιφάνεια πραγματοποιείται μέσω
υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (δeσμοί Van der Waals από τοπικές εναλλαγές
ηλεκτρικών διπόλων) και δεσμών υδρογόνου (Σχήματα 59, 60). Η μέγιστη δυνατή
ποσότητα πρωτεΐνης που μπορεί να προσροφηθεί στη στερεά επιφάνεια με τους
δεσμούς που προαναφέραμε εξαρτάται από γεωμετρικούς παράγοντες όπως το
μέγεθος και το σχήμα του μορίου που πρόκειται να προσροφηθεί. Έτσι για την IgG,
που έχει σχήμα ελλειπτικού σφαιροειδούς και μοριακό βάρος 153KD, η μέγιστη
ποσότητα μονοστρωματικής κάλυψης είναι από 130 έως 650 ng/cm3 ανάλογα με την
διευθέτηση της (οριζόντια ή κάθετα στην στερεά επιφάνεια) (Σχήμα 61), ενώ για
σφαιρικά πρωτεϊνικά αντιγόνα μοριακού βάρους 50-700 KD, η μέγιστη ποσότητα
μονοστρωματικής κάλυψης κυμαίνεται από 200 έως 500 ng/cm3 ανάλογα με το
μοριακό τους βάρος (Σχήμα 62). Στην πράξη η κάλυψη της επιφάνειας είναι πάντα
αρκετά μικρότερη της μέγιστης δυνατής, ενώ σε μερικές περιπτώσεις είναι πολύ
Σχήμα 61. Α: Η ανοσοσφαιρίνη IgG καταλαμβάνει
περίπου τον όγκο ενός ελλειπτικού
σφαιροειδούς διαμέτρου 15 nm και
πάχους 3 nm. Β: Κάλυψη πλακιδίου με
την IgG σε κάθετη διευθέτηση.
Γ: Κάλυψη πλακιδίου με την IgG σε
οριζόντια διευθέτηση
Σχήμα 60. Το μακρομόριο προσροφάται
στη 62.
Maxisorp
επιφάνεια
μέσω υδρόφοβων
Σχήμα
Ποσότητα
μονοστρωματικής
κάλυψης
αλληλεπιδράσεων (δεσμών Van der Waals)
και
δεσμών
υδρογόνου.
σφαιρικών πρωτεϊνών ανάλογα με το
μοριακό τους βάρος.
χαμηλή και δημιουργούνται προβλήματα στη τεχνική.
Η κάλυψη ενός πλακιδίου με μια πρωτεΐνη είναι μία ευαίσθητη διαδικασία που
εξαρτάται από πολλούς παράγοντες (Πίνακας 12)
Πίνακας 12: Παράγοντες που επηρεάζουν την κάλυψη του πλακιδίου της ELISA
Μέγεθος πρωτεΐνης ↑
Φυσικοί
Κάλυψη πλακιδίου ↑
δεσμοί ↑
Ιονική ισχύς δ/τος, Tween
Φυσικοί
20 ↑
δεσμοί ↓
Χρόνος, θερμοκρασία ↑
Φυσικοί
Κάλυψη πλακιδίου ↓
Κάλυψη πλακιδίου ↑
δεσμοί ↑
Μετουσίωση πρωτεΐνης ↑
Ειδικά τον χρόνο και την θερμοκρασία θα πρέπει να σημειώσουμε ότι ενώ με την
αύξηση τους αυξάνει η κάλυψη του πλακιδίου, αυξάνει ταυτόχρονα και η
μετουσίωση των πρωτεϊνών, η οποία με τη σειρά της προκαλεί μείωση του
ποσοστού των μορίων που βρίσκονται προσροφημένα σε δραστική μορφή στο
Σχήμα 63. Ο βέλτιστος χρόνος κάλυψης αντιστοιχεί στην
κορυφή της καμπύλης όπου τα προσροφημένα
μόρια είναι δραστικά (δεν έχουν μετουσιωθεί).
πλακίδιο και συνεπώς μείωση της δραστικότητας στην ELISA (Σχήμα 63).
Ακόμα θα πρέπει να τονίσουμε πως όταν πρόκειται για μικρά μόρια, όπως
πεπτίδια, η αλληλουχία τους σε συνδυασμό με το pH του διαλύματος οπού
βρίσκονται διαλυμένα παίζει μεγάλο ρόλο στη κάλυψη του πλακιδίου. Έτσι
υπάρχουν πεπτίδια που απαιτούν προσεκτική ρύθμιση του pH σε πολύ μικρό εύρος
pH κάλυψης = ισοηλεκτρικό σημείο πεπτιδίου + 1 έως 2 μονάδες
το
για να καλυφθεί
πλακίδιο
Σχήμα 64. Επίδραση της συγκέντρωσης πεπτιδίου και του
pΗ διαλύματος κάλυψης στη προσρόφηση
διαφορετικών πεπτιδίων σε μικροπλακίδια
τιτλοποίησης ELISA (αλληλουχίες πεπτιδίων
Α: LKMADPNRFRGKD, Β: GDTQTHEHPDG,
Γ: EDPEDSALLED, Δ: ELAPEDPEDSALLED)
αποτελεσματικά (Σχήμα 64Δ). Γενικά σαν κανόνας για το pH κάλυψης ισχύει:
Δ.IV.3.1.2 Αλληλεπίδραση αντιγόνου – αντισώματος
Η αλληλεπίδραση αντιγόνου – αντισώματος εξαρτάται κυρίως από το χρόνο, τη
θερμοκρασία, ρυθμιστικό διάλυμα και τη γεωμετρία διάχυσης.
Σχήμα 65. Δομή της ανοσοσφαιρίνης IgG.
Στο Fc τμήμα της βρίσκονται
συνδεδεμένοι πολυσακχαρίτες.
(i)
Χρόνος: Το αντίσωμα πρέπει να έχει τον απαραίτητο χρόνο για να συναντήσει το
αντιγόνο και μάλιστα να το συναντήσει στη κατάλληλη διαμόρφωση και με την
κατάλληλη γεωμετρία ώστε να αντιδράσει μαζί του. Έτσι όταν έχουμε σαν
αντιγόνο ένα πεπτίδιο, το οποίο είναι σχετικά μικρό μόριο και κατά κανόνα
βρίσκεται σε μια ισορροπία διαμορφώσεων (μεταπίπτοντας συνεχώς από την μία
διαμόρφωση στην άλλη), θα πρέπει να έχουμε μεγάλο χρόνο επώασης ώστε να
καταφέρει το αντίσωμα να συναντήσει το πεπτίδιο και στη δραστική του
διαμόρφωση. Από την άλλη πλευρά το αντίσωμα είναι μια γλυκοπρωτεΐνη με
πολυσακχαρίτες συνδεδεμένους στο Fc τμήμα του (Σχήμα 65). Οι πολυσακχαρίτες
αυτοί έχουν πολύ μεγάλη συγγένεια με την Maxisorp επιφάνεια (Πίνακας 11) με
αποτέλεσμα να είναι δυνατό, σε μεγάλους χρόνους επώασης, να συμβεί μερική
αντικατάσταση του αντιγόνου από το αντίσωμα στη επιφάνεια του πλακιδίου
(ιδίως όταν το αντιγόνο είναι πεπτίδιο το οποίο συνδέεται με μικρό αριθμό
φυσικών δεσμών με την στερεή επιφάνεια). Έτσι προκαλείται αύξηση του
θορύβου (background) και μείωση της ευαισθησίας στη ELISA.
(ii)
Θερμοκρασία: Σε υψηλή θερμοκρασία το αντίσωμα συναντά γρηγορότερα το
αντιγόνο. Έτσι γενικά προτιμούνται σχετικά υψηλές θερμοκρασίες (37 oC). Οι
κίνδυνοι από την υψηλή θερμοκρασία αφορούν την μετουσίωση των μορίων και
την μερική απομάκρυνση του αντιγόνου κάλυψης από την επιφάνεια του
πλακιδίου, με αντικατάσταση του από άλλα πιο συγγενή προς την επιφάνεια
μόρια.
(iii) Τα ρυθμιστικά διαλύματα: Η σύνδεση αντιγόνου αντισώματος εξαρτάται σε
μεγάλο βαθμό από το ρυθμιστικό διάλυμα. Έτσι η ιονική ισχύς του διαλύματος, το
pH και η παρουσία απορρυπαντικού (όπως το Tween 20) επηρεάζουν την
αντίδραση αυτή. Ακόμα οι ίδιοι παράγοντες επηρεάζουν και την ανταλλαγή του
αντιγόνου κάλυψης από άλλες πρωτεϊνες ή και αντισώματα στην επίφανεια του
πλακιδίου η οποία πρέπει να αποφεφχθεί.
(iv)
Η γεωμετρία διάχυσης: Παράγοντες όπως η ελλάτωση της απόστασης διάχυσης και
ή ανάδευση μπορούν να επιταχύνουν την αντίδραση αντιγόνου- αντισώματος.
Δ.IV.3.1.3 Η ενζυμική αντίδραση
Ο ποσοτικός προσδιορισμός των ειδικών για το αντιγόνο αντισωμάτων τελικά θα
γίνει με την βοήθεια ενός δευτέρου αντισώματος (αντι-ανοσοσφαιρίνη) που είναι
συζευγμένο με ένζυμο. Η ενζυμική δράση υπολογίζεται με βάση τη μέτρηση του
υποστρώματος που μετατράπηκε σε έγχρωμο προϊόν από το ένζυμο. Έτσι υψηλή
μετατροπή υποστρώματος σημαίνει πολλά σημασμένα με ένζυμο αντισώματα και
επομένως πολλά ειδικά για το αντιγόνο αντισώματα. Τα υποστρώματα όμως
μετατρέπονται εκτός από το ένζυμο και αυτόματα (σε μικρότερο ποσοστό). Η
αυτόματη μετατροπή του υποστρώματος οφείλεται στη θερμοκρασία, στο φως ή σε
ακαθαρσίες που υπάρχουν στο διάλυμα και προκαλεί τον αποκαλούμενο «θόρυβο»
(background). Για να εξαλειφθεί ο παράγοντας αυτός συχνά εφαρμόζεται ένα
τυφλό τεστ, όπου ακολουθείται η ίδια πορεία χωρίς όμως το ειδικό για το αντιγόνο
αντίσωμα, υπολογίζεται ο «θόρυβος» ο οποίος στη συνέχεια αφαιρείται από τη τιμή
μέτρησης του δείγματος.
Ένας άλλος σημαντικός παράγοντας είναι η διάρκεια της ενζυμικής αντίδρασης. Η
Σχήμα 66. Μετατροπή του υποστρώματος σε έγχρωμο προϊόν (α)
που προκαλείται από το ένζυμο, (β) χαμηλής ταχύτητας
αυτόματη μετατροπή, (γ) υψηλής ταχύτητας αυτόματη
ή
ενζυμική αντίδραση με την πάροδο του χρόνου γίνεται ολοένα και πιο αργή (Σχήμα
66), επειδή (i) το ένζυμο εξαντλείται μετά από κάποιο χρόνο και (ii) ενώ αρχικά το
ένζυμο περιβάλλεται από καθαρό υπόστρωμα που δεν έχει μετατραπεί, στη
συνέχεια περιβάλλεται και από υπόστρωμα που ήδη έχει μετατραπεί και το οποίο
δεν αντιδρά περαιτέρω. Για τους λόγους αυτούς προτιμάται η μέτρηση της
ενζυμικής αντίδρασης σε μικρούς χρόνους (< 10 min). Αν όμως ο χρόνος γίνει
ιδιαίτερα μικρός (< 3 min) τότε μικρές διακυμάνσεις στους χρόνους τοποθέτησης
του διαλύματος, του υποστρώματος και του διαλύματος που σταματά την ενζυμική
αντίδραση στις κυψελίδες των μικροπλακιδίων τιτλοποιήσης μπορούν να
δημιουργήσουν σημαντικά πειραματικά σφάλματα.
Δ.IV.3.2 Παραλλαγές της ELISA
Όταν το αντιγόνο είναι ένα μικρό πεπτίδιο συχνά προκύπτουν διάφορα
προβλήματα στη κλασσική ELISA, τα οποία οφείλονται στο ότι
(i)
Τα μικρά πεπτίδια σε αντίθεση με τις μεγάλες πρωτεΐνες προσροφούνται στη
στερεή επιφάνεια με μικρό αριθμό φυσικών δεσμών και έτσι σχετικά εύκολα
μπορούν να αντικατασταθούν από άλλα μόρια με υψηλή συγγένεια προς την
στερεή επιφάνεια (π.χ. πολυσακχαρίτες ή πρωτεΐνες).
(ii)
Υπάρχει μικρός αριθμός δραστικών ομάδων στο μόριο του πεπτιδίου και έτσι
κάποτε, ομάδες που είναι απαραίτητες για τη σύνδεση με το αντίσωμα
χρησιμοποιούνται για την αλληλεπίδραση με τη στερεή επιφάνεια, με αποτέλεσμα
να μην είναι πλέον διαθέσιμες (Σχήμα 67Γ).
(iii) Τα πεπτίδια σε διάλυμα βρίσκονται σε ισορροπία διαμορφώσεων και συχνά
προσροφούνται σε εκτεταμένες διαμορφώσεις οι οποίες δεν είναι πάντα αυτές
που προτιμά το αντίσωμα (Σχήμα 67Γ).
Για τους λόγους αυτούς αναπτύχθηκαν διάφορες παραλλαγές της ELISA.
Δ.IV.3.2.1 ELISA με ομοιοπολική σύνδεση
Στην ELISA αυτή στη στερεή επιφάνεια υπάρχουν δευτεροταγείς αμινομάδες σε
πυκνότητα 1014/cm2 σε απόσταση 20 Å από αυτή (για να αποφευχθεί η στερεοχημική
παρεμπόδιση) (Σχήμα 67Α). Το πεπτίδιο σε μορφή εστέρα του Ν-υδρόξυηλεκτραμιδίου μπορεί να αντιδράσει – χημικά πλέον – με τις αμινομάδες αυτές και
έτσι να συνδεθεί ομοιοπολικά με τη στερεή επιφάνεια. Λόγω της ομοιοπολικής
σύνδεσης το πεπτίδιο είναι μόνιμα συνδεδεμένο σε υψηλή πυκνότητα στην
επιφάνεια, δεν μπορεί να αντικατασταθεί και έχει διαμορφωτική ελευθερία (Σχήμα
67Β).
Σχήμα 67. Α, Β: ELISA με ομοιοπολική σύνδεση πεπτιδίου.
Α:
Η
επιφάνεια
διαθέτει
δευτεροταγείς
αμινομάδες για τη χημική σύνδεση του πεπτιδίου.
Β: Το πεπτίδιο έχει διαμορφωτική ελευθερία.
Γ: Κλασσική ELISA. Το πεπτίδιο συχνά
προσροφάται σε μη δραστική διαμόρφωση ή
διαθέτει τις δραστικές του ομάδες για τη σύνδεση
με τη στερεή επιφάνεια.
Δ.IV.3.2.2 ELISA με βιοτινυλιωμένα πεπτίδια
Στην ELISA αυτή αντί για την άμεση προσρόφηση πεπτιδίων στη στερεή επιφάνεια,
έχουμε κάλυψη της επιφάνειας με στρεπταβιδίνη (η οποία σαν πρωτεΐνη
προσροφάται καλύτερα) και προσθήκη βιοτινυλιωμένων πεπτιδίων σε
δεύτερη
φάση. Τα βιοτινυλιωμένα πεπτίδια είναι πεπτίδια που έχουν στο αμινοτελικό τους
άκρο μια αλληλουχία επιμήκυνσης (spacer) και ένα μόριο βιοτίνης με το οποίο
μπορούν να δεσμεύονται ισχυρά στη στρεπταβιδίνη (3 μόρια πεπτιδίου δεσμεύονται
από ένα μορίο στρεπταβιδίνης) (Σχήμα 68).
Τα πεπτίδια και στη μέθοδο αυτή συνδέονται ισχυρότερα στη στερεή επιφάνεια,
βρίσκονται σε υψηλή πυκνότητα κάλυψης και έχουν διαμορφωτική ελευθερία.
Σχήμα 68. ELISA με βιοτινυλιωμένα πεπτίδια.
Δ.IV.4 Ανοσοαποτύπωση
Σύμφωνα με την τεχνική αυτή γίνεται αναλυτικός διαχωρισμός των πρωτεϊνών
ανάλογα με το μέγεθος τους με ηλεκτροφόρηση σε γέλη πολυακρυλαμιδίου,
μεταφορά των πρωτεϊνών σε χαρτί νιτροκυτταρίνης και καθορισμός των
πρωτεϊνικών αντιγόνων που αποτελούν στόχους των αυτοαντισωμάτων σε κάθε ορό
με ανοσοαποτύπωση (Σχήμα 70).
Δ.IV.4.1 Ηλεκτροφόρηση σε γέλη πολυακρυλαμιδίου
Για να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες από ένα εκχύλισμα αντιγόνων με βάση το
μέγεθος τους, το εκχύλισμα επωάζεται αρχικά σε υψηλή θερμοκρασία με το
ανιονικό απορρυπαντικό δωδεκυλοθειϊκό νάτριο (SDS) παρουσία ενός αναγωγικού
παράγοντα. Το SDS στις συνθήκες αυτές ξεδιπλώνει τις πρωτεΐνες δίνοντας τους
εκτεταμένη διαμόρφωση και ενώνεται σε αυτές σε ποσότητα ανάλογη με το μέγεθος
τους (Σχήματα 69, 70Α). Το καθαρό αρνητικό φορτίο του δεσμευμένου SDS
Σχήμα 69. Αποδιάταξη πρωτεϊνών με θέρμανση παρουσία SDS και θειόλης. Το
SDS δίνει αρνητικό φορτίο στις πρωτεϊνες ανάλογα με τη μάζα τους.
υπερβαίνει και υπερκαλύπτει το φυσικό φορτίο των πρωτεϊνών, φορτίζοντας αυτές
ανάλογα με το μέγεθος τους (σταθερός λόγος αρνητικού φορτιού προς μάζα).
Ωστόσο σε κάποιες ειδικές περιπτώσεις, όπως αυτή της καλρετικουλίνης η οποία
έχει ισοηλεκτρικό σημείο (pI) 4.6 και ένα ισχυρά αρνητικά φορτισμένο
καρβοξυτελικό άκρο, το φυσικό αρνητικό της φορτίο προστίθεται σε αυτό του SDS
και η πρωτεΐνη τελικά μετακινείται στην ηλεκτροφόρηση σαν μια 60KD πρωτεΐνη,
ενώ το πραγματικό της μοριακό βάρος είναι 46 KD (265, 520). Αν εξαιρέσουμε τις
σπάνιες περιπτώσεις όπως αυτή της καλρετικουλίνης, οι πρωτεΐνες τελικά
καταλήγουν να μετακινούνται στην ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου με
ταχύτητα αντιστρόφως ανάλογη του μεγέθους τους (Σχήμα 70Β). Έτσι το μέγεθος
μιας άγνωστης πρωτεΐνης μπορεί να συγκριθεί με σύγκριση της απόστασης που
διανύει μέσα στη γέλη με αυτή που διανύουν πρότυπες πρωτεΐνες γνωστού
μοριακού βάρους κατά την ηλεκτροφόρηση.
Για τον αποτελεσματικό διαχωρισμό πρωτεϊνών με πολύ κοντινά μοριακά βάρη
όπως οι Ro 52KD και η La 48KD πρωτεΐνες, απαιτούνται τροποποιήσεις στη
σύνθεση της γέλης (αύξηση της αναλογίας ακρυλαμιδίου : δι-ακρυλαμιδίου από
37:1 σε 172:1)(521).
Σχήμα 70. Ανοσοαποτύπωση. Α, Β: Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός πρωτεϊνών.
Β: Μεταφορά πρωτεϊνών σε νιτροκυτταρίνη (Western blot).
Δ, Ε: Ανοσοαποτύπωση.
Δ.IV.4.2 Μεταφορά των πρωτεϊνών σε φύλλα νιτροκυτταρίνης
Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες μεταφέρονται από τη γέλη πολυακρυλαμιδίου σε χαρτί
νιτροκυτταρίνης με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου (Σχήμα 70Γ).
Δ.ΙV.4.3 Ανοσοαποτύπωση
Έπειτα από τη μεταφορά των αντιγόνων στα φύλλα νιτροκυτταρίνης, η
νιτροκυτταρίνη τεμαχίζεται σε επιμήκεις ταινίες, μπλοκάρονται οι μη ειδικές θέσεις
δέσμευσης και επωάζεται με τα υπό εξέταση δείγματα (π.χ. ορούς αίματος
ασθενών). Όταν υπάρχουν ειδικά αυτοαντισώματα αυτά προσκολλούνται στα
τμήματα της νιτροκυτταρίνης όπου βρίσκονται τα πρωτεϊνικά αντιγόνα που
στοχεύουν.
Στη
συνέχεια
τα
συμπλέγματα
αντισώματος-αυτοαντιγόνου
αναγνωρίζονται από αντιορό (π.χ. αντί-ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη) ομοιοπολικά
συζευγμένο με ένζυμο (Σχήμα 70Δ). Τέλος οι ταινίες επωάζονται με το κατάλληλο
υπόστρωμα του ενζύμου και αν η αντίδραση είναι θετική, τότε οι ζώνες που
αντιστοιχούν στα αυτοαντιγόνα που αναγνωρίσθηκαν από το αντίσωμα θα
απεικονισθούν με ειδικό χρώμα (Σχήματα 70Ε). Έτσι γίνεται δυνατό να
ταυτοποιηθούν (με βάση το μοριακό τους βάρος) τα πρωτεϊνικά αντιγόνα κατά των
Σχήμα 71 Ανίχνευση
αυτοαντισωμάτων
κατά
αυτοαντιγόνων του Ro/La RNP συμπλόκου
με την τεχνικη της ανοσοαποτύπωσης σε
ορούς ασθενών σύνδρομο Sjogren (κάθε
επιμήκης ταινία αντιστοιχεί σε διαφορετικό
ασθενή).
οποίων στρέφονται τα αυτοαντισώματα των υπό εξέταση δειγμάτων (Σχήμα 71).
Δ.V
ΕΠΙΤΟΠΟΙ
ΤΩΝ
ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ
ΠΟΥ
ΣΤΡΕΦΟΝΤΑΙ
ΕΝΑΝΤΙΑ ΣΤΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ Ro RNP.
Διάφορες μελέτες έχουν ασχοληθεί με τη χαρτογράφηση των αντιγονικών περιοχών
που αναγνωρίζουν τα αυτοαντισώματα σε κάθε ένα από τα συστατικά του
συμπλόκου Ro RNP. Μεταξύ των μελετών αυτών δεν υπάρχει απόλυτη συμφωνία
ως προς τον ακριβή εντοπισμό των επιτόπων επειδή (i) όταν χρησιμοποιούνται για
την αντιγονική χαρτογράφηση ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, εντοπίζονται ως
αντιγονικά μεγάλα τμήματα των πρωτεϊνών, χωρίς να εξακριβώνεται η ακριβής
εντόπιση των επιτόπων, (ii) όταν η αντιγονική χαρτογράφηση γίνεται με συνθετικά
πεπτίδια, είναι μεν λεπτομερής αλλά δεν προσδιορίζονται οι επίτοποι διαμόρφωσης
που είναι και οι πιο συχνοί και (iii) πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι κατά την
εξέλιξη της νόσου υπάρχει ενδομοριακή εξάπλωση των επιτόπων με αποτέλεσμα
στον ορό του αίματος του ιδίου ασθενή ο αριθμός των επιτόπων, που αναγνωρίζουν
τα αυτοαντισώματα (για κάποιο συγκεκριμένο αυτοαντιγόνο), να αυξάνει
προοδευτικά με το χρόνο. Έτσι ο αριθμός των επιτόπων που τελικά θα
προσδιοριστεί σε κάποιο αυτοαντιγόνο εξαρτάται και από το χρονικό σημείο στην
εξέλιξη της νόσου που συλλέχθηκε ο ορός του ασθενή.
Δ.V.1 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο Ro60
Στο αντιγόνο Ro60 ένα σημαντικό μέρος των επιτόπων είναι διαμόρφωσης (328,
330, 331, 522, 523). Ο αριθμός των επιτόπων έχει καθοριστεί στους 7-11 για κάθε
μόριο του αντιγόνου Ro60 (523). Η εντόπιση τους (Σχήμα 72) αφορά κυρίως το
κεντρικό τμήμα του μορίου (μεταξύ του RNP μοτίβου και του δάκτυλου Zn) καθώς
και το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης (177, 182, 183, 328, 338, 391, 523-532).
Από την κατανομή τους αυτή δεν φαίνονται να θίγονται οι περιοχές του μοτίβου
Σχήμα 72. Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο
RNP και του δακτύλου Zn με τις οποίες η Ro60 πρωτεΐνηRo60KD.
αλληλεπιδρά
με το
RNA
Παραπομπές
Α: 177,
(216) και το Ro52 αντιγόνο (222).
338, 526, 527, 529, 530. Β: 532,
Γ: 182, Δ: 531, Ε: 183, 391.
Δ.V.2 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο Ro52
Στο αντιγόνο Ro52 το κύριο μέρος των επιτόπων είναι γραμμικοί (331, 334, 522) και
η εντόπιση τους αφορά το κεντρικό τμήμα του μορίου, στη ευρύτερη περιοχή του
μοτίβου φερμουάρ - λευκίνης (Σχήμα 73) (328, 234, 182, 533-539). Από την
τοπογραφία αυτή των επιτόπων προκύπτει ότι τα αυτοαντισώματα δεν θίγουν την
περιοχή δακτύλου ψευδαργύρου (τύπου RING finger - B box) καθώς και την
ομόλογη rfp περιοχή. Η περιοχή δακτύλου ψευδαργύρου είναι πιθανό να
χρησιμοποιείται για τη σύνδεση της Ro52 με τη Ro60 πρωτεΐνη (222, 540).
Δ.V.3 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο La
Σχήμα 73.
Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο Ro52KD.
Παραπομπές Α: 234, 539, Β: 534, Γ: 533, Δ: 328 ,
Ε, ΣΤ: 535, 536 Ζ: 182, 538, Η: 537.
Με τη χρήση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών προσδιορίστηκαν μεγάλες αντιγονικές
περιοχές στη La πρωτεΐνη, οι οποίες καλύπτουν το μεγαλύτερο τμήμα της. Οι
περιοχές αυτές καλούνται LaA (αμινοξέα 1-107), LaC (αμινοξέα 111-242) και
LaL2/3 (αμινοξέα 346-408) (541). Λεπτομερέστερες χαρτογραφήσεις υπέδειξαν
επιτόπους σε διάφορα τμήματα της La πρωτεΐνης (Σχήμα 74) (333, 178, 187, 239,
531, 532, 542-552). Οι επίτοποι στη La πρωτεΐνη αντίθετα με τις δύο Ro πρωτεΐνες,
Σχήμα 74. Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο La/SSB 48kD. Παραπομπές
Α: 552, 541, Β: 333, Γ: 546, Δ: 551, Ε: 543, ΣΤ: 187.
βρίσκονται και σε λειτουργικές της περιοχές. Έτσι υπάρχουν επίτοποι στο RNP
μοτίβο της (333, 187, 552) καθώς και στη περιοχή δέσμευσης του ATP (551). Τα
αντισώματα κατά του μοτίβου RNP κατευθύνονται σε έναν διαμορφωτικό επίτοπο,
εντός του μοτίβου τον οποίο μάλιστα είναι σε θέση να αναγνωρίζουν ακόμα και
όταν το μοτίβο RNP χρησιμοποιείται για τη σύνδεση της La με το hYRNA στο
πλήρες σύμπλοκό Ro RNP (333). Αντίθετα τα αντισώματα κατά της περιοχής
δέσμευσης του ATP παρεμποδίζονται και δεν αντιδρούν με τη La πρωτεΐνη όταν
στη τελευταία δεσμευτεί ATP (551).
Δ.V.4 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο καλρετικουλίνη
Στην καλρετικουλίνη ο μόνος αντιγονικός καθοριστής που έχει μέχρι στιγμής
προσδιοριστεί αντιστοιχεί στην περιοχή 1-24 του αμινοτελικού της άκρου (198, 199,
502, 504). το τμήμα αυτό της πρωτεΐνης βρίσκεται μακριά από τις λειτουργικές
περιοχές της πρωτεΐνης (Σχήμα 75).
Σχήμα 75. Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο καλρετικουλίνη 48kD
(198, 199, 502, 504).
Δ.V.5 Επίτοποι στα hYRNA
Ο κύριος στόχος των αυτοαντισωμάτων αντί-Ro RNP είναι το πρωτεϊνικό τμήμα του
ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου. Ωστόσο μια μειοψηφία αυτοαντισωμάτων,
που συσχετίζεται με τα αντί-Ro60 αυτοαντισώματα, φαίνεται ότι αναγνωρίζει το
hY5 RNA (328, 332, 553, 554). Ο επίτοπος στη περίπτωση αυτή αποτελείται από ένα
δίκλωνο RNA που σχηματίζει από 27 και 31 νουκλεοτίδια του 5΄και 3΄άκρου
αντίστοιχα (Σχήμα 76) (553).
Σχήμα 76. Επίτοποι στο hY5 RNA (553).
Δ.V.6 Επίτοποι με ειδικότητα για νόσο
Στο σύνδρομο Sjogren τα αυτοαντισώματα στοχεύουν τόσο το Ro60KD (70-80%
των ασθενών) όσο και το La αυτοαντιγόνο (60 -70% των ασθενών)(555). Τα αντί-La
αυτοαντισώματα μάλιστα εμφανίζονται σχεδόν πάντα όταν υπάρχουν και αντί-Ro
αυτοαντισώματα (556). Στο ΣΕΛ αντίθετα τα αυτοαντισώματα κατευθύνονται
κυρίως κατά του Ro60KD αυτοαντιγόνου (30-40%) και πολύ λιγότερο κατά του La
αυτοαντιγόνου (10-15%) (435). Έκτός από τα διαφορετικά ποσοστά εμφάνισης των
αντί-Ro και αντί-La αυτοαντισωμάτων στους ασθενείς με ΣΣ και ΣΕΛ φαίνεται να
υπάρχουν και διαφορές στην ειδικότητα των επιτόπων ανάμεσα στις δύο ασθένειες.
Έτσι στο ΣΕΛ αναγνωρίζεται κυρίως η μετουσιωμένη (αποδιαταγμένη) μορφή του
Ro60 αυτοαντιγόνου ενώ στο ΣΣ αναγνωρίζεται η "φυσική" του μορφή (328, 329).
Τόσο στη Ro60 πρωτεΐνη όσο και στη La έχουν προσδιοριστεί επίτοποι που
παρουσιάζουν ειδικότητα είτε για τα αυτοαντισώματα ασθενών με ΣΕΛ είτε για
αυτοαντισώματα ασθενών με ΣΣ (183, 187, 524). Λεπτομερής αντιγονική
χαρτογράφηση έδειξε ότι τα αυτοαντισώματα στο ΣΣ δεν θίγουν τα RNP μοτίβα
(που χρησιμεύουν για τη συναρμολόγηση του συμπλόκου) στη Ro60 και La
πρωτεΐνη, ενώ στο ΣΕΛ εντοπίζονται είτε πάνω στο RNP μοτίβο (στη La πρωτεΐνη)
είτε κοντά σε αυτό (στη Ro60 πρωτεΐνη) (Σχήμα 77) (183, 187). Το γεγονός αυτό σε
Σχήμα 77. Επίτοποι με ειδικότητα για νόσο στα αυτοαντιγόνα Ro60kD και
La 48kD (183, 187) (ΣΣ: Σύνδρομο Sjogren, ΣΕΛ: Συστηματικός
Ερυθηματώδης Λύκος) .
συνδυασμό με την παρατήρηση ότι αντισώματα κατά της "φυσικής" Ro60 πρωτεΐνης
εμφανίζονται πιο συχνά σε ασθενείς με ΣΣ, ενώ τα αντισώματα κατά της
μετουσιωμένης Ro60 εμφανίζονται πιο συχνά στο ΣΕΛ, ίσως υποδεικνύει ότι στο
ΣΣ ο στόχος των αυτοαντισωμάτων είναι το πλήρες (λειτουργικό) σύμπλοκο Ro
RNP ενώ στο ΣΕΛ στοχεύονται και τα επιμέρους πρωτεϊνικά συστατικά του.
Δ.V.7 Ενδομοριακή και διαμοριακή εξάπλωση των επιτόπων
Ένα πολύ ενδιαφέρον φαινόμενο που παρατηρείται τόσο στη φυσιολογική
ανοσολογική απόκριση όσο και στις αυτοάνοσες παθήσεις και στα πειραματικά
τους μοντέλα είναι η ενδομοριακή και διαμοριακή διασπορά επιτόπων στα
αντιγόνα (557-559). Κατά το φαινόμενο αυτό η κυτταρική ή η χυμική ανοσία ενώ
αρχικά στοχεύει μια μικρή περιοχή ενός αυτοαντιγόνου, στη διαδρομή της
αυτοάνοσης νόσου στρέφεται κατά ενός μεγαλύτερου αριθμού αντιγονικών
καθοριστών οι οποίοι συχνά επεκτείνονται σε όλο το μήκος του μορίου (557, 559).
Παράδειγμα της αντιγονικής αυτής διεύρυνσης σε ριβονουκλεοπρωτεϊνικό
αυτοαντιγόνο ανακοινώθηκε για πρώτη φόρα για το σύμπλοκο Sm/nRNP. Στη
μελέτη αυτή παρουσιάστηκε ένας ασθενής με ΣΕΛ του οποίου τα αντί-SmB
αυτοαντισώματα κατά τριετή διαδρομή της νόσου διεύρυναν την ειδικότητα τους
από τον επίτοπο PPPGMRPP και τον ομόλογο του PPPGIRGP (βέλη στο Σχήμα
78) που ήταν αρχικά, σε πολλαπλούς επιτόπους σε όλο το μήκος του SmB
αυτοαντιγόνου (κάτω τμήμα του σχήματος 78). Παράλληλα με την ενδομοριακή
διασπορά των επιτόπων στο Sm αυτοαντιγόνο υπήρξε και διαμοριακή διασπορά
επιτόπων στα άλλα μέλη του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου Sm/nRNP RNP.
Έτσι ενώ αρχικά στον ορό αίματος υπήρχαν μόνο αντί-SmB/B' και αντί-nRNP70
αυτοαντισώματα κατά την εξέλιξη της νόσου εμφανίστηκαν και αντί-SmD, αντίnRNPA και αντί-nRNPC αυτοαντισώματα (557).
Παρόμοια διασπορά έχει δειχθεί πρόσφατα και για τα μέλη του RoRNP. Έτσι
(i)
Ανοσοποίηση κουνελιών με συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχούσε σε ένα μικρό
τμήμα της πρωτεΐνης Ro60 βρέθηκε να επάγει την παραγωγή αντισωμάτων
Σχήμα 78. Ενδομοριακή εξάπλωση των επιτόπων
που αναγνωρίζουν τα αυτοαντισώματα
ασθενούς με ΣΕΛ στο Sm B
αυτοαντιγόνο (557).
Σχήμα 79. Ενδομοριακή εξάπλωση των επιτόπων
στο Ro60kD αυτοαντιγόνο έπειτα από
ανοσοποίηση κουνελιού με το πεπτίδιο
413-420 (529).
εναντίων πολλαπλών επιτόπων σε όλο το μήκος της πρωτεΐνης (Σχήμα 79).
Επιπλέον η ανοσοποίηση συνοδεύτηκε και από την εμφάνιση αυτοαντισωμάτων
αντί-La (529).
(ii)
Ανοσοποίηση ποντικών είτε με τη Ro60 είτε με τη Ro52 είτε με τη La πρωτεΐνη
οδήγησε σε παραγωγή αυτοαντισωμάτων κατά και των τριών αυτοαντιγόνων
(560).
(iii) Ανοσοποίηση ποντικών με το τμήμα LaC (αμινοξέα 111-242) της La πρωτεΐνης
είχε σαν αποτέλεσμα την εμφάνιση αυτοαντισωμάτων κατά των LaA (αμινοξέα 1107), LaF (αμινοξέα 243-345) και LaL2/3 (αμινοξέα 346-415) περιοχών της La
καθώς και αυτοαντισωμάτων με ειδικότητα αντί-Ro60 (561). Όμοια η
ανοσοποίηση με πεπτίδιο που αντιστοιχούσε στο τμήμα 13-30 της La πρωτεΐνης
οδήγησε στην εμφάνιση αυτοαντισωμάτων με ειδικότητα για τα LaA, LaC, LaF
και LaL2/3 τμήματα της La καθώς και για το Ro52 αντιγόνο (562).
(iv) Εξέταση σειριακών δειγμάτων ορού αίματος ασθενών με αυτοαντισώματα αντίLa έδειξε ότι η ειδικότητα τους επεκτάθηκε κατά την εξέλιξη της νόσου από το
LaA τμήμα στα LaC και LaL2/3 (541).
Ο μηχανισμός με τον οποίον επέρχεται η ενδομοριακή και διαμοριακή
διασπορά επιτόπων σε ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο πιστεύεται (563) ότι
περιλαμβάνει (Σχήμα 80):
(i)
Την απελευθέρωση του Ro RNP από κάποια κύτταρα [π.χ. επιθηλιακά (564)]. Η
απελευθέρωση αυτή πιθανόν να οφείλεται σε δράση κάποιου ιού αφού έχει
δειχθεί ότι απόπτωση κυττάρων οφειλόμενη σε μόλυνση με ιό προκαλεί
απελευθέρωση ριβονουκλεοπρωτεϊνικων αυτοαντιγόνων (127).
(ii)
Την ενδοκύττωση των σωματιδίων Ro/La RNP από μακροφάγα και ειδικά αντίLa ή αντί-Ro B-λεμφοκύτταρα (αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα).
(iii) Την παρουσίαση από τα κύτταρα αυτά ενός πεπτιδίου (Τ-κυτταρικού επιτόπου)
που προέρχεται είτε από τη Ro είτε από τη La
πρωτεΐνη σε βοηθητικό T-
λεμφοκύτταρο με την αντίστοιχη ειδικότητα.
(iv) Την δραστηριοποίηση
(και τον κλωνικό
πολλαπλασιασμό) των ειδικού
βοηθητικού Τ-λεμφοκυτταρικού κλώνου ο οποίος με τη σειρά του ενεργοποιεί
όλα τα Β-λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν επιτόπους σε οποιοδήποτε από τα
συστατικά του συμπλόκου Ro/La RNP ώστε τα τελευταία να πολλαπλασιαστούν,
να διαφοροποιηθούν σε πλασματοκύτταρα και να παράγουν τα αντί-Ro και αντίLa αυτοαντισώματα.
Σχήμα 80. Μοντέλο μηχανισμού με τον οποίον επέρχεται η διαμοριακή διασπορά επιτόπων στο
ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο Ro/La RNP (563).
Ο παραπάνω μηχανισμός (Σχήμα 80) απαιτεί την ύπαρξη τουλάχιστον ενός TH
λεμφοκυτταρικού επιτόπου στο αντιγόνο Ro ή στο αντιγόνο La. Τέτοιοι επίτοποι TH
λεμφοκυττάρων έχουν πρόσφατα βρεθεί στη Ro52 (565) και στη La πρωτεΐνη (562).
Ο ένας μάλιστα από αυτούς (La 13-30) όταν χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοποίηση
ποντικών
οδήγησε
στη
ενδομοριακή
και
διαμοριακή
διασπορά
των
B-
λεμφοκυτταρικών επιτόπων σε όλο το Ro RNP σύμπλοκο (562).
Δ.V.8 Ρόλος
της εξάπλωσης
των
επιτόπων
στην
παθογένεση
των
αυτοάνοσων ασθενειών
Η πορεία ένδο- και δια- μοριακής εξάπλωσης των επιτόπων μπορεί να παίξει
κεντρικό ρόλο στη γένεση των αυτοαντισωμάτων κατά ριβονουκλεοπρωτεϊνικών
συμπλόκων καθώς και στη παθογένεση των αυτοάνοσων ασθενειών. Σύμφωνα με
τον προτεινόμενο μηχανισμό, μόλυνση κυττάρων με ιό δημιουργεί υβριδικά
αντιγονικά σύμπλοκα αυτοαντιγόνων - ιικού RNA - ιικών γλυκοπρωτεϊνών. Μέσω
των συμπλόκων αυτών είναι δυνατόν να γίνει διαμοριακή εξάπλωση Β- και Τλεμφοκυτταρικών επιτόπων από τα ιικά αντιγόνα στα αυτοαντιγόνα και κατά
συνέπεια διάσπαση της ανοσολογικής ανοχής για τα αντιγόνα του εαυτού με την
εμφάνιση της αυτοανοσίας.
(i) Μόλυνση με ιό.
Η μόλυνση με ιό έχει προταθεί σαν έναυσμα της αυτοάνοσης απόκρισης κυρίως για
το σύνδρομο Sjogren (566, 567). Στο σύνδρομο Sjogren υπάρχει πάντα προσβολή
εξωκρινών αδένων (κυρίως των σιελογόνων αδένων), ειδικότητα ιστού που είναι
συμβατή με την ιογενή αιτιολογία της νόσου, ενώ δεδομένα από την αντιγονική
χαρτογράφηση
υποδεικνύουν
ότι
το
ανοσολογικό
σύστημα
στοχεύει
το
σχηματισμένο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο RoRNP και όχι ανεξάρτητα τα
μεμονωμένα συστατικά στοιχεία του (βλέπε κεφάλαιο Δ.V.6) με αποτέλεσμα να
είναι δυνατή η διαμοριακή εξάπλωση των επιτόπων.
Είναι γνωστό ότι η απόπτωση κυττάρων έπειτα από μόλυνση με ιό (με ιό Sindbis)
προκαλεί
την
εμφάνιση
υποκυτταρικών
υβριδικών
πακέτων
ριβονουκλεοπρωτεϊνικών αυτοαντιγόνων - ιικού RNA - ιικών γλυκοπρωτεϊνών τα
οποία οργανώνονται σε φυσαλίδες και μεταφέρονται στη κυτταρική μεμβράνη
(127). Δεδομένα που ενισχύουν το μηχανισμό αυτό είναι:
(α) Η μόλυνση με διάφορους ιούς (ιό του έρπητα, κυτταρομεγαλοϊό, ιό Toga, ιό SV40)
επάγει την υπερέκφραση των αυτοαντιγόνων Ro60, Ro52, La, καλρετικουλίνη και
Sm και την επανακατανομή τους από το κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα προς τη
κυτταρική μεμβράνη (βλέπε κεφάλαια Δ.IIΙ.1.3.2, Δ.ΙΙΙ.2.2.2, 568-570) (τα
αυτοαντιγόνα που υπερεκφράζονται διαφέρουν ανάλογα με τον ιό, την κυτταρική
σειρά ή τη μελέτη). Ταυτόχρονα με την υπερέκφραση των αυτοαντιγόνων
παρατηρείται και υπερέκφραση των MHC-I μορίων (510) καθώς και η σύνθεση
μικρών ιικών RNA (568).
(β) RNA από τον ιό της ερυθράς έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά ταυτόχρονα με τα
αυτοαντιγόνα Ro60 και καλρετικουλίνη (στο 5' και 3' άκρο του αντίστοιχα)
σχηματίζοντας ένα υβριδικό ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο (314, 315, 571).
Όμοια το La αυτοαντιγόνο έχει βρεθεί να δεσμεύει RNA από το ιό της ερυθράς
(572) καθώς και RNA από τον αδενοιό (VA I, VA II), από τον ιό Epstein Barr
(EBER1, EBER2) και τον ιό της φυσαλιδώδους στοματίτιδας (οδηγό RNA) (573).
Η δέσμευση του La αυτοαντιγόνου με τα ιικά RNA δεν είναι παροδική όπως
συμβαίνει με τα περισσότερα ανθρώπινα RNA. Τα ανθρώπινα RNA που είναι
προϊόντα μεταγραφής της RNA πολυμεράσης III (εκτός των hY RNAs) χάνουν την
αλληλουχία πολυουρακίλης από το 3΄ άκρο τους κατά την ωρίμανση τους, ενώ τα
ιικά RNA που παράγονται από την ίδια πολυμεράση τη διατηρούν και μπορούν
μέσω αυτής να συνδέονται σταθερά και μόνιμα με την πρωτεΐνη La (240, 243).
(γ) Αυτοάνοσοι οροί με αντί-La, αντί-Ro ειδικότητα μπορούν να καταβυθίσουν (σε
ανοσοκαταβύθιση) υβριδικά σύμπλοκα που περιέχουν αυτοαντιγόνα και ιικό RNA
από τον κυτταρομεγαλοϊό ή τον ιό Epstein Barr (574, 575). Όμοια οροί με αντί-Sm
και αντί-RNP ειδικότητα έχουν βρεθεί να ανοσοκαταβυθίζουν σύμπλοκα με RNA
του ιού Murine Sarcoma Virus (576). Αντισώματα κατά του ιού αυτού απαντώνται
συχνά σε ασθενείς με ΣΕΛ (577).
(δ) Το αυτοαντιγόνο καλρετικουλίνη συνδέεται ειδικά με τις ιικές γλυκοπρωτεϊνες
gp120 από τον ιό HIV (578), USG και gB από τον κυτταρομεγαλοϊό (579, 580) και
την hemogglutinin (HA) από τον ιό της γρίπης (294, 581, 582). Η καλρετικουλίνη
επίσης υπερεκφράζεται όπως και τα MHC-I μόρια στο κύτταρο και στη κυτταρική
μεμβράνη έπειτα από μόλυνση με ιό (βλέπε κεφάλαιο Δ.IIΙ.2.2.2, 510). Ακόμα θα
πρέπει να σημειωθεί ότι η καλρετικουλίνη είναι το κύριο συστατικό των λυτικών
κοκκίων που απελευθερώνονται από το κυτταροτοξικό Τ-λεμφοκύτταρο για την
καταστροφή του μολυσμένου από ιό κυττάρου (304).
(ε) Τα αυτοαντισώματα αντί-nRNP έχουν συσχετισθεί με μόλυνση με τον ιό HRES-1
(583) και τον ιό Babbon Endogenous Virus (584), ενώ τα αντί-DNA με μόλυνση
από τον ιό πολυώματος (585, 586).
(ii) Διαμοριακή και ενδομοριακή εξάπλωση των επιτόπων. Διασταυρούμενες
αντιδράσεις των αυτοαντισωμάτων.
Η απόπτωση κυττάρων έπειτα από μόλυνση με ιό είναι δυνατόν να απελευθερώσει
υβριδικά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα ιικού RNA - αυτοαντιγόνων και ιικών
γλυκοπρωτεϊνών. Τα σύμπλοκα αυτά μπορούν εν συνεχεία να φαγοκυτταρωθούν
από μακροφάγα κύτταρα ή να προσληφθούν από Β-λεμφοκύτταρα και να
επεξεργαστούν κατάλληλα ώστε να παρουσιαστούν καταρχήν οι Τ-λεμφοκυτταρικοί
επίτοποι
των
ιικών
γλυκοπρωτεϊνων
σε
βοηθητικά
Τ-λεμφοκύτταρα
(TH
λεμφοκύτταρα). Με τη βοήθεια των TH λεμφοκυττάρων μπορεί να γίνει διαμοριακή
εξάπλωση των επιτόπων στο υβριδικό ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο από τις
ιικές γλυκοπρωτεΐνες στα αντιγόνα του εαυτού. Το ποια αυτοαντιγόνα θα
περιλαμβάνει η διαμοριακή επέκταση των επιτόπων εξαρτάται από τη σύνθεση των
υβριδικών συμπλόκων. Τα σύμπλοκα αυτά ανάλογα με την κατηγορία και το είδος
του ιού [π.χ. ιός κατηγορίας I (διπλής έλικας DNA)όπως ο αδενοιός ή ιός
κατηγορίας IVβ (μονής έλικας RNA) όπως ο ιός Sindbis)] και ανάλογα με το αν ο
ιός κάνει χρήση της RNA πολυμεράσης III ή του ματισματοσώματος (spliceosome)
μπορούν να περιλαμβάνουν διαφορετικά αυτοαντιγόνα. Έτσι είναι δυνατό να
περιλαμβάνουν παράγοντες του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου Ro/La RNP
ή/και του Sm/nRNP RNP. Επίσης είναι δυνατό να περιλαμβάνουν και DNA στη
σύνθεση τους, αφού η Ro52KD πρωτεΐνη του Ro/RNP συμπλόκου μπορεί να
δεσμεύει άμεσα DNA (287). Με το μηχανισμό αυτό διασπάται η ανοσολογική
ανοχή και ενεργοποιούνται ανεργικοί αυτοδραστικοί Τ και Β λεμφοκυτταρικοί
κλώνοι (βλέπε κεφάλαιο Β.II.1) (119, 129-131). Οι κλώνοι αυτοί είναι πλέον σε
θέση να αναγνωρίζουν εκτός από το υβριδικό ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο
και τα ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα Ro/La RNP ή Sm/nRNP RNP ή και τα
υπόλοιπά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα των ιδίων πρωτεϊνικών αυτοαντιγόνων
που έχουν κατά καιρούς προσδιοριστεί: Ro60/5SRNA (284, 285), La/U1RNP (587),
La/U6RNP(588), Ro60/UsnRNP (345) εφόσον αυτά απελευθερώνονται από τα
κύτταρα που αποπίπτουν. Στα σύμπλοκα αυτά τώρα μπορεί να γίνει νέα διαμοριακή
επέκταση των επιτόπων στα επιμέρους αντιγονικά συστατικά τους.
Εκτός από τη διαμοριακή εξάπλωση των επιτόπων έχει παρατηρηθεί ότι γίνεται και
ενδομοριακή διασπορά των επιτόπων. Η διαμοριακή και ενδομοριακή επέκταση
των αντιγονικών καθοριστών έχει σαν επακόλουθο την δημιουργία μιας πληθώρας
διαφορετικών αυτοαντισωμάτων που αναγνωρίζουν επιτόπους πάνω στα ίδια
πρωτεϊνικά αυτοαντιγόνα. Η ποικιλία αυτή των αυτοαντισωμάτων δίνει έδαφος σε
Σχήμα 81. Τα αντί-dsDNA αυτοαντισώματα δεσμεύονται κυρίως (μη
ειδικά) στις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες και
στα μόρια δεοξυριβόζης στο σκελετό του DNA διπλής
έλικας.
διασταυρούμενες αντιδράσεις και στην ανάπτυξη ενός πλούσιου ιδιοτυπικού αντιιδιοτυπικού πλέγματος. Τα αυτοαντισώματα που δίνουν τις περισσότερες
διασταυρούμενες αντιδράσεις (και κατά πάσα πιθανότητα προκύπτουν από αυτές)
είναι τα αντισώματα κατά διπλής έλικας DNA (dsDNA) που απαντώνται σε
ασθενείς με ΣΕΛ. Τα αυτοαντισώματα αυτά στοχεύουν τη φυσική διπλή μορφή του
DNA οπού οι δύο σκελετοί φωσφορικής πολυδεοξυριβόζης τυλίγονται γύρω από τις
κεντρικά προσανατολισμενές βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης. Λόγω της
χωροδιατάξης αυτής τα αντί-dsDNA αυτοαντισώματα δεν μπορούν εύκολα να
αλληλεπιδράσουν με τις βάσεις του DNA (οι οποίες προσφέρουν μια ποικιλία
δραστικών χημικών ομάδων) και δεσμεύονται κυρίως με μη ειδικό τρόπο στις
αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες και τα μόρια δεοξυριβόζης στο σκελετό
του DNA (Σχήμα 81). Έτσι τα αντί-dsDNA αντισώματα αποτελούν μία ειδική
κατηγορία πολυδραστικών αντισωμάτων και μπορούν να αντιδράσουν εκτός από το
dsDNA και με φωσφολιπίδια [όπως η καρδιολιπίνη (589)], φωσφορυλιομένες
πρωτεϊνες (590), πεπτίδια (591) και αυτοαντιγόνα όπως τα Sm και nRNP (592-595).
Η διασταυρούμενη αντίδραση των αντί-dsDNA αυτοαντισωμάτων με τα Sm και
nRNP αντιγόνα (αντισώματα κατά των οποίων επίσης απαντώνται στο ΣΕΛ)
μπορεί να είναι υπεύθυνη για τη γένεση των αντί-dsDNA αυτοαντισωμάτων, ενώ οι
διασταυρούμενες αντιδράσεις τους με αντιγόνα των νεφρικών σπειραμάτων (596604), με αντιγόνα του ενδοθηλίου των αγγείων (605, 606) και με μεμβρανικά
αντιγόνα των νευρώνων του εγκεφάλου (607) μπορεί να είναι υπεύθυνες για
ορισμένες από τις κλινικές εκδηλώσεις του ΣΕΛ. Θα πρέπει επίσης να
σημειώσουμε ότι τα αντί-dsDNA αντισώματα εμφανίζουν και μια ιδιοτυπική αντιιδιοτυπική σχέση με τα αντί-Ro αυτοαντισώματα και έτσι τα τελευταία μπορεί
να ενέχονται στη ρύθμιση της παραγωγής των πρώτων ή αντίστροφα (βλέπε
κεφάλαιο Β.I.2.4, Σχήμα 26).
Μέσα
στο
γενικότερο
πλαίσιο,
των
διασταυρούμενων
αντιδράσεων
των
αυτοαντισωμάτων και του ιδιοτυπικού - αντιιδιοτυπικού δικτύου, έχει παρατηρηθεί
διασταυρούμενη αντίδραση μεταξύ των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων από ασθενείς με
ΣΕΛ και πεπτιδίων από τη β-αλυσίδα των HLA μορίων DR3 και DRw53 τα οποία
συσχετίζονται ισχυρά με την ύπαρξη των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων (βλέπε
κεφάλαιο Δ.IIΙ.1.3.4). Τα αυτοαντισώματα αυτά εφόσον υπάρχει το κατάλληλο
γενετικό υπόβαθρο από τη μεριά του ασθενούς (με την έκφραση των DR3 ή DRw53
αντιγόνων ιστοσυμβατότητας τάξεως II) μπορούν να πολυμερίσουν ή να διμερίσουν
τα MHC-II μόρια και μιμούμενα με αυτό τον τρόπο ορισμένα υπεραντιγόνα (400,
401) να προκαλέσουν πολυκλωνική ενεργοποίηση των Β-λεμφοκυττάρων (βλέπε
κεφάλαια Β.I.2.1, Δ.IIΙ.1.3.4). Όμοια αντί-CD4 αντισώματα που ανευρίσκονται σε
ασθενείς με ΣΕΛ (608) μπορούν να διμερίσουν ή να πολυμερίσουν CD4 μόρια στην
επιφάνεια Τ-λεμφοκυττάρων προκαλώντας μη ειδική ενεργοποίηση των τελευταίων
(609-612).
(iii) Δράση παραγόντων που ευοδώνουν την διάθεση των αυτοαντιγόνων στο
ανοσολογικό σύστημα.
Η μόλυνση με ιό μπορεί να οδηγήσει σε απελευθέρωση των αντιγονικών υβριδικών
ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων και να στρέψει την ανοσολογική απόκριση
κατά ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων και πρωτεϊνών του εαυτού. Η
αυτοάνοση αυτή ανοσολογική απόκριση όμως δεν φαίνεται να μπορεί να συνεχιστεί
στην ίδια ένταση - παρά την πολυκλωνική ενεργοποιήση - όταν εξαλειφθεί ο ιός
αφού οδηγείται σε μεγάλο βαθμό από τα αυτοαντιγόνα και ο ιός είναι υπεύθυνος
για την απελευθέρωση τους.
Τα αυτοαντιγόνα μπορούν να γίνουν διαθέσιμα στο ανοσολογικό σύστημα με δύο
επιπλέον τρόπους (α) με την καταστροφή / απόπτωση των κυττάρων (128) (π.χ. από
εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων και δράση του συμπληρώματος, από δράση
κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων ή UV ακτινοβολίας) και (β) με τη δράση
παραγόντων
που
προκαλούν
υπρέκφραση
τους
και
επανακατανομή
των
αυτοαντιγόνων από το κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα στη κυτταρική μεμβράνη. Οι
παράγοντες αυτοί είναι η ορμονική διέγερση με β-οιστραδιόλη, η υπεριώδης
ακτινοβολία και παράγοντες που προκαλούν στρες στα κύτταρα όπως χημικοίκυτταροτοξικοί παράγοντες, βαριά μέταλλα και θερμικό σοκ (βλέπε κεφάλαια
Δ.IIΙ.1.3.2, Δ.IIΙ.2.2.2, 350, 354, 513, 613). Είναι πιθανό μάλιστα να απαιτείται και
συνδυασμένη
δράση
κάποιων από τους παραπάνω
παράγοντες για την
αποτελεσματική τροφοδότηση του ανοσολογικού συστήματος με αυτοαντιγόνα και
τη συνέχιση της αυτοάνοσης απόκρισης.
Σύμφωνα με το μηχανισμό παθογένεσης της αυτοάνοσης ανοσολογικής απόκρισης
που παρουσιάστηκε, η απόκριση οδηγείται από τα αντιγόνα (ιικά καταρχήν,
αυτοαντιγόνα
έπειτα),
διευρύνεται
μέσω
του
μηχανισμού
διαμοριακής
-
ενδομοριακής εξάπλωσης των επιτόπων και διασταυρούμενων αντιδράσεων, ενώ
στη παθογένεια της ενέχονται περιβαλλοντολογικοί παράγοντες (ιοί, UV
ακτινοβολία), ορμονικοί παράγοντες (β-οιστραδιόλη), γενετικοί παράγοντες (HLA
DR3), παράγοντες που προκαλούν στρες [χημικοί κυτταροτοξικοι (φαρμακευτικοί;)
, ίσως και ψυχολογικοί]. Επίσης ο μηχανισμός αυτός περιλαμβάνει καταρχήν την
ανοσολογική απόκριση σε ιογενή μόλυνση (Th1 απόκριση) που ακολουθείται από
ανοσολογική
απόκριση
στα
αυτοαντιγόνα
με
εξάπλωση
επιτόπων
και
διασταυρούμενες αντιδράσεις (Th2 απόκριση). Ένα τέτοιο μοντέλο απόκρισης δύο
σταδίων όπου η αυξημένη παραγωγή τύπου Th1 κυτταροκινών (IL-2 και INF-γ)
ακολουθείται από την παραγωγή Th2 κυτταροκινών (IL-4 και IL-10) έχει
παρατηρηθεί πρόσφατα στον πειραματικό Λύκο (614, 615), ενώ παρόμοια έκφραση
κυτταροκινών έχει βρεθεί σε επίπεδο mRNA στους σιελογόνους αδένες χείλους
ασθενών με σύνδρομο Sjogren (616, 617).
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.
Corey MJ, E.Hallakova: Studies on chymotrypsin-like catalysis by synthetic
peptides. Appl Biochem Biothechnol 47:199-212, 1994
2.
Johnsson K, R.K.Allemann: Synthesis, structure and activity of artificial, rationally
designed catalytic polypeptides. Nature 365:530-532, 1993
3.
Tagliabue A, Boraschi D: Cytokines as vaccine adjuvants: interleukin 1 and its
synthetic peptide 163-171. Vaccine 11:594-595, 1993
4.
Van Regenmortel MH: Synthetic peptides versus natural antigens in immunoassays.
Ann Biol Clin Paris 51:39-41, 1993
5.
Leinikki P, Lehtinen M, Hyoty H, Parkkonen P, Kantanen ML, Hakulinen J:
Synthetic peptides as diagnostic tools in virology. Adv Virus Res 42:149-186, 1993
6.
Park HJ, Byun SM, Ha YJ, Ahn JS, Moon HM: Identification of immunodominant
epitopes in the core and non-structural region of hepatitis C virus by enzyme
immunoassay using synthetic peptides. J Immunoassay 16:167-181, 1995
7.
Nakagiri I, Ichihara K: ELISA for anti-HCV antibody employing a shorter synthetic
core region peptide. J Virol Methods 52:195-207, 1995
8.
Cernescu C, Popescu A, Tirdei G, Alexandrescu R, Ruta SM: Preliminary results of
HIV screening in sentinel facilities in Romania. Rev Roum Virol 44:171-173, 1993
9.
Brocke S, Brautbar C, Steinman L: In vitro proliferative responses and antibody
titers specific to human acetylcholine receptor synthetic peptides in patients with
myasthenia gravis and relation to HLA class II genes. J Clin Invest 82:1894-1900,
1988
10.
Mori T, Sugawa H, Piraphatdist T: Biochem Biophys Res Comm 178:165-172, 1991
11.
Hines J, Danho W, and Elkon K.: Detection and quantification of human anti-Sm
antibodies using synthetic peptides and recombinant SmB antigens. Arthritis
Rheum 34:572-579, 1991
12.
Muto P, Lastoria S, Varrella P, Vergara E, Salvatore M, Morgano G, Lister James
J, Bernardy JD, Dean RT, Wencker D, et al: Detecting deep venous thrombosis
with technetium-99m-labeled synthetic peptide P280. J Nucl Med 36:1384-1391,
1995
13.
Arnon R. Synthetic peptides as the basis for future vaccines. TIBS 11:521-524, 1986
14.
Sela M. Science 166:1365-1374, 1969
15.
Dale J.and Beachey E. J Exp Med 156:1165-1176, 1982
16.
Audibert F, Jolivet M, Chedid L. Nature 289:593-595, 1981
17.
Jacob C., Sela M, and Arnon R Proc Natl Acad Sci USA 80:7611-7615,1983
18.
Gerin J, Alexander H, Shih J.: Proc Natl Acad Sci USA 80:2365-2369, 1983
19.
Shapira M, Misulovin Z and Arnon R.: Specificity and cross-reactivity of synthetic
peptides derived from a major antigenic site of influenza hemagglutinin. Mol
Immunol 22:23-28, 1985
20.
Bittle J. Houghton R, Alexander H. Nature 298:30-33, 1982
21.
Zavala F, Masuda A, Graves P. J Immunol 135:1-4, 1985
22.
Del Giudice G: Hsp70: a carrier molecule with built-in adjuvanticity. Experientia
50:1061-1066, 1994
23.
Toth I: A novel chemical approach to drug delivery: lipid amino acid conjugates. J
Drug Target 2:217-239, 1994
24.
Schwartz R Ann. Rev. Immunol. 5:29-42, 1966
25.
Buus S, Sette A, Colon S, Miles C and Grey H: The relation between major
histocompatibility complex (MHC) restriction and the capacity of Ia to bind
immunogenic peptides. Science 235:1353-1358, 1987
26.
Ho P, Mutch D, Winkel K, Saul A, Jones G, Doran T and Rzepczyk C Eur. J.
Immunol. 20:477, 1990
27.
Kaumaya P, Kobs-Conrad S, Seo Y, Lee H, VanBuskirk A, Feng N, Sheridan J and
Stevens V: Peptide vaccines vncorporating a ‘Promiscuous’ T-cell epitope bypass
certain haplotype restricted immune responces and provide broad spectrum
immunogenicity J. Mol. Recognition 6:81-94, 1993
28.
Lam KS: Treatment of B-cell lymphoma using peptides. A novel concept. West J
Med 158:475-479, 1993
29.
Barna BP, Eppstein DA, Thomassen MJ, Nestor JJ, Jr., Ho T, Medendorp SV,
Deodhar SD: Therapeutic effects of a synthetic peptide of C-reactive protein in preclinical tumor models. Cancer Immunol Immunother 36:171-176, 1993
30.
Celis E, Tsai V, Crimi C, DeMars R, Wentworth PA, Chesnut RW, Grey HM, Sette
A, Serra HM: Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans
using primary cultures and synthetic peptide epitopes. Proc Natl Acad Sci U S A
91:2105-2109, 1994
31.
Denton G, Sekowski M, Price MR: Induction of antibody responses to breast
carcinoma associated mucins using synthetic peptide constructs as immunogens.
Cancer Lett 70:143-150, 1993
32.
Fields G: Synthetic peptides and tumor cell metastasis. Peptide Research 6(3):115120
33.
Humphries MJ, Olden K and Yamada KM: A synthetic peptide from fibronectin
inhibits experimental metastasis of murine melanoma cells. Science 233:467-470,
1986
34.
McCarthy J, Mickelson D, Fields C and Fields G: The use of collagen-model
peptides to correlate collagen primary and secondary structural effects with the
mechanisms of tumor cell adhesion, motility, and invasion. Peptides in press, 1992
35.
Sakamoto N., Iwahana M, Tanaka N and Osada Y:Inhibition of angiogenesis and
tumor growth by a synthetic laminin peptide CDPGYIGSR-NH2. Cancer Res.
51:903-906, 1991
36.
Adorini L: Selective inhibition of T cell responses by protein and peptide-based
immunotherapy. Clin Exp Rheumatol 11 Suppl 8:S41-4, 1993
37.
Takamori M: Myasthenia gravis: pathogenesis and therapeutic approach on the
basis of molecular structure and immunogenicity of acetylcholine receptor. Nippon
Rinsho 52:3038-3045, 1994
38.
Wahl SM, Allen JB, Hines KL, Imamichi T, Wahl AM, Furcht LT, McCarthy JB:
Synthetic fibronectin peptides suppress arthritis in rats by interrupting leukocyte
adhesion and recruitment. J Clin Invest 94:655-662, 1994
39.
Krensky AM: T cells in autoimmunity and allograft rejection. Kidney Int Suppl
44:S50-6, 1994
40.
Goss JA, Alexander Miller MA, Gorka J, Flye MW, Connolly JM, Hansen TH:
Specific prolongation of allograft survival by a T-cell-receptor-derived peptide. Proc
Natl Acad Sci U S A 90:9872-9876, 1993
41.
Harker LA: New antithrombotic strategies for resistant thrombotic processes. J Clin
Pharmacol 34:3-16, 1994
42.
Rozdzinski
E,
Jones
T,
Burnette
WN,
Burroughs
M,
Tuomanen
E:
Antiinflammatory effects in experimental meningitis of prokaryotic peptides that
mimic selectins. J Infect Dis 168:1422-1428, 1993
43.
Mitchell A, Erickson B, Ryabtsev R, Hodges R and Merrifield J. Am . Chem. Soc.
98:7357-7362, 1976
44.
Bodanszky M: «Principles of peptide synthesis» Springer-Verlag, Berlin, Germany,
9-52, 1984
45.
Costle J, Le-Nguyen D and Castro B Tetrahedron lett. 31:205-208, 1990
46.
Clark-Lewis R, Angew B Chem. Int. Ed. Engl. 24:799, 1985
47.
Nakatsuka T, Sasaki T and Kaiser E: Peptide segment coupling catalyzed by the
semisynthetic enzyme thiolsubtilisin. J. Am. Chem. Soc. 109:3808-3810, 1987
48.
Jackson D, Burnier J, Quan C, Stanley M, Tom J and Wells J: A designed peptide
ligase for total synthesis of ribonuclease A with unnatural catalytic residues. Science
266:243-247, 1994
49.
Wunsch E et al Methoden Org. Chem. (Huben-Weyl) 4th Ed Vol. 15a, 1974
50.
Jones J: The chemical peptide synthesis, University Press, Oxford, 1991
51.
Bodansky M: Peptide Chemistry, A Practical Textbook, Springer, Berlin 1988
52.
Rotzschke O, Falk K, Deres K, Schild H, Norda M, Metzger J, Jung G and
Rammensee H Nature 348:252-254, 1990
53.
Weil H, Beck-Sickinger A, Metzger J, Stevanovic S, Jung G, Josten M, Sahl H Eur.
J. Biochem 194:217-223, 1990
54.
Houghten R: General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers
of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual
amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135, 1985
55.
Berg R, Almdal K, Batsberg Pedesrsen W, Holm A, Tam J, Merrifield R J. Am.
Chem. Soc. 111:8024-8026, 1989
56.
Krchnak V, Vagner J: Color-monitored solid-phase multiple peptide synthesis
under low-pressure continuous-flow conditions. Pept. Res. 3:182-193, 1990
57.
Geysen HM, Meloen RH, and Bartelling SJ: Use of peptide synthesis to prove viral
antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81:3998-4002, 1984
58.
Frank R, Guler S, Krause S, Lindenmaier W. Peptides 1990, Proc. 21st Eur. Pept.
Symp. (Eds: Giralt E, Andreu D) Escom, Leiden, 151-152, 1991
59.
Blankenmeyer-Menge B, Frank R,. Tetrahedron Lett. 29:5871-5874, 1988
60.
Lebl M, Eichler: Simulation of continuous solid phase synthesis: synthesis of
methionine enkephalin and its analogs. J. Pept. Res. 2:297-300, 1989
61.
Zimmermann N, Beck-Sickinger A, Folkers G, Krickl S, Muller I and Jung G:
Conformational and epitope mapping of herpes-simplex-virus type-1 thymidine
kinase using synthetic peptide segments. Eur. J. Biochem. 200:519-528, 1991
62.
Beck-Sickinger A, Gaida W, Schnorrenberg G, Lang R, Jung G: Neuropeptide Y:
identification of the binding site. Int. J. Pept. Protein Res. 36:522-530, 1990
63.
Van’t Hof W, Driedijk P, van der Berg M, Beck-Sickinger A, Jung G, Aalberse R:
Epitope mapping of the Dermatophagoides pteronyssinus house dust mite major
allergen Der p II using overlapping synthetic peptides. Mol. Immunol. 1225-1232,
1991
64.
Arad O, Houghten R: An evaluation of the advantages and effectiveness of picric
acid monitoring during solid phase peptide synthesis. Pept. Res. 3:42-50, 1990
65.
Eichler J, Beyermann M, Bienert M, Lebl Peptides 1988 Proc. 20th Eur. Pept. Symp.
(Eds.: Jung G, Bayer E), de Gruyter, Berlin, 205-207, 1989
66.
Frank R, Doring R Tetrahedron 44:6031-6040, 1988
67.
Eichler J, Furkert J, Bienert M, Rohde W and Lebl M Peptides 1990, Proc. 21st Eur.
Pept. Symp. (Eds: Giralt E, Andreu D) Escom, Leiden, 156-157, 1991
68.
Berg R, Almdal K, Batsberg-Pedersen W, Holm A, Tam J, Merrifield R Peptides,
Chemistry, Structure and Biology, Proc. 11th Am. Pept. Symp. (Eds: Rivier J,
Marshall G), Escom Leiden, 1036-1037, 1990
69.
Berg R, Almdal K, Batsberg-Pedersen W, Holm A, Tam J, Merrifield R Peptides
1990, Proc. 21st Eur. Pept. Symp. (Eds: Giralt E, Andreu D) Escom, Leiden, 149150, 1991
70.
Geysen H, Mason T and Rodda S: Cognitive features of continuous antigenic
determinants. J. Mol. Recognition 1:32-41, 1988
71.
Saul A and Geysen H: Identification of epitopes through peptide technology (in
New Generation Vaccines, Eds Woodrow G, Levine M. Dekker, New York), 117126, 1990
72.
Geysen H: Molecular technology: Peptide epitope mapping and the pin technology.
Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 21:523-533, 1990
73.
Geysen HM, Rodda SJ, Mason TJ, Tribbick G and Schoofs PG: Strategies for
epitope analysis using peptide synthesis 102:259-274, 1987
74.
Spellmeyer DC, Brown S, and Stauber GB: Endothelin receptor ligands.
Replacement net approach to SAR determination of potent hexapeptides. Bioorg.
Med. Chem. Lett. 3:519-524, 1993
75.
Wang JX, DiPasquale AJ, Bray AM, Maeji NJ and Geysen HM: Study of stereorequirements of substance P binding to NK1 receptors using analogoues with
systematic D-amino-acid replacements. Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:451-456, 1993
76.
Wang JX, DiPasquale AJ, Bray AM, Maeji NJ Spellmeyer DC and Geysen HM.
Systematic study of substance P analogs. II. Rapid screening of 512 substance P
stereoisomers for binding to NK1 receptor. Int. J. Peptide Protein Res. 42:392-399,
1993
77.
Bray AM, Lagniton LM, Valerio RM and Maeji NJ Sonication-assisted cleavage of
hydrophobic peptides. Application in Multipin synthesis. Tetrahedron Lett. 31:
5811-5814, 1990
78.
Bray AM, Maeji NJ, Valerio RM, Campell RA and Geysen HM. Direct clevage of
peptides from a solid support into aqueous buffer. Application in simultaneous
multiple peptide synthesis J. Org. Chem. 56: 6659-6666, 1991
79.
Bray AM, Valerio RM and Maeji NJ. Cleavage of resin-bound peptide esters with
ammonia vapour. Simultaneous multiple synthesis of peptide amides. Tetrahedron
Lett. 34: 4411-4414, 1993
80.
Bray AM, Jhingran AG, Valerio RM and Maeji NJ. Simultaneous multiple synthesis
of peptide amides by the multipin method. Application of vapor-phase
ammonolysis. J. Org. Chem. 59:2197-2203, 1994
81.
Reece JC, Geysen HM and Rodda SJ. Mapping the major human T-helper epitopes
of tetanous toxin. The emerging picture. J. Immunol. 151:1-10, 1993
82.
Weiner AJ, Geysen HM et al: Evidence for immune selection of hepatitis C virus
(HCV) putative envelope glycoprotein variants: Potential role in chronic HCV
infections. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 3468-3472, 1992
83.
Maeji NJ, Bray AM and Geysen HM: Multipin peptide synthesis strategy for T-cell
epitope analysis. J. Immunol. Methods 134:23-33, 1990
84.
Valerio RM, Bray AM, Campbell RA, DiPasquale A, Margellis C, Rodda SJ,
Geysen HM and Maeji NJ. Multipin peptide synthesis at the micromole scale using
2-hydroxyethyl methacrylate grafted polyethylene supports. Int. J. Pept. Protein
Res. 42:1-9, 1993
85.
Maeji NJ, Bray AM, Valerio RM and Wang W: Larger scale multipin peptide
synthesis Peptide Research 8(1):33-38, 1995
86.
Gnjatic S, Bressac de Paillerets B, Guillet JG, Choppin J: Mapping and ranking of
potential cytotoxic T epitopes in the p53 protein: effect of mutations and
polymorphism on peptide binding to purified and refolded HLA molecules. Eur J
Immunol 25:1638-1642, 1995
87.
Bertoletti A, Costanzo A, Chisari FV, Levrero M, Artini M, Sette A, Penna A,
Giuberti T, Fiaccadori F, Ferrari C: Cytotoxic T lymphocyte response to a wild type
hepatitis B virus epitope in patients chronically infected by variant viruses carrying
substitutions within the epitope. J Exp Med 180:933-943, 1994
88.
Mutch D, Underwood J, Geysen M, Rodda S: Comprehensive T-cell epitope
mapping of HIV-1 env antigens reveals many areas recognized by HIV-1seropositive and by low-risk HIV-1-seronegative individuals. J Acquir Immune
Defic Syndr 7:879-890, 1994
89.
Burrows SR, Gardner J, Khanna R, Steward T, Moss DJ, Rodda S, Suhrbier A: Five
new cytotoxic T cell epitopes identified within Epstein-Barr virus nuclear antigen 3.
J Gen Virol 75:2489-2493, 1994
90.
Selvey LA, Tindle RW, Geysen HM, Haller CJ, Smith JA and Frazer IH:
Identification of B-cell epitopes 18 E7 open reading frame protein. J. Immunol.
145:3105-3110, 1990
91.
Zhao YP, Shi BJ, Deng HK, Yu DT, Hamachi M, Hamachi T, Zhao DF, Tang SR,
Tsang JC, Park MS, Terasaki P and Tribbick G: Epitope analysis of an HLA-B27derived synthetic peptide: a possible approach to analyzing HLA class I antigens.
Clin. Exp. Rheumatol. 9:235-239, 1991
92.
Das MK and Lindstrom J: Epitope mapping of antibodies to acetylcholine receptor
alpha subunits using peptides synthesized on polyprolyne eggs. Biochemistry 30:
2470-2477,1991
93.
James JA and Harley JB: Linear epitope mapping of an Sm B/B’ polypeptide. J.
Immunol. 148: 2074-2079, 1992
94.
Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT and Solas D: Light-directed,
spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 251:767-773, 1991
95.
Lam KS, Salmon SE, Hersh EM, Hruby VJ, Kazmierski WM and Knapp RJ: A new
type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity Nature
354:82-84, 1991
96.
Houghten RA, Pinilla C, Blondelie SE, Appel JR Dooley CT, Cuervo JH:
Elucidation of discontinuous linear determinants in peptides. Nature 354:84-86,
1991
97.
Gras-Masse H, Ameisen JC, Boutillon C, Rouaix F, Bossus M, Deprez B, Capron A
and Tartar A Peptides, Chemistry and Biology, Proc. 11th Am. Pept. Symp. (Eds:
Smith JA, Rivier JE), Escom, Leiden 842-844, 1992
98.
Tjoeng FS, Towery DS, Bulock JW, Whipple DE, Fok KF, Williams MH, Zupec
ME and Adams SP: Multiple peptide synthesis using a single support (MPS3). Int. J.
Pept. Protein Res. 35: 141-146, 1990
99.
Furka A, Sebestyen F, Asgedom M and Dibo G: General method for rapid synthesis
of multicomponent peptide mixtures. Int. J. Pept. Protein Res. 37: 487-493, 1991
100.
Sepetov NF, Krchnak V, Stankova M, Wade S, Lam KS, Lebl M: Library of
libraries: approach to synthetic combinatorial library design and screening of
"pharmacophore" motifs. Proc Natl Acad Sci U S A 92:5426-5430, 1995
101.
Holmes CP, Adams CL, Kochersperger LM, Mortensen RB, Aldwin LA: The use of
light-directed combinatorial peptide synthesis in epitope mapping. Biopolymeres 37:
199-211, 1995
102.
Smith MH, Lam KS, Hersh EM, Lebl M, Grimes WJ: Peptide sequences binding to
MHC class I proteins. Mol Immunol 31:1431-1437, 1994
103.
Gavin MA,
Dere
B,
Grandea
AG,
Hogquist
KA,
Bevan MJ:
Major
histocompatibility complex class I allele-specific peptide libraries: identification of
peptides that mimic an H-Y T cell epitope. Eur J Immunol 24:2124-2133, 1994
104.
Mattioli S, Imberti L, Stellini R, Primi D: Mimicry of the immunodominant
conformation-dependent antigenic site of hepatitis A virus by motifs selected from
synthetic peptide libraries. J Virol 69:5294-5299, 1995
105.
Pinilla C, Appel JR, Houghten RA: Investigation of antigen-antibody interactions
using a soluble, non-support-bound synthetic decapeptide library composed of four
trillion (4 x 10(12) sequences. Biochem J 301:847-853, 1994
106.
Sakihama T, Smolyar A, Reinherz EL: Oligomerization of CD4 is required for
stable binding to class II major histocompatibility complex proteins but not for
interaction with human immunodeficiency virus gp120. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
92:6444-6448, 1995
107.
Roussel A, Anderson BF, Baker HM, et al: Crystal structure of the streptococcal
superantigen SPE-C: dimerization and zinc binding suggest a novel mode of
interaction with MHC class II molecules. Nat.Struct.Biol. 4:635-643, 1997
108.
Bernatchez C, Al DR, Mayer PE, et al: Functional analysis of Mycoplasma
arthritidis-derived mitogen interactions with class II molecules.
65:2000-2005, 1997
Infect.Immun.
109.
Cohen PL, Cheek RL, Hadler JA, et al: The subclass distribution of human IgG
rheumatoid factor. J.Immunol. 139:1466-1471, 1987
110.
Miller FW, Twitty SA, Biswas T, et al: Origin and regulation of a disease-specific
autoantibody response. Antigenic epitopes, spectrotype stability, and isotype
restriction of anti-Jo-1 autoantibodies. J.Clin.Invest. 85:468-475, 1985
111.
Shlomchik M, Mascelli M, Shan H: Anti-DNA antibodies from autoimmune mice
arise by clonal expansion and somatic mutation. J.Exp.Med. 171:265-292, 1990
112.
Manheimer-Lory A, Katz JB, Pillinger M, et al: Molecular characteristics of
antibodies bearing an anti-DNA-associated idiotype. J.Exp.Med. 174:1639-1652,
1991
113.
Plotz PH: What drives autoantibodies? The evidence from spotaneous human
autoimmune diseases, in de Vries RRP, Cohen IR, van Rood JJ. (eds): The Role of
Micro-Organisms in Non-Infectious Diseases. London, Springer-Verlag, 1990, pp
111-121
114.
Tan EM: Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and
probes for cell biology. Adv.Immunol. 44:93-151, 1989
115.
Tan EM: Do autoantibodies inhibit function of their cognate antigens in vivo?
[editorial]. Arthritis Rheum. 32:924-925, 1989
116.
Kaufman DL, Clare-Salzler M, Tian J: Spontaneous loss of T-cell tolerance to
glutamic acid decarboxylase in murine insulin-dependent diabetes. Nature 366:6972, 1993
117.
Khoury SJ, Sayegh MH, Hancock WW, et al: Acquired tolerance to experimental
autoimmune encephalomyelitis by intrathymic injection of myelin basic protein or
its major encephalitogenic peptide. J.Exp.Med. 178:559-566, 1993
118.
Tisch R, Yang XD, Singer SM, et al: Immune response to glutamic acid
decarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice. Nature 366:72-75,
1993
119.
Ohashi PS, Oehen S, Buerki K: Ablation of "tolerance" and induction of diabetes by
virus infection in viral antigen transgenic mice. Cell 65:305-317, 1991
120.
Schwimmbeck P, Yu DT, Oldstone MBA: Autoantibodies to HLA B27 in the sera
of HLA B27 patients with ankylosing spondylitis and Reiter's syndrome. Molecular
mimicry with Klebsiella pneumoniae as potential mechanism of autoimmune
disease. J.Exp.Med. 166:173-181, 1987
121.
Horsfall AC: Molecular mimicry and autoantigens in connective tissue diseases.
Mol.Biol.Reports 16:139-147, 1992
122.
Tsuchiya N, Endo T, Matsuta K: Detection of glycosylation abnormality in
rheumatoid IgG using N-acetylglucosamine-specific Psathyrella velutina lectin.
J.Immunol. 151:1137-1146, 1993
123.
Smith H, Chen IM, Kubo R, et al: Neonatal thymectomy results in a repertoire
enriched in T cells deleted in adult thymus. Science 245:749-752, 1989
124.
Theofilopoulos AN: Bona C, Siminovitch KA, Zanetti M, et al.
(eds):
The
Molecular Pathology of Autoimmune Diseases. Harwood Academic Publishers,
1993, pp 1-12
125.
Brocke S, Gaur A, Piercy C: Induction of relapsing paralysis in experimental
autoimmune encephalomyelitis by bacterial superantigen. Nature 365:642-644, 1993
126.
Greiner DL, Mordes JP, Handler ES, et al: Depletion of RT6.1+ T lymphocytes
induces diabetes in resistant biobreeding/Worcester (BB/W) rats. J.Exp.Med.
166:461-475, 1987
127.
Rosen A, Casciola RL, Ahearn J: Novel packages of viral and self-antigens are
generated during apoptosis. J.Exp.Med. 181:1557-1561, 1995
128.
Casciola RL, Anhalt G, Rosen A: Autoantigens targeted in systemic lupus
erythematosus are clustered in two populations of surface structures on apoptotic
keratinocytes . J.Exp.Med. 179:1317-1330, 1994
129.
Takeno M, Nagafuchi H, Kaneko S, et al: Autoreactive T cell clones from patients
with systemic lupus erythematosus support polyclonal autoantibody production. J
Immunol. 158: 3529-38,1997
130.
Carruthers C, Bell D: Production and characterization of human hybridoma
monoclonal anti-Sm and anti-U1RNP antibodies spontaneously produced from
normal human lymphocytes. J Autoimmun 5: 527-44, 1992
131.
Oldstone MBA, Nerenberg M, Southern P, et al: Virus infection triggers insulindependent diabetes mellitus in a transgenic model: role of anti-self (virus) immune
response. Cell 65:319-332, 1991
132.
Drosos AA, Dimou GS, Siamopoulou-Mavridou A, Hatzis J, Moutsopoulos HM:
Subacute cutaneous lupus erythematosus in Greece. A clinical, serological and
genetic study. Ann Med Interne Paris. 141: 421-4, 1990
133.
Andonopoulos AP, Papasteriades CA, Drosos AA, Dimou GS, Moutsopoulos-HM:
HLA alloantigens in Greek patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp
Rheumatol. 8: 47-50, 1990
134.
Papasteriades CA, Skopouli FN, Drosos AA, Andonopoulos AP, Moutsopoulos
HM: HLA-alloantigen associations in Greek patients with Sjogren's syndrome. J
Autoimmun. 1: 85-90, 1988
135.
Moutsopoulos HM, Papasteriades CA, Skopouli FN, Drosos-AA: HLA antigens in
patients with Sjogren's syndrome Ter-Arkh. 60: 28-30, 1988
136.
Chiang B, Bearer E, Ansari A, et al: The bm12 mutation and aytoantibodies to
dsDNA in NZB.H-2bm12 mice. J.Immunol. 145:94-101, 1990
137.
Watanabe-Fukunaga R, Brannan CI, Copeland NG: Lymphoproliferation disorder
in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis. Nature 356:314317, 1992
138.
Takahashi T, Tanaka M, Brannan CI: Generalized lymphoproliferative disease in
mice, caused by a point mutation in the Fas ligand. Cell 76:969-976, 1994
139.
Lynch DH, Watson ML, Alderson MR: The mouse Fas-ligand gene is mutated in
gld mice and is part of a TNF family gene cluster. Immunity 1:131-136, 1994
140.
Elkon KB: Apoptosis in SLE--too little or too much? Clin Exp Rheumatol. 12: 5539, 1994
141.
Rose LM, Latchman DS, Isenberg DA: Bcl-2 and Fas, molecules which influence
apoptosis. A possible role in systemic lupus erythematosus? Autoimmunity. 17: 2718, 1994
142.
Olee T, Yang PM, Siminovitch KA: Molecular basis of an autoantibody-associated
restriction fragment length polymorphism that confers susceptibility to autoimmune
diseases. J.Clin.Invest. 88:193-203, 1991
143.
Heber-Katz E, Acha-Orbea H: The V-region disease hypothesis: evidence from
autoimmune encephalomyelitis. Immunol.Today 10:164-169, 1989
144.
Frank MB, McArthur R, Harley JB, et al: Anti-Ro(SSA) autoantibodies are
associated with T cell receptor beta genes in systemic lupus erythematosus patients.
J.Clin.Invest. 85:33-39, 1990
145.
Theofilopoulos AN: Bona CA, Siminovitch K, Zanetti M, et al.
(eds):
The
Molecular Pathology of Autoimmune Diseases. Harwood Academic Publishers,
1993, pp 281-316
146.
Tominaga A, Takaki S, Koyama N, et al: Transgenic mice expressing a B cell growth
and differentiation factor gene (interleukin 5) develop eosinophilia and
autoantibody production. J.Exp.Med. 173:429-437, 1991
147.
Suematsu S, Matsuda T, Aozasa K, et al: IgG1 plasmacytosis in interleukin 6
transgenic mice. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86:7574-7557, 1989
148.
Merino R, Fossati L, Lancour M, et al: Selective autoantibody production by Yaa+
B cells in autoimmune Yaa(+)-Yaa- bone marrow chimeric mice. J.Exp.Med.
174:1023-1029, 1991
149.
Geysen HM, Rodda SJ, Mason TJ: The delineation of peptides able to mimic
assembled epitopes., in Porter R, Whelan J. (eds): Synthetic Peptides as Antigens.
London, Pitman, 1986, pp 130-149
150.
Lipham WJ, Redmond TM, Takahashi H, et al: Recognition of peptides that are
immunogenic but cryptic: mechanisms that allow lymphocytes sensitized against
cryptic peptides to initiate pathogenic autoimmune processes.
J.Immunol.
146:37571991
151.
Van Regenmortel MHV: Van Regenmortel MHV. (ed): Structure of Antigens.
Boca Raton, Florida, CRC Press, 1992, pp 1-27
152.
Van Regenmortel MHV: Trends Biochem.Sci. 12:237-240, 1987
153.
Slagle SP, Kozack RE, Subramaniam S: Role of Electrostatics in Antibody-Antigen
Association: Anti-Hen Egg Lysozyme/Lysozyme Complex (HyHEL-5/HEL).
J.Biomol.Structure & Dynamics 12:439-456, 1994
154.
Geysen HM: Antigen-antibody interactions at the molecular level: adventures in
peptide synthesis. Immunol.Today 6:364-369, 1985
155.
Getzoff ED, Geysen HM, Rodda SJ, et al: Mechanisms of Antibody Binding to a
Protein. Science 235:1191-1196, 1987
156.
Rini JM, Schulze-Gahmen U, Wilson IA: Structural Evidence for Induced Fit as a
Mechanism for Antibody-Antigen Recognition. Science 255:959-965, 1992
157.
Baca M, Scanlan TS, Stephenson RC, et al: Phage display of a catalytic antibody to
optimize affinity for transition-state analog binding.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
94:10063-10068, 1997
158.
Smithrud DB, Benkovic SJ: The state of antibody catalysis. Curr.Opin.Biotechnol.
8:459-466, 1997
159.
Patten PA, Gray NS, Yang PL, et al: The immunological evolution of catalysis .
Science 271:1086-1091, 1996
160.
Vlassov AV, Andrievskaya OA, Kanyshkova TG, et al: RNA-hydrolyzing antibodies
from peripheral blood of patients with lupus erythematosus. Biochemistry Mosc.
62:474-479, 1997
161.
Paul S, Li L, Kalaga R, et al: Characterization of thyroglobulin-directed and
polyreactive catalytic antibodies in autoimmune disease. J Immunol. 159:1530-1536,
1997
162.
Buneva VN, Andrievskaia OA, Romannikova IV, et al: Interaction of catalytically
active antibodies with oligoribonucleotides. Mol.Biol.Mosk. 28:738-743, 1994
163.
Ghosh S, Campbell AM: Immunol.Today 7:217-222, 1986
164.
Zimmermann D, Van Regenmortel MHV: Spurious cross-reactions between plant
viruses and monoclonal antibodies can be overcome by saturating ELISA plates
with milk proteins. Arch.Virol. 106:15-22, 1989
165.
Dietzgen R, Zaitlin M: Alleged common antigenic determinant of tobacco mosaic
virus coat protein and the host protein ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase is an
artifact of indirect ELISA and western blotting. Virology 184:397-398, 1991
166.
Pettersson I: Methods of epitope mapping. Mol.Biol.Reports 16:149-153, 1992
167.
Hopp TP, Woods KR: A computer program for predicting protein antigenic
determinants. Mol.Immunol. 20:483-489, 1983
168.
Karplus
PA,
Schulz
GE:
Prediction
of
chain
flexibility
in
proteins.
Naturwissenschaften 72:2121985
169.
Welling GW, Weijer WJ, van der Zee R, et al: Prediction of sequential antigenic
regions in proteins. FEBS Letters 188:215-218, 1985
170.
Fraga S: Theoretical prediction of protein antigenic determinants from amino acid
sequences. Can.J.Chem. 60:26061982
171.
Fanning DW, Smith JA, Rose GD: Molecular cartography of globular proteins with
application to antigenic sites. Biopolymeres 25:863-883, 1986
172.
Novothy J, Handschumacher M, Haber E, et al: Antigenic determinants in protein
coincide with surface regions accessible to large probes (antibody domains).
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 83:226-230, 1986
173.
Thorton JM, Edwards MS, Taylor WR, et al: Location of 'continuous' antigenic
determinants in the protruding regions of proteins. EMBO J. 5:409-415, 1986
174.
Westhof E, Altschuh D, Moras D, et al: Correlation between segmental mobility
and the location of antigenic determinants in proteins. Nature 311:123-126, 1984
175.
Van Regenmortel MHV: Which structural features determine protein antigenicity?
Trends Biochem.Sci. 11:36-39, 1986
176.
Tainer JA, Getzoff ED, Alexander H, et al: The reactivity of anti-peptide antibodies
is a function of the atomic mobility of sites in a protein. Nature 312:127-134, 1984
177.
Scofield RH, Dickey WD, Jackson KW, et al: A common autoepitope near the
carboxyl terminus of the 60-kD Ro ribonucleoprotein: sequence similarity with a
viral protein. J Clin.Immunol. 11:378-388, 1991
178.
Whittingham S, Naselli G, McNeilage LJ: Autoepitopes reactive with anti-SS-B/La.
J Autoimmun. 2:345-351, 1989
179.
McCauliffe DP, Lux FA, Lieu TS, et al: Molecular cloning, expression, and
chromosome 19 localization of a human Ro/SS-A autoantigen.
J Clin.Invest
85:1379-1391, 1990
180.
Pisetsky DS, Grudier JP: Polyspecific binding of Escherichia coli beta-galactosidase
by murine antibodies to DNA. J.Immunol. 143:3609-3613, 1989
181.
Frorath B, Scanarini M, Netter HJ, et al: Cloning and expression of antigenic
epitopes of the human 68-kDa (U1) ribonucleoprotein antigen in Escherichia coli.
BioTechniques 11:364-371, 1991
182.
McCauliffe DP, Yin H, Wang LX, et al: Autoimmune sera react with multiple
epitopes on recombinant 52 and 60 kDa Ro(SSA) proteins. J Rheumatol. 21:10731080, 1994
183.
Routsias JG, Tzioufas AG, Sakarellos DM, et al: Epitope mapping of the
Ro/SSA60KD autoantigen reveals disease-specific antibody-binding profiles.
Eur.J.Clin.Invest. 26:514-521, 1996
184.
Tribbick E, et al: Systematic fractionation of serum antibodies using multiple
antigen homologous peptides as affinity ligands. J.Immunol.Methods 139:155-166,
1991
185.
Kabat
EA:
Heterogeneity
and
structure
of
antibody-combining
sites.
Ann.N.Y.Acad.Sci. 169:43-54, 1970
186.
Schechter I: Mapping of the combining sites of antibodies specific to polyalanine
chains. Ann.N.Y.Acad.Sci. 190:394-419, 1971
187.
Tzioufas AG, Yiannaki E, Sakarellos DM, Routsias JG, et al: Fine specificity of
autoantibodies
to
La/SSB:
epitope
mapping,
and
characterization.
Clin.Exp.Immunol. 108:191-198, 1997
188.
Geysen HM, Rodda SJ, Mason TJ: A priori delineation of a peptide which mimics a
discontinous antigenic determinant. Mol.Immunol. 23:709-715, 1986
189.
Geysen HM, Barteling SJ, Meloen RH: Small peptides induce antibodies with a
sequence and structural requirement for binding antigen comparable to antibodies
raised against the native protein. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 82:178-182, 1985
190.
Freitas AA, Guilbert B, Holmberg D, et al: Analysis of autoantibody reactivities in
hybridoma collections derived from normal adult BALB/c mice. Ann.Inst.Pasteur
Immunol. 137D:33-45, 1986
191.
Hahn BH: Arthritis Rheum. 25:747, 1982
192.
Cheng ST, Nguyen TQ, Yang YS, et al: Calreticulin binds hYRNA and the 52-kDa
polypeptide component of the Ro/SS-A ribonucleoprotein autoantigen. J.Immunol.
156:4484-4491, 1996
193.
Lieu TS, Sontheimer RD: A subpopulation of WIL-2 cell calreticulin molecules is
associated with RO/SS-A ribonucleoprotein particles. Lupus. 6:40-47, 1997
194.
Rader MD, Codding C, Reichlin M: Differences in the fine specificity of anti-Ro
(SS-A) in relation to the presence of other precipitating autoantibodies. Arthritis
Rheum. 32:1563-1571, 1989
195.
Reichlin M: Mixed Connective Tissue Disease Elsevier, 1987, pp 85-96
196.
Hendrick JP, Wolin SL, Rinke J, et al: Ro small cytoplasmic ribonucleoproteins are
a subclass of La ribonucleoproteins: further characterization of the Ro and La small
ribonucleoproteins from uninfected mammalian cells. Mol.Cell.Biol. 1:1138-1149,
1981
197.
Wolin SL, Steitz JA: The Ro small cytoplasmic ribonucleoproteins: identification of
the
antigenic
protein
and
its
binding
site
on
the
Ro
RNAs.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81:1996-2000, 1984
198.
Lieu TS, Newkirk MM, Capra JD, et al: Molecular characterization of human
Ro/SS-A antigen. Amino terminal sequence of the protein moiety of human Ro/SSA antigen and immunological activity of a corresponding synthetic peptide.
J.Clin.Invest. 82:96-101, 1988
199.
Lieu TS, Newkirk MM, Arnett FC, et al: A major autoepitope is present on the
amino terminus of a human SS-A/Ro polypeptide. J.Autoimmun. 2:367-374, 1989
200.
McCauliffe DP, Zappi E, Lieu TS, et al: A human Ro/SS-A autoantigen is the
homologue of calreticulin and is highly homologous with onchocercal RAL-1
antigen and an aplysia "memory molecule". J.Clin.Invest. 86:332-335, 1990
201.
Rokeach LA, Haselby JA, Meilof JF, et al: Characterization of the autoantigen
calreticulin. J.Immunol. 147:3031-3039, 1991
202.
Boehm J, Orth T, Van NP, et al: Systemic lupus erythematosus is associated with
increased auto-antibody titers against calreticulin and grp94, but calreticulin is not
the Ro/SS-A antigen. Eur.J.Clin.Invest. 24:248-257, 1994
203.
Eggleton P, Reid KB, Kishore U, et al: Clinical relevance of calreticulin in systemic
lupus erythematosus. Lupus. 6:564-571, 1997
204.
Boire G, Craft J: Human Ro ribonucleoprotein particles: characterization of native
structure and stable association with the La polypeptide. J.Clin.Invest. 85:11821190, 1990
205.
Boire G, Gendron M, Monast N, et al: Purification of antigenically intact Ro
ribonucleoproteins; biochemical and immunological evidence that the 52-kD
protein is not a Ro protein. Clin.Exp.Immunol. 100:489-498, 1995
206.
Granger D, Gendron M, Tremblay A, et al: RNA-labelled Ro and La
ribonucleoprotein complexes reassembled in vitro; characterization by gel shift
analysis. Clin.Exp.Immunol. 106:498-503, 1996
207.
Kato N, Hoshino H, Harada F: Nucleotide sequence of 4.5S RNA (C8 or hY5) from
HeLa cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 108:363-370, 1982
208.
Wolin SL, Steitz JA: Genes of two small cytoplasmic Ro RNAs are adjacent and
appear to be single-copy in the human genome. Cell 32:735-744, 1983
209.
O'Brien C, Harley JB: A subset of hY RNAs is associated with erythrocyte Ro
ribonucleoproteins. EMBO J. 9:3683-3689, 1990
210.
Rader MD, O'Brien C, Liu YS, et al: Heterogeneity of the Ro/SSA antigen.
Different molecular forms in lymphocytes and red blood cells.
J.Clin.Invest.
83:1293-1298, 1989
211.
Pruijn GJM, Wingens PAETM, Peters SLM, et al: Ro RNPs associated Y RNAs
are highly conserved among mammals. Biochem.Biophys.Acta 1216:395-401, 1993
212.
Itoh K, Itoh Y, Frank MB: Protein heterogeneity in the human Ro/SSA
ribonucleoproteins. The 52- and 60-kD Ro/SSA autoantigens are encoded by
separate genes. J.Clin.Invest. 87:177-186, 1991
213.
Van HD, Eisenberg D, O'Brien CA, et al: Caenorhabditis elegans embryos contain
only one major species of Ro RNP. RNA. 1:293-303, 1995
214.
Itoh Y, Kriet JD, Reichlin M: Organ distribution of the Ro (SS-A) antigen in the
guinea pig. Arthritis Rheum. 33:1815-1821, 1990
215.
O'Brien CA, Margelot K, Wolin SL: Xenopus Ro ribonucleoproteins: members of
an
evolutionarily
conserved
class
of
cytoplasmic
ribonucleoproteins.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90:7250-7254, 1993
216.
Pruijn GJ, Slobbe RL, van VW: Analysis of protein--RNA interactions within Ro
ribonucleoprotein complexes. Nucleic.Acids.Res. 19:5173-5180, 1991
217.
Chan EKL, Buyon JP: The SS-A/Ro antigen., in Van Venrooij WJ, Maini RN.
(eds):
Manual of biological markers of disease. Dordrecht, Kluwer Academic
Publishers, 1994, pp 1-18
218.
Frank MB, Mattei MG: Mapping of the human 60,000 M(r) Ro/SSA locus: the
genes for three Ro/SSA autoantigens are located on separate chromosomes.
Immunogenetics 39:428-431, 1994
219.
Deutscher SL, Harley JB, Keene JD: Molecular analysis of the 60-kDa human Ro
ribonucleoprotein. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85:9479-9483, 1988
220.
Ben CE, Gandy BJ, Tan EM, et al: Isolation and characterization of a cDNA clone
encoding the 60-kD component of the human SS- A/Ro ribonucleoprotein
autoantigen. J.Clin.Invest. 83:1284-1292, 1989
221.
Mattaj IW: RNA recognition - A family matter. Cell 73:837-840, 1993
222.
Slobbe RL, Pluk W, van VW, et al: Ro ribonucleoprotein assembly in vitro.
Identification of RNA-protein and protein-protein interactions.
J.Mol.Biol.
227:361-366, 1992
223.
Ramakrishnan S, Sharma HW, Farris AD, et al: Characterization of human
telomerase complex. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94:10075-10079, 1997
224.
Harrington L, McPhail T, Mar V, et al: A mammalian telomerase-associated
protein. Science 275:973-977, 1997
225.
Slobbe RL, Pruijn GJ, Damen WG, et al: Detection and occurrence of the 60- and
52-kD Ro (SS-A) antigens and of autoantibodies against these proteins [published
erratum appears in Clin Exp Immunol 1992 Feb;87(2):336]. Clin.Exp.Immunol.
86:99-105, 1991
226.
Wang D, Buyon JP, Chan EK: Cloning and expression of mouse 60 kDa
ribonucleoprotein SS-A/Ro. Mol.Biol.Rep. 23:205-210, 1996
227.
Frank MB, Itoh K, Fujisaku A, et al: The mapping of the human 52-kD Ro/SSA
autoantigen
gene
to
human
chromosome
11,
and
its
polymorphisms.
Am.J.Hum.Genet. 52:183-191, 1993
228.
Chan EK, Hamel JC, Buyon JP, et al: Molecular definition and sequence motifs of
the 52-kD component of human SS-A/Ro autoantigen. J.Clin.Invest. 87:68-76, 1991
229.
Chan EK, Dinodato F, Hamel JC, et al: 52-KD SS-A/Ro: Genomic structure and
identification of an alternatively spliced transcript encoding a novel leucine zipperminus autoantigen expressed in fetal and adult heart. J.Exp.Med. 182:983-992, 1995
230.
Ben CE, Chan EK, Sullivan KF, et al: A 52-kD protein is a novel component of the
SS-A/Ro antigenic particle. J.Exp.Med. 167:1560-1571, 1988
231.
Kelekar A, Saitta MR, Keene JD: Molecular composition of Ro small
ribonucleoprotein complexes in human cells. Intracellular localization of the 60- and
52-kD proteins. J.Clin.Invest. 93:1637-1644, 1994
232.
Peek R, Pruijn GJM, Van Venrooij WJ: Epitope specificity determines the ability of
anti-Ro52 autoantibodies to precipitate Ro ribonucleoprotein particles. J.Immunol.
153:4321-4329, 1994
233.
Chan EKL, Hamel J, Tan EM: Functional interaction of 52-kD and 60-kD SS-A/Ro
autoantigens in transfection analysis. Arthritis-Rheum 1995
234.
Ricchiuti V, Pruijn GJ, Thijssen JP, et al: Accessibility of epitopes on the 52-kD
Ro/SSA protein (Ro52) and on the RoRNP associated Ro52 protein as determined
by anti-peptide antibodies. J.Autoimmun. 10:181-191, 1997
235.
Reddy BA, Etkin LD, Freemont PS: A novel zinc finger coiled-coil domain in a
family of nuclear proteins. Trends Biochem.Sci. 17:344-345, 1992
236.
Alber T: Structure of the leucine zipper. Curr.Opin.Genet.Dev. 2:205-210, 1992
237.
Bellini M, Lacroix JC, Gall JG: A putative zinc-binding protein on lampbrush
chromosome loops. EMBO J. 12:107-114, 1993
238.
Chambers JC, Kenan D, Martin BJ, et al: Genomic structure and amino acid
sequence domains of the human La autoantigen. J.Biol.Chem. 263:18043-18051,
1988
239.
Chan EK, Sullivan KF, Fox RI, et al: Sjogren's syndrome nuclear antigen B (La):
cDNA cloning, structural domains, and autoepitopes. J.Autoimmun. 2:321-327,
1989
240.
Stefano JE: Purified lupus antigen La recognizes an oligouridylate strech common
to the 3' termini of RNA polymerase III transcripts. Cell 36:145-154, 1984
241.
Mathews MB, Francoeur AM: La antigen recognizes and binds to the 3'oligouridylate tail of a small RNA. Mol.Cell.Biol. 4:1134-1140, 1984
242.
Glickman JN, Howe JG, Steitz JA: Structural analyses of EBER1 and EBER2
ribonucleoprotein particles present in Epstein-Barr virus-infected cells. J.Virology
62:902-911, 1988
243.
Lerner MR, et al: Science 211:4001981
244.
Topfer F, Gordon T, McCluskey J: Characterization of the mouse autoantigen
La(SS-B) - Identification of conserved RNA-binding motifs, a putative ATP binding
site and reactivity of recombinant protein with poly(U) and human autoantibodies.
J.Immunol. 150:3091-3100, 1993
245.
Chan EK, Sullivan KF, Tan EM: Ribonucleoprotein SS-B/La belongs to a protein
family with consensus sequences for RNA-binding.
Nucleic.Acids.Res. 17:2233-
2244, 1989
246.
Clemens MJ: The small RNAs of Epstein-Barr virus. Mol.Biol.Rep. 17:81-92, 1993
247.
Dingwall C, Laskey RA: Nuclear targeting sequences -- a consensus?.
Trends
Biochem.Sci. 16:478-481, 1991
248.
Pfeifle J, Anderer FA, Franke M: Multiple phosphorylation of human SS-B/La
aytoantigen
and
its
effect
on
poly(U)
and
autoantibody
binding.
Biochem.Biophys.Acta 928:217-226, 1987
249.
Chan EK, Francoeur AM, Tan EM: Epitopes, structural domains and asymmetry of
amino acid residues in SS-B/La nuclear protein. J.Immunol. 136:3744-3749, 1986
250.
Hoch SO, Billings PB: Characterization of the La (SS-B) antigen from several
mammalian sources. J.Immunol. 133:1397-1403, 1984
251.
Francouer AM, gritzmacher CA, Peebles CL, et al: Synthesis of small nuclear
ribonucleoprotein particles by the malarial parasite Plasmodium falciparum.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 82:3635-3639, 1985
252.
Chan EK, Tan EM: Human autoantibody-reactive epitopes of SS-B/La are highly
conserved in comparison with epitopes recognized by murine monoclonal
antibodies. J.Exp.Med. 166:1627-1640, 1987
253.
Semsei I, Troster H, Bartsch H, et al: Isolation of Rat cDNA clones coding for the
autoantigen SS-B/La - Detection of species-specific variations. Gene 126:265-268,
1993
254.
Scherly D, Stutz F, Lin Marq N, et al: La proteins from Xenopus Laevis. cDNA
cloning and developmental expression. J.Mol.Biol. 231:196-204, 1993
255.
Lin Marq N, Clarkson SG: A yeast RNA binding protein that resembles the human
autoantigen La. J.Mol.Biol. 245:81-85, 1995
256.
Yoo CJ, Wolin SL: La proteins from Drosophila melanogaster and Saccharomyces
cerevisiae: a yeast homolog of the La autoantigen is dispensable for growth.
Mol.Cell.Biol. 14:5414-5424, 1994
257.
Bai C, Li Z, Tolias PP: Devolopmental characterization of a Drosophila RNAbinding protein homologous to the human systemic lupus erythematosus associated La/SS-B autoantigen. Mol.Cell.Biol. 14:5123-5129, 1994
258.
Ostwald TJ, Maclennan DH: J.Biol.Chem. 249:974-979, 1974
259.
Waisman D, Salimath BP, Anderson MI: Isolation and characterization of CAB-63,
a novel calcium-binding protein. J.Biol.Chem. 260:1652-1660, 1985
260.
Macer DRJ, Koch GLE: Identification of a set of calcium-binding proteins in
reticuloplasm, the luminal content of the endoplasmic reticulum. J.Cell.Sci. 91:6170, 1988
261.
Van PN, Peter F, Soling HD: Four intracisternal calcium-binding glycoproteins
from rat liver microsomes with high affinity for calcium. No indication for
calsequestrin-like
proteins
in
inositol
1,4,5-trisphosphate-sensitive
calcium
sequestering rat liver vesicles. J.Biol.Chem. 264:17494-17501, 1989
262.
Lewis MJ, Mazzarella RA, Green M: Structure and assembly of the endoplasmic
reticulum. The synthesis of three major endoplasmic reticulum proteins during
lipopolysaccharide-induced differentiation of murine lymphocytes. J.Biol.Chem.
260:3050-3057, 1985
263.
Fliegel L, Buerns K, Maclennan DH, et al: Molecular cloning of the high affinity
calcium-binding protein (calreticulin) of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum.
J.Biol.Chem. 264:21522-21528, 1989
264.
Smith MJ, Koch GL: Multiple zones in the sequence of calreticulin (CRP
55,calregulin, HACBP), a major calcium binding ER/SR protein. EMBO J. 8:35813586, 1989
265.
Michalak M, Milner RE, Burns K, et al: Calreticulin. Biochem.J. 285:681-692, 1992
266.
Baksh S, Michalak M: Expression of calreticulin in Escherichia coli and
identification of its Ca2+ binding domains. J.Biol.Chem. 266:21458-21465, 1991
267.
Khanna NC, Tokuda M, Waisman DM: Conformational changes induced by
binding of divalent cations to calregulin. J Biol.Chem. 261:8883-8887, 1986
268.
Khanna NC, Tokuda M, Waisman DM: Comparison of calregulins from vertebrate
livers. Biochem.J. 242:245-251, 1987
269.
Rogers S, Wells R, Rechsteiner M: Amino acid sequences common to rapidly
degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 234:364-368, 1986
270.
Pelham HRB: Control of protein exit from the endoplasmic reticulum.
Annu.Rev.Cell.Biol. 5:1-23, 1989
271.
Milner RE, Baksh S, Shemanko C, et al: Calreticulin, and not calsequestrin, is the
major calcium binding protein of smooth muscle sarcoplasmic reticulum and liver
endoplasmic reticulum. J.Biol.Chem. 266:7155-7165, 1991
272.
Michalak M, Baksh S, Opas M: Identification and immunolocalization of
calreticulin in pancreatic cells: no evidence for "calciosomes". Exp.Cell.Res. 179:9199, 1991
273.
Bassuk JA, Berg RA:
J.Biol.Chem. A novel 53-kDa polypeptide from chicken
embryo. 266:23732-23738, 1991
274.
Murthy K, Banville D, Srikant CB, et al: Structural homology between the rat
calreticulin
gene
product
and
the
Onchocerca
volvulus
antigen
Ral-1.
Nucleic.Acids.Res. 18:49331990
275.
Kennedy TE, Gawinowicz MA, Berzilai A, et al: Sequencing of proteins from twodimensional gels by using in situ digestion and transfer of peptides to polyvinylidene
difluoride membranes: application to proteins associated with sensitization in
Aplysia. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85:7008-7012, 1988
276.
Gottlieb E, Steitz JA: The RNA binding protein La influences both the accuracy
and the efficiency of RNA polymerase III transcription in vitro. EMBO J. 8:841850, 1989
277.
Gottlieb E, Steitz JA: Function of the mammalian La protein: evidence for its
action in transcription termination by RNA polymerase III. EMBO J. 8:851-861,
1989
278.
Maraia RJ: Transcription termination factor La is also an initiation factor for RNA
polymerase III. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93:3383-3387, 1996
279.
Maraia RJ, Kenan DJ, Keene JD: Eukaryotic transcription termination La mediates
transcript release and facilitates reinitiation by RNA polymerase III. Mol.Cell.Biol.
14:2147-2158, 1994
280.
Bachmann M, Pfeifer K, Schroder HC, et al: Characterization of the autoantigen La
as a nucleic acid-dependent ATPase/dATPase with melting properties. Cell 60:8593, 1990
281.
Huhn P, Pruijn GJM, Van Venrooij WJ, et al: Characterization of the aytoantigen
La(SS-B) as a dsRNA unwinding enzyme. Nucleic.Acids.Res. 25:410-416, 1997
282.
Xia Q, Sharp TV, Jeffrey IW, et al: The La antigen inhibits the activation of the
inteferon-inducible protein kinase PKR by sequestering and unwinding doublestranded RNA. Nucleic.Acids.Res. 22:2512-2518, 1994
283.
Peek R, Pruijn GJM, Van Venrooij WJ: Interaction of La (SS-B) autoantigen with
small ribosomal subunits. Eur.J.Biochem. 236:649-655, 1996
284.
O'Brien CA, Wolin SL: A possible role for the 60-kD Ro autoantigen in a discard
pathway for defective 5S rRNA precursors. Genes Dev. 8:2891-2903, 1994
285.
Shi H, O'Brien CA, Van HD, et al: A misfolded form of 5S rRNA is complexed with
the Ro and La autoantigens. RNA. 2:769-784, 1996
286.
Bondar AG, Ouellette MFM, Holt SE, et al: Extension of Life-Span by introduction
of telomerase into normal human cells. Science 279:349-352, 1998
287.
Frank MB, McCubbin VR, Heldermon C: Expression and DNA binding of the
human 52kDa Ro/SSA autoantigen. Biochem.J. 305:359-362, 1995
288.
Opas M, Fliegel L, Michalak M: Proc.Intl.Cogr.Cell Biol.,4th,Montreal 3531988
289.
Fliegel L, Burns K, Opas M, et al: The high-affinity calcium binding protein of
sarcoplasmic reticulum. Tissue distribution, and homology with calregulin.
Biochim.Biophys.Acta 982:1-8, 1989
290.
Fliegel L, Ohnishi M, Carpenter MR, et al: Amino acid sequence of rabbit fasttwitch skeletal muscle calsequestrin deduced from cDNA and peptide sequencing.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84:1167-1171, 1987
291.
Maclennan DH, Campbell KP, Reithmeier RAF: Cheng WY. (ed): Calcium and
Cell Function. New York, Academic Press, 1983,
292.
Conrad ME, Umbreit JN, Moore EG: Rat duodenal iron-binding protein
mobilferrin is a homologue of calreticulin. Gastroenterology 104:1700-1704, 1993
293.
Wiuff C, Houen G: Cation-dependent interactions of calreticulin with denatured
and native proteins. Acta Chem.Scand. 50:788-795, 1996
294.
Hebert DN, Foellmer B, Helenius A: Calnexin and calreticulin promote folding,
delay oligomerization and suppress degradation of influenza hemagglutinin in
microsomes. EMBO J 15:2961-2968, 1996
295.
Rodan AR, Simons JF, Trombetta ES, et al: N-linked oligosaccharides are
necessary and sufficient for association of glycosylated forms of bovine RNase with
calnexin and calreticulin. EMBO J 15:6921-6930, 1996
296.
McDonnell JM, Jones GE, White TK, et al: Calreticulin binding affinity for
glycosylated laminin. J Biol.Chem. 271:7891-7894, 1996
297.
Peterson JR, Ora A, Van PN, et al: Transient, lectin-like association of calreticulin
with folding intermediates of cellular and viral glycoproteins. Mol.Biol.Cell 6:11731184, 1995
298.
Ortmann B, Copeman J, Lehner PJ, et al: A critical role for tapasin in the assembly
and function of multimeric MHC class I-TAP complexes. Science 277:1306-1309,
1997
299.
Janeway
CA,
Travers
P:
Antigen
recognition
by
T
lymphocytes.,
in
AnonymousImmunobiology. (ed3rd). New York, Current Biology Ltd, 1997, pp
4:11-4:15
300.
Kumagai S, Kanagawa S, Morinobu A, et al: Association of a new allele of the
TAP2 gene, TAP2*Bky2(Val577) with susceptibility to Sjogren's syndrome. ArthritisRheum 9:1685-1692, 1997
301.
Liu H, Bowes RC, van-de WB, et al: Endoplasmic reticulum chaperones GRP78
and calreticulin prevent oxidative stress, Ca2+ disturbances, and cell death in renal
epithelial cells. J Biol.Chem. 272:21751-21759, 1997
302.
Jethmalani SM, Henle KJ: Prompt glycosylation of calreticulin is independent of
Ca2+ homeostasis. Biochem.Biophys.Res.Commun. 205:780-787, 1994
303.
Conway EM, Liu L, Nowakowski B, et al: Heat shock-sensitive expression of
calreticulin. In vitro and in vivo up-regulation. J Biol.Chem. 270:17011-17016, 1995
304.
Dupuis M, Schaerer E, Krause KH, et al: The calcium-binding protein calreticulin is
a major constituent of lytic granules in cytolytic T lymphocytes. J Exp.Med. 177:1-7,
1993
305.
Opas M, Dziak E, Fliegel L, et al: Regulation of expression and intracellular
distribution of calreticulin, a major calcium binding protein of nonmuscle cells.
J.Cell.Physiol. 149:160-171, 1991
306.
Burns K, Duggan B, Atkinson EA, et al: Modulation of gene expression by
calreticulin binding to the glucocorticoid receptor. Nature 367:476-480, 1994
307.
Opas M, Szewczenko PM, Jass GK, et al: Calreticulin modulates cell adhesiveness
via regulation of vinculin expression. J Cell Biol. 135:1913-1923, 1996
308.
St AR, Prud'homme J, Leung HC, et al: Constitutive expression of calreticulin in
osteoblasts inhibits mineralization. J Cell Biol. 131:1351-1359, 1995
309.
Burns K, Opas M, Michalak M: Calreticulin inhibits glucocorticoid- but not cAMPsensitive expression of tyrosine aminotransferase gene in cultured McA-RH7777
hepatocytes. Mol.Cell Biochem. 171:37-43, 1997
310.
Adibzadeh M, Friccius H, Bornhak S, et al: Role of three quantitatively dominant
endogenous peptides from HLA-DRB1*0401 molecules in class II specific
alloreactivity. Transpl.Immunol. 2:293-299, 1994
311.
Max H, Halder T, Kalbus M, et al: A 16mer peptide of the human autoantigen
calreticulin
is
a
most
prominent
HLA-DR4Dw4-associated
self-peptide.
Hum.Immunol. 41:39-45, 1994
312.
Verreck FA, Elferink D, Vermeulen CJ, et al: DR4Dw4/DR53 molecules contain a
peptide from the autoantigen calreticulin. Tissue Antigens. 45:270-275, 1995
313.
Collins EJ, Garboczl DN, Wiley DC: Three-dimensional structure of a peptide
extending from one end of a class I MHC binding site. Nature 371:626-629, 1994
314.
Nakhasi HL, Singh NK, Pogue GP, et al: Identification and characterization of host
factor interactions with cis-acting elements of rubella virus RNA. Arch.Virol.Suppl.
9:255-267, 1994
315.
Singh NK, Atreya CD, Nakhasi HL: Identification of calreticulin as a rubella virus
RNA binding protein. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91:12770-12774, 1994
316.
Peek R, Pruijn GJ, van-der KAJ, et al: Subcellurar distribution of Ro
ribonucleoprotein complexes and their constituents. J.Cell.Sci. 106:929-935, 1993
317.
Simons FHM, Pruijn GJM, Van Venrooij WJ: Analysis of the intracellurar
localization and assembly of Ro ribonucleoprotein particles by microinjection into
Xenopus laevis oocytes. J.Cell.Biol. 125:981-988, 1994
318.
Pruijn GJM, Simons FHM, Van Venrooij WJ: Intracellular localization and
nucleocytoplasmic transport of Ro RNP components. Eur.J.Cell Biol. 74:123-132,
1997
319.
Simons FHM, Broers FJM, Van Venrooij WJ, et al: Characterization of cis-acting
signals for nuclear import and retention of the La (SS-B) autoantigen.
Exp.Cell.Res. 224:224-236, 1996
320.
Simons FH, Rutjes SA, van VW, et al: The interactions with Ro60 and La
differentially affect nuclear export of hY1 RNA. RNA. 2:264-273, 1996
321.
Anderson J.R.: Lancet 456, 1961
322.
Clark G.et al: J.Immunol. 102:117, 1969
323.
Mattioli M., Reichlin M: Arthritis Rheum. 17:421, 1974
324.
Alsplaugh M.A., Tan E.M.: J.Clin.Invest. 55:1067, 1975
325.
Alspaugh M.A.et al: Arthritis Rheum. 19:216, 1976
326.
Alsplaugh M., Maddison P.J.: Arthritis Rheum. 22:796, 1979
327.
Ben CE: The molecular basis of the SSA/Ro antigens and the clinical significance of
their autoantibodies. Br.J.Rheumatol. 32:396-402, 1993
328.
Bozic B, Pruijn GJ, Rozman B, et al: Sera from patients with rheumatic diseases
recognize
different
epitope
regions
on
the
52-kD
Ro/SS-A
protein.
Clin.Exp.Immunol. 94:227-235, 1993
329.
Tsuzaka K, Fujii T, Akizuki M, et al: Clinical significance of antibodies to native or
denatured 60-kd or 52-kd Ro/SS-A proteins in Sjogren's syndrome.
Arthritis
Rheum. 37:88-92, 1994
330.
Boire G, Lopez LF, Lapointe S, et al: Sera from patients with autoimmune disease
recognize conformational determinants on the 60-kd Ro/SS-A protein . Arthritis
Rheum. 34:722-730, 1991
331.
Reichlin M, Brucato A, Frank MB, et al: Concentration of autoantibodies to native
60-kd Ro/SS-A and denatured 52-kd Ro/SS-A in eluates from the heart of a child
who died with congenital complete heart block. Arthritis Rheum. 37:1698-1703,
1994
332.
Boire G, Craft J: Biochemical and immunological heterogeneity of the Ro
ribonucleoprotein particles. Analysis with sera specific for the RohY5 particle.
J.Clin.Invest. 84:270-279, 1989
333.
Rischmueller M, McNeilage LJ, McCluskey J, et al: Human autoantibodies directed
against the RNA recognition motif of La (SS-B) bind to a conformational epitope
present
on the
intact
La
(SS-B)/Ro
(SS-A) ribonucleoprotein particle.
Clin.Exp.Immunol. 101:39-44, 1995
334.
Itoh Y, Itoh K, Frank MB, et al: Autoantibodies to the Ro/SSA autoantigen are
conformation dependent. II: Antibodies to the denatured form of 52 kD Ro/SSA
are a cross reacting subset of antibodies to the native 60 kD Ro/SSA molecule.
Autoimmunity. 14:89-95, 1992
335.
Itoh Y, Rader MD, Reichlin M: Heterogeneity of the Ro/SSA antigen and autoantiRo/SSA
response:
evidence
of
the
four
antigenically
distinct
forms.
Clin.Exp.Immunol. 81:45-51, 1990
336.
Reichlin M, Rader M, Harley JB: Autoimmune response to the Ro/SSA particle is
directed to the human antigen. Clin.Exp.Immunol. 76:373-377, 1989
337.
Rosario MO, Fox OF, Koren E, et al: Anti-Ro (SS-A) antibodies from Ro (SS-A)immunized mice. Arthritis Rheum. 31:227-237, 1988
338.
Scofield RH, Harley JB: Autoantigenicity of Ro/SSA antigen is related to a
nucleocapsid protein of vesicular stomatitis virus.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
88:3343-3347, 1991
339.
Huang SC, Yu H, Barler BD, et al: Linear epitopes of Ro. 27th ACR Annual
Meeting.Atlanta, USA 12-17 Octob.1992 (abstr) C25:1992
340.
Hardgrave KL, Neas B, Scofield RH, et al: Antibodies binding Vesicular Stomatitis
Virus proteins in Systemic Lupus Erythematosus patients and Normals. 27th ACR
Annual Meeting.Atlanta, USA 12-17 Octob.1992 (abstr) A259:1992
341.
Hardgrave KL, Neas BR, Scofield RH, et al: Antibodies to vesicular stomatitis virus
proteins in patients with systemic lupus erythematosus and in normal subjects.
Arthritis Rheum. 36:962-970, 1993
342.
Huang SC, Pan Z, Kurien BT, et al: Immunization with vesicular stomatitis virus
nucleocapsid protein induces autoantibodies to the 60 kD Ro ribonucleoprotein
particle. J.Investig.Med. 43:151-158, 1995
343.
Routsias JG, Sakarellos-Daitsiotis M, Detsikas E, et al: Antibodies to EYRKK
vesicular stomatitis virus-related peptide account only for a minority of anti-60KD
antibodies. Clin.Exp.Immunol. 98:414-418, 1994
344.
Zhu J: Cytomegalovirus infection induces expression of 60 KD/Ro antigen on
human keratinocytes. Lupus. 4:396-406, 1995
345.
Wahren M, Mellqvist E, Vene S, et al: Nuclear colocalization of the Ro 60 kDa
autoantigen and a subset of U snRNP domains. Eur.J.Cell Biol. 70:189-197, 1996
346.
Furukawa F, Kashihara SM, Lyons MB, et al: Binding of antibodies to the
extractable nuclear antigens SS-A/Ro and SS-B/La is induced on the surface of
human keratinocytes by ultraviolet light (UVL): implications for the pathogenesis of
photosensitive cutaneous lupus . J.Invest.Dermatol. 94:77-85, 1990
347.
Furukawa F, Kanauchi H, Imamura S: Susceptibility to UVB light in cultured
keratinocytes of cutaneous lupus erythematosus. Dermatology. 189 Suppl 1:18-23,
1994
348.
Golan TD, Elkon KB, Gharavi AE, et al: Enhanced membrane binding of
autoantibodies to cultured keratinocytes of systemic lupus erythematosus patients
after ultraviolet B/ultraviolet A irradiation. J.Clin.Invest. 90:1067-1076, 1992
349.
Jones SK: Ultraviolet radiation (UVR) induces cell-surface Ro/SSA antigen
expression by human keratinocytes in vitro: a possible mechanism for the UVR
induction of cutaneous lupus lesions. Br.J.Dermatol. 126:546-553, 1992
350.
Furukawa F, Lyons MB, Lee LA, et al: Estradiol enhances binding to cultured
human keratinocytes of antibodies specific for SS-A/Ro and SS-B/La. Another
possible mechanism for estradiol influence of lupus erythematosus. J.Immunol.
141:1480-1488, 1988
351.
Furukawa F, Imamura S, Norris DA: Stimulation of anti-RNP antibody binding to
cultured keratinocytes by estradiol. Arch.Dermatol.Res. 283:258-261, 1991
352.
Jones SK: The effects of hormonal and other stimuli on cell-surface Ro/SSA antigen
expression by human keratinocytes in vitro: their possible role in the induction of
cutaneous lupus lesions. Br.J.Dermatol. 126:554-560, 1992
353.
Wang D, Chan EK: 17-beta-estradiol increases expression of 52-kDa and 60-kDa
SS-A/Ro autoantigens in human keratinocytes and breast cancer cell line MCF-7.
J.Invest.Dermatol. 107:610-614, 1996
354.
Furukawa F, Ikai K, Matsuyoshi N, et al: Relationship between heat shock protein
induction and the binding of antibodies to the extractable nuclear antigens on
cultured human keratinocytes. J.Invest.Dermatol. 101:191-195, 1993
355.
Mendlovic S, Brocke S, Shoenfeld Y, et al: Induction of a systemic lupus
erythematosus-like disease in mice by a common human anti-DNA idiotype.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85:2260-2264, 1988
356.
Mendlovic S, Fricke H, Shoenfeld Y, et al: The role of anti-idiotypic antibodies in
the
induction
of
experimental
Eur.J.Immunol. 19:729-734, 1989
systemic
lupus
erythematosus
in
mice.
357.
Mozes E, Brocke S, Shoenfeld Y, et al: The role of the idiotypic network in the
induction of experimental systemic lupus erythematosus. J.Cell Biochem. 40:173181, 1989
358.
Blank M, Krup M, Mendlovic S, et al: The importance of the pathogenic 16/6
idiotype in the induction of SLE in naive mice. Scand.J.Immunol. 31:45-52, 1990
359.
Blank M, Mendlovic S, Fricke H, et al: Sex hormone involvement in the induction of
experimental systemic lupus erythematosus by a pathogenic anti-DNA idiotype in
naive mice. J.Rheumatol. 17:311-317, 1990
360.
Kalush F, Rimon E, Keller A, et al: Neonatal lupus erythematosus with cardiac
involvement
in
offspring
of
mothers
with
experimental
systemic
lupus
erythematosus. J.Clin.Immunol. 14:314-322, 1994
361.
Kalush F, Rimon E, Mozes E: Neonatal lupus erythematosus in offspring of
mothers with experimental systemic lupus erythematosus. Am.J.Reprod.Immunol.
28:264-268, 1992
362.
Mamula MJ, Fox OF, Yamagata H, et al: The Ro/SSA autoantigen as an
immunogen. Some anti-Ro/SSA antibody binds IgG. J.Exp.Med. 164:1889-1901,
1986
363.
Zhang W, Reichlin M: Some autoantibodies to Ro/SS-A and La/SS-B are
antiidiotypes to anti-double-stranded DNA. Arthritis Rheum. 39:522-531, 1996
364.
Arnett FC, Bias WB, Reveille JD: Genetic studies in Sjogren's syndrome and
systemic lupus erythematosus. J.Autoimmun. 2:403-413, 1989
365.
Arnett FC, Hamilton RG, Reveille JD, et al: Genetic studies of Ro (SS-A) and La
(SS-B) autoantibodies in families with systemic lupus erythematosus and primary
Sjogren's syndrome. Arthritis Rheum. 32:413-419, 1989
366.
Garcia PR, Belmonte LM, Camps GM, et al: [Immunogenetics of the Sjogren's
syndrome in southern Spain]. An.Med.Interna. 11:56-61, 1994
367.
Harley JB, Alexander EL, Bias WB, et al: Anti-Ro (SS-A) and anti-La (SS-B) in
patients with Sjogren's syndrome. Arthritis Rheum. 29:196-206, 1986
368.
Julkunen H, Siren MK, Kaaja R, et al: Maternal HLA antigens and antibodies to
SS-A/Ro and SS-B/La. Comparison with systemic lupus erythematosus and primary
Sjogren's syndrome. Br.J.Rheumatol. 34:901-907, 1995
369.
Ricchiuti V, Isenberg D, Muller S: HLA association of anti-Ro60 and anti-Ro52
antibodies in Sjogren's syndrome. J.Autoimmun. 7:611-621, 1994
370.
Wilson RW, Provost TT, Bias WB, et al: Sjogren's syndrome. Influence of multiple
HLA-D region alloantigens on clinical and serologic expression. Arthritis Rheum.
27:1245-1253, 1984
371.
Reveille JD, Bias WB, Winkelstein JA, et al: Familial systemic lupus erythematosus:
immunogenetic studies in eight families. Medicine (Baltimore.) 62:21-35, 1983
372.
Lulli P, Sebastiani GD, Trabace S, et al: HLA antigens in Italian patients with
systemic lupus erythematosus: evidence for the association of DQw2 with the
autoantibody response to extractable nuclear antigens. Clin.Exp.Rheumatol. 9:475479, 1991
373.
Provost TT, Talal N, Bias W, et al: Ro(SS-A) positive Sjogren's/lupus erythematosus
(SC/LE) overlap patients are associated with the HLA-DR3 and/or DRw6
phenotypes. J.Invest.Dermatol. 91:369-371, 1988
374.
Provost
TT,
Watson
R:
Anti-Ro(SS-A)
HLA-DR3-positive
women:
the
interrelationship between some ANA negative, SS,SCLE, and NLE mothers and
SS/LE overlap female patients. J.Invest.Dermatol. 100:14S-20S, 1993
375.
Reveille JD, Schrohenloher RE, Acton RT, et al: DNA analysis of HLA-DR and
DQ genes in American blacks with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum.
32:1243-1251, 1989
376.
Smolen JS, Klippel JH, Penner E, et al: HLA-DR antigens in systemic lupus
erythematosus: association with specificity of autoantibody responses to nuclear
antigens. Ann.Rheum.Dis. 46:457-462, 1987
377.
Watson RM, Lane AT, Barnett NK, et al: Neonatal lupus erythematosus. A clinical,
serological and immunogenetic study with review of the literature.
Medicine
Baltimore. 63:362-378, 1984
378.
Watson RM, Talwar P, Alexander E, et al: Subacute cutaneous lupus
erythematosus-immunogenetic associations. J.Autoimmun. 4:73-85, 1991
379.
Miyagawa S, Dohi K, Shima H, et al: HLA antigens in anti-Ro(SS-A)-positive
patients with recurrent annular erythema. J.Am.Acad.Dermatol. 28:185-188, 1993
380.
Miyagawa S: Clinical, serological and immunogenetic features of Japanese antiRo/SS-A-positive patients with annular erythema. Dermatology. 189 Suppl 1:11-13,
1994
381.
Pease CT, Shattles W, Charles PJ, et al: Clinical, serological, and HLA phenotype
subsets in Sjogren's syndrome. Clin.Exp.Rheumatol. 7:185-190, 1989
382.
Vitali C, Tavoni A, Rizzo G, et al: HLA antigens in Italian patients with primary
Sjogren's syndrome. Ann.Rheum.Dis. 45:412-416, 1986
383.
Alexander EL, McNicholl J, Watson RM, et al: The immunogenetic relationship
between anti-Ro(SS-A)/La(SS-B) antibody positive Sjogren's/lupus erythematosus
overlap syndrome and the neonatal lupus syndrome. J.Invest.Dermatol. 93:751-756,
1989
384.
Camps GM, Ocon SP, Alonso OA, et al: [Class I and II HLA antigens in patients
with systemic lupus erythematosus in the south of Spain]. Med.Clin.Barc. 102:688693, 1994
385.
Hamilton RG, Harley JB, Bias WB, et al: Two Ro (SS-A) autoantibody responses in
systemic lupus erythematosus. Correlation of HLA-. Arthritis Rheum. 31:496-505,
1988
386.
Fujisaku A, Frank MB, Neas B, et al: HLA-DQ gene complementation and other
histocompatibility relationships in man with the anti- Ro/SSA autoantibody
response of systemic lupus erythematosus. J.Clin.Invest. 86:606-611, 1990
387.
Harley JB, Sestak AL, Willis LG, et al: A model for disease heterogeneity in
systemic lupus erythematosus. Relationships between histocompatibility antigens,
autoantibodies, and lymphopenia or renal disease. Arthritis Rheum. 32:826-836,
1989
388.
Scofield RH, Frank MB, Neas BR, et al: Cooperative association of T cell beta
receptor and HLA-DQ alleles in the production of anti-Ro in systemic lupus
erythematosus. Clin.Immunol.Immunopathol. 72:335-341, 1994
389.
Harley JB, Reichlin M, Arnett FC, et al: Gene interaction at HLA-DQ enhances
autoantibody production in primary Sjogren's syndrome. Science 232:1145-1147,
1986
390.
Tishler M, Moutsopoulos HM, Yaron M: Genetic studies of anti-Ro (SSA)
antibodies in families with rheumatoid arthritis. J.Rheumatol. 19:234-236, 1992
391.
Routsias JG, Sakarellos-Daitsiotis M, Sakarellos C, et al: Structural, molecular and
immunological properties of linear B-cell epitopes of Ro60KD autoantigen.
Scand.J.Immunol. 47:280-287, 1998
392.
Brown JH, Jardetzky TS, Gorga JC, et al: Three-dimensional structure of the
human class II histocompatibility antigen HLA-DR1. Nature 364:33-39, 1993
393.
Mengle-Gaw LS, Conner S, McDevitt HO, et al: Gene conversion between murine
class II major histocompatibility complex loci: functional and molecular evidence
from the bm12 mutant. J.Exp.Med. 160:11841, 984
394.
Chiang B, Bearer E, Ansari A, et al: The bm12 mutation and aytoantibodies to
dsDNA in NZB.H-2bm12 mice. J.Immunol. 145:94-101, 1990
395.
Kaye J, Janeway-CA J: The Fab fragment of a directly activating monoclonal
antibody that precipitates a disulfide-linked heterodimer from a helper T cell clone
blocks activation by either allogeneic Ia or antigen and self-Ia.
J.Exp.Med.
159:1397-1412, 1984
396.
Koulova L, Clark EA, Shu G, et al: The CD28 ligand B7/BB1 provides
costimulatory signal for alloactivation of CD4+ T cells. J.Exp.Med. 173:759-762,
1991
397.
Lane PJ, McConnell FM, Schieven GL, et al: The role of class II molecules in
human B cell activation. Association with phosphatidyl inositol turnover, protein
tyrosine phosphorylation, and proliferation. J.Immunol. 144:3684-3692, 1990
398.
Mooney N, Grillot CC, Hivroz C, et al: A role for MHC class II antigens in B-cell
activation. J.Autoimmun. 2 Suppl:215-223, 1989
399.
Cambier JC, Lehmann KR: Ia-mediated signal transduction leads to proliferation of
primed B lymphocytes. J.Exp.Med. 170:877-886, 1989
400.
Bernatchez C, Al DR, Mayer PE, et al: Functional analysis of Mycoplasma
arthritidis-derived mitogen interactions with class II molecules.
Infect.Immun.
65:2000-2005, 1997
401.
Roussel A, Anderson BF, Baker HM, et al: Crystal structure of the streptococcal
superantigen SPE-C: dimerization and zinc binding suggest a novel mode of
interaction with MHC class II molecules. Nat.Struct.Biol. 4:635-643, 1997
402.
Suzuki H, Takemura H, Suzuki M, et al: Molecular cloning of anti-SS-A/Ro 60-kDa
peptide Fab fragments from infiltrating salivary gland lymphocytes of a patient with
Sjogren's syndrome. Biochem.Biophys.Res.Commun. 232:101-106, 1997
403.
Alexander E, Buyon JP, Provost TT, et al: Anti-Ro/SS-A antibodies in the
pathophysiology of congenital heart block in neonatal lupus syndrome, an
experimental model. In vitro electrophysiologic and immunocytochemical studies.
Arthritis Rheum. 35:176-189, 1992
404.
Alexander EL, Buyon JP, Lane J, et al: Anti-SS-A/Ro SS-B/La antibodies bind to
neonatal rabbit cardiac cells and preferentially inhibit in vitro cardiac
repolarization. J.Autoimmun. 2:463-469, 1989
405.
Andriessen P, Tanke R, Fiselier T: Congenital complete atrioventricular block in
neonatal lupus erythematosus. Tijdschr.Kindergeneeskd. 61:178-182, 1993
406.
Buyon JP: Neonatal lupus and congenital complete heart block: manifestations of
passively acquired autoimmunity. Clin.Exp.Rheumatol. 7 Suppl 3:S199-S203, 1989
407.
Buyon JP: Neonatal lupus syndromes. Am.J.Reprod.Immunol. 28:259-263, 1992
408.
Buyon JP, Winchester RJ, Slade SG, et al: Identification of mothers at risk for
congenital heart block and other neonatal lupus syndromes in their children.
Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and immunoblot for
measurement of anti-SS-A/Ro and anti-SS-B/La antibodies.
Arthritis Rheum.
36:1263-1273, 1993
409.
Buyon JP, Waltuck J, Caldwell K, et al: Relationship between maternal and
neonatal levels of antibodies to 48 kDa SSB(La), 52 kDa. J.Rheumatol. 21:19431950, 1994
410.
Buyon JP: Neonatal lupus syndromes. Curr.Opin.Rheumatol. 6:523-529, 1994
411.
Buyon JP: Neonatal lupus. Curr.Opin.Rheumatol. 8:485-490, 1996
412.
Buyon
JP:
Neonatal
lupus:
bedside
to
bench
and
back
[editorial].
Scand.J.Rheumatol. 25:271-276, 1996
413.
Callen JP, Fowler JF, Kulick KB, et al: Neonatal lupus erythematosus occurring in
one fraternal twin. Serologic and immunogenetic studies. Arthritis Rheum. 28:271275, 1985
414.
Chen
CM,
Hsu
YH:
Neonatal
lupus
erythematosus:
Kao.Hsiung.I.Hsueh.Ko.Hsueh.Tsa.Chih. 8:280-284, 1992
a
case
report.
415.
Cortes DL, Romero GJ, Roldan MA, et al: Neonatal lupus erythematosus:
dermatitis, A-V block and SSA/Ro antibodies. An.Esp.Pediatr. 37:151-152, 1992
416.
de PY, Bodemer C: Neonatal lupus. Ann.Med.Interne.Paris. 141:250-252, 1990
417.
Finkelstein Y, Adler Y, Harel L, et al: Anti-Ro (SSA) and anti-La (SSB) antibodies
and complete congenital heart block. Ann.Med.Interne.Paris. 148:205-208, 1997
418.
Frohn MI, Meilof JF, Szatmari A, et al: Clinical significance of maternal antiRo/SS-A antibodies in children with isolated heart block.
J.Am.Coll.Cardiol.
23:1677-1681, 1994
419.
Fu LS, Hwang B, Lee BH: Newborns of Chinese mother with systemic lupus
erythematosus (SLE). Acta Paediatr.Sin. 33:341-349, 1992
420.
Garcia S, Nascimento JH, Bonfa E, et al: Cellular mechanism of the conduction
abnormalities induced by serum from anti-Ro/SSA- positive patients in rabbit
hearts. J.Clin.Invest. 93:718-724, 1994
421.
Gurakan B, Yalcin S, Tekinalp G, et al: Neonatal lupus syndrome: report of a case.
Turk.J.Pediatr. 37:153-156, 1995
422.
Jenkins RE, Kurwa AR, Atherton DJ, et al: Neonatal lupus erythematosus.
Clin.Exp.Dermatol. 19:409-411, 1994
423.
Kaneko F, Tanji O, Hasegawa T, et al: Neonatal lupus erythematosus in Japan.
J.Am.Acad.Dermatol. 26:397-403, 1992
424.
Lane AT, Watson RM: Neonatal lupus erythematosus. Am.J.Dis.Child 138:663666, 1984
425.
Lang B, Wilhelm C, Gildein P, et al: Fetal complete heart block with myocarditis
and maternal SS-A-/AA-B/antibodies. Schweiz.Med.Wochenschr. 120:1741-1744,
1990
426.
Lawrence N, Bligard CA, Storer J, et al: Neonatal lupus in twins. South.Med.J.
82:657-660, 1989
427.
Lee LA, Weston WL: New findings in neonatal lupus syndrome. Am.J.Dis.Child
138:233-236, 1984
428.
Lee LA: Neonatal lupus erythematosus. J.Invest.Dermatol. 100:9S-13S, 1993
429.
Lee LA, Frank MB, McCubbin VR, et al: Autoantibodies of neonatal lupus
erythematosus . J.Invest.Dermatol. 102:963-966, 1994
430.
Lehman TJ, Reichlin M, Santner TJ, et al: Maternal antibodies to Ro (SS-A) are
associated with both early onset of disease and male sex among children with
systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 32:1414-1420, 1989
431.
Leu LY, Lan JL: The influence on pregnancy of anti-SSA/Ro antibodies in systemic
lupus
erythematosus.
Chung.Hua.Min.Kuo.Wei.Sheng.Wu.Chi.Mien.I.Hsueh.Tsa.Chih. 25:12-20, 1992
432.
Lumpkin LR, Hall J, Hogan JD, et al: Neonatal lupus erythematosus. A report of
three cases associated with anti-Ro/SSA antibodies. Arch.Dermatol. 121:377-381,
1985
433.
Luo SF, Huang CC, Wang JW: Neonatal lupus erythematosus: report of a case.
Taiwan.I.Hsueh.Hui.Tsa.Chih. 88:832-835, 1989
434.
Mayet WJ, Hermann E, Bachmann M, et al: Neonatal lupus erythematosus.
Z.Rheumatol. 48:57-62, 1989
435.
McCarron DP, Hellmann DB, Traill TA, et al: Neonatal lupus erythematosus
syndrome: late detection of isolated heart block. J.Rheumatol. 20:1212-1214, 1993
436.
McCauliffe DP: Neonatal lupus erythematosus: a transplacentally acquired
autoimmune disorder. Semin.Dermatol. 14:47-53, 1995
437.
Miyagawa S, Dohi K, Yoshioka A, et al: Female predominance of immune response
to SSA/Ro antigens and risk of neonatal lupus erythematosus.
Br.J.Dermatol.
123:223-227, 1990
438.
Miyagawa S, Fukumoto T, Hashimoto K, et al: Maternal autoimmune response to
recombinant Ro/SSA and La/SSB proteins in Japanese neonatal lupus erythem
atosus. Autoimmunity. 21:277-282, 1995
439.
Petri M, Watson R, Hochberg MC: Anti-Ro antibodies and neonatal lupus.
Rheum.Dis.Clin.North Am. 15:335-360, 1989
440.
Prados R, Maroto E, Lopez LJ, et al: [Neonatal lupus erythematosus: complete
atrioventricular block and SSA/Ro antibodies]. An.Esp.Pediatr. 26:449-451, 1987
441.
Provost TT, Watson R, Gaither KK, et al: The neonatal lupus erythematosus
syndrome. J.Rheumatol. 14 Suppl 13:199-205, 1987
442.
Reichlin M, Friday K, Harley JB: Complete congenital heart block followed by antiRo/SSA in adult life. Studies of an informative family. Am.J.Med. 84:339-344, 1988
443.
Sany
J:
Pathogenic
role
of
antinuclear
antibodies
in
lupus
disease.
Ann.Med.Interne.Paris. 141:222-226, 1990
444.
Tseng CE, Caldwell K, Feit S, et al: Subclass distribution of maternal and neonatal
anti-Ro(SSA) and La(SSB) antibodies in congenital heart block.
J.Rheumatol.
23:925-932, 1996
445.
Tseng CE, Di DF, Buyon JP: Stability of immunoblot profile of anti-SSA/RoSSB/La antibodies over time in mothers whose children have neonatal lupus.
Lupus. 5:212-215, 1996
446.
Tseng CE, Buyon JP: Neonatal lupus syndromes.
Rheum.Dis.Clin.North Am.
23:31-54, 1997
447.
Watson RM, Scheel JN, Petri M, et al: Neonatal lupus erythematosus. Report of
serological and immunogenetic studies in twins discordant for congenital heart
block. Br.J.Dermatol. 130:342-348, 1994
448.
Reed BR, Lee LA, Harmon C, et al: Autoantibodies to SS-A/Ro in infants with
congenital heart block. J-Pediatr 103:889-891, 1983
449.
Scott JS, Maddison PJ, Taylor PV, et al: Connective-tissue disease, antibodies to
ribonucleoprotein, and congenital heart block. N-Engl 309:209-212, 1983
450.
Reichlin M, Wasicek CA: Clinical and biologic significance of antibodies to
Ro/SSA. Hum.Pathol. 14:401-405, 1983
451.
Behan WM, Behan PO, Reid JM, et al: Family studies of congenital heart block
associated with Ro antibody. Br.Heart J. 62:320-324, 1989
452.
Diestelmeier MR, Hayne ST, Rada DC: Neonatal lupus: a case report.
Cutis.
33:191-193, 1984
453.
Gross KR, Petty RE, Lum VL, et al: Maternal autoantibodies and fetal disease.
Clin.Exp.Rheumatol. 7:651-657, 1989
454.
Silverman E, Mamula M, Hardin JA, et al: Importance of the immune response to
the Ro/La particle in the development of congenital heart block and neonatal lupus
erythematosus. J.Rheumatol. 18:120-124, 1991
455.
Deng JS, Bair-LW J, Shen SS, et al: Localization of Ro (SS-A) antigen in the
cardiac conduction system. Arthritis Rheum. 30:1232-1238, 1987
456.
Lee LA, Coulter S, Erner S, et al: Cardiac immunoglobulin deposition in congenital
heart block associated with maternal anti-Ro autoantibodies. Am.J.Med. 83:793796, 1987
457.
Litsey SE, Noonan JA, O'Connor WN, et al: Maternal connective tissue disease and
congenital heart block. Demonstration of immunoglobulin in cardiac tissue. N Engl
J Med. 312:98-100, 1985
458.
Taylor PV, Scott JS, Gerlis LM, et al: Maternal antibodies against fetal cardiac
antigens in congenital complete heart block. N Engl J Med. 315:667-672, 1986
459.
Beutner EH, Blaszczyk M, Jablonska S, et al: Studies on criteria of the European
Academy of Dermatology and Venerology for the classification of cutaneous lupus
erythematosus. I. Selection of clinical groups and study factors [published erratum
appears in Int J Dermatol 1991 Aug;30(8):557]. Int.J.Dermatol. 30:411-417, 1991
460.
David BK, Bennion SD, DeSpain JD, et al:
Clinical, histologic, and
immunofluorescent distinctions between subacute cutaneous lupus erythematosus
and discoid lupus erythematosus. J.Invest.Dermatol. 99:251-257, 1992
461.
Deng JS, Sontheimer RD, Gilliam JN: Relationships between antinuclear and antiRo/SS-A
antibodies
in
subacute
cutaneous
lupus
erythematosus.
J.Am.Acad.Dermatol. 11:494-499, 1984
462.
Hasan T, Nyberg F, Stephansson E, et al: Photosensitivity in lupus erythematosus,
UV photoprovocation results compared with history of photosensitivity and clinical
findings. Br.J.Dermatol. 136:699-705, 1997
463.
Lee LA, Roberts CM, Frank MB, et al: The autoantibody response to Ro/SSA in
cutaneous lupus erythematosus . Arch.Dermatol. 130:1262-1268, 1994
464.
Lopez LF, Monteagudo I, Gonzalez CM, et al: Systemic lupus erythematosus:
clinical expression and anti-Ro/SS--a response in patients with and without lesions
of subacute cutaneous lupus erythematosus. Lupus. 6:32-39, 1997
465.
McCauliffe DP: Cutaneous diseases in adults associated with anti-Ro/SS-A
autoantibody production. Lupus. 6:158-166, 1997
466.
Nagy E, Meszaros C, Debreczeni M: Subacute lupus erythematosus of the skin-clinical aspects and laboratory findings. Z.Hautkr. 65:1039-1041, 1990
467.
Provost TT, Watson R, Simmons OE: Significance of the anti-Ro (SS-A) antibody
in evaluation of patients with cutaneous manifestations of a connective tissue
disease. J.Am.Acad.Dermatol. 35:147-169, 1996
468.
Simmons OE, Chen S, Watson R, et al: One hundred anti-Ro (SS-A) antibody
positive patients: a 10-year follow-up. Medicine Baltimore. 74:109-130, 1995
469.
Sontheimer RD, McCauliffe DP: Pathogenesis of anti-Ro/SS-A autoantibodyassociated cutaneous lupus erythematosus. Dermatol.Clin. 8:751-758, 1990
470.
Valeski JE, Kumar V, Forman AB, et al: A characteristic cutaneous direct
immunofluorescent pattern associated with Ro(SS-A) antibodies in subacute
cutaneous lupus erythematosus. J.Am.Acad.Dermatol. 27:194-198, 1992
471.
Zappi E, Sontheimer R: Clinical relevance of antibodies to Ro/SS-A and La/SS-B in
subacute cutaneous lupus erythematosus and related conditions. Clin.Dermatol.
10:431-441, 1992
472.
Zappi E, Sontheimer R: Clinical relevance of antibodies to Ro/SS-A and La/SS-B in
subacute cutaneous lupus erythematosus and related conditions. Immunol.Invest.
22:189-203, 1993
473.
Jones SK, Coulter S, Harmon C, et al: Ro/SSA antigen in human epidermis.
Br.J.Dermatol. 118:363-367, 1988
474.
Lee LA, Harmon CE, Huff JC, et al: The demonstration of SS-A/Ro antigen in
human fetal tissues and in neonatal and adult skin. J.Invest.Dermatol. 85:143-146,
1985
475.
Lee LA, Gaither KK, Coulter SN, et al: Pattern of cutaneous immunoglobulin G
deposition in subacute cutaneous lupus erythematosus is reproduced by infusing
purified anti-Ro (SSA) autoantibodies into human skin-grafted mice. J.Clin.Invest.
83:1556-1562, 1989
476.
Lee LA, Weston WL, Krueger GG, et al: An animal model of antibody binding in
cutaneous lupus. Arthritis Rheum. 29:782-788, 1986
477.
Maddison PJ, et al: Medicine 60:871981
478.
Bylund DJ, Nakamura RM: Importance of detection of SS-A/Ro autoantibody in
screening immunofluorescence tests for autoantibodies to nuclear antigens.
J.Clin.Lab.Anal. 5:212-218, 1991
479.
Keech CL, Howarth S, Coates T, et al: Rapid and sensitive detection of anti-Ro
(SS-A) antibodies by indirect immunofluorescence of 60kDa Ro HEp-2
transfectants. Pathology. 28:54-57, 1996
480.
Deng JS, Bair-LW J, Medsger-TA J, et al: Correlation between ANA
determinations on tissue substrate, WiL-2 cell substrate, and precipitin antibody by
double diffusion [published erratum appears in Diagn Clin Immunol 1988;5(5):277].
Diagn.Clin.Immunol. 5:151-157, 1987
481.
Ruddy
S:
Rheumatic
diseases
and
inherited
complement
deficiencies.
Bull.Rheum.Dis. 45:6-8, 1996
482.
Nusinow SR, Zuraw BL, Curd JG: The hereditary and acquired deficiencies of
complement. Med.Clin.North Am. 69:487-504, 1985
483.
Provost TT, Arnett FC, Reichlin M: Homozygous C2 deficiency, lupus
erythematosus, and anti-Ro (SSA) antibodies. Arthritis-Rheum 26:1279-1282, 1983
484.
Holtman JH, Neustadt DH, KleMn J, et al: Dapsone is an effective therapy for the
skin lesions of subacute cutaneous lupus erythematosus and urticarial vasculitis in a
patient with C2 deficiency. J.Rheumatol. 17:1222-1225, 1990
485.
Meyer O, Hauptmann G, Tappeiner G, et al: Genetic deficiency of C4, C2 or C1q
and
lupus
syndromes.
Association
with
anti-Ro
(SS-A)
antibodies.
Clin.Exp.Immunol. 62:678-684, 1985
486.
Weiss L, Maillet F, Kazatchkine M: Lupus and protein deficiencies of the classical
complement pathway. Rev.Prat. 40:1937-1940, 1990
487.
Wilson WA, Perez MC: Complete C4B deficiency in black Americans with systemic
lupus erythematosus. J.Rheumatol. 15:1855-1858, 1988
488.
Miyagawa S, Iida T, Fukumoto T, et al: Anti-Ro/SSA-associated annular erythema
in childhood. Br.J.Dermatol. 133:779-782, 1995
489.
Usuda T: Recurrent annular erythema--cutaneous manifestation of Sjogren
syndrome with anti SS-A (Ro) and anti SS-B (La) antibodies]. Nippon.Rinsho.
53:2557-2562, 1995
490.
Nishiyama S, Miyawaki S, Hashimoto T: [Cutaneous manifestations of primary
Sjogren's syndrome. Nippon.Rinsho. 53:2551-2556, 1995
491.
Provost TT, Vasily D, Alexander E: Sjogren's syndrome. Cutaneous, immunologic,
and nervous system manifestations. Neurol.Clin. 5:405-426, 1987
492.
Alexander EL, Provost TT: Cutaneous manifestations of primary Sjogren's
syndrome: a reflection of vasculitis and association with anti-Ro(SSA) antibodies.
J-Invest-Dermatol 80:386-391, 1983
493.
Moutsopoulos HM, Zerva LV: Anti-Ro (SSA)/La (SSB) antibodies and Sjogren's
syndrome. Clin.Rheumatol. 9:123-130, 1990
494.
Hansen B, Manthorpe R: Antibodies against SS-B/La and SS-A/Ro antigens in
patients with primary Sjogren's syndrome.
Scand.J.Rheumatol.Suppl. 61:93-97,
1986
495.
Harley JB, Scofield RH, Reichlin M: Anti-Ro in Sjogren's syndrome and systemic
lupus erythematosus. Rheum.Dis.Clin.North Am. 18:337-358, 1992
496.
Skopouli FN, Andonopoulos AP, Moutsopoulos HM: Clinical implications of the
presence of anti-Ro (SSA) antibodies in patients with rheumatoid arthritis.
J.Autoimmun. 1:381-388, 1988
497.
Moutsopoulos HM, Skopouli FN, Sarras AK, et al: Anti-Ro(SSA) positive
rheumatoid arthritis (RA): a clinicoserological group of patients with high incidence
of D-penicillamine side effects. Ann.Rheum.Dis. 44:215-219, 1985
498.
Boire G, Menard HA: Clinical significance of anti-Ro(SSA) antibody in rheumatoid
arthritis. J.Rheumatol. 15:391-394, 1988
499.
Drosos AA, Moutsopoulos HM: Rheumatoid arthritis in Greece: clinical,
serological and genetic considerations. Clin.Exp.Rheumatol. 13 Suppl 12:S7-12,
1995
500.
Moutsopoulos HM, Giotaki H, Maddison PJ, et al: Antibodies to cellular antigens
in Greek patients with autoimmune rheumatic diseases: anti- Ro(SSA) antibody a
possible marker of penicillamine-D intolerance. Ann.Rheum.Dis. 43:285-287, 1984
501.
Vlachoyiannopoulos PG, Zerva LV, Skopouli FN, et al: D-penicillamine toxicity in
Greek
patients
with
rheumatoid
arthritis:
anti-Ro(SSA)
antibodies
and
cryoglobulinemia are predictive factors. J.Rheumatol. 18:44-49, 1991
502.
Bennion SD, Ferris C, Lieu TS, et al: IgG subclasses in the serum and skin in
subacute cutaneous lupus erythematosus and neonatal lupus erythematosus.
J.Invest.Dermatol. 95:643-646, 1990
503.
McCauliffe DP, Lux FA, Lieu TS, et al: Ro/SS-A and the pathogenic significance of
its antibodies. J.Autoimmun. 2:375-381, 1989
504.
Routsias JG, Tzioufas AG, Sakarellos DM, et al: Calreticulin synthetic peptide
analogues:
anti-peptide
antibodies
in
autoimmune
rheumatic
diseases.
Clin.Exp.Immunol. 91:437-441, 1993
505.
Meilof JF, Van-der LA, Rokeach LA, et al: Autoimmunity and filariasis.
Autoantibodies against cytoplasmic cellular proteins in sera of patients with
onchocerciasis. J.Immunol. 151:5800-5809, 1993
506.
Brattig NW, Krawietz I, Abakar AZ, et al: Strong IgG isotypic antibody response in
sowdah type onchocerciasis. J.Infect.Dis. 170:955-961, 1994
507.
Lux FA, McCauliffe DP, Buttner DW, et al: Serological cross-reactivity between a
human Ro/SS-A autoantigen (calreticulin) and the lambda Ral-1 antigen of
Onchocerca volvulus. J.Clin.Invest. 89:1945-1951, 1992
508.
Brattig NW, Tischendorf FW, Reifegerste EJ, et al: Differences in the distribution
of HLA antigens in localized and generalized form of onchocerciasis.
Trop.Med.Parasitol. 37:271-275, 1986
509.
Khalife J, Trottein F, Schacht AM, et al: Cloning of the gene encoding a
Schistosoma mansoni antigen homologous to human Ro/SS-A autoantigen.
Mol.Biochem.Parasitol. 57:193-202, 1993
510.
Zhu J, Newkirk MM: Viral induction of the human autoantigen calreticulin.
Clin.Invest.Med. 17:196-205, 1994
511.
Kawashima T, Zappi EG, Lieu TS, et al: Impact of ultraviolet irradiation on
expression of SSA/Ro autoantigenic polypeptides in transformed human epidermal
keratinocytes. Lupus. 3:493-500, 1994
512.
Kawashima T, Zappi EG, Lieu TS, et al: Impact of ultraviolet radiation on the
cellular expression of Ro/SS-A-autoantigenic polypeptides.
Dermatology. 189
Suppl 1:6-10, 1994
513.
Nguyen TO, Capra JD, Sontheimer RD: Calreticulin is transcriptionally
upregulated by heat shock, calcium and heavy metals. Mol.Immunol. 33:379-386,
1996
514.
Winfield JB: Stress protein, arthritis and autoimmunity.
32:14971989
Arthritis Rheum.
515.
Orth T, Dorner T, Meyer-Zum BK, et al: Complete congenital heart block is
associated with increased autoantibody titers against calreticulin. Eur.J.Clin.Invest.
26:205-215, 1996
516.
Holman HR, Kunkel HG: Science 126:162, 1957
517.
Friou GJ: J.Clin.Invest. 36:890, 1957
518.
Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis., in Kallos P.
(ed): Progress in Allergy. Kargel, Basel, 1958, pp 1-78
519.
Engvall E: Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA., in Chang TMS. (ed):
Biomedical Applications of Immobilized Enzymes and Proteins. New York, Plenum
Press, 1977,
520.
Lu J, Willis AC, Sim RB: A calreticulin-like protein co-purifies with a '60 kD'
component of Ro/SSA, but is not recognized by antibodies in Sjogren's syndrome
sera. Clin.Exp.Immunol. 94:429-434, 1993
521.
Buyon JP, Slade SG, Chan EK, et al: Effective separation of the 52 kDa SSA/Ro
polypeptide from the 48 kDa SSB/La polypeptide by altering conditions of
polyacrylamide gel electrophoresis. J.Immunol.Methods 129:207-210, 1990
522.
Itoh Y, Reichlin M: Autoantibodies to the Ro/SSA antigen are conformation
dependent. I: Anti-60 kD antibodies are mainly directed to the native protein; anti52 kD antibodies are mainly directed to the denatured protein. Autoimmunity.
14:57-65, 1992
523.
Huang SC, Scofield RH, Kurien BT, et al: Human anti-Ro autoantibodies bind
multiple conformational epitopes of 60-kD Ro autoantigen.
J Clin.Immunol.
17:212-219, 1997
524.
Barakat S, Meyer O, Torterotot F, et al: IgG antibodies from patients with primary
Sjogren's syndrome and systemic lupus erythematosus recognize different epitopes
in 60-kD SSA/Ro protein. Clin.Exp.Immunol. 89:38-45, 1992
525.
Dickey WD, van EJ, Hardgrave KL, et al: Presence of anti-La(SS-B) is associated
with binding to the 13-kD carboxyl terminus of 60- kD Ro(SS-A) in systemic lupus
erythematosus. J Invest Dermatol 100:412-416, 1993
526.
Huang SC, Yu H, Scofield RH, et al: Human anti-Ro autoantibodies bind peptides
accessible to the surface of the native Ro autoantigen. Scand.J Immunol. 41:220228, 1995
527.
James JA, Scofield RH, Harley JB: Lupus humoral autoimmunity after short
peptide immunization. Ann.N Y.Acad.Sci. 815:124-127, 1997
528.
Saitta MR, Arnett FC, Keene JD: 60-kDa Ro protein autoepitopes identified using
recombinant polypeptides. J Immunol. 152:4192-4202, 1994
529.
Scofield RH, Henry WE, Kurien BT, et al: Immunization with short peptides from
the sequence of the systemic lupus erythematosus- associated 60-kDa Ro
autoantigen results in anti-Ro ribonucleoprotein autoimmunity.
J Immunol.
156:4059-4066, 1996
530.
Scofield RH, Zhang FC, Kurien BT, et al: Anti-Ro fine specificity defined by
multiple
antigenic
peptides
identifies
components
of
tertiary
epitopes.
Clin.Exp.Immunol. 109:480-487, 1997
531.
Veldhoven CH, Pruijn GJ, Meilof JF, et al: Characterization of murine monoclonal
antibodies against 60-kD Ro/SS-A and La/SS-B autoantigens. Clin.Exp.Immunol.
101:45-54, 1995
532.
Wahren M, Solomin L, Pettersson I, et al: Autoantibody repertoire to Ro/SSA and
La/SSB antigens in patients with primary and secondary Sjogren's syndrome. J
Autoimmun. 9:537-544, 1996
533.
Blange I, Ringertz NR, Pettersson I: Identification of antigenic regions of the
human 52kD Ro/SS-A protein recognized by patient sera. J Autoimmun. 7:263-274,
1994
534.
Buyon JP, Slade SG, Reveille JD, et al: Autoantibody responses to the "native" 52kDa SS-A/Ro protein in neonatal lupus syndromes, systemic lupus erythematosus,
and Sjogren's syndrome. J Immunol. 152:3675-3684, 1994
535.
Dorner T, Feist E, Wagenmann A, et al: Anti-52 kDa Ro(SSA) autoantibodies in
different autoimmune diseases preferentially recognize epitopes on the central
region of the antigen. J Rheumatol. 23:462-468, 1996
536.
Dorner T, Feist E, Held C, et al: Differential recognition of the 52-kd Ro(SS-A)
antigen by sera from patients with primary biliary cirrhosis and primary Sjogren's
syndrome. Hepatology 24:1404-1407, 1996
537.
Frank MB, Itoh K, McCubbin V: Epitope mapping of the 52-kD Ro/SSA
autoantigen. Clin.Exp.Immunol. 95:390-396, 1994
538.
Kato T, Sasakawa H, Suzuki S, et al: Autoepitopes of the 52-kd SS-A/Ro molecule.
Arthritis Rheum 38:990-998, 1995
539.
Ricchiuti V, Briand JP, Meyer O, et al: Epitope mapping with synthetic peptides of
52-kD SSA/Ro protein reveals heterogeneous antibody profiles in human
autoimmune sera. Clin.Exp.Immunol. 95:397-407, 1994
540.
Cao T, Borden KL, Freemont PS, et al: Involvement of the rfp tripartite motif in
protein-protein interactions and subcellular distribution. J Cell Sci. 110:1563-1571,
1997
541.
McNeilage LJ, Macmillan EM, Whittingham SF: Mapping of epitopes on the
La(SS-B) autoantigen of primary Sjogren's syndrome: identification of a crossreactive epitope. J Immunol. 145:3829-3835, 1990
542.
Bini P, Chu JL, Okolo C, et al: Analysis of autoantibodies to recombinant La (SS-B)
peptides in systemic lupus erythematosus and primary Sjogren's syndrome.
J
Clin.Invest 85:325-333, 1990
543.
Kohsaka H, Yamamoto K, Fujii H, et al: Fine epitope mapping of the human SSB/La protein. Identification of a distinct autoepitope homologous to a viral gag
polyprotein. J Clin.Invest 85:1566-1574, 1990
544.
Rauh AJ, Hornig H, Luhrmann R: At least three distinct B cell epitopes reside in
the C-terminal half of La protein, as determined by a recombinant DNA approach.
Eur.J Immunol. 18:2049-2057, 1988
545.
St, Pisetsky DS, Reich CF, et al: Analysis of autoantibody binding to different
regions of the human La antigen expressed in recombinant fusion proteins. J
Immunol. 141:4173-4180, 1988
546.
Haaheim LR, Kvakestad R, et al: Immunodominant epitopes on the La/SSB
autoantigen recognized by sera from patients with primary Sjogren syndrome and
systemic lupus erythematosus.
Sjogren’s Syndrome – State of the Art - 4th
International Symposium, Tokyo, Japan. 11-13, 1993
547.
St, Burch-JA J, Ward MM, et al: Temporal correlation of antibody responses to
different epitopes of the human La autoantigen. J Clin.Invest 85:515-521, 1990
548.
St, Kenan D, Burch-JA J, et al: Anti-La antibody production by MRL-1pr/1pr mice.
Analysis of fine specificity. J Immunol. 146:1885-1892, 1991
549.
St CE, Kenan D, Burch-JA J, et al: The fine specificity of anti-La antibodies
induced in mice by immunization with recombinant human La autoantigen.
J
Immunol. 144:3868-3876, 1990
550.
Sturgess AD, Peterson MG, McNeilage LJ, et al: Characteristics and epitope
mapping of a cloned human autoantigen La. J Immunol. 140:3212-3218, 1988
551.
Troster H, Bartsch H, Klein R, et al: Activation of a murine autoreactive B cell by
immunization with human recombinant autoantigen La/SS-B: characterization of
the autoepitope. J Autoimmun. 8:825-842, 1995
552.
Weng YM, McNeilage J, Topfer F, et al: Identification of a human-specific epitope
in a conserved region of the La/SS-B autoantigen. J Clin.Invest 92:1104-1108, 1993
553.
Boulanger C, Chabot B, Menard HA, et al: Autoantibodies in human anti-Ro sera
specifically recognize deproteinized hY5 Ro RNA . Clin.Exp.Immunol. 99:29-36,
1995
554.
Keene JD: RNA recognition by autoantigens and autoantibodies. Mol.Biol.Rep.
23:173-181, 1996
555.
van Venroij W, Charles P, Maini RN: The consensus workshops for the detection of
autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. J.Immunol.Methods
140:181-189, 1991
556.
Reichlin M: Antibodies to RNA proteins in Systemic Lupus Erythematosus: The
significance of paired immune responses., in Talal N. (ed):
Molecular
Autoimmunity. New York, Academic Press, 1991, pp 51-63
557.
James JA, Gross T, Scofield RH, et al: Immunoglobulin epitope spreading and
autoimmune disease after peptide immunization: Sm B/B'- derived PPPGMRPP
and PPPGIRGP induce spliceosome autoimmunity. J Exp.Med. 181:453-461, 1995
558.
Craft J, Fatenejad S: Self antigens and epitope spreading in systemic autoimmunity.
Arthritis Rheum 40:1374-1382, 1997
559.
Vanderlugt CJ, Miller SD: Epitope spreading. Curr.Opin.Immunol. 8:831-836, 1996
560.
Keech CL, Gordon TP, McCluskey J: The immune response to 52-kDa Ro and 60kDa Ro is linked in experimental autoimmunity. J.Immunol. 157:3694-3699, 1996
561.
Topfer F, Gordon T, McCluskey J: Intra- and intermolecular spreading of
autoimmunity involving the nuclear self-antigens La (SS-B) and Ro (SS-A).
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92:875-879, 1995
562.
Reynolds P, Gordon TP, Purcell AW, et al: Hierarchical self-tolerance to T cell
determinants within the ubiquitous nuclear self-antigen La (SS-B) permits induction
of systemic autoimmunity in normal mice. J Exp.Med. 184:1857-1870, 1996
563.
Gordon T, Topfer F, Keech C, et al: How does autoimmunity to La and Ro initiate
and spread? Autoimmunity. 18:87-92, 1994
564.
Yennopoulos DI, Roncin S, Lamour A, et al: Conjunctival epethelial cells from
patients with Sjogren's syndrome inappropriately express major histocompatibility
complex molecules, La(SS-B) antigen and heat-shock proteins. J.Clin.Immunol.
12:259-265, 1992
565.
Sumida T, Namekawa T, Maeda T, et al: New T-cell epitope of Ro/SS-A 52 kDa
protein in labial salivary glands from patients with Sjogren's syndrome [letter].
Lancet 348:16671996
566.
Price
EJ,
Venables
PJ:
The
etiopathogenesis
of
Sjogren's
syndrome.
Semin.Arthritis Rheum 25:117-133, 1995
567.
Smeenk RJ: Ro/SS-A and La/SS-B: autoantigens in Sjogren's syndrome?
Clin.Rheumatol. 14 Suppl 1:11-16, 1995
568.
Bachmann M, Falke D, Preuhs J, et al: Occurrence of novel small RNAs with
concomitant inhibition of host cellular U small nuclear. J.Gen.Virol. 67:2587-2594,
1986
569.
Zhu J: Ultraviolet B irradiation and cytomegalovirus infection synergize to induce
the cell surface expression of 52-kD/Ro antigen.
Clin.Exp.Immunol. 103:47-53,
1996
570.
Miyagawa S, Okada N, Inagaki Y, et al: SSA/Ro antigen expression in simian virus
40-transformed human keratinocytes. J.Invest.Dermatol. 90:342-345, 1988
571.
Pogue GP, Cao XQ, Singh NK, et al: 5' sequences of rubella virus RNA stimulate
translation of chimeric RNAs and specifically interact with two host-encoded
proteins. J.Virol. 67:7106-7117, 1993
572.
Pogue GP, Hofmann J, Duncan R, et al: Autoantigens interact with cis-acting
elements of rubella virus RNA. J.Virol. 70:6269-6277, 1996
573.
McNeilage LJ, Whittingham S, MacKay IR: Autoantibodies reactive with small
ribonucleoprotein antigens: a convergence of molecular biology and clinical
immunology. J.Clin.Lab.Immunol. 15:1-17, 1984
574.
Lord PC, Rothschild CB, DeRose RT, et al: Human cytomegalovirus RNAs
immunoprecipitated
by
multiple
systemic
lupus
erythematosus
antisera.
J.Gen.Virol. 70:2383-2396, 1989
575.
McNeilage LJ, Whittingham S, Jack I, et al: Molecular analysis of the RNA and
protein
components
recognized
by
anti-La(SS-B)
autoantibodies.
Clin.Exp.Immunol. 62:685-695, 1985
576.
Hamelin R, Chan EK, Tan EM, et al: Antibodies against small nuclear
ribonucleoproteins immunoprecipitate complexes containing ts110 Moloney murine
sarcoma virus genomic and messenger RNAs. Virology 152:87-99, 1986
577.
Rucheton M, Graafland H, Fanton H, et al: Presence of circulating antibodies
against gag-gene MuLV proteins in patients with autoimmune connective tissue
disorders. Virology 144:468-480, 1985
578.
Otteken A, Moss B: Calreticulin interacts with newly synthesized human
immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein, suggesting a chaperone
function similar to that of calnexin. J Biol.Chem. 271:97-103, 1996
579.
Hengel H, Koopmann JO, Flohr T, et al: A viral ER-resident glycoprotein
inactivates the MHC-encoded peptide transporter. Immunity 6:623-632, 1997
580.
Zheng Z, Maidji E, Tugizov S, et al: Mutations in the carboxyl-terminal
hydrophobic sequence of human cytomegalovirus glycoprotein B alter transport and
protein chaperone binding. J Virol. 70:8029-8040, 1996
581.
Peterson JR, Ora A, Van PN, et al: Transient, lectin-like association of calreticulin
with folding intermediates of cellular and viral glycoproteins. Mol.Biol.Cell 6:11731184, 1995
582.
Hebert DN, Zhang JX, Chen W, et al: The number and location of glycans on
influenza hemagglutinin determine folding and association with calnexin and
calreticulin. J Cell Biol. 139:613-623, 1997
583.
Perl A, Colombo E, Dai H, et al: Antibody reactivity to the HRES-1 endogenous
retroviral element identifies a subset of patients with systemic lupus erythematosus
and overlap syndromes. Correlation with antinuclear antibodies and HLA class II
alleles. Arthritis Rheum 38:1660-1671, 1995
584.
Blomberg J, Nived O, Pipkorn R, et al: Increased antiretroviral antibody reactivity
in sera from a defined population of patients with systemic lupus erythematosus.
Correlation with autoantibodies and clinical manifestations. Arthritis Rheum 37:5766, 1994
585.
Rekvig OP, Moens U, Sundsfjord A, et al: Experimental expression in mice and
spontaneous expression in human SLE of polyomavirus T- antigen. A molecular
basis for induction of antibodies to DNA and eukaryotic transcription factors. J
Clin.Invest 99:2045-2054, 1997
586.
Rekvig OP, Moens U, Fredriksen K, et al: Human polyomavirus BK and
immunogenicity of mammalian DNA: a conceptual framework. Methods 11:44-54,
1997
587.
Madore SJ, Wieben ED, Pedreson T: Eukariotic Small Ribonucleoproteins.
J.Biol.Chem. 259:1929-1933, 1984
588.
Rinke J, Steitz JA: Association of the lupus antigen La with a subset of U6 snRNA
molecules. Nucleic.Acids.Res. 13:2617-2629, 1985
589.
Lafer EM, et al: J.Exp.Med. 153:897, 1981
590.
Stollar BD: An overview of the anti-DNA antibody workshop: expansion of
molecular structural analysis. Lupus. 6:346-348, 1997
591.
Sibille P, Ternynck T, Nato F, et al: Mimotopes of polyreactive anti-DNA
antibodies identified using phage-display peptide libraries.
Eur.J Immunol.
27:1221-1228, 1997
592.
Williams-RC J, Malone CC, Fry G, et al: Affinity columns containing anti-DNA
Id+ human myeloma proteins adsorb human epibodies from intravenous gamma
globulin. Arthritis Rheum 40:683-693, 1997
593.
Williams-RC J, Malone CC, Cimbalnik K, et al: Cross-reactivity of human IgG antiF(ab')2 antibody with DNA and other nuclear antigens. Arthritis Rheum 40:109123, 1997
594.
Williams-RC J, Malone CC, Silvestris F, et al: Benign monoclonal gammopathy
with IgG anti-DNA, anti-Sm and anti-F(ab')2 activity. Clin.Exp.Rheumatol. 15:3338, 1997
595.
Williams-RC J, Malone CC, Silvestris F: Cationic myeloma M-components
frequently show cross-reacting anti-DNA, Anti-F(ab')2 and anti-nucleosome
specificities. Scand.J Rheumatol. 26:79-87, 1997
596.
Naparstek Y, Ben-Yehuda A, Madaio MP, et al: Binding of anti-DNA antibodies
and inhibition of glomerulonephritis in MRL-lpr/lpr mice by heparin Arthritis
Rheum 33:1554-1559, 1990
597.
Jacob L, Lety MA, Louvard D, et al: Binding of a monoclonal anti-DNA
autoantibody to identical protein(s) present at the surface of several human cell
types involved in lupus pathogenesis. J.Clin.Invest. 75:315-317, 1985
598.
Fillit H, Shibata S, Sasaki T, et al: Autoantibodies to the protein core of vascular
basement membrane heparan sulfate proteoglycan in systemic lupus erythematosus.
Autoimmunity. 14:243-249, 1993
599.
Madaio MP, Carlson J, Cataldo J, et al: Murine monoclonal anti-DNA antibodies
bind directly to glomerular antigens and form immune deposits. J.Immunol.
138:2883-2889, 1987
600.
Shefner R, Kleiner G, Turken A, et al: A novel class of anti-DNA antibodies
identified in BALB/c mice. J.Exp.Med. 173:287-296, 1991
601.
Katz JB, Limpanasithikul W, Diamond B: Mutational analysis of an autoantibody:
differential binding and pathogenicity. J.Exp.Med. 180:925-932, 1994
602.
Vargas MT, Gustilo K, D'Andrea DM, et al: Structural features of nephritogenic
lupus autoantibodies. Methods 11:62-69, 1997
603.
Adyel FZ, Hentati B, Boulila A, et al: Characterization of autoantibody activities in
sera anti-DNA antibody and circulating immune complexes from 12 systemic lupus
erythematosus patients. J Clin.Lab.Anal. 10:451-457, 1996
604.
Suenaga R, Abdou NI: Anti-(DNA-histone) antibodies in active lupus nephritis. J
Rheumatol. 23:279-284, 1996
605.
Chan TM, Cheng IK: Identification of endothelial cell membrane proteins that bind
anti-DNA antibodies from patients with systemic lupus erythematosus by direct or
indirect mechanisms. J Autoimmun. 10:433-439, 1997
606.
Lai KN, Leung JC, Lai KB, et al: Upregulation of adhesion molecule expression on
endothelial cells by anti-DNA autoantibodies in systemic lupus erythematosus.
Clin.Immunol.Immunopathol. 81:229-238, 1996
607.
Amital TH, Avinoach I, Coates AR, et al: Binding of monoclonal anti-DNA and
anti-TB glycolipids to brain tissue. Autoimmunity. 4:277-287, 1989
608.
Lenert P, Lenert G, Senecal JL: CD4-reactive antibodies in systemic lupus
erythematosus. Hum.Immunol. 49:38-48, 1996
609.
Weber S, Karjalainen K: Mouse CD4 binds MHC class II with extremely low
affinity. Int.Immunol. 5:695-698, 1993
610.
Sakihama T, Smolyar A, Reinherz EL: Molecular recognition of antigen involves
lattice formation between CD4, MHC class II and TCR molecules. Immunol.Today
16:581-587, 1995
611.
Konig R, Shen X, Germain RN: J.Exp.Med. 182:779-787, 1995
612.
Wu H, Kwong PD, Hendrickson WA: Dimeric association and segmental variability
in the structure of human CD4. Nature 387:527-530, 1997
613.
Igarashi T, Itoh Y, Fukunaga Y, et al: Stress-induced cell surface expression and
antigenic alteration of the Ro/SSA autoantigen. Autoimmunity. 22:33-42, 1995
614.
Segal R, Dayan M, Globerson A, et al: Effect of aging on cytokine production in
normal
and
experimental
systemic
lupus
erythematosus
afflicted
mice.
Mech.Ageing Dev. 96:47-58, 1997
615.
Segal R, Bermas BL, Dayan M, et al: Kinetics of cytokine production in
experimental systemic lupus erythematosus: involvement of T helper cell 1/T helper
cell 2-type cytokines in disease. J Immunol. 158:3009-3016, 1997
616.
Ohyama Y, Nakamura S, Matsuzaki G, et al: Cytokine messenger RNA expression
in the labial salivary glands of patients with Sjogren's syndrome. Arthritis Rheum
39:1376-1384, 1996
617.
Ohyama Y, Nakamura S, Shinohara M: Cytokine mRNA expression in the labial
glands of patients with Sjogren's syndrome. Nippon.Rinsho. 53:2412-2417, 1995
Ε.I
Συνθετικά Πεπτιδικά Ανάλογα της Καλρετικουλίνης και αντίΠεπτιδικά Αντισώματα στα Συστηματικά Αυτοάνοσα Νοσήματα
Ι.Γ.Ρούτσιας, Α.Γ. Τζιούφας, Μ. Σακαρέλλου-Δαιτσιώτου*, Κ.Σακαρέλλος* και Χ.Μ.
Μουτσόπουλος.
Τομέας Παθολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Ιωαννίνων και *Τμήμα Χημείας
Πανεπιστημίου Ιωαννίνων.
Δημοσιεύθηκε στο
Clinical and Experimental Immunology 1993;91:437-441
Abstract:
A utoantibodies in sera from patients with systemic lupus erythematosus (SLE)
and onchocerciasis recognize calreticulin (CaR), a calcium-binding protein, as antigen.
In this study we present the immunological properties of two synthetic peptides
prepared to correspond to the 1-24 and 7-24 amino acid sequence of CaR. In contrast to
information previously reported for the recombinant protein, the CaR-peptide
analogues appeared immunoreactive to anti-Ro/SSA autoimmune sera. Human sera
from patients with SLE, Sjogren's syndrome (SS), rheumatoid arthritis (RA), as well as
mixed connective tissue disease (MCTD), demonstrated a positive autoimmune
response (binding of antibodies), to the CaR-peptide analogues. These findings suggest
that anti-calreticulin autoantibodies are not restricted to any disease specificity.
Περίληψη:
Η καλρετικουλίνη
(CaR) - μια πρωτεΐνη
που δεσμεύει ασβέστιο –
αναγνωρίζεται από αυτοαντισώματα στον ορό ασθενών με Συστηματικό Ερυθηματώδη
Λύκο (ΣΕΛ) και Onchocerciasis. Στη μελέτη αυτή παρουσιάζονται οι ανοσολογικές
ιδιότητες δύο συνθετικών πεπτιδίων που αντιστοιχούν στις 1-24 και 7-24 περιοχές της
αλληλουχίας αμινοξέων της CaR. Τα πεπτιδικά αυτά ανάλογα της CaR, σε αντίθεση
την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εμφανίστηκαν ανοσοδραστικά με αντί-Ro/SSA
αυτοάνοσους ορούς. Έτσι οροί ασθενών με ΣΕΛ, Σύνδρομο Sjogren (ΣΣ), Ρευματοειδή
Αρθρίτιδα (ΡΑ) και Μικτή Νόσο του Συνδετικού Ιστού (ΜΝΣΙ) παρουσίασαν
δέσμευση αντισωμάτων στα πεπτιδικά ανάλογα της CaR. Τα αποτελέσματα αυτά
υποδηλώνουν ότι τα αντισώματα κατά της καλρετικουλίνης δεν εμφανίζουν ειδικότητα
νόσου.
Ε.I.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Οι αυτοάνοσες ρευματικές παθήσεις έχουν συσχετισθεί με αυτοαντισώματα ενάντια σε
διάφορους κυτταροπλασματικούς ή πυρηνικούς πρωτεϊνικούς παράγοντες. Ανάμεσα σ΄
αυτούς βρίσκεται το αντιγόνο Ro/SSA το οποίο αρχικά ανεβρέθηκε από τους Clark και
συν. (1) σαν κοινός στόχος της αυτοάνοσης απόκρισης στο Συστηματικό Ερυθηματώδη
Λύκο (ΣΕΛ) και στο Σύνδρομο Sjogren (ΣΣ) (2,3). Το αντιγόνο Ro/SSA αποτελείται
από τουλάχιστον δυο αντιγονικά διακριτές πρωτεΐνες (60 και 52 KD) οι οποίες
ενώνονται μη ομοιοπολικά με μια οικογένεια μικρών RNA (4, 5).
Οι Lieu και συν. περιέγραψαν μια πρωτεΐνη 60KD η οποία θεωρήθηκε ότι είναι η
60KD Ro/SSA. Η πρωτεΐνη αυτή όπως και συνθετικά πεπτίδια που αντιστοιχούν στο
αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης βρέθηκαν να αναγνωρίζονται ειδικά από αντί-Ro/SSA
μονοειδικούς ορούς. Επιπρόσθετα πολυκλωνικά αντιπεπτιδικά αντισώματα που
αναπτύχθηκαν σε κουνέλια έδειξαν συμπεριφορά ταυτόσημη με τα αντί-Ro/SSA στη
ανοσοαποτύπωση (Western Blot), ανοσοφθορισμό και ανοσοκαταβύθιση RNA. Έτσι
προτάθηκε ότι ο κύριος αντιγονικός επίτοπος της πρωτεΐνης 60KD Ro/SSA βρίσκεται
στο αμινοτελικό άκρο (6-11). Ωστόσο με την απομόνωση του c-DNA που κωδικοποιεί
την 60KD πρωτεΐνη (11) αποκαλύφθηκε ότι αυτή ήταν η ανθρώπινη καλρετικουλίνη
(CaR) (12-14), μια πρωτεΐνη
που δεσμεύει ασβέστιο και η οποία είχε ήδη
κλωνοποιηθεί (15, 16).
Οι ομάδες των Deutscher (17) και Ben-Chetrit (18), δουλεύοντας ανεξάρτητα
απομόνωσαν τον κλώνο για την 60KD Ro/SSA, ο οποίος βρέθηκε εντελώς
διαφορετικός από αυτόν της CaR. Η πρωτεΐνη του κλώνου αυτού που μεταφράστηκε in
vitro και εκφράστηκε σε βακτήρια, δέσμευσε τόσο τα αντί-Ro/SSA αυτοαντισώματα
στη ανοσοαποτύπωση και στη ανοσοκαταβύθιση όσο και τα hY1 RNA in vitro (17, 20).
Από την άλλη πλευρά οι Rokeach και συν. (21, 22) χρησιμοποιώντας c-DNA
κλωνοποίησαν το ανθρώπινο ανάλογο της CaR. Η πρωτεΐνη αυτή δεν αντέδρασε με
τους αντί-Ro/SSA μονοειδικούς ορούς, παρόλο που ήταν δραστική με ορούς που είχαν
αντί-Ro/SSA (και αντι-Sm και/ή αντί-nRNP) ειδικότητα. Επίσης βρέθηκε ότι η
πρωτεΐνη αυτή δεν αλληλεπιδρά με τα Ro/SSA RNPs μέσω αλληλεπιδράσεων
πρωτεΐνης-RNA ή πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε αντίθεση
με τα ήδη δημοσιευμένα (6-11) γεγονός που θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι οφείλεται σε
ταυτόχρονη απομόνωση των 60KD Ro/SSA και CaR πρωτεϊνών (21). Η υπόθεση αυτή
δεν εξηγεί ωστόσο την αντί-Ro/SSA δραστικότητα των συνθετικών πεπτιδίων που
αντιστοιχούν στο αμινοτελικό άκρο της CaR (7,9).
Η παρούσα μελέτη σχεδιάσθηκε για να εξετάσει το εάν οροί ασθενών με ρευματικές
παθήσεις αναγνωρίζουν τη CaR και να εμπλουτίσει τις γνώσεις μας στην αυτοανοσία.
Έτσι ανακοινώνουμε τη σύνθεση και τον ανοσολογικό έλεγχο δύο πεπτιδίων ομολόγων
με το αμινοτελικό άκρο της CaR που αντιστοιχούν στις περιοχές 1-24 και 7-24 της
αλληλουχίας της πρωτεΐνης.
Ε.I.2 ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
Ε.I.2.1 Οροί ασθενών
Τριάντα-τρεις οροί ασθενών με ΣΕΛ, 27 με ΣΣ, 28 με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα (ΡΑ) και
18 με Μικτή Νόσο του Συνδετικού Ιστού (ΜΝΣΙ) [η διάγνωση πληροί τα κριτήρια που
έχουν ανακοινωθεί (23-36)]
εξετάσθηκαν
σε
αντίθετη
ανοσοηλεκτροφόρηση.
Βρέθηκαν οι ακόλουθες ειδικότητες αυτοαντισωμάτων: 49 αντί-Ro/SSA, 16 αντίRo/SSA και αντί-La/SSB και 13 αντί-nRNP. Εξήντα εννέα φυσιολογικοί οροί
συλλέχθηκαν από υγιείς δότες αίματος.
Ε.I.2.2 Πεπτιδική σύνθεση και καθαρισμός των αναλόγων της CaR.
Συνετέθησαν δύο πεπτίδια που αντιστοιχούσαν στα τμήματα 1-24 (SP24) και 724 (SP18) της αλληλουχίας του αμινοτελικού άκρου της CaR Glu1-Pro-Ala-Val-TyrPhe-Lys7-Glu-Gln-Phe-Leu-Asp-Gly-Trp-Thr-Ser-Arg-Trp-Ile-Glu-Ser-Lys24.
Η σύνθεση στερεάς φάσης των SP24 και SP18 έγινε με τη χρήση της ρητίνης Ναt-Boc-Νε-(2-χλώρο-CBz)-L-λυσίνη-PAM
(1%
συζευγμένου
διβυνιλο
βενζόλιου-
στυρόλιου, 1,5g, 0,38 meq/g) και των Να-t-Boc/βένζυλο ομάδων προστασίας (27). Οι
συζεύξεις αμινοξέων εκτελέσθηκαν με την πορεία του δικυκλοέξυλο καρβοδιιμιδίου
(DCC) / υδροξυβενζοτριαζολίου (HOBt), χρησιμοποιώντας μια σχέση αμινοξέος
/DCC/HOBt/ρητίνης (3/3/3/1). Η αποπροστασία της Να-t-Boc προστατευτικής ομάδας
έγινε με τριφθοροοξεικό οξύ (TFA) που ακολουθήθηκε με διισοπροπυλαιθυλαμίνη
για εξουδετέρωση. Έπειτα από τη σύνθεση, τα πεπτίδια απομακρύνθηκαν από τη
ρητίνη με άνυδρο HF, παρουσία ανισόλης και φαινόλης (10% κ.ο.) στους 0οC για 1
ώρα.
Τα
πεπτίδια
εκλούσθηκαν από
τη
ρητίνη
με
2Μ
οξεικό
οξύ
και
λυοφιλιοποιήθηκαν για να δώσουν τελικά 0,85g 24SP (52% απόδοση) και 0,57g 18SP
(45% απόδοση).
Ο καθαρισμός των πεπτιδίων επιτεύχθηκε με ανιονοανταλακτική ρητίνη,
χρησιμοποιώντας για έκλουση μίγμα NH3/H2O με βαθμιαία αύξηση της συγκέντρωσης
της NH3 έως 0,1Μ. Τα πεπτίδια βρέθηκαν ομογενή στη χρωματογραφία λεπτής
στιβάδας σε MeOH/CHCl3/27% NH3 (2/2/1) (RfSP24= 0,73, RfSP18= 0,49). Η ολική
απόδοση μετά το καθαρισμό ήταν 480 mg (απόδοση 30%) για το 24SP και 320 mg
(απόδοση 25%) για το 18SP. Κατάλληλα 1D και 2D 1H-NMR φάσματα επιβεβαίωσαν
την ταυτότητα των δύο πεπτιδίων.
Ε.I.2.3 Σύζευξη πεπτιδίου σε πρωτεΐνη-φορέα
Το πεπτίδιο SP24 συζεύχθηκε με βόεια αλβουμίνη (BSA) μέσω των καταλοίπων
τυροσίνης με δι-διαζωβενζιδίνης σύμφωνα με τη μέθοδο του Schedtman (28). Το
ασύζευκτο πεπτίδιο και τα αντιδραστήρια σύζευξης απομακρύνθηκαν με διαπίδυση
ενάντια σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού άλατος (PBS) στους 4οC για 2 ημέρες.
Ε.I.2.4 ELISA
Εφαρμόσθηκε τροποποιημένη η ενζυμική μέθοδος στερεάς φάσεως ELISA των
Engvall και Prelman (27). Σε μικροπλακίδια Nunc προστέθηκαν τα πεπτίδια SP18 και
SP24 (1 mg/ml σε αιθανόλη ή PBS pH=7,2, 50μl/κυψελίδα) και τα μικροπλακίδια
επωάστηκαν ολονύκτια στους 4οC. Ακολούθησε έκπλυση με PBS-Tween 20 και οι
εναπομείναντες θέσεις δέσμευσης αντιγόνου καλύφθηκαν με 0.5 % BSA, 1.5%
οβαλβουμίνη και 0.1% Tween 20 σε PBS (ρυθμιστικό διάλυμα κάλυψης) για 2h. Έπειτα
από εκπλύσεις με PBS-Tween 20, ο αραιωμένος ορός (1:50 σε διάλυμα κάλυψης)
προστέθηκε ορός αίγας αντί-ανθρώπινης IgG (0.5 mg / 1 ml) συζευγμένος με αλκαλική
φωσφατάση (1:1000 σε δάλυμα καλύψης). Εν συνεχεία, τα πλακίδια επωάστηκαν για
2h, εκπλύθηκαν και προστέθηκε υπόστρωμα φωσφορικής p-νιτροφαινόλης στους 37οC.
Η ενζυματική αντίδραση τερματίστηκε με με προσθήκη NaOH 4N (50 μl/κυψελίδα) και
η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 405 nm.
Οι μονάδες δέσμευσης (Σχήματα 1 και 2) παρουσιάζονται χωρίς αφαίρεση της
μη ειδικής δέσμευσης, αφού τόσο οι φυσιολογικοί όσο και οι παθολογικοί οροί έδειξαν
χαμηλά και σχεδόν ταυτόσημα επίπεδα δέσμευσης στη ELISA με BSA και με πεπτίδια
ελέγχου.
Ε.I.2.5 Ανοσοαποτύπωση κηλίδων
Χρησιμοποιήθηκε η τεχνική του Towbin (30) με τις τροποποιήσεις που
ακολουθούν. Σε μεμβράνες Immobilon διφθοριούχου πολυβινυλδιενίου (PVDF)
τοποθετήθηκε 1 μικρόλιτρο υδατικού διαλύματος πεπτιδίου και επωάστηκε αρχικά με
διάλυμα κάλυψης για 2h και έπειτα με αραιωμένο ορό (1:50) σε διάλυμα καλύψης
ολονύκτια στους 4οC. Έπειτα οι μεμβράνες εκπλύθηκαν με PBS-Tween 20 και
προστέθηκε διάλυμα αντι-ανθρώπινης IgG αίγας, το οποίο αφέθηκε να αντιδράσει για
1h. Οι μεμβράνες εν συνεχεία πλύθηκαν και αναπτύχθηκε η αντίδραση χρώσης με τη
προσθήκη υποστρώματος 4-χλώρο-1-ναφθόλης.
Ε.I.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Ε.I.3.1 Ποιοτική ανάλυση των αυτοαντισωμάτων ενάντια στα πεπτιδικά ανάλογα της
CaR (SP24, SP18)
Η ποιοτική ανάλυση των αυτοαντισωμάτων που κατευθύνονται ενάντια στα πεπτίδια
SP18 και SP24 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της ανοσοαποτύπωσης κηλίδων (Σχήμα
3). Οι φυσιολογικοί οροί δεν αναγνώρισαν κανένα από τα συνθετικά πεπτίδια σε
αντίθεση με τους αυτοάνοσούς ορούς που αντέδρασαν ειδικά με αυτά. Τα πεπτίδια
ελέγχου δεν έδειξαν καμία αντιγονική δραστικότητα με τους φυσιολογικούς ή τους
παθολογικούς ορούς (Σχήμα 3).
Ε.I.3.2 Αντιγονικότητα των πεπτιδικών αναλόγων της CaR
Αυτοάνοσοι οροί ασθενών. Εφαρμόσθηκε η ανοσοενζυμική μέθοδος στερεάς
φάσεως (ELISA) για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αντί-SP αντισωμάτων στους
αυτοάνοσους ορούς ασθενών. Τριάντα-τρία τις εκατό των ασθενών με ΣΕΛ, 40,7% των
ασθενών με ΣΣ, 25% των ασθενών με ΡΑ, 27,7% των ασθενών με ΜΝΣΙ και 5,8% των
φυσιολογικών βρέθηκαν θετικοί για τα αντί-SP24 αντισώματα (Σχήμα 1). Οι ίδιοι οροί,
όταν αντέδρασαν με το BSA-SP24, εμφάνισαν μεγαλύτερα επίπεδα δέσμευσης από
Σχήμα 1: Αναγνώριση του πεπτιδικού αναλόγου 24 SP της καλρετικουλίνης (CaR) από
ασθενείς με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ), σύνδρομο Sjogren (ΣΣ),
ρευματοειδή αρθρίτιδα (ΡΑ) και μικτή νόσο του συνδετικού ιστού (ΜΝΣΙ). Η
διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει 3 s.d. πάνω από το μέσο επίπεδο
δέσμευσης των φυσιολογικών ορών ελέγχου.
Σχήμα 2: Αναγνώριση του πεπτιδικού αναλόγου 24 SP της καλρετικουλίνης (CaR) από
ασθενείς με αυτοαντισώματα ειδικότητας αντί-Ro/SSA, αντί-Ro/SSA + αντίLa και αντί-nRNP.Η διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει 3 s.d. πάνω από το
μέσο επίπεδο δέσμευσης των φυσιολογικών ορών ελέγχου.
αυτά του ελεύθερου SP24, ενώ δεν ανιχνεύθηκε καμία δραστικότητα με BSA. Τα
πεπτίδια ελέγχου ήταν ανενεργά τόσο με τους φυσιολογικούς όσο και με τους
παθολογικούς ορούς.
Ειδικότητες των ανθρώπινων αυτοαντισωμάτων. Αυτοάνοσοι οροί διάφορων
αντιγονικών ειδικοτήτων (αντί-Ro/SSA, αντί-La/SSB, αντί-nRNP) εξετάστηκαν σε
ELISA για ποσοτική μέτρηση της δραστικοτητάς τους ενάντια στα SP24 και SP18
ανάλογα της CaR. Συνολικά, 28,5% των αντί-Ro/SSA ορών, 29,4% των αντί-Ro/SSA +
αντί-La/SSB ορών και 46,1% των αντί-nRNP ορών βρέθηκαν θετικοί για αντί-SP
αντισώματα (Σχήμα 2). Οι ΣΕΛ και ΣΣ μονοειδικοί αντί-Ro/SSA οροί ήταν θετικοί για
αντί-SP24 αντισώματα σε ποσοστά 35% και 37% αντίστοιχα (δεν φαίνεται στα
σχήματα). Τα πεπτίδια ελέγχου δεν παρουσίασαν αντιγονική δραστικότητα ούτε με
φυσιολογικούς
ούτε
με
ορούς
ασθενών.
Τα
ακόλουθα
πεπτίδια
ελέγχου
χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα (Σχήματα 1-3): (i) Trp-Asn-Pro-Asn-Asp-TyrGly-Gly-Ile-Lys, (ii) Trp-Asn-Pro-dAla-Asp-Tyr-Gly-Gly-Ile-Lys, (iii) Arg-Leu-Gly-ArgLeu-Gly και (iv) πολύ-(Arg-Nva-Gly).
Η ανοσολογική δραστικότητα και των δύο συνθετικών πεπτιδίων ήταν περίπου η ίδια
Σχήμα 3: Ανοσοαποτύπωση κηλίδων των πεπτικών αναλόγων της
καλρετικουλίνης (CaR) 24SP (γραμμή Α), 18SP (γραμμή
Β), πεπτιδίων ελέγχου (γραμμή Γ). Οροί ασθενών με
αυτοάνοσες νόσους (στήλες 1-4), φυσιολογικοί οροί
ελέγχου (στήλες 5-8).
σε όλες τις περιπτώσεις, υποδεικνύοντας ένα ταυτόσημο αντιγονικό καθοριστή στις 124 και 7-24 περιοχές της αλληλουχίας της CaR.
Ε.I.4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Δύο συνθετικά πεπτίδια που εμπεριέχουν τις περιοχές 1-24 (SP24) και 7-24 (SP18) της
αμινοτελικής αλληλουχίας της CaR συνετέθησαν με την τεχνική της πεπτιδικής
σύνθεσης σε στερεά φάση. Τα πεπτιδικά ανάλογα της CaR αντέδρασαν σε ELISA με
ορούς ασθενών με ΣΕΛ, ΣΣ, ΡΑ και ΜΝΣΙ (Σχήμα 1), γεγονός το οποίο συμφωνεί με
προηγούμενες παρατηρήσεις που δήλωναν ότι τα αντί-CaR αυτοαντισώματα δεν είναι
περιορισμένα σε κάποια υποομάδα ασθενειών (7-9).
Τα SP18 και SP24 πεπτίδια ήταν θετικά σε ELISA με ειδικά αυτοαντισώματα, όπως
αντί-Ro/SSA, αντί-Ro/SSA + αντί-La/SSB και σε κάποιες περιπτώσεις με αντί-nRNP
(Σχήμα 2) και αντί-Sm (δεν φαίνεται στο Σχήμα 2). Ωστόσο δεν μπορεί να αποκλειστεί
η συνύπαρξη αντί-Ro/SSA αυτοαντισωμάτων με τα αντί-nRNP και αντί-Sm
αυτοαντισώματα, εφόσον είναι γνωστό ότι τα αντισώματα αντι-52KD Ro/SSA και
κάποιοι υποπληθυσμοί των αντί-60KD Ro/SSA αντισωμάτων αναγνωρίζουν ειδικά τα
ανθρώπινα αυτοαντιγόνα, ενώ αποτυγχάνουν να δεσμευτούν σε αντιγόνα μη
πρωτευόντων
ειδών,
σαν
και
αυτά
που
χρησιμοποιήθηκαν
στην
αντίθετη
ανοσοηλεκτροφόρηση (32, 33).
Είναι επίσης ενδιαφέρον να σημειώσουμε ότι τα ανάλογα της CaR που
παρασκευάστηκαν εμφανίστηκαν ανοσοδραστικά με αντί-Ro/SSA αυτοάνοσους ορούς
(Σχήμα 2) παρόλο που η CaR που παρασκευάστηκε από c-DNA δεν παρουσίασε
παρόμοια δραστικότητα (21, 22) [η κλωνοποιημένη CaR αντιδρούσε με αντί-Ro/SSA
(+ αντί-Sm και/ή αντί-nRNP ορούς). Τα αντικρουόμενα αυτά ευρήματα μπορούν να
αποδοθούν στα επιπλέον αμινοξέα που υπάρχουν στο αμινοτελικό άκρο στη
ανασυνδυασμένη CaR και απουσιάζουν από την αυθεντική
πρωτεΐνη
(21).
Επιπρόσθετα είναι πιθανό ότι αυτή η αλληλουχία αμινοξέων που είναι πλούσια σε
υδρόφοβα αμινοξέα (οδηγό πεπτίδιο), μπορεί να επηρεάζει την διαμορφωτική
κινητικότητα του αμινοτελικού τμήματος του μορίου, η οποία εν συνεχεία μπορεί να
επιδρά στην αναγνώριση από το αντίσωμα. Από την άλλη πλευρά δεν μπορούμε να
αποκλείσουμε το ότι τα συνθετικά πεπτιδικά ανάλογα της CaR μπορεί να είναι πιο
εύκολα αναγνωρίσιμα από τους αντί-Ro/SSA αυτοάνοσους ορούς, συγκρινόμενα με
ολόκληρη την πρωτεΐνη, σαν μια συνέπεια του σημαντικού βαθμού διαμορφωτικής
ελευθερίας που εμφανίζουν μικρά συνθετικά πεπτίδια (34).
Ακόμα και αν θεωρηθεί ότι η CaR δεν αναγνωρίζεται από μονοειδικούς αντί-Ro/SSA,
είναι σχεδόν σίγουρο ότι η πρωτεΐνη αυτή είναι ένα αυτοαντιγόνο (6, 21, 35). Τα
αποτελέσματα μας συμφωνούν απόλυτα με αυτή την παρατήρηση, αφού ανεβρέθηκαν
αντισώματα κατά των συνθετικών πεπτιδικών αναλόγων της CaR σε όλες τις
αυτοάνοσες ρευματικές ασθένειες (Σχήμα 1). Έχει επίσης προταθεί ότι η CaR είναι
μια πρωτεΐνη θερμικού σοκ / στρες (15) και έτσι ενδεχομένως να σχετίζεται με τον
αυτοάνοσο μηχανισμό (36). Από αυτή την πλευρά δεν είναι αναπάντεχο το ότι τα αντίπεπτιδικά αντισώματα ανιχνεύονται σε αυτοάνοσους ορούς (Σχήμα 1).
Λαμβάνοντας υπόψη την ετερογένεια και το υψηλό μοριακό βάρος του Ro/SSA-RNP
συμπλόκου (όπως αυτό καθορίστηκε με χρωματογραφία μοριακής διήθησης) (37-39),
θα μπορούσε να τεθεί το ερώτημα εάν η CaR είναι μέλος του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού
συμπλόκου. Η ταυτοποιήση και η σύνθεση των CaR επιτόπων καθώς και ο καθορισμός
των ανοσολογικών τους ιδιοτήτων θα μπορούσε να απαντήσει στο ερώτημα. Επιπλέον,
τα συνθετικά πεπτιδικά ανάλογα της CaR θα μπορούσαν να βοηθήσουν στη διαφώτιση
των αντικρουόμενων παρατηρήσεων που έχουν παρουσιαστεί από τους Rokeash (21)
και McCauliffe και συν. (8, 9, 11) και να δώσουν πληροφορίες για τις κυτταρικές
λειτουργίες της CaR.
Ε.I.5 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.
Clark G, Reichlin M, Thomasi TB. Characterization of a soluble cytoplasmic antigen
reactive wilh sera from patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol 1969;
102: 117-22.
2.
Harley JB. Autoantibodies in Sjogren's syndrome. J Autoim 1989;2:283 -394.
3.
Rechlin M. Significance of the Ro antigen system. J Clin Immunol 1986; 6:339.
4.
Wolin SL, Steiz JA. The Ro small cytoplasmic ribonucleoproteins: identification of
the antigenic protein and its binding site on the Ro RNAs. Proc Nall Acad Sci USA
1984; 81:1996- 2000.
5.
Ben Chetrit E, Chan EK, Sullivan KF, Tan EM. A 52-kD protein
is a novel
component of the SS-A/Ro antigenic particle. J Exp Med 1988; 167:1560-71.
6.
Lieu TS, Newkirk MM, Capra JD, Sontheimer RD. Molecular characterization of
human Ro/SS-A antigen. J Clin Invest 1988;82:96- 101.
7.
Lieu TS, Newkirk MM, Arnett FC, Lee LA, Beng JS, Capra JD, Sontheimer RD. A
major autocpitope is present on the amino terminus of a human SS-A/Ro
polypeptide. 2nd International Symposium Sjogren's Syndrome: a model for
understanding autoimmunity. In: Talal N, ed. Division of Clinical Immunology,
Department of Medicine, University of Texas, Health Center at San Antonio, San
Antonio, TX 78284-7874, USA 1988:59-66.
8.
Lieu TS, McCauliffe DP, Arnett FC, Lee LA, Deng JS, Capra JD, Sontheimer RD.
Epitope mapping of thc human wil-2 cell Ro/SSA (Ro) autoantigenic polypeptide
(abstr.). J Invest Dermatol 1989;92:471.
9.
McCauliffe DP, Lux FA, Lieu TS er al. Ro/SS-A and the pathogenic significance of
its antibodies.
2nd International Symposium Sjogren Syndrome: a model for
understanding autoimmunity.
In: Talal N, ed. Division of Clinical Immunology,
Department of Medicine, University of Texas, Health Center at San Antonio, San
Antonio, TX 78284-7874, Texas, USA 1988:68-73.
10.
Bennion SD, Ferris C, Lieu TS, Reimer CB, Lee LA. IgG subclasses in the serum
and skin in subacute cutaneous lupus erythemtosus and neonatal lupus
erythematosus. J Invest Dermatol 1990; 95:643-6.
11.
McCauliffe DP, Lux FA, Lieu TS et al. Molecular cloning, Expression and
chromosome 19 Localization of a human Ro/SS-A autoantigen. J Clin Invest 1990;
85:1379-91.
12.
McCauliffe DP, Zappi E, Lieu TS, Michalak M, Sontheimer RD, Capra JD. A
human Ro/SS-A autoantigen is the homologue of calreticulin and is highly
homologous with onchocercal RAL-1 antigen and an aplysia "Memory Molecule". J
Clin Invest 1990;86:332-5.
13.
Collins JH, Xi Z, Alderson-Lang BH, Treves S, Volpe P. Sequence homology of a
canine brain calcium-binding protein with
calreticulin and the human Ro/SSA
antigen. Biochem Biophys Res Commun 1989; 164:575-9.
14.
Gersten DM, Bijwaard KE, Law LW, Hearing VJ. Homology of the B50 murine
melanoma antigen to the Ro/SS-A antigen of human systemic lupus erylhematosus
and to calcium-binding proteins. Biochim Biophys Acta 1991; 1096:20-25.
15.
Fliegel L, Burns K, Maclennan DH, Reithmcicr RA, Michalak M. Molecular cloning
of the high affinity calcium-binding protein (calreticulin) of skeletal muscle
sarcoplasmic reticulum. J Biol Chem 1989; 264:21522-8.
16.
Smith MJ, Koch GL. Multiple zones in the sequence of calreticulin (CRP 55,
calrequlin, HACBP), a major calcium binding ER/SR protein. EMBO J 1989;
8:3581-6.
17.
Deutscher SL, Harley JB, Keene JD. Molecular analysis of the 60- KDa human Ro
ribonucleoprotein. Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:9479-83.
18.
Ben-Chetrit E, Candy BJ, Tan EM, Sullivan KF. lsolation and characterization of a
cDNA
clone
encoding
the
60-KD
component
of
the
human
SS-A/Ro
ribonucleoprotein autoantigen. J Clin Invest 1989; 83: 1284-2.
19.
James JA, Dickey WD, Fujisaka A, O'Brien CA, Deutscher SL, Keene JD, Harley
JB. Antigenicity of a recombinant Ro(SS-A) fusion protein. Arthr Rheum 1990;
33:102-6.
20.
Prujin GJ, Slobbe RL, Van Venrooij WJ. Analysis of protein-RNA interactions
within Ro ribonucleoprotein complexes. Nucleic Acids Res 1991; 19:5173-80.
21.
Rokeach LA, Haselby JA, Meilof JF, Smeenk RJT, Unnasch TR, Greene BM, Hoch
SO. Characterization of the autoantigen calreticulin. J Immunol 1991; 147:3031-9.
22.
Rokeach LA, Haselby JA, Meilof JF, Smeenk RJT, Unnasch TR, Greene BM, Hoch
SO. Analysis of the self-immunoreactivity of the ER/SR protein calreticulin. Arthritis
Rheum 1991; 34 (Suppl.):S101.
23.
Tan EM, Cohen AS, Fries JF. The 1982 revised criteria for the classification of
systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1982; 25:1271-7.
24.
Vitalic C, Bombardieri S. Diagnostic criteria for Sjogren's syndrome. The state of
the art. Clin Exp Rheumatol 1990; 8 (Suppl.5): 13-16.
25.
Ropes MW, Bennet GA, Gobbs S, Jacox R, Jessar RA. Revision of diagnostic
criteria for rheumatoid arthritis. Bull Rheum Dis 1958;9:175-6.
26.
Sharp GC, Ivvin WC, Pan EN, Could RG, Holmantt R. Mixed connective tissue
disease an apparently distinct rheumatic disease syndrome associated with a specific
antibody to an extractable nuclear antigen (ENA). Am J Med 1972; 52: 148.
27.
Merrifield RB. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of a tetrapeptide. JACS
1963; 85:2149-54.
28.
Scheidtman KH. ln: Greightan TE, ed. Protein structure-a practical approach.
Oxford: IRL Press 1989:97 -98.
29.
Engvall E, Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative
assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 1971; 8: 871 -874.
30.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transpher of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc
Natl Acad Sci USA 1979;76:4350-4.
31.
Bunn CC, Charavani AE, Hughes GRV. Antibodies to extractable nuclear antigens
in 175 patients with DNA-binding positive SLE: an association between antibodies to
RNP and Sm antigens observed by counter immunoelectrophoresis. J Clin Lab
lmmunol 1982; 8: 13-17.
32.
Slobbe RL, Pruijn GJM, Damen WGM, Van der Kemp JWM, Van Venrooij WJ.
Detection and occurrence of the 60- and 52-kD Ro/SSA antigens and of
autoantibodies against these proteins. Clin Exp Immunol 1991; 86:99-105.
33.
Reichlin M, Rader M, Harlcy JB. Autoimmune response to the Ro/SSA particle is
directed to the human antigen. Clin Exp Immunol1989; 76:373 -7.
34.
Kaiser ET, Kerdy FJ. Secondary structures of proteins and peptides in amphiphilic
environments (A Review). Proc Natl Acad Sci USA1983; 80:1 137-43.
35.
Hunter FA, Barger BD, Schrohenloher R, Koopman WJ, Dohlman JG, Hoch SO,
Rokcach LA. Autoantibodies to calreticulin in the sera of patients with systemic
lupus erylhematosus. Arth Rheum1991; 34: (Suppl.):S75.
36.
Winfield JB. Stress protein, arthritis and autoimmunity. Arthritis Rheum 1989;
32:1497.
37.
Boire G, Craft J. Biochemical and immunological heterogeneity of the Ro
ribonucleoprotein particles. J Clin lnvest 1989; 84:270-9.
38.
Itoh Y, Rader MD, Reichlin M. Heterogeneity of the Ro/SSA antigen and autoantiRo/SSA response: evidence of the four antigenically distinct forms. Clin Exp
Immunol 1990;81:45-51.
39.
Boire G, Craft J. Human Ro ribonucleoprotein particles: characterization of native
structure and stable association with the La polypeptide. J Clin lnvest 1989;85:118290.
Ε.II
Τα Αντισώματα Ενάντια στο Σχετιζόμενο με τον Ιό της
Φυσσαλιδώδους Στοματίτιδας Πεπτίδιο EYRKKMDI Αποτελούν
Ένα Μικρό Μόνο Μέρος των Αντισωμάτων αντί-Ro 60kD.
Ι.Γ.Ρούτσιας, Μ. Σακαρέλλου-Δαιτσιώτου*, Ε. Δέτσικας*, Α.Γ. Τζιούφας#,
Κ.Σακαρέλλος* και Χ.Μ. Μουτσόπουλος#.
Τομέας Παθολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Ιωαννίνων και *Τμήμα Χημείας
Πανεπιστημίου
Ιωαννίνων
Πανεπιστημίου Αθηνών.
και
#
Τομέας
Παθοφυσιολογίας,
Ιατρική
Σχολή
Δημοσιεύθηκε στο
Clinical and Experimental Immunology 1994;98:414-418
Abstract:
Previous studies demonstrated a possible antigenic relation between the carboxyl
terminal portion of anti-Ro60kD autoantigen and a nucleocapsid protein (N) of
vesicular stomatitis virus (VSV). In order to investigate whether anti-Ro60kD
autoantibodies react with the VSV homologous region of the Ro60kD protein we
synthesized, according to Merrifield's method, the EYRKKMDI octapeptide (8p)
sharing a common sequence with the N protein of VSV. Sera from 61 patients with
autoimmune rheumatic diseases (34 systemic lupus erythematosus (SLE), 21 Sjorgren's
syndrome (SS) and six rheumatoid arthritis (RA)) as well as 59 from normal blood
donors were tested for the presence of anti-Ro60kD autoantibodies by ELISA and
immunoblot (IB) and anti-8p antibodies by ELISA. Antibodies to 8p were found in 9/31
of anti-Ro60kD IB-positive sera, 5/30 of anti-Ro60kD-negative sera and 2/59 of normal
control sera. The concordance between the anti-8p ELISA and the anti-Ro60kD IB was
very poor (chi 2 = 0.71, P = 0.4) in contrast to the anti-Ro60kD ELISA and the anti-Ro
IB (chi 2 = 27.6, P = 10(-7)). Subsequent affinity purification of the anti-8p antibodies
from a strong positive anti-8p and anti-Ro60kD SLE serum yielded 95% depletion of
the anti-8p activity and 37% reduction of the anti-Ro60kD activity. Inhibition assays
with the affinity-purified anti-8p antibodies demonstrated that the octapeptide gave
94.5% inhibition of the anti-Ro60kD activity, while Ro60kD protein led to 42.3%
inhibition of the anti-8p. Preincubation of the serum with the octapeptide produced 4%
inhibition of anti-Ro60kD ELISA. These results indicate that the anti-8p antibodies
account only for a minority of the anti-Ro60kD autoantibodies.
Περίληψη:
Προηγούμενες μελέτες έχουν υποδείξει ότι πιθανόν να υπάρχει αντιγονική
συσχέτιση μεταξύ του καρβοξυτελικού τμήματος του αυτοαντιγόνου Ro 60kD και της
νουκλεοκαψιδικής πρωτεΐνης (Ν) του ιού της Φυσσαλιδώδους Στοματίτιδας (VSV). Για
να ελέγξουμε εάν τα αντί-Ro/SSA αυτοαντισώματα αντιδρούν με την ομόλογη με το
VSV περιοχή της πρωτεΐνης Ro 60kD, συνθέσαμε σύμφωνα με τη μέθοδο του
Merrifield το οκταπεπτίδιο EYRKKMDI (8p) που εμπεριέχει την κοινή αλληλουχία
αμινοξέων της πρωτεΐνης Ν του VSV. Ελέχθηκαν οροί 61 ασθενών με αυτοάνοσες
ρευματικές παθήσεις [34 με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ), 21 με Σύνδρομό
Sjogren's (ΣΣ) και 6 με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα (ΡΑ)] καθώς και 59 οροί εθελοντών
αιμοδοτών για την παρουσία (i) αυτοαντισωμάτων αντί-Ro 60kD με ELISA και
ανοσοαποτύπωση (IB) και (ii) αντί-8p αντισωμάτων με ELISA. Ανεβρέθηκαν
αντισώματα κατά του 8p στους 9/31 των θετικών στο IB αντί-Ro 60kD ορών, 5/30 των
αρνητικών στο IB ορών και 2/59 των φυσιολογικών ορών ελέγχου. Η συμφωνία μεταξύ
της ELISA αντί-8p και του ΙΒ αντί-Ro 60kD ήταν χαμηλή (χ2=0,71, p=0.4) σε αντίθεση
με τη ELISA αντί-Ro 60kD και του IB αντί-Ro 60kD (χ2=27,6, p=10-7). Επιπλέον
καθαρισμός με ανοσοσυγγένεια των αντί-8p αντισωμάτων από έναν ισχυρά θετικό
αντί-8p και αντί-Ro 60kD ΣΕΛ ορό οδήγησε σε εξάλειψη της αντί-8p δραστικότητας
κατά 95% ενώ η αντί-Ro 60kD δραστικότητα του μειώθηκε κατά 37%. Πειράματα
αναστολής με τα κακαθαρμένα αντισώματα αντί-8p έδειξαν ότι με το οκταπεπτίδιο
μπορούσε να επιτευχθεί αναστολή της αντί-Ro 60kD δραστικότητας τους κατά 94,5%
ενώ με τη Ro 60kD πρωτεΐνη είχαμε αναστολή της αντί-8p δραστικότητας τους κατά
42,3%. Προεπώαση του ορού με το οκταπεπτίδιο έδωσε αναστολή 4% στη ELISA αντίRo 60kD. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι τα αντί-8p αντισώματα είναι μόνο
ένα μικρό μέρος των αντί-Ro αυτοαντισωμάτων.
Ε.II.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Οροί ασθενών με αυτοάνοσες ρευματικές παθήσεις όπως το Σύνδρομο Sjogren (ΣΣ), ο
Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ) και η Ρευματοειδής Αρθρίτιδα (ΡΑ) συχνά
εμπεριέχουν κυκλοφορούντα αντισώματα ενάντια στο αυτοαντιγόνο Ro/SSA (1-3). Το
Ro/SSA είναι ένα σύμπλοκο RNA-πρωτεϊνών (RNP) που αποτελείται από πρωτεΐνες
μη ομοιοπολικά συνδεδεμένες με μια οικογένεια μικρών κυτταροπλασματικών RNAs
τα hY1, hY3, hY4 και hY5 RNAs (4). Το πρωτεϊνικό τμήμα του Ro/SSA RNP
αποτελείται από τουλάχιστον τρεις ανοσολογικά διακριτές πρωτεΐνες
την 60kD
Ro/SSA, τη 52kD Ro/SSA και τη πρωτεΐνη La/SSB (5). Η βιολογική δράση του Ro
RNP παραμένει άγνωστη. Τα αντί-Ro RNP αντισώματα στρέφονται κύρια ενάντια στα
πρωτεϊνικά του μέλη, οι αντιγονικοί καθοριστές των οποίων (Β κυτταρικοί επίτοποι)
δεν
έχουν
προσδιορίστει
επαρκώς.
Από
κλινική
άποψη
η
παρουσία
των
αυτοαντισωμάτων αντί-Ro 60kD συσχετίζεται ισχυρά με την παθογένεια του νεογνικού
Λύκου, του συγγενούς εμφράγματος του μυοκαρδίου και του υποξέως δερματικού
Λύκου (7, 8).
Πρόσφατα οι Scofield και συν. (9), χρησιμοποιώντας πρωτεολυτική πέψη βοείου Ro
60kD,
προσδιόρισαν ένα κυρίως ανοσοδραστικό τμήμα (13kD) της Ro 60kD στο
καρβοξυτελικό
άκρο
του
μορίου.
Εξετάσθηκε
μια
ομάδα
ορών
με
αλληλεπικαλυπτόμενα συνθετικά οκταπεπτίδια που κάλυπταν το 13kD τμήμα της
Ro60kD και αποκαλύφθηκε ότι το μοτίβο δέσμευσης διέφερε αρκετά ανάμεσα στους
θετικούς αντί-13kD ορούς. Ένας από τους κυρίους αντιγονικούς καθοριστές του Ro
60kD αυτοαντιγόνου, βρέθηκε στην αλληλουχία 485-492 (EYRKKMDI), ο οποίος είναι
ομόλογος με τμήμα (EYRKKLMD) της νουκλεοκαψιδικής (Ν) πρωτεΐνης του ιού της
Φυσσαλιδώδους Στοματίτιδας (VSV). Σε μια ακόλουθη μελέτη δείχθηκε ότι οροί αντίRo60kD που είναι θετικοί στην ανοσοκαταβύθιση αναγνωρίζουν τουλάχιστον 19
ομάδες συνθετικών πεπτιδίων σε ολόκληρη την πρωτεΐνη Ro και η περιοχή 13kD
εμπεριέχει δύο από αυτές, συμπεριλαμβανόμενης της ομόλογης με το VSV περιοχής
(10,11). Έτσι έχει προταθεί ότι η αυτοάνοση απόκριση στο Ro/SSA σχετίζεται με την
ανοσολογική επεξεργασία της Ν πρωτεΐνης του VSV (12, 13).
Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε να ερευνήσει τη σχέση μεταξύ της αυτοάνοσης
απόκρισης στο Ro/SSA και της ανοσολογικής επεξεργασίας της Ν πρωτεΐνης του VSV.
Παρουσιάζουμε
τη σύνθεση και τα ανοσολογικά χαρακτηριστικά του συνθετικού
οκταπεπτιδίου EYRKKMDI (485-492) του Ro/SSA που εμπεριέχει ομόλογη περιοχή
(EYRKK) με το τμήμα EYRKKLMD (151-158) της Ν πρωτεΐνης του VSV.
Ε.II.2 ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
Ε.II.2.1 Οροί
Συλλέχτηκαν 34 οροί ασθενών με ΣΕΛ, 21 με ΣΣ και 6 με ΡΑ από ασθενείς ποτ
πληρούσαν τα κλινικά κριτήρια των ΣΕΛ (14), ΣΣ (15) και ΡΑ (16). Από τους 61 ορούς
οι 31 ήταν θετικοί στην ανοσοαποτύπωση για αυτοαντισώματα αντί-Ro 60kD. Πενήνταεννέα φυσιολογικοί οροί συλλέχτηκαν από υγιείς δότες αίματος και χρησιμοποιήθηκαν
σαν οροί ελέγχου.
Ε.II.2.2 Πεπτιδική σύνθεση και καθαρισμός του οκταπεπτιδίου EYRKKMDI (8p)
Η σύνθεση του EYRKKMDI (Glu485-Tyr-Arg-Lys-Lys-Met-Asp-Ile492) σε στερεά φάση
έγινε χρησιμοποιώντας Να-t-Boc-L-ισολευκίνη-PAM ρητίνη (1% συζευγμένου διβυνιλο
βενζόλιου-στυρόλιου, 1,2g, 0,6 mmol/g) και των Να-t-Boc/βένζυλο ομάδων προστασίας
(17).
Οι συζεύξεις αμινοξέων εκτελέσθηκαν με την πορεία του δικυκλοέξυλο
καρβοδιιμιδίου (DCC) / υδροξυβενζοτριαζολίου (HOBt), χρησιμοποιώντας μια σχέση
αμινοξέος
/DCC/HOBt/ρητίνης
(3/3/3/1).
Η
αποπροστασία
της
Να-t-Boc
προστατευτικής ομάδας έγινε με τριφθοροοξεικό οξύ (TFA) που ακολουθήθηκε με
διισοπροπυλαιθυλαμίνη για εξουδετέρωση. Έπειτα από τη σύνθεση, το πεπτίδιο
απομακρύνθηκε από τη ρητίνη με άνυδρο HF, παρουσία ανισόλης και φαινόλης (10%
κ.ο.) στους 0οC για 1 ώρα. Το πεπτίδιο εκλούσθηκε από τη ρητίνη με 2Μ οξεικό οξύ και
λυοφιλιοποιήθηκε για να δίνοντας 0.74g πεπτιδίου (95% απόδοση). Ο καθαρισμός του
πεπτιδίου
έγινε
με
χρωματογραφία
κατανομής
σε
Sephadex
G25
με
But/Pyr/AcOH/H2O (5/5/2/5 κ.ο.). Το πεπτίδιο βρέθηκε ομογενές στη χρωματογραφία
λεπτής στιβάδας σε But/Pyr/AcOH/H2O (5/5/2/5 κ.ο.) (Rf=0,41) και AcOH 2N
(Rf=0,53). Η συνολική απόδοση έπειτα από τον καθαρισμό ήταν 0,56 g (απόδοση 76
%). Κατάλληλα 1D και 2D 1H-NMR φάσματα επιβεβαίωσαν την ταυτότητα και την
καθαρότητα του πεπτιδίου.
Ε.II.2.3 Καθαρισμός της πρωτεΐνης Ro/SSA
Η πρωτεΐνη Ro/SSA 60kD απομονώθηκε σύμφωνα με μια ήδη γνώστη μέθοδο (18).
Περιληπτικά ανθρώπινος σπλήνας ομογενοποιήθηκε σε ίσο ποσό PBS pH 7,2 κ.β. Το
διάλυμα που προέκυψε από τη λύση των κυττάρων φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 g για 1h
και το υπερκείμενο αναμείχθηκε ολονύχτια με 40% DE-52 (κ.ο.). Ακολούθησε έκλουση
με 0,5 Μ NaCl σε PBS pH 7,2. Το διάλυμα έκλουσης, στη συνέχεια, πέρασε από μια
στήλη ανοσοσυγγένειας αντί-Ro/SSA 60kD. Η στήλη αυτή έγινε με σύζευξη
κεκαθαρμένης IgG, από ένα μονοειδικό ΣΕΛ ορό, σε ενεργοποιημένη με βρωμιούχο
κυάνιο (CNBr) Sepharose 4B. Το Ro/SSA εκλούστηκε από τη στήλη ανοσοσυγγένειας
με HCl-γλυκίνη pH 2,7 και το διάλυμα έκλουσης υποβλήθηκε σε διαπίδυση ενάντια σε
PBS pH 7,2. Το παρασκεύασμα ελέγχθηκε με SDS-ηλεκτοφόρηση και βρέθηκε να
περιέχει μόνο την πρωτεΐνη Ro 60kD.
Ε.II.2.4 Εκχύλισμα κυττάρων και ανοσοαποτύπωση
Το κυτταροπλασματικό εκχύλισμα παρασκευάσθηκε από καλλιεργημένα κύτταρα
HeLa όπως περιγράφθηκε από τους Habets και συν. (19). Δείγματα των
κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων με 50x106 κύτταρα αναλύθηκαν σε 10% PAGE
έπειτα από βρασμό σε SDS (4%) και 2-μερκαπτοαιθανόλη (10%). Η γέλη της SDSPAGE ηλεκτροαποτυπώθηκε σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (20). Οι μεμβράνες
νιτροκυτταρίνης κόπηκαν σε λωρίδες αφού προηγουμένως βάφτηκαν με Ponseau S. Οι
λωρίδες αυτές καλυφθηκάν με άπαχο γάλα 5% σε TBS και επωάστηκαν ολονυκτία
στους 4οC με αραιωμένο ορό (1:50). Έπειτα προστέθηκε διάλυμα με αντί-ανθρώπινη
IgG ορού αίγας συζευγμένη με υπεροξειδάση, και αφέθηκε να αντιδράσει για 1h. Το
χρώμα αναπτύχθηκε με τη προσθήκη διαλύματος του υποστρώματος 4-χλώρο-1ναφθόλη.
Ε.II.2.5 Καθαρισμός των αντισωμάτων αντί-8p
Επιλέχθηκε ένας ισχυρά θετικός αντί-Ro 60kD ορός για την ικανότητα του να
αναγνωρίζει ισχυρά το 8p. Από αυτό τον ορό καθαρίστηκε IgG με μια στήλη πρωτεΐνης
Α – Sepharose και στη συνέχεια συμπυκνώθηκε και υποβλήθηκε σε διαπίδυση ενάντια
σε PBS. Το 8p έπειτα συνδέθηκε σε ενεργοποιημένη με CNBr στήλη Sepharose 4B,
διαμέσου της οποίας πέρασε η κεκαθαρμένη IgG. Η στήλη εκπλύθηκε με PBS,
εκλούστηκε με αλλαγή του pH, και τα διαλύματα έκλουσης εξουδετερώθηκαν,
συμπυκνώθηκαν και υποβληθηκάν σε διαπίδυση ενάντια σε PBS. Οι συγκεντρώσεις
IgG εκτιμήθηκαν με νεφελομετρία (Beckman Instruments, USA).
Ε.II.2.6 ELISA
Τα επίπεδα των αντί-Ro/SSA αντισωμάτων καθορίστηκαν από μια εμπορικά διαθέσιμη
ELISA (Diastat αντί-Ro, Shield Diagnostics) χρησιμοποιώντας μικροπλακίδια
τιτλοποιήσης καλυμμένα με κεκαθαρμένο με ανοσοσυγγένεια βόειο αντιγόνο Ro/SSA,
σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Για τα αντί-8p αντισώματα εφαρμόστηκε μια τροποποιημένη μέθοδος στερεάς φάσης
(ELISA) (21). Μικροπλακίδια τιτλοποίησης Nunc καλύφθηκαν ολονυκτία στους 4οC με
50 μl 8p (100 μg/ml σε αιθανόλη). Προκαταρτικές μελέτες έδειξαν ότι η βέλτιστη
συγκέντρωση πεπτιδίου ήταν 5μg / κυψελίδα για την ανίχνευση 7,5 μg / κυψελίδα
αντισωμάτων IgG. Έπειτα από κάλυψη των εναπομεινάντων θέσεων δέσμευσης με 1%
βόεια αλβουμίνη (BSA), 1% οβαλβουμίνη και 0,1% Tween 20 σε PBS για 1h σε
θερμοκρασία δωματίου, τα πλακίδια επωάστηκαν με IgG (150 μg/ml) ή αραιωμένο ορό
(1:50 σε διάλυμα κάλυψης) για 3h. Οι κυψελίδες έπειτα πλύθηκαν (PBS-Tween 20) και
προστέθηκε αντί-ανθρώπινη IgG αίγας (0,5 mg/ml) συζευγμένη με αλκαλική
φωσφατάση (1:1500 σε διάλυμα κάλυψης).
Τα πλακίδια επωάστηκαν για 1h,
εκπλύθηκαν όπως προηγουμένως, και προστέθηκε υπόστρωμα φωσφορικής pνιτροφαινόλης. Το χρώμα που αναπτύχθηκε μετρήθηκε στα 405 nm με ένα μετρητή
micro-ELISA (Dynatech-UK).
Η αξιοπιστία της ELISA αντί-8p ελέγχθηκε ως εξής: (i) Η IgG από όλους τους ορούς
ασθενών μετρήθηκε με νεφελομετρία (μέσος όρος 1580±420 mg/dl). Δεν παρατηρήθηκε
καμία συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων IgG και των τιμών O.D. της ELISA (p > 0,1),
(ii) όλοι οι οροί ελέγχθηκαν ενάντια σε BSA και το πεπτίδιο έλεγχου RLGRLG
σύμφωνα με την περιγραφείσα μέθοδο, τόσο οι φυσιολογικοί όσο και οι παθολογικοί
οροί έδειξαν πολύ χαμηλά και σχεδόν ταυτόσημα επίπεδα δέσμευσης στις ELISA με
BSA και με πεπτίδιο ελέγχου, (iii) εξάλειψη των αντί-8p αντισωμάτων από ένα ισχυρά
θετικό αντί-VSV ορό έδειξε μείωση της οπτικής πυκνότητας κατά 95% σε αντί-8p
ELISA και (iv) το 8p προκάλεσε ομόλογη αναστολή κατά 55,8% στη δέσμευση των
αντισωμάτων αντί-8p σε ELISA.
Οι μετρήσεις στην ELISA εκφράζονται σαν O.D. μονάδες σύμφωνα με τον τύπο:
⎛
O.D. ορού που ελέγχθηκε
⎞
Μονάδες O.D. = ⎜⎜
⎟⎟ × 100
⎝ μέσο O.D. φυσιολογικών + 2 s.d. ⎠
Ε.II.2.7 Πειράματα αναστολής
Λήφθηκαν δείγματα IgG από τον προαναφερθέντα ισχυρά θετικό ορό και επωάστηκαν
με διαλυτό πεπτίδιο EYRKKMDI (συγκεντρώσεις από 25 μg/ml έως 2mg/ml) ή
κεκαθαρμένο ανθρώπινο αντιγόνο Ro 60kD (10 μg/ml), για 2h σε θερμοκρασία
δωματίου πριν εφαρμοστούν στην ELISA.
Ε.II.2.8 Στατιστική ανάλυση
Οι συσχετίσεις μεταξύ των αντισωμάτων αντί-Ro 60kD και των αντισωμάτων αντί-8p
μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας το χ2 τεστ (με τη διόρθωση του Yates). Για τις
συγκρίσεις μεταξύ των μέσων O.D. των επιπέδων δέσμευσης των αντισωμάτων αντί-Ro
60kD και αντί-8p χρησιμοποιήθηκε το Student’s t-τεστ.
Ε.II.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Ε.II.3.1 Συσχετίσεις μεταξύ των αντισωμάτων αντί-Ro 60kD και αντί-8p
Ελέγχθηκαν με ανοσοαποτύπωση οροί ασθενών με αυτοάνοσες νόσους για την ύπαρξη
αντισωμάτων κατά της μετουσιωμένης μορφής της Ro 60kD. Οι ίδιοι οροί εκτιμήθηκαν
σε ELISA για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αντισωμάτων αντί-Ro 60kD και αντί-8p.
Είκοσι-έξι οροί από τους 31 αντί-Ro 60kD θετικούς ορούς με ανοσοαποτύπωση ήταν
επίσης θετικοί σε αντί-Ro 60kD ELISA, ενώ 9/31 ήταν θετικοί σε αντί-8p ELISA. Τα
επίπεδα δέσμευσης αντισώματος των αντί-Ro/SSA ορών ήταν υψηλότερα σε ELISA
αντί-Ro 60kD συγκρινόμενα με αυτά της ELISA αντί-8p (t=5,46, p=9x10-7). Κάποιοι
αρνητικοί στην ανοσοαποτύπωση αντί-Ro 60kD θετικοί οροί βρέθηκαν θετικοί στην
αντί-Ro 60kD (4/30) και στην αντί-8p (5/30) ELISA. Η συμφωνία μεταξύ των
πειραμάτων αντί-Ro 60kD ανοσοαποτύπωσης και αντί-Ro 60kD ELISA ήταν πολύ
υψηλή (χ2=27,59, p=10-7) σε αντίθεση με αυτή των πειραμάτων αντί-Ro 60kD
Σχήμα 1:
Δέσμευση σε αντί-Ro και αντί-8p ELISA των θετικών ορών για αντί-Ro στην ανοσοαποτύπωση,
των αρνητικών ορών για αντί-Ro στην ανοσοαποτύπωση και των φυσιολογικών ορών. Η
διακεκομμένη γραμμή αντιπτοσωπεύει 2 s.d. πάνω από το μέσο επίπεδο δέσμευσης των
φυσιολογικών.
ανοσοαποτύπωσης και αντί-8p ELISA (χ2=0,71, p=0,4).
Αντί-Ro 60kD αντισώματα βρέθηκαν σε 13/34 των ΣΕΛ ορών, 13/21 των ΣΣ ορών και
4/6 των ΡΑ ορών (Σχήμα 1).
Ε.II.3.2 Δραστικότητα αντί-Ro 60kD των αντισωμάτων αντί-8p
IgG από ένα ΣΕΛ ορό, ο οποίος έδωσε ισχυρά θετική αντίδραση τόσο στη αντί-Ro
60kD ELISA όσο και στη αντί-8p, καθαρίστηκε με τη μέθοδο της πρωτεΐνης Α –
Sepharose και κατόπιν διαβιβάστηκε διαμέσου μιας στήλης Sepharose 4B οπού ήταν
συζευγμένο το 8p. Η έκλουση των αντισωμάτων αντί-8p πραγματοποιήθηκε με
μεταβολή του pH και απέδωσε δυο κύρια κλάσματα IgG σε pH=4,5 (A) και pΗ=2.7
(Β) (Σχήμα 2). Δείγματα της IgG από τον ΣΕΛ ορό πριν και έπειτα από την
κατεργασία με το 8p, όπως και τα κλάσματα της IgG που εκλούστηκε, ελέγχθηκαν στην
ίδια συγκέντρωση σε ELISA αντί-Ro 60kD και αντί-8p. Τα δύο κλάσματα έκλουσης
κατείχαν 36% και 300% της αντί-Ro 60kD και της αντί-8p δραστικότητας αντίστοιχα.
Σχήμα 2: Αντί-Ro60kD (α) και αντί-8p
δραστικότητα (β) της συνολικής
IgG (i), της αντί-8p IgG από τα
κλάσματα έκλουσης Α (ii) και Β (iii)
και της IgG έπειτα από την
κατεργασία με την αντί-8p στήλη
(iv). Έκλουση των αντί-8p
αντισωμάτων από την αντί-8p
στήλη (γ), διακρίνονται τα
κλάσματα Α και Β.
Αντίθετα το δείγμα έπειτα από την κατεργασία με την στήλη του 8p διατήρησε το 73%
της αντί-Ro 60kD δραστικότητας και μόνο το 5% της αντί-8p δραστικότητας (Σχήμα 2).
Ε.II.3.3 Μελέτες αναστολής των αντισωμάτων αντί-8p
Πειράματα διασταυρούμενης αναστολής έδειξαν ότι το 8p ανέστειλε την αντί-Ro 60kD
δραστικότητα (i) των κλασμάτων έκλουσης Α και Β, (ii) της ΣΕΛ IgG πριν τη
κατεργασία με τη στήλη 8p και (iii) της IgG που κατεργάστηκε με τη στήλη 8p κατά
περίπου 50,2 %, 94,5%, 4,9% και 3,9% αντίστοιχα. Επιπρόσθετα προεπώαση των αντί8p αντισωμάτων (κλάσμα έκλουσης Β) με κεκαθαρμένο Ro/SSA έδωσε 68% αναστολή
της αντί-Ro/SSA 60kD δραστικότητας και 44% της αντί-8p δραστικότητας. Τέλος
πείραμα ομόλογης αναστολής έδειξε ότι το 8p προκάλεσε αναστολή της δραστικότητας
των αντί-8p αντισωμάτων.
Ε.II.4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Η μοριακή μίμηση σαν ένας μηχανισμός επαγωγής και εξέλιξης της αυτοανοσίας έχει
αποτελέσει αντικείμενο μεγάλου ερευνητικού ενδιαφέροντος (22). Ένα από τα καλά
τεκμηριωμένα παραδείγματα της μοριακής μίμησης μεταξύ μολυσματικών παραγόντων
και αυτοαντιγόνων είναι η μοριακή μίμηση μεταξύ της gp120 του HIV και των
αντιγόνων HLA τάξεως II (23). Ωστόσο είναι πιθανό πολλές από τις αναφερόμενες την
τελευταία δεκαετία ομοιότητες αλληλουχιών να συμβαίνουν κατά τύχη και οι εν
δυνάμει αλληλουχίες διασταυρωτής αντίδρασης να είναι στη πραγματικότητα
επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες. Σε προηγούμενες μελέτες (9-13) προτάθηκε ότι η
αντί-Ro 60kD αυτοάνοση απόκριση σχετίζεται με την ανοσολογική επεξεργασία της
νουκλεοκαψιδικής N πρωτεΐνης του VSV λόγω ομοιότητας στην αλληλοδιαδοχή
αμινοξέων μεταξύ της αλληλουχίας 485-492 της Ro 60kD (ενός αντιγονικού καθοριστή
σύμφωνα με τους Scofield και συν.) και της αλληλουχίας 151-158 της Ν πρωτεΐνης του
VSV.
Μια ομάδα 61 ορών από ασθενείς με αυτοάνοσες ρευματικές παθήσεις ελέγχθηκαν για
την παρουσία αντισωμάτων αντί-Ro 60kD αρχικά με ηλεκτροαποτύπωση γέλης SDS.
Οι οροί αυτοί ελέγχθηκαν για αντισώματα ενάντια στη μετουσιωμένη μορφή του
Ro60kD επειδή είναι πιθανότερο αυτά να αντιδρούν με γραμμικούς επιτόπους (24, 25).
Τα αποτελέσματα μας δείχνουν πτωχή συμφωνία μεταξύ της αντί-Ro 60kD
ανοσοαποτύπωσης και της αντί-8p ELISA σε αντίθεση με την αντί-Ro 60kD
ανοσοαποτύπωση και της αντί-Ro 60kD ELISA.
Σε προηγούμενη μελέτη (12) δείχθηκε ότι τα αντισώματα αντί-VSV (αντίνουκλεοκαψιδικής πρωτεΐνης) βρίσκονται συχνότερα σε αντί-Ro 60kD θετικούς ΣΕΛ
ορούς (41,5%) από ότι σε αντί-Ro 60kD αρνητικούς ΣΕΛ ορούς (20,5%). Στη δικιά μας
μελέτη η επίπτωση των αντισωμάτων κατά 8p δεν ήταν στατιστικά σημαντικά
διαφορετική ανάμεσα στους αντί-Ro 60kD θετικούς και αρνητικούς ορούς (33,3% και
21,1% αντίστοιχα).
Παρόλο που η αντί-8p ανοσολογική απόκριση δεν σχετίζεται με την αντί-Ro 60kD
δραστικότητα, συσχέτιση μεταξύ αυτών παρατηρήθηκε στη περίπτωση ενός ΣΕΛ ορού
ο οποίος έδωσε ισχυρά θετική αντίδραση και στην αντί-Ro 60kD και στη αντί-8p
ELISA. Διαβίβαση κεκαθαρμένης IgG από τον ορό αυτό μέσα από μια στήλη
Sepharose με συζευγμένο 8p οδήγησε σε απαλοιφή της αντί-8p δραστικότητας ενώ η
αντί-Ro 60kD δραστικότητα διατηρήθηκε. Αξιοσημείωτα τα κλάσματα έκλουσης της
IgG από τη στήλη αυτή είχαν 300% αντί-8p δραστικότητας και μόνο 36% αντί-Ro 60kD
δραστικότητας όταν εξετάστηκαν στην ίδια συγκέντρωση με την αρχική IgG. Τα
ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα αντί-8p αντισώματα αντιπροσωπεύουν μια
περιορισμένη μειοψηφία των αντί-Ro 60kD αντισωμάτων. Εναλλακτικά, είναι πιθανό
να είναι εντελώς διαφορετικά από τα αντισώματα αντί-Ro 60kD, αφού ένα μικρό
πεπτίδιο είναι δυνατό να υπάρχει σε διαφορετικές ευκίνητες διαμορφώσεις
συγκρινόμενο με το πιο άκαμπτο ομόλογο τμήμα της πρωτεΐνης Ro 60kD (26). Στη
περίπτωση αυτή η παρατηρούμενη αντί-Ro 60kD δραστικότητα θα μπορούσε να
αποδοθεί στη δυνατότητα που έχουν ορισμένα αντί-Ro 60kD αντισώματα να
δεσμεύονται στην IgG. (27).
Με σκοπό να διακρίνουμε μεταξύ αυτών των πιθανών εξηγήσεων χρησιμοποιήθηκαν
δείγματα IgG σε πειράματα ομόλογης και διασταυρωτής αναστολής. Το 8p ανέστειλε
τη δέσμευση των αντί-8p αντισωμάτων και στη Ro και στη 8p ELISA. Προεπώαση των
αντισωμάτων αντί-8p με το Ro αντιγόνο οδήγησε σε σημαντική αναστολή τόσο της αντίRo όσο και της αντί-8p δραστικότητας. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι
κάποια αντί-Ro αντισώματα αντιδρούν πραγματικά με το ομόλογο με τη Ν πρωτεΐνη
του VSV τμήμα της Ro πρωτεΐνης. Θα έπρεπε επίσης να σημειώσουμε ότι τα κλάσματα
της αντί-8p που εκλούστηκε είχαν διαφορετική συμπεριφορά όσον αφορά τη δέσμευση
τους στο Ro 60kD και στο 8p. Στη πραγματικότητα, το 8p οδήγησε σε αναστολή 94,5%
(κλάσμα εκλουσής Β) και 50,2% (κλάσμα έκλουσης Α) της αντί-Ro 60kD
δραστικότητας. Λαμβάνωντας υπόψη τα διαφορετικά pH που χρησιμοποιήθηκαν για
την έκλουση της IgG (pH 4,2 και 2,7 για τα κλάσματα Α και Β αντίστοιχα) είναι πολύ
πιθανό τα αυτοαντισώματα που εκλούστηκαν σε υψηλότερο pH να έχουν χαμηλή
συγγένεια προς το 8p και υψηλή συγγένεια προς το Ro 60kD αντιγόνο. Σε αντίθεση, τα
αντισώματα που εκλούστηκαν σε χαμηλότερο pH έδειξαν υψηλή συγγένεια προς και τα
δύο αντιγόνα, το 8p και το Ro 60kD. Επιπρόσθετα, προεπώαση του αρχικού
παρασκευάσματος IgG με το 8p οδήγησε σε αναστολή 5% στην αντί-Ro 60kD ELISA,
η οποία επιβεβαιώνει περαιτέρω ότι τα αντισώματα αντί-8p αντικατοπτρίζουν μια
μειοψηφία των αντισωμάτων αντί-Ro 60kD.
Λαμβάνωντας υπόψη τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούμε να συμπεράνουμε ότι τα
αντισώματα αντί-8p δεν είναι συχνό εύρημα σε ορούς ασθενών με αυτοάνοσες
ρευματικές παθήσεις και αντί-Ro/SSA αντισώματα. Ωστόσο, η παρουσία ειδικών
αντισωμάτων αντί-8p ανάμεσα στα αντί-Ro 60kD δεν είναι απρόσμενη αφού η αντίRo/SSA αυτοάνοση απόκριση χαρακτηρίζεται από ετερογένεια αντισωμάτων. Έχουν
αναφερθεί διάφοροι υποπληθυσμοί αντισωμάτων αντί-Ro/SSA που συσχετίζονται
ειδικά με ορισμένες ασθένειες και η ποικιλία τους βασίζεται στις διαφορετικές
μοριακές μορφές του αντιγόνου Ro/SSA (24, 28, 29). Τα αποτελέσματα αυτά
συμφωνούν με προηγούμενες αναφορές, οι οποίες απέτυχαν να δείξουν παρουσία
επιτόπων Β-λεμφοκυττάρων στο καρβοξυτελικό άκρο του αυτοαντιγόνου Ro 60kD,
όπου βρίσκεται η αλληλουχία EYRKK (30). Είναι επίσης συμβατά με δικά μας
πρόσφατα αποτελέσματα που τοποθετούν τους δύο κύριους νοσοειδικούς στόχους των
αντί-Ro 60kD στο κεντρικό τμήμα του Ro 60kD (31).
Είναι επίσης ενδιαφέρον να σημειώσουμε ότι δεν υπάρχει τεκμηρίωση μόλυνσης
ανθρώπου με VSV στην Ευρώπη, ενώ τα αντισώματα αντί-Ro/SSA όπως και οι
σχετιζόμενες με αυτά αυτοάνοσες ρευματικές παθήσεις ανευρίσκονται στην Ευρώπη
όπως και σε όλο τον κόσμο. Επομένως, ο ιός VSV δεν μπορεί από μόνος του να είναι
υπεύθυνος για τα αντισώματα αντί-Ro 60kD και τις αυτοάνοσες παθήσεις. Από την
άλλη πλευρά, τα αντί-8p αντισώματα υπάρχουν, έστω και σαν μια μειοψηφία της αντίRo 60kD απόκρισης, και η διαγνωστική ή βιολογική σημασία τους παραμένει να
ερευνηθεί.
Ε.II.5 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.
Moutsopoulos HM, Zerva LV. Anti Ro(SSA)/La (SSB) antibodies and Sjogren's
syndrome. Clin Rheumatol 1990: 9 (Suppl. 1): 1-9.
2.
Reichlin M, Harley JB. Antibodies to Ro/SSA and the heterogeneity of Systemic
Lupus Erythematosus. J Rheumatol 1987; 14 (Suppl. 13): 112-117.
3.
Skopouli FN, Andonopoulos AP, Moutsopoulos HM. Clinical implications of the
presence of anti-Ro(SSA), antibodies in
patients with rheumatoid arthritis. J
Autoimmun 1988; 3: 381-8
4.
Pruijn GJ, Slobbe RL, Van Venrooij WV. Structure and function of La and Ro
RNPs. Mol Biol Reports 1990; 14: 43-48.
5.
Slobbe
RL,
Pruijn
GJ,
Van
Venrooij
WV.
Ro(SS-A)
and
La(SS-B)
ribonucleoprotein complexes: structure function and antigenicity. Ann Med Intern
199I; 42: 592-600.
6.
Wolin SL, Steitz JA. The Ro small cytoplasmic ribonucleoproteins: identification of
the antigenic protein and its binding site on the Ro RNAs. Proc Natl Acad Sci USA
1984; 81: 1996-2000.
7.
Buyon AP, Ben-Chetrit E, Karps et al. Acquired congenital heart block. Pattern of
maternal antibody response to biochemically defined antigens of the SSA/Ro-SSB/La
system in neonatal lupus. J Clin Invest 1989; 84: 627-34.
8.
Lee LA, Gaither KK, Coulter SN, Norris DA, Harley JB. Pattern of cutaneous
immunoglobulin G deposition in subacute cutaneous lupus erythematosus is
reproduced by infusing purified anti-Ro(SSA) autoantibodies into human skingrafted mice. J Clin Invest 1989; 83: 1556-62.
9.
Scofield RH, Dickey WD, Jackson KW, James JA, Harley JB. A common
autoepitope near the carboxyl terminus of the 60-kD Ro ribonucleoprotein:
sequence similarity with a viral protein. J Clin Immun 1991; 11: 378-88.
10.
Scofield RH, Harley JB. Autoantigenicity of Ro/SSA antigen is related to a
nucleocapsid protein of vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:
3343-7.
11.
Huang SC, Yu H, Barler BD, Scofield RH, Harley JB. Linear epitopes of Ro. 27th
ACR Annual Meeting. Atlanta, USA 12-17 Oct. 1992 (Abst): C25; Arthritis Rheum
(S171), 1992.
12.
Hardgrave KL, Neas B, Scofield RH, Harley JB. Antibodies to vesicular stomatitis
virus proteins in patients with systemic lupus erythematosus and in normal subjects.
Arthritis Rheum 1993; 36; 962-70.
13.
Hardgrave KL, Neas B, Scofield RH, Harley JB. Antibodies binding vesicular
stomatitis virus proteins in systemic lupus erythematosus patients and normals. 27the
ACR Annual Meeting. Atlanta, USA 12-17 Oct. 1992: A259. Arthritis Rheum 1992;
35: S112 (Abstr.) .
14.
Tan EM, Cohen AS, Fries JB. The 1982 revised criteria for the classification of
systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1982; 75: 1271-7.
15.
Vitali C, Bombardieri S, Moutsopoulos HM et at. Preliminary criteria for the
classification of Sjogren's syndrome. Arthritis Rheum 1993: 36: 340-7.
16.
Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA er at. The American Rheumatism Association
1987 revised critcria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum
1988; 31: 315-24.
17.
Merrifield RB. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of a tetrapeptide. J Am
Chem Soc 1963; 85: 2149-54.
18.
Mamula MJ, O'Brien CA, Harley JB, Hardin JA. The Ro ribonucleoprotein particle:
induction of autoantibodies and the detection of Ro RNAs among species. Clin
Immunol Immunopathol 1989; 52: 435-46.
19.
Habets WJ, De Rooij DJ, Hoet MH, Van de Putte LB, Van Venrooij WJ.
Quantitation of anti-RNP and anti-Sm antibodies in MCTD and SLE patient by
immunoblotting. Clin Exp Immunol 1985; 59: 457-66.
20.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc
Natl Acad Sci USA 1979; 76:4350-4.
21.
Engvall E, Perlman A. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative
assay for immunoglobulin G. Immunochemistry 1971; 8: 871-4.
22.
Horsfal AC. Molecular mimicry and autoantigens in connective tissue diseases. Mol
Biol Rep 1992; 16: 139-47.
23.
Garry RF. Extensive antigenic mimicry by retrovirus capsid proteins. AIDS Res Hum
Rotroviruses 1990; 6: 1361-2.
24.
Boire G, Lopez-Longo FJ, Laponte S, Menand HA. Sera from patients with
autoimmune disease recognize conformational determinants on the 60-kD Ro/SS-A
protein. Arthritis Rheum 1991; 34; 722-30.
25.
Geysen HM, Rodda SJ, Mason TJ, Tribbick G, Schoofs PG. Strategies for epitope
analysis using peptide synthesis. J Immunol Methods 1987; 102: 259-74.
26.
Kaiser ET, Kerdy FJ. Secondary structures of proteins and peptides in amphiphilic
environments (A review). Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 1137-43.
27.
Mamula MJ, Fax OF, Yamagata H, Harley JB. The Ro/SSA autoantigen as an
immunogen. Some anti-Ro/SSA antibody binds IgG. J Exp Med 1986; 164: 1889-901.
28.
Boire G, Craft J. Biochemical and immunological heterogeneity of the Ro
ribonucleoprotein particle. Analysis of sera spccific for the Ro hY5 particle. J Clin
Invest 1989; 84: 270-9.
29.
Barakat S, Meyer O, Tonerotot F, Youinou P, Brand JP, Kahn MF, Muller S. IgG
antibodies from patients with primary Sjogren's syndrome and systemic lupus
etythematosus recognize different epitopes in 60-kD SSA/Ro protein. Clin Exp
Immunot 1992; 89; 38-45.
30.
Wahren ME, Ryden U, Andersson B, Ringertz NR, Petterson I, Characterization of
eutoepitopes present on the human SSA/Ro 60kD protein using recombinant
antigen and synthetic peptide. Clin Exp Rheum 1991: 9: 332 (Abst.)
31.
Routsias JG, Tzioufas AG, Sakarellos C, Sakarellos-Daitsiotis M, Moutsopoulos
HM. Preferred antibody recognition of the 169-190 and 211-232 seqnence of the
Ro60kD antigen. Clin Rheumatol 1994: 13: 146 (Abst.).
Ε.ΙΙΙ
Η Αντιγονική Χαρτογράφηση του
Αυτοαντιγόνου Ro/SSA 60kD Αποκαλύπτει Πρότυπα
Δέσμευσης Αντισώματος Ειδικά για Νόσο.
Ι.Γ.Ρούτσιας#, Α.Γ. Τζιούφας, Μ. Σακαρέλλου-Δαιτσιώτου*, Κ.Σακαρέλλος*
και Χ.Μ. Μουτσόπουλος.
#
Τομέας Παθολογίας,
Ιατρική
Σχολή
Πανεπιστημίου
Ιωαννίνων
και Τομέας
Παθολογικής Φυσιολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών και *Τμήμα
Χημείας Πανεπιστημίου Ιωαννίνων.
Δημοσιεύθηκε στο
European Journal of Clinical Investigation 1996;26:514-521
Abstract:
Anti-Ro60KD autoantibodies are commonly found in sera from patients with
primary Sjogren's syndrome (SS) and systemic lupus erythematosus (SLE). In order to
identify the epitopes of this autoantigen, 22-mer, synthetic peptides overlapping by eight
residues, and covering the entire sequence of the Ro60KD autoantigen were prepared.
Three groups of sera were evaluated according to their autoantibody specificites. The
first group consisted of monospecific anti Ro60KD sera from four patients with SLE and
one with SS, the second one was composed of anti-Ro60KD+anti-La(SSB)-positive sera
from four patients with SS and the third group included three normal sera and one anti
Ro52KD serum. It was found that sera from SLE patients interact with a common
antigenic site spanning the sequence TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) of
the Ro60KD protein. On the other hand, sera from SS patients recognise the
ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV
(211-232)
region
of
this
autoantigen.
Determination of the minimal required peptide length for optimal antibody recognition
showed that the defined epitopes can be shortened to the NGWSHKDLLR (175-184)
and
KALSVETEKLLKYLEAV
(216-232)
sequences
respectively.
Inhibition
experiments using the Ro60KD antigen and soluble peptides corresponding to the 175184 and 216-232 segments further confirmed the specific antibody binding. These
results, although only a small number of sera were used, indicate that the Ro60KD
autoantigen, which is not characterized by disease specificity, contains two discrete
epitopes specifically recognized from SLE and SS patient sera. Finally, the sequence
similarity of the NGWSHKDLLR (175-184) epitope with some of the HLA haplotypes,
associated with anti-Ro response, deserves to be noted.
Περίληψη:
Τα αντισώματα αντί-Ro/SSA ανευρίσκονται συχνά σε ορούς ασθενών με
πρωτοπαθές σύνδρομο Sjogren (ΣΣ) και συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ). Με
σκοπό να προσδιορίσουμε τους επιτόπους στο αυτοαντιγόνο αυτό, προετοιμάσαμε 22μερή συνθετικά πεπτίδια που κάλυπταν όλη την αλληλουχία του αυτοαντιγόνου Ro και
ήταν αλληλοεπικαλυπτόμενα κατά οκτώ αμινοξέα. Εκτιμήθηκαν τρεις ομάδες ορών,
ανάλογα με την ειδικότητα των αυτοαντισωμάτων τους. Η πρώτη ομάδα αποτελούνταν
από μονοειδικούς αντί-Ro/SSA ορούς από τέσσερις ασθενείς με ΣΕΛ και ένα με ΣΣ, η
δεύτερη συντέθηκε από αντί-Ro 60kD + αντί-La(SSB) θετικούς ορούς από τέσσερις
ασθενείς με ΣΣ και η τρίτη ομάδα περιλάμβανε τρεις φυσιολογικούς ορούς και ένα
αντί-Ro 52kD ορό. Βρέθηκε ότι οι οροί των ασθενών με ΣΕΛ αλληλεπιδρούν με μια
κοινή
αντιγονική
περιοχή
που
κατέχει
την
αλληλουχία
TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) της πρωτεΐνης Ro60kD. Από την άλλη
πλευρά,
οροί
ασθενών
ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV
με
ΣΣ
(211-232)
αναγνωρίζουν
του
το
τμήμα
αυτοαντιγόνου
αυτού.
Προσδιορισμός του ελάχιστου απαιτούμενου πεπτιδικού μήκους για τη βέλτιστη
αναγνώριση από τα αντισώματα έδειξε ότι οι καθορισμένοι επίτοποι μπορούν να
περιοριστούν
στις
αλληλουχίες
NGWSHKDLLR
(175-184)
και
KALSVETEKLLKYLEAV (216-232) αντίστοιχα. Πειράματα αναστολής με το
αντιγόνο Ro60kD και διαλυτά πεπτίδια που αντιστοιχούν στα τμήματα 175-184 και 216232 επιβεβαίωσαν περαιτέρω την ειδική δέσμευση αντισώματος. Παρόλο που
χρησιμοποιήθηκε ένας μικρός αριθμός ορών, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι
το αυτοαντιγόνο Ro60kD το οποίο δεν χαρακτηρίζεται από ειδικότητα για νόσο,
περιέχει δύο διακριτούς επιτόπους οι οποίοι αναγνωρίζονται ειδικά από ορούς
ασθενών με ΣΕΛ και ΣΣ. Τέλος η ομοιότητα στην αλληλουχία του επιτόπου
NGWSHKDLLR (175-184) με κάποιους απλότυπους HLA, οι οποίοι συσχετίζονται με
την αντί-Ro απόκριση, αξίζει να σημειωθεί.
E.ΙΙΙ.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Οι ριβονουκλεοπρωτεΐνες Ro (Ro RNPs) είναι σύμπλοκα σωμάτια που αποτελούνται
από διάφορες πρωτεΐνες σε σύμπλεξη με κυτταροπλασματικά RNA (Y RNAs) που
είναι προϊόντα μεταγραφής της RNA πολυμεράσης III (1). Τα Ro RNP είναι παρόντα
σε ποικιλία σπονδυλωτών ζωικών ειδών και κυτταρικών τύπων (2), αλλά η βιολογική
λειτουργία τους παραμένει άγνωστη. Τα σωμάτια αυτά ανακαλύφθηκαν σαν κοινοί
στόχοι σε ορισμένες αυτοάνοσες παθήσεις, όπως το σύνδρομο Sjogren (ΣΣ) και ο
συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (ΣΕΛ) (3). Παρόλο που δεν είναι ακόμη γνωστό το
τι οδηγεί στη διάσπαση της ανοσολογικής ανοχής και στο σχηματισμό αντισωμάτων
ενάντια σε αυτά τα αντιγόνα του εαυτού, τα υπάρχοντα στοιχεία δηλώνουν ότι τα
αυτοαντισώματα αντί-Ro έχουν ανοσοπαθογονική ικανότητα (4). Η παρουσία των
αντισωμάτων αντί-Ro έχει επίσης συσχετισθεί με ορισμένους απλότυπους HLA και
ειδικά με τους HLA-DR3, -DRw53 και με ετεροζυγώτες DQ1/DQ2 (5, 6).
Η χυμική αυτοάνοση απόκριση κατευθύνεται κύρια ενάντια στο πρωτεϊνικό μέρος του
Ro RNP, το οποίο συντίθεται από τρεις ανοσολογικά διακριτές πρωτεΐνες, τη Ro/SSA
60kD, τη Ro/SSA 52kD και την πρωτεΐνη La/SSB (1). Τα αντισώματα ενάντια στη
πρωτεΐνη Ro60kD ανευρίσκονται συχνά σε ορούς ασθενών με ΣΕΛ και με πρωτοπαθές
ΣΣ, ενώ αντισώματα κατά της Ro52kD και της La/SSB ανιχνεύονται συχνότερα στους
ΣΣ ορούς (7).
Έχουν
χρησιμοποιηθεί
διάφορες
τεχνικές
για
τη
χαρτογράφηση
των
Β-
λεμφοκυτταρικών επιτόπων της πρωτεΐνης Ro 60kD. Αυτές περιλαμβάνουν τον έλεγχο
αυτοάνοσων ορών με ανοσοενζυμική τεχνική στερεάς φάσεως (ELISA) ενάντια σε
αλληλοεπικαλυπτόμενα συνθετικά πεπτίδια (8) ή με ανοσοαποτύπωση (Western Blot) ή
ανοσοκαταβύθιση ενάντια σε ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες με ελλειματικές μεταλάξεις
(9). Οι μελέτες αυτές έχουν μέχρι στιγμής οδηγήσει σε αλληλοσυγκρουόμενα
αποτελέσματα, τα οποία μπορούν να αποδοθούν σε διάφορα αίτια, όπως στο τύπο της
μεθόδου ανίχνευσης που χρησιμοποιήθηκε, στην επιλογή των ορών των ασθενών και
στη παρουσίαση των αντιγονικών θραυσμάτων (10).
Λαμβάνοντας υπόψη και το
γεγονός ότι ένα σημαντικό τμήμα των αντισωμάτων αντί-Ro 60kD στοχεύει σε
επιτόπους διαμόρφωσης (11), φαίνεται ότι η γνώση μας για τους Β-λεμφοκυτταρικούς
επιτόπους του μορίου Ro60kD παραμένει μάλλον περιορισμένη. Ωστόσο, λόγω της
κλινικής σημασίας και του εν δυνάμει παθογονικού ρόλου των αυτοαντισωμάτων αντίRo/SSA, ο προσδιορισμός των κύριων αντιγονικών καθοριστών του Ro 60kD μπορεί
να παρέχει σημαντική βοήθεια στη κατανόηση της αυτονοσίας όπως επίσης μπορεί να
αποβεί χρήσιμος στην ανάπτυξη διαγνωστικών τεχνικών.
Στην παρούσα μελέτη, ερευνήθηκαν οι γραμμικοί αντιγονικοί καθοριστές του μορίου
Ro 60kD χρησιμοποιώντας μεγάλα (22-μερή) αλληλοεπικαλυπτόμενα συνθετικά
πεπτίδια, σύμφωνα με τη στρατηγική αντιγονικής χαρτογράφησης σε πολλαπλούς
ράβδους και με βάση τις δύο δημοσιευμένες αλληλουχίες του Ro 60kD (12, 13).
Δείχθηκε ότι τα αντισώματα κατά Ro 60kD από ασθενείς με ΣΕΛ και πρωτοπαθές ΣΣ
εκλεκτικά αναγνωρίζουν διαφορετικούς επιτόπους στο μόριο. Επίσης ανακοινώνεται
το ελάχιστο αποτελούμενο μήκος των επιτόπων αυτών που απαιτείται για την δέσμευση
των αντισωμάτων καθώς και οι ομοιότητες της αλληλουχίας τους με άλλα μόρια.
E.ΙΙΙ.2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
E.ΙΙΙ.2.1 Οροί και καθαρισμός της IgG
Ελέγχθηκε μια ομάδα ορών από ασθενείς με ΣΕΛ και πρωτοπαθές ΣΣ για την
ειδικότητα
των
αυτοαντισωμάτων
τους
με
αντίθετη
ανοσοηλεκτροφόρηση,
ανοσοαποτύπωση και ELISA. Όλοι οι ασθενείς με ΣΕΛ πληρούσαν τα διαγνωστικά
κριτήρια της Αμερικάνικης Εταιρίας Ρευματολογίας (14), ενώ αυτοί με ΣΣ τα
προκαταρτικά κριτήρια της ομάδας μελέτης της Ευρωπαϊκής Ένωσης (15).
Επιλέχθηκαν οροί οι οποίοι έδωσαν ισχυρή αντί-Ro αντίδραση σε όλες τις μεθόδους
και καθαρό-ευδιάκριτο μοτίβο αναγνώρισης στην ανοσοαποτύπωση, οι οποίοι
χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Η πρώτη ομάδα αποτελούνταν από μονοειδικούς αντί-Ro
60kD ορούς από τέσσερις ασθενείς με ΣΕΛ και ένα με πρωτοπαθές ΣΣ. Η δεύτερη
ομάδα συνετέθη από ορούς θετικούς για αντί-Ro 60kD και αντί-La από τέσσερις ορούς
από ασθενείς με πρωτοπαθές ΣΣ. Η ομάδα ελέγχου περιλάμβανε τρεις φυσιολογικούς
ορούς και ένα αντί-Ro 52kD ορό από ένα ασθενή με πρωτοπαθές ΣΣ. Από όλους τους
ορούς καθαρίστηκε IgG με στήλη πρωτεΐνης Α – sepharose, συμπυκνώθηκε και
υποβλήθηκε σε διαπίδυση ενάντια σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού άλατος (PBS),
pH=7,3. Οι
συγκεντρώσεις της IgG
εκτιμήθηκαν
νεφελομετρικά (Bechman
Instruments, Brea, CA, USA)
E.ΙΙΙ.2.2 Πεπτιδική σύνθεση
(α) Συνολικά 119 συνθετικά πεπτίδια παρασκευάστηκαν σε δύο αντίγραφα το
καθένα με τη μέθοδο πολλαπλής πεπτιδικής σύνθεσης σε ράβδους του Geysen και συν.
(16). Η σύνθεση πραγματοποιήθηκε σε ράβδους πολυαιθυλενίου (Cambridge Research
Biochemicals, UK) και το πρωτόκολλο βασίστηκε σε αρχές της σύνθεσης σε στερεά
φάση του Merrifield (17), με τη χρήση της Να-φθορομεθόξυ καρβονυλικής (FMOC)
στρατηγικής προστατευτικών ομάδων. Για την ακριβή διανομή των διαφορετικών
διαλυμάτων στη φάση της σύζευξης, χρησιμοποιήθηκε λογισμικό ηλεκτρονικού
υπολογιστή φτιαγμένο από εμάς. Σε κάθε κύκλο σύνθεσης παρασκευάστηκαν πεπτίδια
ελέγχου PLAG(G)n και PLAG(G)n διαφορετικού μήκους. (ν=0,6,12 και 18). Όλα τα
πεπτίδια ελέγχου PLAG(G)n αναγνωρίστηκαν ειδικά από τα αντί-PLAG μονοκλωνικά
αντισώματα (Cambridge Research Biochemicals) ενώ τα πεπτίδια GLAG(G)n ήταν
ανενεργά.
(β) Η πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης των πεπτιδίων NGWSHKDLLR (175184) και KALSVETEKLLKYLEAV (216-232) έγινε με τη χρήση βενζυδριλαμίνης
ρητίνης (18) (η υποκατάσταση της ρητίνης (19) εκτιμήθηκε στα 0,42 και 0,46 meq g-1
αντίστοιχα) και των Να-BOC/βενζυλομάδων προστασίας. Οι συζεύξεις των αμινοξέων
πραγματοποιήθηκαν
με
υδροξυβενζοτριαζόλιου
την
πορεία
(HOBt)
δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμιδίου
χρησιμοποιώντας
μια
(DCC)
–
σχέση
αμινοξέος/DCC/HOBt/ρητίνης (3:3:3:1). Η αποπροστασία της προστατευτικής ομάδας
Να-t-Boc έγινε με τριφθοροοξεικό οξύ που ακολουθήθηκε από διισοπροπυλαιθυλαμίνη
για εξουδετέρωση. Έπειτα από τη σύνθεση τα πεπτίδια απομακρύνθηκαν από τη
ρητίνη με άνυδρο υδροφθόριο παρουσία ανισόλης και φαινόλης (10% κ.ο.) στους 0οC
για 1h. Τα πεπτίδια εκχυλίστηκαν από τη ρητίνη χρησιμοποιώντας οξεικό οξύ 2M και
αφού λυοφιλιοποιήθηκαν υποβλήθηκαν σε χρωματογραφικό καθαρισμό με Sephadex
G-25 εξισορροπημένη με 2M υδατικό οξεικό οξύ. Η έκλουση των πεπτιδίων έγινε με
ομογενή διάλυμα n-βουτανόλης-πυριδίνης-οξεικού οξέος-H2O (9:3:2:4 κ.ο.) (BPyAW).
Τα πεπτίδια ήταν ομογενή στη χροματογραφία λεπτής στιβάδας σε BPyAW (9:3:2:4)
(Rf(175-184)=0,27, Rf(216-232)= 0,35) και BPyAW (5:5:1:4) (Rf(175-184)=0,47, Rf(216-232)= 0,54).
Η ολική απόδοση έπειτα από τον καθαρισμό κυμάνθηκε από 40% έως 50%.
Κατάλληλα φάσματα 1Η πυρηνικού-μαγνητικού συντονισμού (NMR) μίας και δύο
διαστάσεων επιβεβαίωσαν την καθαρότητα των πεπτιδίων.
E.ΙΙΙ.2.3 Κυτταρικό εκχύλισμα και ανοσοαποτύπωση
Το κυτταροπλασματικό εκχύλισμα παρασκευάστηκε από κύτταρα HeLa καλλιέργειας
όπως έχει περιγραφεί από τους Habets και συν. (20). Δείγματα των εκχυλισμάτων
υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου με δωδεκακυλοσουλφονικό
νάτριο (SDS), η οποία ακολουθήθηκε από ηλεκτρομεταφορά σε νιτροκυτταρίνη. Τα
αποτυπώματα νιτροκυτταρίνης βάφτηκαν με Ponceau S και κόπηκαν σε επιμήκης
ταινίες, οι οποίες καλύφτηκαν ολονύκτια με άπαχο γάλα 5% στους 4οC. Έπειτα από
πλύσιμο, προστέθηκε αντί-ανθρώπινη IgG συνδεδεμένη με υπεροξειδάση (σε αραίωση
1:1000 σε διάλυμα κάλυψης) και αφέθηκε να αντιδράσει για 1h. Το χρώμα
αναπτύχθηκε με προσθήκη υποστρώματος 4-χλώρο-1-ναφθόλης στις ταινίες.
E.ΙΙΙ.2.4 ELISA
(α) Προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των αντισωμάτων αντί-Ro/SSA στους ορούς
των ασθενών με μία εμπορικά διαθέσιμη ELISA (Diastat αντί-Ro, Shield Diagnostics,
London, UK) χρησιμοποιώντας μικροπλακίδιο τιτλοποίησης καλυμένο με κεκαθαρμένο
με ανοσοσυγγένεια βόειο
αντιγόνο Ro/SSA σύμφωνα με τις οδηγίες του
κατασκευαστή.
(β)
Τα
πεπτίδια
που
ήταν
ομοιοπολικά
συνδεδεμένα
στις
ράβδους
πολυαιθυλενίου ελέγχθηκαν για δέσμευση αντισώματος με ELISA σε μικροπλακίδια
τιτλοποίησης 96 θέσεων. Οι ράβδοι βυθίστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού
νατρίου (PBS) που περιείχε 0,1% Tween 20, 1% αλβουμίνη και 1% οβαλβουμίνη για να
εμποδιστεί η μη ειδική δέσμευση. Προστέθηκε
IgG, αραιωμένη με το παραπάνω
ρυθμιστικό διάλυμα, στις κυψελίδες και επωάστηκε ολονύκτια στους 4οC. Έπειτα από
πλύσιμο με PBS που περιείχε IgG συζευγμένη με υπεροξειδάση (αραιωμένη 1:1000 σε
διάλυμα κάλυψης) και επωάστηκε για ακόμη 1h στους 20οC. Οι ράβδοι ξαναπλύθηκαν
και η παρουσία αντισωμάτων ανιχνεύτηκε με διάλυμα υποστρώματος 2,2΄-αζινο-cis-3αιθυλβενζοθειαζολίνο σουλφονικό οξύ (ABTS) και μέτρηση της απορρόφησης του
χρώματος που παρήχθη στα 405nm. Εν συνεχεία, τα δεμευμένα αντισώματα
απομακρύνθηκαν από τις ράβδους με υπερήχους για 30 min σε λουτρό ύδατος με 0,1Μ
δισόξινου φωσφορικού νατρίου, 1% SDS και 0,1% 2-μερκαπτοαιθανόλης στους 60οC
και οι ράβδοι είτε ξαναχρησιμοποιήθηκαν είτε ξηράθηκαν για αποθήκευση.
E.ΙΙΙ.2.5 Καθαρισμός του αντιγόνου Ro/SSA και πειράματα αναστολής
Η στήλη ανοσοσυγγένειας με αντί-Ro 60kD έγινε με σύζευξη κεκαθαρμένης IgG,
ειδικής για το πεπτίδιο NGWSHKDLLR σε ενεργοποιημένη sepharose 4B με
βρωμιούχο κυάνιο (CNBr) σύμφωνα με συμβατικές μεθόδους. Εκχύλισμα ανθρώπινου
σπλήνα παρασκευάστηκε όπως έχει περιγραφτεί παλαιότερα (21) και διαβιβάστηκε
διαμέσου της αντί-Ro 60kD στήλης ανοσοσυγγένειας. Το αντιγόνο Ro εκλούστηκε με
HCI-γλυκίνη pH=2,7. Η καθαρότητα του εκτιμήθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης SDS και
ανοσοαποτύπωση. Στα πειράματα αναστολής, δείγματα IgG (200mg/ml) επωάστηκαν
με διαλυτά πεπτίδιο (100μg/ml) ή κεκαθαρμένο ανθρώπινο αντιγόνο Ro 60kD για 1h
σε θερμοκρασία δωματίου, πριν από την εφαρμμογή τους στη δοκιμασία της ELISA.
E.ΙΙΙ.2.6 Προβλέψεις με ηλεκτρονικούς υπολογιστές και έρευνα ομολογιών
Τα προφίλ ευκαμπτότητας, υδροφιλικότητας και Β-λεμφοκυτταρικής αντιγονικότητας
υπολογίστηκαν με το πρόγραμμα EPIPLOT και με βάση την πρωτοταγή δομή του
Ro60kD. Η πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής του Ro 60kD έγινε χρησιμοποιώντας
τη μέθοδο νευρωνικών δικτύων PHDsec (22). Οι αντιγονικές πεπτιδικές αλληλουχίες
συγκρίθηκαν έναντι των βάσεων δεδομένων SWISS-PROT, NBRF/PIR, PRF και
GENPEPT χρησιμοποιώντας τους αλγορίθμους Fasta (23) και Smith-Waterman (24)
στους εξυπηρέτες GENOMENET-FASTA και EMBL –FASTA, -BLITZ. Τα μη
ταυτόσημα αμινοξέα βαθμολογήθηκαν με τους πίνακες PAM250 και PAM100 (25) και
επιτράπηκε η εισαγωγή χασμάτων (gaps) στις αναζητήσεις με τον αλγόριθμο SmithWaterman. Οι αλληλουχίες
των HLA τάξεως II λήφθηκαν από των Marsh
και
Badmer’s στη βάση δεδομένων του EMBL.
Ε.III.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Ε.III.3.1 Προσδιορισμός των αντιγονικών περιοχών
Συνετέθηκαν, σε δύο αντίγραφα το καθένα, τριάντα-οκτώ
22-μερή πεπτίδια, που
κάλυπταν ολόκληρη την αλληλουχία της πρωτεΐνης Ro 60kD, όπως αυτή καθορίστηκε
από τους Duetscher και συν. Συνετέθη ακόμη ένα επιπλέον 22-μερές πεπτίδιο, που
αντιπροσωπεύει τις κύριες διαφορές μεταξύ των αλληλουχιών των Duetscher και συν.
και των Ben-Chetrit και συν. Τα μοτίβα δέσμευσης αντισωμάτων για όλα τα πεπτίδια
που
ελέγχθηκαν
με
ELISA
φαίνονται
στο
Σχήμα
1.
Η
αλληλουχία
TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP που αντιστοιχεί στο τμήμα 169-190 της Ro 60kD
παρουσίασε σημαντική δραστικότητα με όλους τους μονοειδικούς αντί-Ro ορούς
(ομάδα 1) που ελέγχθηκαν (5/5). Το πεπτίδιο που κατείχε την αλληλουχία 449-470 του
αντιγόνου αναγνωρίστηκε από τα 2/5 των ορών, ενώ τέσσερα ακόμη πεπτίδια έδωσαν
θετική αντίδραση με το 1/5 των ορών που ελέγχθηκαν (Σχήμα 1Α). Οι αντί-Ro και αντίLa θετικοί οροί (ομάδα 2) αντέδρασαν με ένα διαφορετικό προφίλ επιτόπων, όπου το
πεπτίδιο ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV(211-232) καθορίστηκε
καθαρά σαν το
ανοσοκαθοριστικό τμήμα για τα 3/4 των ορών (Σχήμα 1Β). Το πεπτίδιο 183-204 ήταν
θετικό για το 1/4 των ορών και μόνο ένας ορός αυτής της κατηγορίας βρέθηκε
ανενεργός ενάντια σε όλα τα συντεθειμένα 22-μερή, λόγω των υψηλών επιπέδων
"θορύβου". Οι φυσιολογικοί οροί όπως και ο αντί-Ro 52kD ορός (ομάδα 3) έδωσε
χαμηλές τιμές απορρόφησης για όλα τα πεπτίδια που ελέγχθηκαν (Σχήμα 1Γ).
Σχήμα 1: Αντιγονική χαρτογράφηση της πρωτεϊνης Ro 60kD. (A) Δεσμευσή
των αντί-Ro 60kD + αντί-La ορών (συνδρομό Sjogren, ΣΣ) στα 22μερή. Το βέλος δείχνει το πεπτίδιο ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV
(211-232 της αλληλουχίας της Ro). (Β) Δέσμευση των θετικών αντίRo60kD ορών (συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, ΣΕΛ) στα 22μερή. Το βέλος δείχνει το πεπτίδιο TKYKQRNGWSHKDLLRLSHLKP
(169-190 της αλληλουχίας της Rο). (Γ) Δέσμευση των φυσιολογικών
ορών και του αντί-Ro 52kD ορού στα 22-μερή. Οι στήλες
αντιστοιχούν στην απορρόφηση στην ELISA στα 405 nm που
έδωσε το κάθε 22-μερές που συντέθηκε και οι γραμμές
αντιστοιχούν σε κάθε ορό που ελέγχθηκε.
Ε.III.3.2 Προσδιορισμός του ελάχιστου απαιτούμενου μήκους των αντιγονικών
καθοριστων
Ο περιορισμός του μήκους των καθορισμένων επιτόπων πραγματοποιήθηκε με τη
σύνθεση δύο ομάδων πεπτιδίων πολλαπλού μήκους για κάθε μια 22-μερή αντιγονική
περιοχή. Η πρώτη ομάδα αποτελούνταν από 18 πεπτίδια με μειούμενο μήκος (από 22
στα 5 αμινοξέα). Το κάθε πεπτίδιο λήφθηκε με αφαίρεση ενός αμινοξέος κάθε φορά
από το αμινοτελικό άκρο της αντιγονικής περιοχής. Όμοια, η δεύτερη ομάδα πεπτιδίων
χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό του καρβοξυτελικού άκρου του επιτόπου και
περιλάμβανε 18 πεπτίδια πολλαπλών μηκών, τα οποία διέφεραν κατά ένα αμινοξύ από
το C-τελικό τμήμα (Σχήμα 2). Έτσι ο περιορισμός του αντιγονικού καθοριστή
TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) στο NGWSHKDLLR (175-185), με
αφαίρεση έξι αμινοξέων και από τα δύο άκρα του τμήματος 169-190 δεν επηρέασε τη
δέσμευση αντισώματος (Σχήμα 2Α). Παρόμοια, ο περιορισμός της αντιγονικής
Σχήμα 2: Περιορισμός του μήκους των επιτόπων της πρωτεΐνης Ro 60kD. (Α) Ελάχιστο απαιτούμενο μήκος
πεπτιδίου για την δέσμευση των αντί-Ro 60kD ορών ασθενών με συστηματικό ερυθηματώδη
λύκο. (Β) Ελάχιστο απαιτούμενο μήκος πεπτιδίου για την δέσμευση των αντί-Ro 60kD + αντί-La
ορών ασθενών με σύνδρομο Sjogren. Η γραμμή που αρχίζει από αριστερά αντιστοιχεί στο
αμινοτελικό άκρο και η γραμμή που αρχίζει από δεξιά αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο των
περιορισμένων επιτόπων.
περιοχής
ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV
(211-232)
στη
KALSVETEKLLKYLEAV (216-232) με αποκοπή πέντε αμινοξέων από το N-τελικό
άκρο του τμήματος 211-232 δεν προκάλεσε σημαντική απώλεια της αντιγονικότητας
(Σχήμα 2Β). Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο κάθε ξεχωριστός ορός έδωσε ελαφρά
διαφορετικό μοτίβο δέσμευσης-αντισώματος θα μπορούσε να μειωθεί περαιτέρω κατά
ένα ή δυο αμινοξέα ανάλογα με τον ορό που χρησιμοποιήθηκε.
Ε.III.3.3 Αναστολή της δέσμευσης αντισώματος στα αντιγονικά πεπτίδια
Προεπώαση
ενός
ορού,
SVETEKLLKYLEAV
ειδικού
(211-232)
για
με
το
αντιγονικό
αντιγόνο
πεπτίδιο
Ro60kD,
ELYKEKAL-
διαλυτά
πεπτίδια
KALSVETEKLLKYLEAV (216-232) και NGWSHKDLLR (175-184) οδήγησε σε
αναστολή 62%, 56% και 13% αντίστοιχα. Τα αντισώματα ενάντια στο αντιγονικό
πεπτίδιο TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) αναστάλθηκαν κατά 54% από
το αντιγόνο Ro60kD, 24% από το NGWSHKDLLR και 8% από το πεπτίδιο
KALSVETEKLLKYLEAV (216-232) (Σχήμα 3).
Ε.III.3.4 Προβλεπόμενα χαρακτηριστικά των αντιγονικών επιτόπων του Ro60kD
Οι δύο κύριοι επίτοποι των αντί-Ro60kD αντισωμάτων βρίσκονται στο κεντρικό τμήμα
Σχήμα 3:
Πειράματα ανάστολης των πεπτιδίων. Πάνω, απεικονίζεται η αναστολή της
δεσμευσης στο ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (το 22-μερές σχετιζόμενο με το ΣΣ
πεπτίδιο), χρησιμοποιώντας τα πεπτίδια NGWSHKDLLR (ο σχετιζόμενος με το ΣΕΛ
επίτοπος), KALSVETEKLLKYLEAV (ο σχετιζόμενος με το ΣΣ επίτοπος) και το Ro
60kD.
Κάτω,
απεικονίζεται
η
αναστολή
της
δεσμευσης
στο
TKYKQRNGWSHKDLLRLSHKP (το 22-μερές σχετιζόμενο με το ΣΕΛ πεπτίδιο),
χρησιμοποιώντας τα πεπτίδια NGWSHKDLLR (ο σχετιζόμενος με το ΣΕΛ επίτοπος),
KALSVETEKLLKYLEAV (ο σχετιζόμενος με το ΣΣ επίτοπος) και το Ro 60kD.
του μορίου το οποίο τοποθετείται ανάμεσα στο RNP80 μοτίβο δέσμευσης RNA και σε
μια περιοχή που είναι ικανή για δέσμευση DNA (δάκτυλο ψευδαργύρου) και
προβλέπεται να έχει δομή α-έλικας. Κατάλοιπα κυστεϊνης τα οποία είναι ικανά να
σχηματίσουν δισουλφιδικούς δεσμούς δεν υπάρχουν στις ανοσοκαθοριστικές περιοχές
της πρωτεΐνης Ro 60kD και οι δύο επίτοποι NGWSHKDLLR (175-184) και
KALSVETEKLLKYLEAV (216-232) είναι
υδρόφιλες περιοχές (26), μέτριας
ευκαμπτότητας (27) και κατέχουν υψηλό ποσοστό αμινοξέων που ανευρίσκονται συχνά
σε αντιγονικούς καθοριστές Β-λεμφοκυττάρων (28).
Ε.III.3.5 Ομοιότητες αλληλουχίας των ανοσοκαθοριστικών επιτόπων
Ο καθορισμός της αλληλουχίας των επιτόπων του Ro60kD μας έδωσε τη δυνατότητα να
ψάξουμε βάσεις πρωτεϊνών για να βρούμε κοινές αλληλουχίες με άλλες άσχετες με τη
Ro πρωτεΐνες. Οι αλληλουχίες με την υψηλότερη βαθμολόγηση ομοιότητας που
βρέθηκαν στην έρευνα αυτή συνοψίζονται στον Πίνακα 1.
Οι
αλληλουχίες
αμινοξέων
των
επιτόπων
NGWSHKDLLR
και
KALSVETEKLLKYLEAV βρέθηκαν να διατηρούνται στην πρωτεΐνη Ro/SSA του
xenopus laevis (ομοιότητα αλληλουχίας 100% και 84% αντίστοιχα). Η NGWSHKDLLR
έχει επίσης τοπική ομοιότητα με τον παράγοντα μεταγραφής του αδενοϊού E4TF1,
επίσης ήταν ομόλογη με τη δεσμεύουσα GA πρωτεΐνη του ιού του απλού έρπη I και με
τη β-αλυσίδα των HLA τάξεως II. Η τελευταία παρουσίασε ταυτότητα σε έξι αμινοξέα
με την εισαγωγή ενός χάσματος. Κάποια από τα αλληλόμορφα των απλοτύπων που
σχετίζονται με τα αντί-Ro/SSA κατέχουν αλληλουχίες με τοπική ταυτότητα αλληλουχίας
με τον επίτοπο NGWSHKDLLR.
Ο επίτοπος KALSVETEKLLKYLEAV είχε τοπική ομολογία αλληλουχίας με τη
αναγωγάση ριβονουκλεοτιδίων του african swine fever virus (συγγενής ιός με την
οικογένεια ιών της σύφιλης) και την υποθετική πρωτεΐνη 7.17 της salmonella
choleraesuis.
Πίνακας 1: Ομοιότητες αλληλουχιών μεταξύ των επιτόπων NGWSHKDLLR (Α) και
KALSVETEKLLKYLEAV (Β) του αντιγόνου Ro60kD και άλλων πρωτεϊνών.
Αλληλουχία αμινοξέων
Πρωτεΐνη
NGWSHKDLLR
Πρωτεΐνη Ro/SSA, άνθρωπος
NGWSHKDLLR
Πρωτεΐνη Ro/SSA, xenopus laevis
ILWSHLELLR
Παράγοντας μεταγραφής του αδενοϊού, άνθρωπος
YWNSQKDLLQ*
HLA τάξεως II (β-αλυσίδα), άνθρωπος
NWRSDKDLLE*
Αντιγόνο Ε, ambrosia artemisiifolia
KALSVETEKLLKYLEAV
Πρωτεΐνη Ro/SSA, άνθρωπος
KELSPETEKVLKYLEAT
Πρωτεΐνη Ro/SSA, xenopus laevis
IIYSIEQERLLKYEKEV
Υποθ. πρωτεΐνη 7.17, salmonella choleraesuis
GALEVKRKELLKYLTAA
Πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου, άνθρωπος
KALNVDLNKLLQALNHH
Αναγωγάση ριβονουκλεοτιδίων, african swine fever virus
*περιλαμβάνονται χάσματα (gaps)
Ε.III.4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Ο
καθορισμός
των
Β-λεμφοκυτταρικών
επιτόπων
που
αναγνωρίζονται
από
αυτοάνοσους ορούς μπορεί να προσφέρει σημαντικές βιολογικές - πρακτικές
εφαρμογές. Έτσι μπορεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες για το μηχανισμό
διέγερσης της παραγωγής αντισωμάτων και για τη φύση των δομών που στοχεύονται
από τα αντισώματα. Επιπρόσθετα, ο καθορισμός της αλληλουχίας του κύριου επιτόπου
μπορεί να κάνει ευχερή την ανίχνευση των αυτοαντισωμάτων , αφού τα αντιγονικά
συνθετικά πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν αξιόπιστα υποστρώματα για το
σκοπό αυτό (29). Η εφαρμογή των τεστ αυτών μπορεί να φανεί χρήσιμη στη διάκριση
μεταξύ υποομάδων της ασθένειας και έτσι να έχει μια πιθανή προγνωστική αξία.
Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζεται η ακριβής ειδικότητα των αντισωμάτων αντίRo60kD που προέρχονται από δύο διαφορετικές κλινικές οντότητες. Χρησιμοποιώντας
τις ομάδες μονοειδικών αντί-Ro60kD + αντί-La/SSB ορών, καθορίστηκαν δύο
διαφορετικά αντιγονικά προφίλ. Η αλληλουχία 175-184 αναγνωρίστηκε ειδικά από
ΣΕΛ ορούς, ενώ η αλληλουχία 216-232 είναι κυρίως στόχος των ορών από ασθενείς με
πρωτοπαθές ΣΣ. Παρόλο που ο αριθμός των ορών που χρησιμοποιήθηκε είναι μάλλον
μικρός, λόγω των περιορισμών που υπάρχουν στα δεσμευμένα στις ράβδους πεπτίδια
για χρήση με μεγάλο αριθμό ορών στην ELISA, φαίνεται ότι τα μοτίβα αναγνώρισης
αντισωμάτων υποδεικνύουν μια ειδικότητα για νόσο των επιτόπων που καθορίστηκαν.
Τα ελαφρώς διαφορετικά τελικά άκρα των επιτόπων για κάποιους από τους ορούς της
ίδιας ομάδας μπορούν να αποδοθούν σε αποκλίσεις της ακριβούς ειδικότητας των
ανθρώπινων αυτοαντισωμάτων λόγω διαφορετικού ρεπερτορίου αντισωμάτων ή
ιδιοτυπικών παραλλαγών.
Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχουν αντιγονικά διακριτές μοριακές
μορφές του συμπλόκου RoRNP σε ποικίλους τύπους κυττάρων και ζωικών ειδών (21).
Τα αντισώματα κατά του μετουσιωμένου Ro/SSA είναι συχνότερο εύρημα στους ΣΕΛ
ορούς και όχι στους ΣΣ ορούς (30). Επιπλέον τα αντισώματα αντί-Ro/SSA στον ΣΕΛ
(όπου τα αντί-La/SSB αντισώματα συνήθως δεν παρατηρούνται) φαίνονται να
κατευθύνονται ενάντια σε μια περιοχή κοντά στο μοτίβο RNP-80 το οποίο κατέχει
δομικά χαρακτηριστικά απαραίτητα για το σχηματισμό του σωματίου Ro/La-RNP (31).
Έτσι φαίνεται ότι η χυμική απόκριση σε διαφορετικές αυτοάνοσες παθήσεις μπορεί να
στοχεύει διαφορετικές μορφές του αντιγόνου Ro/SSA. Οι παρατηρήσεις αυτές δίνουν
επιπλέον υποστήριξη στα ευρήματα μας που αφορούν νοσοειδικά προφίλ δέσμευσης
αντισώματος στους επιτόπους του Ro60kD.
Το μήκος των αναφερόμενων ελαχίστων αντιγονικών καθοριστών (10 και 17 αμινοξέα)
είναι αρκετά μεγαλύτερο από αυτό που παρατηρείται σε γραμμικούς επιτόπους. Για
παράδειγμα οι Geysen και συν. έχουν ισχυριστεί ότι το 90% των γραμμικών επιτόπων
είναι μήκους έξι αμινοξέων ή ακόμα μικρότερου (32). Μια πιθανή εξήγηση γι’ αυτό
είναι ότι τα άκρα ενός αντιγονικά δραστικού πεπτιδίου μπορεί να αντιπροσωπεύουν
τμήματα ενός μικρού επιτόπου διαμόρφωσης. Εναλλακτικά, ένα ορισμένο μήκος
πεπτιδίου μπορεί να απαιτείται για τη σταθεροποίηση μιας ενεργής διαμόρφωσης του
επιτόπου. Είναι επίσης γνωστό ότι μεγάλα πεπτίδια (>15 αμινοξέα) μπορούν να
λάβουν δομή
έλικας
(33)
η
οποία
προβλέπεται ισχυρά
για
τον
επίτοπο
KALSVETEKLLKYLEAV (216-232). Το διευρυμένο μήκος των επιτόπων που
καθορίστηκαν μπορεί επίσης να εξηγήσει γατί προηγούμενες έρευνες επιτόπων στη
πρωτεΐνη Ro 60kD με συνθετικά οκταπεπτίδια δεν μπόρεσαν να προσδιορίσουν τους
δύο αυτούς επιτόπους (8), ενώ απεναντίας μελέτη με ανασυνδυασμένα τμήματα του
Ro/SSA έδειξε σημαντική αντιγονικότητα στο κεντρικό τμήμα του μορίου (9), ένα
εύρημα που συμφωνεί καλά με τα παρόντα αποτελέσματα.
Οι επίτοποι NGWSHKDLLR και KALSVETEKLLKYLEAV συνετέθησαν επίσης
στην ελεύθερη μορφή τους και χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα αναστολής. Βρέθηκε
ότι το πεπτίδιο KALSVETEKLLKYLEAV είναι ικανό να παρεμποδίσει τη
δραστικότητα του δεσμευμένου στη ράβδο αναλόγου του σε ένα ποσοστό παρόμοιο με
αυτό που παρατηρήθηκε για το αντιγόνο Ro60kD. Το πεπτίδιο NGWSHKDLLR
παρόλο που παρεμπόδισε τη δέσμευση του αντισώματος στο ομόλογο του πεπτίδιο στη
ράβδο τρεις φορές πιο αποτελεσματικά από το πεπτίδιο KALSVETEKLLKYLEAV, το
ποσοστό αναστολής ήταν το μισό από αυτό που προκάλεσε το αντιγόνο Ro 60kD. Το
εύρημα αυτό μπορεί να προκύπτει είτε από τη γνωστή αυξημένη συγγένεια των
αντισωμάτων για το συζευγμένο στη ράβδο πεπτίδιο (που προκαλείται από τη δισθενή
δέσμευση τους στη πολυμερική πεπτιδική επιφάνεια της ράβδου) είτε από μερική
απώλεια της δραστικότητας κατά τον περιορισμό του μήκους.
Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι ένας από τους κυρίως αντιγονικούς καθοριστές της
Ro60kD τοποθετείται κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο (485-492) και είναι ομόλογος με
ένα τμήμα της νουκλεοκαψιδικής πρωτεΐνης του ιού της φυσσαλιδώδους στοματίτιδας
(VSV) (8). Ο έλεγχος του πεπτιδίου αυτού με μια ομάδα αυτοάνοσων ορών αποκάλυψε
ότι δεσμεύει ένα μόνο περιορισμένο αριθμό από αυτούς (34). Τα ευρήματα αυτά
επιβεβαιώνονται με την παρούσα μελέτη, αφού δεν παρατηρήθηκε δέσμευση στο
προαναφερθέν τμήμα του μορίου Ro60kD.
Οι αντιγονικοί επίτοποι που παρουσιάζονται στη μελέτη αυτή κατέχουν ομολογία με
τον παράγοντα μεταγραφής E4TF1 του αδενοϊού, τη αναγωγάση ριβονουκλεοτιδίων
του african swine fever virus και την υποθετική πρωτεΐνη 7.17 της salmonella
choleraesuis. Παρόλο που οι ομολογίες αλληλουχίας μεταξύ αυτοαντιγόνων και
μολυσματικών παραγόντων μπορούν να συμβούν κατά τύχη, η μοριακή μίμηση είναι
ένας ελκυστικός μηχανισμός ο οποίος μπορεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες για
τους μηχανισμούς παραγωγής αντισωμάτων (35). Σε αυτό το πνεύμα, ανοσοποιήσεις
κουνελιών με τη Ν-πρωτεΐνη του VSV έχει οδηγήσει σε ανάπτυξη χυμικής
ανοσολογικής απόκρισης κατά της πρωτεΐνης Ro60kD και του VSV (36).
Λαμβάνοντας
υπόψη ότι το μήκος των επιτόπων που καθορίστηκαν είναι
μάλλον μεγάλο, τοπικές ομολογίες με άλλες πρωτεΐνες μπορεί να αποβούν επαρκείς
για διασταυρωτή αντίδραση αντισωμάτων. Ο επίτοπος NGWSHKDLLR βρέθηκε να
έχει τοπική ταυτότητα αμινοξέων με τη β-αλυσίδα των HLA τάξεως II. Απρόσμενα,
πολλά από τα αλληλόμορφα των απλότυπων που συσχετίζονται με τα αντί-Ro/SSA,
όπως τα DR3, DRw53 και DQ2 κατέχουν ομοιότητα αλληλουχίας με τον επίτοπο
NGWSHKDLLR σε αντίθεση με τα αλληλόμορφα που δεν σχετίζονται με τα αντίRo/SSA. Η αλληλουχία YWNSQKDLLQ η οποία είναι μερικά ομόλογη με τον επίτοπο
NGWSHKDLLR βρίσκεται σε μία άκρως εκτεθειμένη περιοχή της τριτοταγούς δομής
του HLA DR (37).
Το πιο σημαντικό εύρημα της μελέτης αυτής είναι ο προσδιορισμός δύο
διακριτών Β-λεμφοκυτταρικών επιτόπων της πρωτεΐνης Ro 60kD οι οποίοι
αναγνωρίζονται εκλεκτικά από ορούς ασθενών με ΣΕΛ και πρωτοπαθές ΣΣ. Τα
ευρήματα αυτά, όπως και οι ομοιότητες αλληλουχίας των Β-λεμφοκυτταρικών επιτόπων
της πρωτεΐνης Ro 60kD με άλλες άσχετες πρωτεΐνες, μπορεί να δώσει στοιχεία για τους
μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την παραγωγή αντισωμάτων. Σε αυτό το πνεύμα
είναι μεγάλου ενδιαφέροντος το ότι ανοσοποιήση με μικρά πεπτίδια του B/B΄
πολυπεπτιδίου
του
αυτοαντισωμάτων
αυτοαντιγόνου
που
Sm
κατευθύνονται
μπορεί
ενάντια
να
σε
επάγει
άλλους
την
παραγωγή
παράγοντες
του
ματισματοσώματος π.χ. κατά των πρωτεϊνών D, 70kD, A και C. Επιπλέον τα
ανοσοποιημένα αυτά ζώα ανέπτυξαν χαρακτηριστικά συστηματικών αυτοάνοσων
διαταραχών
με
θρομβοκυττοπενία,
αιφνιδιαστικές
προσβολές,
πρωτεϊνουρία
αντισώματα κατά του Sm και του DNA διπλής έλικας (38).
Στο εργαστήριο μας πραγματοποιούνται μελέτες που ερευνούν τον ανοσολογικό
λειτουργικό ρόλο των προσδιορισμένων επιτόπων σε in vitro και in vivo συστήματα.
ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ
Η δουλειά αυτή υποστηρίχτηκε από το πρόγραμμα Human Capital Mobility της
Ευρωπαικής Ένωσης και προγράμματα της Ελληνικής Γραμματείας Έρευνας και
Τεχνολογίας του Ελληνικού Υπουργείου Υγείας. Οι συγγραφείς ευχαριστούν την
κυρία Α. Κορμπά για τη γραμματειακή της υποστήριξη.
Ε.III.5 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.
Pruijn GJ, Slobbe RL, van Venrooij WJ. Structure and function of La and Ro RNPs.
Mol Biol Rep 1990;42:592-600.
2.
Pruijn GJ, Wingens PA, Peters SL, Thijssen JP, Van Venrooij WJ. Ro RNP
associated Y RNAs are highly conserved among mammals. Biochim. Biophys. Acta
1993;1216:395-401.
3.
Tan E. Antinouclear antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and
probes for cell biology. Adv Immunol 1989;44:93-151.
4.
Naparstek Y and Plotz PH. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Ann
Rev Immunol 1993;11:79-104.
5.
Hartung K, Ehrfeld H, Lakomek HJ, et al The genetic basis of Ro and La antibody
formation in Systemic Lupus Erythematosus. Rheumatol Int 1992;11:243-9.
6.
Harley JB, Reichlin M, Arnett FC et al. Gene interaction at HLA-DQ enhances
autoantibody production in primary Sjogren's Syndrome. Science 1986;232:11451147.
7.
Ben-Chetrit EB, Fox RI, Ten EM. Dissociation of immune respoases to the SSA(Ro) 52kd and 60-kd polypeptides in Systemic Lupus Erythematosus and Sjogren's
Syndrome. Arthritis Rheum 1990;33:349-55
8.
Scofield RH, Harley JB. Autoantigenicity of Ro/SSA antigen is related to a
nucleocapsid protein of Vesicular Stomatitis Virus. Proc Natl Acad Sci USA
1991;88:3343-47
9.
Wahren M, Ruden U, Andersson B, Ringertz N, Pettenon I. ldentification of
antigenic regions of the human Ro 60 KD protein using recombinant antigen and
synthetic peptides. J Autoimmun 1992;5:319-32.
10.
Ricchuiti V, Muller S. Use of peptides for the mapping of B-cell epitopes recognized
by antiRo(SSA) antibodies. ln: Isenberg DA, Horsfall AC, eds. Autoimmune
Diseases: focus on Sjogren's Syndrome London: Bios Scientific Publishers, 1994:10116.
11.
Boire G, Lopez-Longo F, Lapointe S, Menard H. Sera from patients with
autoimmune disease recognize conformation determinants on the 60kd Ro/SS-A
protein. Arthritis Rheum 1991 34:722-30.
12.
Deutscher SL, Harley JB, Keene JD. Molecular analysis of the 60-KDa human Ro
Ribonucleoprotein. Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:9479-83.
13.
Ben-Chetrit E, Gandy BJ, Tan EM, Sullivan KF. Isolation and characterization of a
c-DNA clone encoding the 60-KD component of the Human SS-A/Ro
ribonucleoprotein autoantigen. J Clin tnvest 1989:83;1284-92.
14.
Tan EM, Cohen AS, Fries JH, et al. The 1982 revised criteria for the classification of
Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 1982;25:1271-77
15.
Vitali C, Bombardieri S, Moutsopoulos HM et al. Preliminary criteria for the
classification of Sjogren's Syndrome. Arthritis Rheum 1993;36:340-7.
16.
Geysen HM, Rodda SJ, Mason TJ, Tribbick G, Schoofs PG. Strategies for epitope
analysis uslng peptide synthesis. J Immun Methods 1987;102:259.
17.
Merrifield RB. Solid phase peptide synthesis. I. The synlhesis of a tetrapeptide.
J.A.C.S. 1963;85:2149-54.
18.
Stewart JM, Young JD (eds), Solid Phase Peptide Synthesis. Rockford, I USA:
Pierce Chemical Co,l984.
19.
Gisin BF. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric
acid. Anal Chim Acta 1972:58:248-9.
20.
Habets WJ, De Rooij DJ, Hoet MH, van de Putte LB, van Venrooij WJ.
Quantitation of anti-RNP and anti-Sm antibodies in MCTD and SLE patients by
immunobloting. Clin Exp Immunol 1985;59:457-66.
21.
Mamula MJ, O'Brien CA, Herley JB, Hardin JA. The Ro Ribonucleoprotein
particle; ioduction of autoantibodies and the detection of Ro RNAs among species.
Clin Immunol Immunopathol 1989;52:435-46.
22.
Burkhard R, Sander C. Prediction of protein secondary structure at better than 70%
accuracy. J Mol Biol 1993;732:584-99.
23.
Pearson WR, Lipman DJ. Improved tools for biological sequence comparison Proc
Natl Acad Sci USA 1988;85:2444-8.
24.
Smith TF, Waterman MS. Identification of common molecular subsequences. J Mol
Biol 1981;147:195-7.
25.
Altschul SE. Amino acid substitution matrices from an information theoretic
perspective. J Mol Biol 1991;219:555-65.
26.
Hopp TP, Wood KR Prediction of protein antigenic determinants from amino acid
sequences. Proc Natl Acad Sci (USA) 1981,78:3824-8.
27.
Karplus
PA,
Schulz
GE.
Ptediction
of
chain
flexibility
in
proteins.
Naturwissenschaften 1985;72:212-13.
28.
Welling GW, Weijer WJ, van der Zee R. WeIIing-Wester. Prediction of sequential
antigenic regions in protein. FEBS Lett 1985;188:215-18.
29.
Elkon KB. Use of synthetic peptides for the detection and quantification of
autoantibodies. Mol Biol Rep 1992;16:207-12.
30.
Tsuzaka K, Fujii T, Akizuki M et al. Clinical significance of antibodies to native or
denatured 60-kd or 52-kd Ro/SSA proteins in Sjogren's syndrome. Anhritis Rheum
1994;37:88-92.
31.
Habets WJ, Sillekens PT, Hoet MH et al. Small nuclear RNA-associated proteins ere
immunologically related as revealed by mapping of autoimmune reactive B-cell
epitopes. Proc Natl Acad Sci USA 1989;86:4674-8.
32.
Geysen HM, Mason TJ, Rodda SI. Cognitive features of antigenic determinants. J
Mol Recognit 1988;1:32-41.
33.
Kaiser EI, Kezdy FJ. Secondary structures of proteins and peptides in amphiphilic
environments. (Review). Proc Natl Acad Sci USA I983;80:1137-43.
34.
Routsias JG, Sakarellos-Daitsiotis M, Detsikas E, Tzioufas AG, Sakarellos C,
Moutsopoulos HM. Antibodies to EYRKKMDI Vesicular Stomatitis Virus-related
peptide account only for a minority of antiRo6OKD antibodies. Clin Exp Immunol
35.
Horsfall AC.Molecular mimicry and autoantigens in connective tissue diseases. Mol
Biol Rep 1992;16:139-47.
36.
Scofield RH, Huang SC, Pan Z, Harley JB. Induction of anti Ro/SSA by
immunization with viral nucleocapsid protein (Abstract) Arthritis Rheum
1994;37:SI73.
37.
Brown JH, Jardetzky T, Corg JC er al.Three dimension structure of the human class
II histocompatibility antigen HLA- DR1. Nature 1993;364:33-9.
38.
James JA, Gross T, Scofield RH, Herley JB. Immunoglobulin epitope spreading and
autoimmune disease after peptide immunization: Sm B/B-derived PPPGMRPP and
PPPGIRGP induce splicesome autoimmunity J Exp Med 1995; 181:453-61.
Ε.IV
Δομικές, Μοριακές και Ανοσολογικές Ιδιότητες των
Γραμμικών Β-Κυτταρικών Επιτόπων του Αυτοαντιγόνου
Ro60kD
Ι.Γ.Ρούτσιας, Μ. Σακαρέλλου-Δαιτσιώτου*,Β. Τσίκαρης*, Κ.Σακαρέλλος*,
Χ.Μ. Μουτσόπουλος και , Α.Γ. Τζιούφας.
Τομέας Παθολογικής Φυσιολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών και *Τμήμα
Χημείας Πανεπιστημίου Ιωαννίνων.
Δημοσιεύθηκε στο
Scandinavian Journal of Immunology 1998;47(3):280-287
Abstract:
A ntibodies
to Ro60KD protein are found with high frequency in sera from
patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and primary Sjogren's syndrome
(pSS). Two major epitopes of the Ro60KD antigen, the TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) and the ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232), were
synthesized and their antigenic and structural properties were studied. Using a large
panel of SLE and pSS patients' sera, it was found that the anti-Ro60KD reactivity of
both Ro60KD epitopes is rather limited (approximately 45%), although they retain their
original disease specificity. The epitope p.169-190 possessed sequence similarity with the
peptide RPDAEYWNSQKDLLEQKRGR, shared in the beta-chain of different HLADR molecules, among them the HLA-DR3 (which is associated with anti-Ro/Sjogren's
syndrome A (SSA) response in patients with SLE). The antigenicity of the HLA-DR3
RPDAEYWNSQKDLLEQKRGR peptide was found to be similar to the 169-190
homologous Ro60KD epitope, recognized mainly by SLE sera. Structural studies
showed that the 211-232 Ro60KD epitope exhibits pronounced helical characteristics,
while the 169-190 epitope and the HLA-DR3 homologous peptide possess a somewhat
lower percentage of alpha-helix. A beta-folded structure was identified in the latter two
peptides. Although the diagnostic value of the reported Ro60KD epitopes seems to be
rather limited, correlations with other ribonucleoprotein epitopes (La/Sjogren's
syndrome B, Ro52KD) may prove complementary to each other and valuable in clinical
use. The ordered structure of the HLA-DR3 homologous peptide, exposed to the
autoantibody binding, may offer an initiative in further investigation of the role of the
HLA haplotypes, associated with the anti-Ro/SSA response, in the autoimmune
stimulus.
Περίληψη:
Σε ασθενείς με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ) και πρωτοπαθές
Σύνδρομο Sjogren (πΣΣ) ανευρίσκονται σε υψηλή συχνότητα αντισώματα κατά της
πρωτεΐνης
Ro
60kD.
Οι
δύο
TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP
κύριοι
επίτοποι
του
αντιγόνου
Ro60kD
ο
(169-170) και ο ELYKEKALSVETEKLLKY-
LEAV (211-232) συνετέθησαν και μελετήθηκαν οι αντιγονικές και δομικές τους
ιδιότητες. Με τη βοήθεια ενός μεγάλου αριθμού ορών από ασθενείς με ΣΕΛ και πΣΣ
βρέθηκε ότι η δραστικότητα και των δύο επιτόπων είναι μάλλον περιορισμένη (45%)
παρόλο πυ η αρχική τους ειδικότητα για νόσο διατηρείται. Η αντιγονικότητα του HLA
DR3
πεπτιδίου RPDAEYWNSQKDLLEQKDLLEQKRGR βρέθηκε να είναι
παρόμοια με αυτή του ομόλογου επιτόπου 169-190 του Ro60kD και αφορούσε κυρίως
τους ΣΕΛ ορούς. Μελέτη των δομικών χαρακτηριστικών έδειξε ότι ο επίτοπος 211-232
του Ro 60kD παρουσιάζει χαρακτηριστικά α-έλικας ενώ ο επίτοπος 169-190 και το
ομόλογο με αυτόν πεπτίδιο του HLA DR3, κατέχουν μικρότερο ποσοστό α-έλικας. Στα
δύο τελευταία πεπτίδια προσδιορίστηκε δομή β-στροφής. Παρόλο που η διαγνωστική
αξία των συγκεκριμένων επιτόπων του Ro 60kD φαίνεται να είναι μάλλον
περιορισμένη,
θα
μπορούσε
ριβονουκλεοπρωτεϊνικού
συσχετιζόμενη
συμπλόκου
(La/SSB,
με
άλλους
Ro52kD),
επιτόπους
να
του
αποδειχθεί
συμπληρωματική με αυτούς και χρήσιμη στη κλινική πράξη. Η εκτεθειμένη στα
αυτοαντισώματα δομή του ομολόγου HLA DR3 πεπτιδίου ίσως μπορεί να προσφέρει
έναυσμα για περαιτέρω μελέτη του ρόλου που παίζουν στη διέγερση της αυτοάνοσης
αντίδρασης οι συσχετιζόμενοι με την αντί-Ro/SSA απόκριση HLA απλότυποι.
Ε.IV.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Σε ασθενείς με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ) και πρωτοπαθές Σύνδρομο
Sjogren
(πΣΣ)
συνήθως
ανευρίσκονται
αντισώματα
κατά
του
Ro/SSA.
Τα
αυτοαντισώματα αυτά κατευθύνονται ενάντια σε ένα σύμπλοκο σωμάτιο αποτελούμενο
από κυτταροπλασματικά RNAs (hY RNAs) σε σύμπλεξη με μια πρωτεΐνη μοριακού
βάρους 60kD (την Ro 60kD). Μια άλλη πρωτεΐνη μοριακού βάρους 52kD (η Ro 52kD)
έχει θεωρηθεί επίσης ότι συμμετέχει στο σύμπλεγμα μέσω αλληλεπιδράσεων
πρωτεΐνης-πρωτεΐνης με την πρωτεΐνη Ro 60kD (1, 2). Η αυτοάνοση απόκριση στο
Ro/SSA χαρακτηρίζεται από αξιοσημείωτη ετερογένεια και ο ακριβής καθορισμός της
αντί-Ro/SSA ειδικότητας θα βοηθούσε στην κατανόηση της ανοσολογικής διαταραχής
που συνοδεύεται από την παραγωγή αυτών των αντισωμάτων (3). Διαφορές
προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί για τη χαρτογράφηση Β-λεμφοκυτταρικών
επιτόπων του Ro/SSA, μεταξύ των οποίων και ο έλεγχος αυτοάνοσων ορών με
συνθετικά πεπτίδια και η ανοσοαποτύπωση ή ανοσοκαταβύθιση με ανασυνδυασμένες
ελλειμματικές πρωτεΐνες (4-7).
Σε προηγούμενη μελέτη χρησιμοποιώντας αλληλοεπικαλυπτόμενα 22-μερή πεπτίδια,
σύμφωνα με τη μέθοδο των Geysen και συν. για τη χαρτογράφηση επιτόπων,
προσδιορίσαμε δύο διακριτούς γραμμικούς επιτόπους της πρωτεΐνης Ro 60kD τον
TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP
(169-190)
και
τον
ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232) οι οποίοι αναγνωρίζονται από ορούς
ασθενών με ΣΕΛ και πΣΣ αντίστοιχα. Επίσης προσδιορίστηκε το ελάχιστο πεπτιδικό
μήκος που απαιτείται για την αναγνώριση από τα αντισώματα (N175GWSHKDLLR184
και K216ALSVETEKLLKYLEAV232) (8). Τα δεδομένα αυτά βρίσκονται σε συμφωνία
με πρόσφατες μελέτες (9), οι οποίες έδειξαν ότι μονοκλωνικά αντισώματα, που
παρήχθησαν με ανοσοποιήση με κεκαθαρμένη ανθρώπινη ανασυνδυασμένη Ro 60kD
πρωτεΐνη σε ποντικούς BALB/c αναγνωρίζουν διακριτούς επιτόπους στην περιοχή του
μοτίβου RNP και της υποτιθέμενης περιοχής δακτύλου ψευδαργύρου (182-236). τα
ευρήματα μας βρίσκονται επίσης σε συμφωνία με μελέτες που υποδεικνύουν τους
κυρίως επιτόπους, ανάμεσα στα αμινοξέα 139-326 και 181-320 της ανασυνδυσμένης
πρωτεΐνης Ro 60kD όταν αυτή αντιδρά με αυτοάνοσους ορούς από ασθενείς με πΣΣ (7,
10).
Από την άλλη πλευρά, παρόλο που στις περισσότερες περιπτώσεις παραμένει άγνωστο
το ανοσογονικό ερέθισμα το οποίο οδηγεί στη δημιουργία αυτοαντισωμάτων, είναι
πιθανόν ότι συνθετικά πεπτίδια που αντιστοιχούν σε αντιγονικούς επιτόπους, μπορούν
να μιμηθούν καλύτερα μικρά εκτεθειμένα τμήματα της επιφάνειας μακρομοριακών
δομών που
συμμετέχουν
σαν
ανοσογόνα στην
αυτοάνοση
απόκριση. Έτσι
χρησιμοποιώντας βάσεις δεδομένων πρωτεϊνών (8) δείχθηκε ότι ο επίτοπος που
κατέχει την αλληλουχία 175-184 έχει μοριακή ομοιότητα με την αλληλουχία
YWNSQKDLLQ η οποία βρίσκεται στη β-αλυσίδα συγκεκριμένων μορίων HLA-DR.
Ανάμεσα στα μόρια αυτά βρίσκεται το HLA-DR3 το οποίο συσχετίζεται ισχυρά με την
ίδια την αντί-Ro/SSA απόκριση (11,12).
Στη μελέτη αυτή παρουσιάζονται τα μοριακά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των
συνθετικών πεπτιδικών επιτόπων TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) και
ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232) της πρωτεΐνης Ro 60kD, καθώς και η
διαγνωστική
τους
αξία
για
την
ανίχνευση
των
αντισωμάτων
αντί-Ro/SSA
χρησιμοποιώντας ένα μεγάλο αριθμό ορών από ασθενείς με ΣΕΛ και πΣΣ.
Ε.IV.2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
Ε.IV.2.1 Οροί ασθενών και καθαρισμός της IgG
Χρησιμοποιήθηκαν εξήντα ένα οροί ασθενών με ΣΕΛ και πΣΣ οι οποίοι είχαν
ελεγχθεί για την ειδικότητα των αντισωμάτων τους με αντίθετη ανοσοηλεκτροφόρηση,
με ανοσοαποτύπωση και με την εμπορικά διαθέσιμη αντί-Ro/SSA ELISA (Diastat
αντί-Ro/SSA, Shield Diagnostics, London, UK). Όλοι οι ασθενείς πληρούν τα κριτήρια
της ταξινόμησης του ΣΕΛ (13) και πΣΣ (14). Τριάντα-ένα ΣΕΛ και 30 πΣΣ οροί
έδωσαν θετική αντί-Ro 60kD αντίδραση με όλες τις μεθόδους. Για τα πειράματα
υποκατάστασης με αλανίνη, η IgG των ορών καθαρίστηκε με στήλη πρωτεΐνης Α sepharose, συμπυκνώθηκε και υποβλήθηκε σε διαπίδυση
ενάντια σε ρυθμιστικό
διάλυμα φωσφορικών, pH 7,3. Οι συγκεντρώσεις της IgG υπολογίστηκαν με
ανοσοδιάχυση (Boehringer, Mannheim, Germany).
Κεκαθαρμένη ανθρώπινη IgG με δραστικότητα αντί-p216-232 και αντί-p175-184
απομονώθηκε έπειτα από διέλευση του κλάσματος της ολικής IgG διαμέσου στήλης
sepharose 4B με ομοιοπολικά συνδεδεμένα τα πεπτίδια KALSVETEKLLKYLEAV και
NGWSHKDLLR αντίστοιχα, έπειτα από ενεργοποίηση με CNBr. Οι στήλες
εκπλύθηκαν με PBS, pH 7,2 και έπειτα από έκλουση με HCl-Gly pH 2,7, η ειδική IgG
εξουδετερώθηκε, συμπυκνώθηκε και υποβλήθηκε σε διαπίδυση ενάντια σε PBS.
Ε.IV.2.2 Πεπτιδική σύνθεση
Υποκατεστημένοι με Ala - δεσμευμένοι σε ράβδους πεπτιδικοί επίτοποι. Εικοσίδύο 22-μερή πεπτιδικά ανάλογα παρασκευάσθηκαν, για κάθε έναν από τους
γραμμικούς επιτόπους της Ro 60kD που περιγράψαμε (8), εις διπλούν σύμφωνα με τη
μέθοδο των Geysen και συν. (15). Κάθε αμινοξύ του επιτόπου Ro 60kD
αντικαταστάθηκε ανεξάρτητα από τα άλλα με αλανίνη. Η σύνθεση έγινε σε ράβδους
πολυαιθυλενίου (16, 17). Τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν βασίστηκαν ατις
αρχές πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεά φάση του Merrifield (18), χρησιμοποιώντας τη
Να-φθορονύλομεθόξυ καρβονύλο (Fmoc) στρατηγική προστατευτικών ομάδων (19, 20).
Για την ακριβή διανομή των διαφορετικών διαλυμάτων στα στάδια σύζευξης
χρησιμοποιήθηκε λογισμικό που αναπτύχθηκε από εμάς. Σε κάθε συνθετικό κύκλο
συντέθηκαν
δύο
πεπτίδια
ελέγχου
τα
VRLRWNPADYGGIKKIRL
και
VRLRWAPADYGGIKRL. Το πρώτο βρέθηκε να αναγνωρίζεται ειδικά από το
μονοκλωνικό αντίσωμα αντί-VRLRWNPADYGGIKKIRL, ενώ το δεύτερο δεν
αντιδρούσε με αυτό.
Συνδεδεμένες στη ράβδο πεπτιδικές αλληλουχίες των HLA που είναι ομόλογες με
τον επίτοπο 169-190 του Ro 60kD. Πέντε εικοσιδυομερή πεπτίδια που αντιστοιχούσαν
στις ομόλογες περιοχές μεταξύ του Ro/SSA και τμημάτων των HLA DR1, DR3, DR5,
DQ1 και DQ2 συνετέθησαν εις διπλούν σε ξεχωριστούς ράβδους πολυαιθυλενίου
σύμφωνα με τα κατάλληλα πρωτόκολλα (15-20).
Διαλυτά πεπτίδια. Συνετέθησαν πεπτίδια που αντιστοιχούσαν στο πλήρες μήκος
των επιτόπων του Ro 60kD TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) και
ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232) καθώς και στην ομόλογη με το Ro 60kD
περιοχή του DR3 RPDAEYWNSQKDLLEQKDLLEQKRGR σύμφωνα με την κατά
βήματα σύνθεση σε στερεά φάση (SPPS) σε ρητίνη PAM (φαινυλακετάμιδομεθυλο
ρητίνη) (21, 22). Η προστασία των παράπλευρών ομάδων με Να-Boc/Bzl (Boc: tβουτυλοξυκαρβόνυλο,
Bzl:
βένζυλο-)
πραγματοποιήθηκε
με
την
κλασσική
μεθοδολογία. Η ιστιδίνη εισήχθη σαν Να-Boc-L-His(Tos) (Tos: π-τολουενοθειονύλο)
και η λυσίνη σαν Να-Boc-L-Lys (Fmoc) (Fmoc: 9-φθορενυλομεθυλοξυκαρβονύλο). Όλα
τα προστατευμένα αμινοξέα συνδέθηκαν σε μοριακή αναλογία 3:3:3:1 για τα
αμινοξύ:1-υδροξυβενζοτριαζόλιο:Ν'Ν'
δικυκλοέξυλο
καρβοδιιμίδιο:ρητίνη.
Η
περάτωση των αντιδράσεων σύζευξης εξασφαλίστηκε με τη χρήση του ελέγχου
νινυδρίνης (21, 23). Η αποπροστασία των προστατευτικών ομάδων Να-t-Boc
εκτελέσθηκε με τη χρήση TFA (τριφθοροοξεικού οξέος) και ακολουθήθηκε από
DIPEA (διισοπρόπυλαιθυλαμίνη) για εξουδετέρωση. Έπειτα από τη σύνθεση τα
πεπτίδια απομακρύνθηκαν από τη ρητίνη με HF (ανυδρό υδροφθόριο) παρουσία
ανισόλης και φαινόλης (10% κ.ο.) σαν καθαριστές (scavengers) στους 0οC για 1h. Τα
πεπτίδια απομακρύνθηκαν από τη ρητίνη με οξεικό οξύ 2Μ, λυοφιλοποιήθηκαν και
καθαρίστηκαν με παρσκευαστική HPLC (υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία) σε
μια στήλη C-18 (24). Χρησιμοποιήθηκε ένα διάλυμα έκλουσης προγραμματισμένης
διαβάθμισης συγκέντρωσης με τους ακόλουθους διαλύτες: (Α) H20 / 0,1% TFA , (Β)
CH3CN/0,1% TFA, (CH3CN: ακετονιτρίλιο) (Σχήμα 1). Η καθαρότητα των πεπτιδίων
επιβεβαιώθηκε με αναλυτική HPLC, μίας και δύο διαστάσεων (1D, 2D) 1H-NMR
(φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου).
Βιοτινυλιωμένα διαλυτά πεπτίδια. Το πεπτίδιο που αντιστοιχεί στο περιορισμένο
μήκος του επιτόπου του Ro 60kD KALSVETEKLLKYLEAV (216-232) συνετέθηκε
μέσω της SPPS που περιγράψαμε προηγουμένως (21). Επιμηκύνθηκε με ένα επιπλέον
τετραπεπτίδιο
στο
αμινοτελικό
του
άκρο.
Η
βιοτινυλιώση
του
πεπτιδίου
πραγματοποιήθηκε με σύζευξη d-βιοτίνης στη Ν-τελική αμινομάδα έπειτα από
αποπροστασία της Boc σύμφωνα με τη κλασσική διαδικασία σύζευξης σε στερεά φάση
(23). Το βιοτινυλιωμένο πεπτίδιο απομακρύνθηκε από τη ρητίνη χρησιμοποιώντας HF
και καθαρίστηκε με παρασκευαστική HPLC (Α: H20 / 0,1% TFA , Β: CH3CN/0,1%
TFA) (Σχήμα 1). Η ομοιογένεια του πεπτιδίου επιβεβαιώθηκε με αναλυτική HPLC και
φασματοσκοπία 1H-NMR 1D και 2D.
Σχήμα 1: Αναλυτική HPLC του επιτόπου TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) (Α) και
του επιτόπου ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232) (Β) σε στήλη C-18.
Διαλυτά πεπτίδια συνδεδεμένα σε ολιγοπεπτιδικό φορέα. Το πεπτίδιο
TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP που αντιστοιχεί στον επίτοπο
169-190
της
πρωτεΐνης Ro 60kD συζεύκτηκε στον ολιγοπεπτιδικό φορέα (Lys-Aib-Gly)2 (SOC2)
από την ομάδα Lys-NεH2 (για λεπτομέρειες κοιτάξτε τις αναφορές 26-28). Η διμερής
ένωση που παραλήφθηκε υποβλήθηκε σε διαπίδυση ενάντια σε νερό χρησιμοποιώντας
σωλήνες διαπίδυσης με όριο αποκοπής μοριακής μάζας περίπου 1500 (Sigma
Chemicals, St Louis, MO, USA). Η καθαρότητα των πεπτιδίων επιβεβαιώθηκε με
αναλυτική HPLC και ανάλυση αμινοξέων.
Ε.IV.2.3 ELISA
Δεσμευμένα σε ράβδους πεπτίδια. Πεπτίδια ομοιοπολικά συνδεδεμένα σε
ράβδους πολυαιθυλενίου ελέγχθηκαν για δέσμευση αντισώματος με ELISA σε
μικροπλακίδια τοτλοποιήσης 96 κυψελίδων. Οι ράβδοι βυθίστηκαν σε ρυθμιστικό
διάλυμα φωσφορικού νατρίου (PBS) pH=7,2 που περιείχε 0,1% Tween 20 και 2%
αλβουμίνη για την αποφυγή της μη ειδικής δέσμευσης. Η IgG αραιωμένη με το
παραπάνω ρυθμιστικό διάλυμα (200 μg/ml) προστέθηκε στις κυψελίδες και επωάστηκε
ολονύκτια στους 4οC. Έπειτα από έκπλυση με PBS που περιείχε 0,1% Tween 20,
προστέθηκε αντιανθρώπινη IgG συνδεδεμένη με υπεροξεδάση (1:1000 αραίωση σε
ρυθμιστικό διάλυμα κάλυψης) και επωάστηκε για 1h στους 20οC. Οι ράβδοι
εκπλύθηκαν ξανά και η παρουσία αντισωμάτων ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας ένα
διάλυμα υποστρώματος 2-2΄αζινο cis3αιθυλβενζοθειαζολίνο σουλφονικό οξύ (ABTS)
και η απορρόφηση του χρώματος μετρήθηκε στα 405 nm. Εν συνεχεία, τα δεσμευμένα
αντισώματα απομακρύνθηκαν από τις ράβδους με υπερήχους για 30 λεπτά σε
υδατόλουτρο που περιείχε 0,1Μ δισόξινου φωσφορικού νατρίου, 1% SDS και 0,1%
μερκαπτοαιθανόλης στους 60οC, και οι ράβδοι ξαναχρησιμοποιήθηκαν ή στεγνώθηκαν
για αποθήκευση. Για να προσδιορίσουμε εάν τα αντισώματα από το προηγούμενο
πείραμα απομακρύνθηκαν εξολοκλήρου από το πεπτίδιο, οι ράβδοι επωάστηκαν χωρίς την προσθήκη IgG- με αντιανθρώπινη IgG συνδεδεμένη με υπεροξειδάση και
ακολούθησε προσθήκη του διαλύματος του υποστρώματος (ABTS). Σε όλες τις
περιπτώσεις το τελικό O.D. ήταν ίσο με τον «θόρυβο» (background).
Διαλυτά πεπτίδια. (i) Στην περίπτωση των μη-βιοτινυλιωμένων πεπτιδίων,
μικροπλακίδια τιτλοποιήσης πολυστυρολίου (Nunc, Denmark) καλύφθηκαν με 100 μl
πεπτιδικού διαλύματος (5 μg/ml) και κρατήθηκαν στους 37οC για 4h έτσι ώστε το
διάλυμα να εξατμιστεί έως ξηρού.
Αφού καλύφθηκαν οι εναπομείναντες θέσεις
δεσμευσής με 2% BSA και 0,1% Tween 20 σε PBS και θερμοκρασία δωματίου για 1h,
τα πλακίδια επωάστηκαν με αραιωμένο ορό (1:50 σε διάλυμα κάλυψης) ολονύκτια
στους 4οC. Τα πλακίδια με τα μη-βιοτινυλιωμένα πεπτίδια πλύθηκαν και ακολουθήθηκε
η διαδικασία που περιγράφτηκε για τα συνδεδεμένα σε ράβδούς πεπτίδια. (ii) Στην
περίπτωση των βιοτινυλιωμένων πεπτιδίων, τα πλακίδια επωάστηκαν με 100 μl
διαλύματος 5μg/ml στρεπταβιδίνης και εν συνεχεία με διαλύματα των βιοτινυλιωμένων
πεπτιδίων για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Έπειτα από 3 εκπλύσεις με PBS0,1% Tween 20, προστέθηκαν οροί σε αραίωση 1/125 σε PBS-BSA 2% (100 μl /
κυψελίδα). Ακολούθησε επώαση 1h και 3 εκπλύσεις με PBS-0,1% Tween 20,
προστέθηκε αντί-ανθρώπινη IgG συνδεδεμένη με υπεροξειδάση και αραιωμένη 1:1000
σε PBS-BSA 2%. Τα πλακίδια επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου,
εκπλύθηκαν 3 φορές και προστέθηκε 50μl/κυψελίδα υποστρώματος ABTS. Η οπτική
απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm έπειτα από 20 min. Το επίπεδο «θορύβου» για
κάθε ορό καθορίστηκε με παράλληλο πείραμα με πλακίδια ELISA προεπωασμένα με
στρεπταβιδίνη χωρίς όμως πεπτίδιο. Σε όλα τα πειράματα ELISA θετικές θεωρήθηκαν
αντιδράσεις οι οποίες έδωσαν O.D. μεγαλύτερο από το μέσο O.D. των πειραμάτων
αναφοράς συν τρεις τυπικές αποκλίσεις.
Ε.IV.2.4 Πειράματα κυκλικού διχρωισμού (CD) και μοντελοποιήσης
Όλα τα φάσματα CD μετρήθηκαν σε φασματοπολωσιμόμετρο με τη βοήθεια
ηλεκτρονικού υπολογιστη κάτω από σταθερή ατμόσφαιρα αζώτου. Τα δεδομένα
εκφράστηκαν σαν μέση υπολειπόμενη ελλειπτικότητα [θ]. Οι συγκεντρώσεις των
διαλυμάτων
πεπτιδίων
υπολογίστηκαν
από
τα
προζυγισμένα
δείγματα
και
χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα 8,0-8,5x 10-4 M σε όλα τα πειράματα.
Οι συντεταγμένες του ετεροδιμερούς HLA-DR1 (29) λήφθηκαν από την βάση
δεδομένων πρωτεϊνών Brookhaven (PDB). Η μοντελοποιήση έγινε σε έναν σταθμό
εργασίας Silicon Graphics Indy με τη βοήθεια του λογισμικού InsightII (Biosym
Technologies, San Diego, CA). Οι διαμορφώσεις των υποκατεστημένων αμινοξέων
στην ομόλογη με το Ro/SSA αλληλουχία του HLA-DR1 επιλέχτηκαν από βιβλιοθήκη
διαμορφομερών χρησιμοποιώντας το κατάλληλο διαμορφομερές για τη κάθε
περίπτωση
έτσι ώστε
η
ενέργεια του συστήματος να ελαχιστοποιείται.
Η
ελαχιστοποίηση ενέργειας του πεπτιδικού μοντέλου του Ro/SSA έγινε μέσω του
προγράμματος Discover (Biosym Technologies, San Diego, CA)
Ε.IV.2.5 Ανοσοποιήσεις ζωών
Λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας, δύο για κάθε πεπτίδιο
που ελέγχθηκε,
ανοσοποιήθηκαν με υποδόρια ένεση με τα πεπτίδια NGWSHKDLLR (175-184) και
KALSVETEKLLKYLEAV (216-232). Τα κουνέλια έλαβαν 500 μg πεπτιδίου σε πλήρες
ανοσοενισχυτικό Freund’s (1:1) την ημέρα 0 και μη πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund’s
(1:1) τις ημέρες 14 και 28 ενώ η συλλογή αίματος έγινε την ημέρα 35. Οι αντιοροί
χρησιμοποιήθηκαν χωρίς επιπρόσθετο καθαρισμό. Για να ελεγχθεί η ικανότητα των
αντιορών να αναγνωρίζουν τα Ro 60kD πεπτίδια χρησιμοποιήθηκε η τεχνική ELISA
όπως περιγράφτηκε προηγουμένως
Ε.IV.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Ε.IV.3.1 Υποκαταστάσεις Αλανίνης
Με σκοπό να καθορίσουμε τον αντιγονικό ρόλο κάθε αμινοξέος στους επιτόπους του
Ro 60kD, όλα τα αμινοξέα αντικαταστάθηκαν ξεχωριστά το καθένα με αλανίνη και τα
δεσμευμένα σε ράβδους πεπτίδια που δημιουργήθηκαν ελέγχθηκαν (Σχήμα 2) ενάντια
σε IgG με δραστικότητα αντί-Ro 60kD (η αλανίνη επιλέχτηκε λόγω της χαμηλής
αντιγονικότητας και του μικρού στερεοχημικού της όγκου). Η υποκατάσταση των E223,
Σχήμα 2:
ELISA των δεσμευμένων σε ράβδο - υποκατεστημένων με αλανίνη
πεπτιδικών επιτόπων. (Α) Κεκαθαρμένη με ανοσοσυγγένεια IgG αντίKALSVETE-KLLKYLEAV από
αντί-Ro 60kD θετικούς ΣΣ ορούς. (Β)
Κεκαθαρμένη IgG αντί-NGWSHKDLLR από θετικούς αντίRo 60kD ΣΕΛ
ορούς. Στον οριζόντιο άξονα φαίνεται το αμινοξύ που υποκαθίσταται
κάθε φορά με αλανίνη. Τα βέλη δείχνουν τους περιορισμένους επιτόπους.
Η πρώτη στήλη (*) αντιστοιχεί στην απορρόφηση που έδωσε σε ELISA ο
κάθε επίτοπος χωρίς καμία υποκατάσταη.
L226, K227 και Y228 με την αλανίνη οδήγησε σε σημαντική απώλεια της αντιγονικότητας
του επιτόπου ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232). Η ικανότητα δέσμευσης
αντισώματος του επιτόπου TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) επηρεάστηκε
ελαφρά όταν τα W177, S178, H179, K180, L183, L185 και S186 υποκαταστάθηκαν από την
αλανίνη.
Ε.IV.3.2 Αντί-Ro 60kD δραστικότητα της ομόλογης με τον επίτοπο Ro 60kD 169-190
περιοχής του HLA-DR
Ερευνήθηκε η διασταυρούμενη δραστικότητα των αντί-Ro 60kD αντισωμάτων κατά του
επιτόπου 169-190 με απλότυπους των HLA-DR (11, 12) οι οποίοι συσχετίζονται με την
αντί-Ro/SSA απόκριση (οι DR3 και DRw53 κατέχουν ταυτόσημες αλληλουχίες στην
ομόλογη περιοχή γι’ αυτό δεν συντέθηκε ξεχωριστά ο DRw53). Έτσι συνετέθησαν και
ελέγχθηκαν οι αλληλουχίες των HLA DR1, DR3 (DRw53) και DQ1 που έχουν
συσχετισθεί με την αντί-Ro απόκριση καθώς και οι DR5 και DQ2 που δεν
συσχετίζονται (Σχήμα 3). Οι ομόλογες αλληλουχίες των DR1 και DR3 (DRw53)
έδειξαν αντί-Ro 60kD δραστικότητα ίση με αυτή του επιτόπου 169-190. Τα DR αυτά
κατέχουν τοπική ταυτότητα με τον επίτοπο 169-190 που αφορά τα αμινοξέα W177, S178
και K180DLL183. Απεναντίας μειωμένη βρέθηκε η αντί-Ro 60kD δραστικότητα των
αλληλουχιών των DR5, DQ2 και DQ1, οι οποίες δεν σχετίζονται με την αντί-Ro 60kD
απόκριση, σε σχέση με τη δραστικότητα του επιτόπου 169-190. Σε αυτά τα HLA η
αλληλουχία KDLL δεν είναι πλήρης (βλέπε κάτω τμήμα Σχήματος 3).
Ε.IV.3.3 Δομικά χαρακτηριστικά των επιτόπων Ro 60kD και του ομολόγου HLA DR3
Τα φάσματα κυκλικού διχρωισμού των TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190),
ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232) και του ομολόγου προς τον επίτοπο 169190, HLA DR3 πεπτίδιου RPDAEYWNSQKDLLEQKDLLEQKRGR, φαίνονται στο
Σχήμα 4. Και τα 3 πεπτίδια έδωσαν σε υδατικό διάλυμα δύο αρνητικές περιοχές
απορρόφησης στα 200 και 220 nm, οι οποίες είναι τυπικές τυχαίου σπειράματος. Σε
μίγμα TFE:H2O (50:50) (TFE: τριφθοροαιθανόλη) τα πεπτίδια έλαβαν ελικοειδή
διάταξη όπως μπορεί να εκτιμηθεί από τις αρνητικές μπάντες στα 220 nm (ήπια
Σχήμα 3: Αντί-Ro 60kD δραστικότητα των πεπτιδικών αλληλουχίων των HLA -DR και -DQ. Πάνω,
αντί-Ro 60kD δραστικότητα του δεσμευμένου σε ράβδο 169-190 επιτόπου του Ro 60kD,
των ομόλογων αλληλουχιών από τα HLA –DR1, -DR3, -DR5, -DQ2 και -DQ1. Στο πείραμα
Σχήμα 4: Φάσμα
διχρωισμούκεκαθαρμένη
του (Α) TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP
(169-190), (Β)
αυτό κυκλικού
χρησιμοποιήθηκε
με ανοσοσυγγένεια αντί-NGWSHKDLLR
IgG.
ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV
(211-232)
και
(Γ)
PRDAEYWNSQKDLLEQKRGR
σε
Κάτω, κοινές τοπικές ομολογίες αλληλουχίας του επιτόπου 169-190 του Ro(HLA-DR3)
60kD με τα
....
_
-4
Hτα
O
(
)
και
50:50
TFE:H
O
(
).
Συγκέντρωση
8,0-8,5x10
M.
2 HLA –DR1, -DR3, -DR5,
2
-DQ2 και -DQ1.
μετάπτωση) και στα 208 nm, όπως και από τη θετική (μετάπτωση ππ*) στα 190 nm (30,
31). Συμφωνά με την ανάλυση των Greenfield και Fasman (32). Το ποσοστό έλικας
υπολογίστηκε με βάση τη μοριακή ελλειπτικότητα στα 208 nm και βρέθηκε 33% για το
πεπτίδιο 211-232 ενώ περίπου 23% για τα άλλα δύο. Συγκρίσιμες ελικοειδής
διαμορφώσεις κατείχαν οι επίτοποι του Ro 60kD και το ομόλογο με το HLA DR3
πεπτίδιο σε αμφιφιλικό περιβάλλον (δωδέκυλο σουλφονικό νάτριο: SDS, 10nm) το
οποίο μπορεί να θεωρηθεί μυκηλιακό μέσο (33). Η υψηλότερη ένταση της μπάντας στα
208 nm εν συγκρίσει με αυτής στα 220 nm που παρατηρήθηκε για το πεπτίδιο 169-190
και το ομόλογο πεπτίδιο HLA DR3 μπορεί να αποδοθεί σε συμμέτοχη ενός τύπου III β
στροφής (34).
Μελέτες
μοντελοποιήσης
που
βασίστηκαν
στη
δομή
του
HLA
DR1
από
κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ έδειξαν την παρουσία μιας διπλωμένης δομής (Σχήμα 5)
γύρω από την αλληλουχία KDLL του επιτόπου 169-190 του Ro 60kD και της ομόλογης
περιοχής του HLA DR1. Οι γωνίες φ και ψ (35) του πεπτιδικού σκελετού της
αλληλουχίας KDLL του Ro 60kD είναι σε καλή συμφωνία με αυτές που λήφθηκαν από
την ομόλογη αλληλουχία του HLA DR3. Στην πραγματικότητα οι φ και ψ τιμές των
αμινοξέων D και L είναι πολύ όμοιες με αυτές μιας τύπου III β στροφής (φ= -60ο, -30ο,
Σχήμα 5: Δομή στο χώρο του (Α) ομοδιμερούς HLA-DR1, (Β) της ομολόγης προς το επίτοπο
169-190 του Ro HLA-DR1 περιοχής και (Γ) μοντέλο της ομόλογης περιοχής του
επιτόπου 169-190 του Ro60 kD.
ψ=60ο, -30ο) (36).
Ε.IV.3.4 Δραστικότητα αντιορών κατά των πεπτιδικών επιτόπων NGWSHKDLLR
(175-184) και KALSVETEKLLKYLEAV (216-232)
Η δραστικότητα των αντιορών κουνελιών κατά των πεπτιδίων 175-184 και 216-232
υπολογίστηκε με ελέγχους ELISA χρησιμοποιώντας τους διαλυτούς πεπτιδικούς
επιτόπους 175-184 και 216-232. Οι αντιοροί που λήφθηκαν από τα ανοσοποιημένα
κουνέλια με το πεπτίδιο 175-184 αναγνώριζαν μόνο το πεπτίδιο αυτό. Απουσία
διασταυρούμενης αντίδρασης επίσης παρατηρήθηκε για τους αντιορούς που λήφθηκαν
από ανοσοποιημένα κουνέλια με το πεπτίδιο 216-232. Σε αντίθεση, οι οροί ασθενών με
πΣΣ που ήταν θετικοί για το πεπτίδιο 216-232 αναγνώριζαν επίσης την αλληλουχία 175184, ενώ οροί ασθενών με ΣΕΛ που ήταν θετικοί για το 175-184 αναγνώριζαν επίσης
την αλληλουχία 216-232. Από τους αντιορούς που παρήχθησαν δεν έδειξε κανένας μη
ειδική δέσμευση.
Ε.IV.3.5 Συχνότητα των αντιπεπτιδικών αντισωμάτων σε αυτοάνοσους ορούς
Ερευνήθηκε η συχνότητα εμφάνισης των αντιπεπτιδικών αντισωμάτων σε ορούς
ασθενών με ΣΕΛ και πΣΣ με τη χρήση των συνθετικών επιτόπων του Ro 60kD σε
έλεγχο ELISA (Σχήμα 6). Αντισώματα έναντι του TKYKQRNGWSH-KDLLRSHLKP
(169-190) εμφανίστηκαν στους 17/31 (55%) των ΣΕΛ ορών και στους 10/30 (33%) των
πΣΣ ορών με δραστικότητα αντί-Ro 60kD. Ο επίτοπος 169-190 αναγνωρίστηκε
συνολικά από 27/61 (44%) των αντί-Ro 60kD θετικών ορών. Αντισώματα κατά του
ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232) ανιχνεύτηκαν στους 11/31 (35%) των
ΣΕΛ ορών και στους 16/30 (53%) των πΣΣ ορών. Το ομόλογο προς το τον επίτοπο 169190
του
αυτοαντιγόνου
HLA
DR3
πεπτίδιο
RPDAEYWNSQKDLLEQKDLLEQKRGR αναγνωρίστηκε από 12/31 (39%) των
ΣΕΛ ορών και 4/30 (13%) των πΣΣ ορών. Στατιστική ανάλυση των επιπέδων
δέσμευσης των ορών ΣΕΛ και πΣΣ στο πεπτίδιο HLA DR3 έδειξε στατιστικά
σημαντική προτίμηση προς τους ΣΕΛ ορούς (t=4,28, p=3,5x10-5). Αντισώματα κατά του
Σχήμα 6:
Συχνότητα εμφάνισης των αντισωμάτων ενάντιά στα πεπτίδια (Α) TKYKQRNGWSH-KDLLRSHLKP
(169-190), (Β) ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232), (Γ) RDAEYWNSQ-KDLLEQKRGR (HLA-DR3)
και (Δ) TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP συζευγμένο με SOC2 σε αντί-Ro 60kD ορούς ασθενών με ΣΕΛ
και πΣΣ. Η διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει το όριο θετικότητας (cut-off) το οποίο ορίζεται
σαν το μέσο O.D. των φυσιολογικών συν τρεις τυπικές αποκλίσεις.
βιοτινυλιωμένου επιτόπου KALSVETEKLLKYLEAV (216-232) ανιχνεύθηκαν σε 2/31
(6%) των ΣΕΛ ορών και 9/30 (30%) των πΣΣ ορών. Ο επίτοπος αναγνωρίστηκε
συνολικά από 11/16 (18%) των θετικών αντί-Ro 60kD ορών. Ο επίτοπος
TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) συνδέθηκε σε συνθετικό φορέα SOC2
και ελέγχθηκε επίσης σε πειράματα ELISA. Βρέθηκε ότι 11/29 (38%) των ορών
ασθενών με ΣΕΛ και 17/27 (63%) των ορών ασθενών με πΣΣ αναγνώρισαν τη διμερή
μορφή του επιτόπου 169-190, η οποία συνολικά έδωσε θετική αντίδραση αντί-Ro 60kD
στους 28/56 (50%). Δεν βρέθηκε καμία συσχέτιση ανάμεσα στα αντί-πεπτιδικά
αντισώματα και κάποιου ειδικού κλινικού ή ορολογικού
χαρακτηριστικού στον
πληθυσμό των ασθενών που μελετήθηκε.
Οι φυσιολογικοί οροί, ήταν αρνητικοί για αντισώματα αντί-Ro 60kD, και
χρησιμοποιήθηκαν σε όλους τους ελέγχους ELISA.
Ε.IV.4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Ο
προσδιορισμός των Β-λεμφοκυτταρικών επιτόπων μπορεί να μας δώσει
πληροφορίες τόσο για τους μηχανισμούς που υπεισέρχονται στη διέγερση της
παραγωγής αυτοαντισωμάτων όσο και για τη φύση των δομών – στόχων των
αυτοαντισωμάτων. Το αυτοαντιγόνο Ro 60kD, έχει τραβήξει το ερευνητικό ενδιαφέρον
εδώ και αρκετά χρόνια επειδή αυτοαντισώματα κατά αυτού απαντώνται σε σημαντικό
ποσοστό των αυτοάνοσων ορών.
Προσπαθώντας να καταλάβουμε τις μοριακές, βιοχημικές και ανοσολογικές
ιδιότητες της πρωτεΐνης αυτής συνθέσαμε και μελετήσαμε τους κύριους επιτόπους (8)
του αυτοαντιγόνου αυτού όπως και του τμήματος του HLA-DR3 που είναι ομόλογο
προς τον επίτοπο 169-190 του Ro60kD. Με τη βοήθεια ενός μεγάλου αριθμού θετικών
για αντί-Ro 60kD ορών από ασθενείς με ΣΕΛ και πΣΣ ερευνήσαμε την συχνότητα
εμφάνισης
των
αντιπεπτιδικών
αντισωμάτων.
Βρέθηκε
ότι
ο
επίτοπος
TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) αναγνωρίζεται κυρίως από ΣΕΛ ορούς
(55%) ενώ ο επίτοπος ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232) αναγνωρίζεται
κυρίως από πΣΣ ορούς (53%). Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν κάποια
ειδικότητα για νόσο των συνθετικών επιτόπων η οποία είναι σε συμφωνία με
προηγούμενα αποτελέσματα μας στη χαρτογράφηση των επιτόπων της Ro 60kD (8).
Ωστόσο η ευαισθησία ανίχνευσης των αντί-Ro 60kD αντισωμάτων και για τα δύο
πεπτίδια παραμένει μάλλον περιορισμένη (44%). Όταν ο επίτοπος 169-190 συζευκτεί
σε ένα διαλυτό συνθετικό φορέα (SOC2 ) η αντί-Ro 60kD δραστικότητα αυξάνεται
ελαφρά (50%) ενώ η ειδικότητα για νόσο μειώνεται (38%). Από την άλλη πλευρά, οι
αντιοροί που παρήχθησαν από τα πεπτίδια NGWSHKDLLR (175-184) και
KALSVETEKLLKYLEAV (216-232) (περιορισμένοι επίτοποι) έδειξαν σχεδόν 100%
δραστικότητα κατά του αρχικού πεπτιδίου.
Οι υποκαταστάσεις αλανίνης έδειξαν ότι τα αμινοξέα που είναι κρίσιμα για τη
δέσμευση αντισώματος στον επίτοπο 211-232 του Ro 60kD βρίσκονται μέσα στη
περιοχή 216-232 η οποία έχει καθοριστεί σαν το ελάχιστο πεπτιδικό μήκος με τη
βέλτιστη αναγνώριση αντισώματος. Στην περίπτωση του επιτόπου 169-190 της Ro 60kD
πρωτεΐνης τα αμινοξέα που ήταν σημαντικά για την αναγνώριση αντισώματος (W177,
S178, H179, K180 και L183) βρίσκονται εντός του περιορισμένου επιτόπου και είναι επίσης
ομόλογα (εκτός του Η179) με τις αλληλουχίες των HLA DR. Τα αμινοξέα L185 και S186 τα
οποία
φαίνεται
να
παίζουν κάποιο
ρόλο
στη
δέσμευση
αντισώματος δεν
περιλαμβάνονται στο περιορισμένο μήκος (175-184) και αυτός ίσως να είναι ένας από
τους λόγους για την μικρή δραστικότητα του περιορισμένου επιτόπου. Ωστόσο καμιά
από τις αναφερόμενες υποκαταστάσεις δεν οδήγησε σε πλήρη απώλεια της
αντιγονικότητας του επιτόπου.
Ένα συμπέρασμα που προκύπτει από τα ευρήματα μας είναι ότι οι οροί από
ασθενείς με ΣΕΛ και πΣΣ κατέχουν αντισώματα που στοχεύουν κύρια διαμορφωτικούς
παρά γραμμικούς επιτόπους. Στην πραγματικότητα η πλειοψηφία των αντί-Ro 60kD
ορών δεν αντέδρασε με τα συνθετικά πεπτιδικά ανάλογα. Με δεδομένο το ότι τα αντίRo 60kD αντισώματα κατευθύνονται ενάντια σε επιτόπους διαμόρφωσης (37), είναι
πιθανό οι αλληλουχίες 169-190 και 211-232 να αποτελούν τμήματα επιτόπων
διαμόρφωσης του Ro 60kD, διατηρώντας μέρος της αρχικής δραστικότητας αυτών όταν
εξετάζονται μεμονωμένα. Από την άλλη πλευρά υπάρχει η πιθανότητα να υπάρχουν
αρκετές άλλες διαφορετικές υποομάδες αντί-Ro 60kD αυτοαντισωμάτων που
αναγνωρίζουν αποκλειστικά επιτόπους διαμόρφωσης σε άλλες περιοχές του μορίου Ro
60kD. Θα πρέπει επίσης να σημειώσουμε ότι πεπτίδια με διαφορετικό μήκος των ιδίων
επιτόπων παρουσίασαν την ίδια αντί-Ro 60kD δραστικότητα όταν ελέγχθηκαν με την
ίδια IgG (8).
Οι ομοιότητες της αντί-Ro 60kD δραστικότητας των δεσμευμένων σε ράβδο
πεπτιδίων των DR1 και DR3 (DRw53) με το πεπτιδικό ανάλογο του επιτόπου 169-190,
σε αντίθεση με τα δεσμευμένα στη ράβδο πεπτίδια των DR5, DQ2 και DQ1 μπορούν
να αποδοθούν στα κοινά αμινοξέα W177,S178 και K180DLL183. Το ίδιο ισχύει και για το
διαλυτό πεπτίδιο DR3, το οποίο κυρίως αναγνωρίζεται από αντί-Ro 60kD θετικούς
ορούς.
Μελέτες διαμόρφωσης των δύο επιτόπων της Ro 60kD και του ομόλογου
πεπτιδίου DR3 με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού, έδειξε μια προτιμούμενη
ελικοειδή δομή για το διαλυτό πεπτίδιο 211-232 (33%) και χαμηλότερο ποσοστό έλικας
για τα δύο άλλα πεπτίδια (23%). Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκονται σε συμφωνία με
την προβλεπόμενη από ηλεκτρονικό υπολογιστή δευτεροταγή δομή της πρωτεΐνης Ro
60kD (8, 38). Υποδεικνύουν επίσης ένα κοινό δομικό χαρακτήρα για τον επίτοπο 169190 της Ro 60kD και την ομόλογη αλληλουχία του HLA DR3, γεγονός που ενισχύεται
περαιτέρω από τις μελέτες μοντελοποιήσης. Η ομόλογη αλληλουχία KDLL μαζί με τα
αμινοξέα W και S βρίσκονται σε ένα εκτεθειμένο τμήμα της HLA DR πρωτεΐνης το
οποίο προσφέρεται για δέσμευση αντισώματος. Στο τμήμα αυτό (60-69 της
αλληλουχίας της β-αλυσίδας του DR) τα υδρόφιλα αμινοξέα S178, K180 και D181
κατευθύνονται προς την έξω επιφάνεια της πρωτεΐνης, ενώ τα υδρόφοβα W177, L182 και
L183
προς το εσωτερικό σταθεροποιώντας έτσι τη διπλωμένη δομή με υδρόφοβες
αλληλεπιδράσεις. Σε αυτό το πλαίσιο πιθανότατα η αλληλουχία KDLL, η οποία είναι
κοινή σε όλα τα δραστικά πεπτίδια, παίζει σημαντικό ρόλο στη δέσμευση αντισώματος
βοηθώντας το πεπτιδίου να πάρει τη σωστή διαμόρφωση παρά μέσω άμεσης
αναγνώρισης της πρωτοταγούς της αλληλουχίας από το αντίσωμα.
Από όσο γνωρίζουμε δεν υπάρχουν προηγούμενες παρατηρήσεις για τη μοριακή
μίμηση μεταξύ μορίων HLA και αυτοαντιγόνων. Αξίζει ωστόσο να σημειωθεί ότι μια
μετάλλαξη στη β-αλυσίδα των MHC ταξεώς II των ποντικών NZB H-2 (μετάλλαξη IAβ βm12), η οποία αφορά τα αμινοξέα 68, 71 και 72, οδήγησε στην εμφάνιση αντίDNA αντισωμάτων και στοιχείων αυτοανοσίας σε αντίθεση με τα ποντίκια NZB-H2b
χωρίς τη μετάλλαξη και τα ποντίκια NZB-H2d. Οι συγγραφείς υποστηρίζουν ότι
μεταλλάξεις στην περιοχή 66-72 της β-αλυσίδας των MHC-II μορίων μπορεί να
οδηγήσουν την ανοσολογική απόκριση προς την εμφάνιση αυτοαντισωμάτων, όταν
συνδυαστούν με το κατάλληλο γενετικό υπόβαθρο (39). Η μοριακή ομοιότητα μεταξύ
της ανθρώπινης MHC β-αλυσίδας και του Ro 60kD που αποκαλύφθηκε στη μελέτη μας
αφορά την περιοχή 63-72 της ανθρώπινης MHC β-αλυσίδας η οποία παρόλο που δεν
περιέχει αμινοξέα ταυτόσημα προς την μετάλλαξη βm12, ίσως να αποτελεί στόχο των
αυτοαντισωμάτων σε ασθενείς που παράγουν αντισώματα αντί-Ro (169-190) 60kD και
κατέχουν μόρια HLA DR3. Εκτός αυτού αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι αντισώματα
κατά εκτεθειμένων τμημάτων των MHC μπορούν να ενεργοποιήσουν Β-λεμφοκύτταρα
και μακροφάγα μέσω διμερισμού και σύνδεσης των μορίων αυτών (40, 41). Επίσης
πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι σύνδεση των αντιγόνων HLA-DR σε μικρά
ηρεμούντα Β λεμφοκύτταρα επάγει την άμεση εμφάνιση των συνδιεγερτικών μορίων
επιφανείας B7.1 με επακόλουθη διέγερση των CD4 Τ-λεμφοκυττάρων μεσώ των
μορίων CD28 που κατέχουν (42).
Συμπερασματικά τα συνθετικά πεπτίδια της Ro TKYKQRNGWSHKDLLRSHLKP (169-190) και ELYKEKALSVETEKLLKYLEAV (211-232)
παρουσιάζουν
μάλλον περιορισμένη αντί-Ro 60kD δραστικότητα λόγω είτε της ετερογενούς και
σύνθετης ανοσολογικής απόκρισης ή είτε της συμμετοχής τους σε επίτοπους
διαμόρφωσης (37). Η αντιγονική ομοιότητα του πεπτιδίου HLA DR3 RPDAEYWNSQKDLLEQKDLLEQKRGR με τον ομόλογο του επίτοπο 169-190 του Ro 60kD
πρέπει να τονιστεί αφού οι αυτοάνοσες ασθένειες συσχετίζονται ισχυρά με αυτόν τον
απλότυπο των HLA τάξεως II (HLA-DR3).
Ε.IV.5 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.
Tan ΕΜ. Antinuclear antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and
probes for cell biology. Adv. Immunol 1989; 44:93-151.
2.
Whittingham S. B-cell epitopes of La and Ro autoantigens. Mol. Blol. Rep. 1992;
16:175-181.
3.
Ricchuiti V, Muller S. Use of peptides for the mapping of B-cell epitopes recognized
by antiRo(SSA) antibodies. In: Isenberg DA, Horsfall AC, eds.
Autoimmune
Diseases: focus on Sjogren's Syndrome London: Bios Scientific Publishers, 1994:10116.
4.
Petterson I. Methods of epitope mapping. Mol. Biol. Rep. 1992; 16:149-153.
5.
Scofield R, Harley J. Autoantigenicity of Ro/SSA antigen is related to a nucleocasid
protein of vesicular stomatitis virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991; 88:3343-3347.
6.
Barakat S., Meyer O, Torterotot P, Youinou P, Briand J, Kahn M, Muller. IgG
atitibodies from patients with primary Sjogren's syndrome and systemic lupus
erythematosus recognized different epitopes in 60-KD SSA/Ro protein.
Clin.
Exp.Immunol. 1992; 89:38-45.
7.
Wahren M, Ruden U, Andersson B, Ringertz N, Petterson I.
Identification of
antigenic regions of the human Ro60KDa protein using recombinant antigen and
synthetic peptides. J. Autoimmun. 1992; 5:319-332.
8.
Routsias J, Tzioufas A, Sakarellos-Daitisotis M, Sakarellos C, Moutsopoulos H.
Epitope mapping of the Ro/SSA6OKD autoantigen reveals
disease-specific
antibody-binding profiles. Eur. J. Clin. Invest. 1996; 26:514-521.
9.
Veldhoven C, Pruijn G, Meilof J, Thijssen J, Van der Kemp A, Van Venrooij W,
Smeenk R. Characterization of murine monoclonal antibodies
against 60-KD
Ro/SS-A and La/SS-B autoantigens. Clin. Exp. Immunol. 1995;101:45-54.
10.
McCauliffe D, Hongliang Y, Wang L-X, Lucas L. Autoimmune sera react with
multiple epitopes on recombinant 52 and 60KDa Ro(SSA) Proteins.
J. Rheum
1994;21:1073-80.
11.
Hartung K, Ehrfeld H, Lakomek H. The genetic basis of Ro and La antibody
formation in Systemic Lupus Erythematosus. Rheumatol Int 1992; 11:243-9.
12.
Moriuchi J., Ichikawa Y., Takaya M., Shimizu H., Uchiyama M., Sato K., Tsuji K.,
Asimori S. Association between HLA and Sjogren's Syndrome in Japanese patients.
Arth. Rheum. 1986; 29: 1518-21.
13.
Tan E, Cohen A, Fries J. The 1982 revised criteria for the classification of Systemic
Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 1982; 25:1271-77.
14.
Vitali C, Bombardieri S, Moutsopoulos H et al. Prelimlnary
criteria for the
classification of Sjogren's Syndrome. Arthritis Rheum. 1993; 36:340-7.
15.
Geysen H, Rodda S, Mason T, Tribbick G, Schoofs P. Strategies for epitope analysis
using peptide synthesis. J. Immunol Methods 1987; 202:259
16.
Valerio R, Bray A, Campell R, Dipasquale A, Margelis C, Rodda S, Geysen M,
Maeji N. Multipin peptide synthesis at the micromole scale using 2-hydroxyethyl
methacrylate grafted polyethylene support. Int. J. Pept. Protein Res. 1993; 42:1-9.
17.
Maeji N, Valeri R, Bray A, Campbell R, Geysen H. Grafted supports used wlth the
multipin method of peptide synthesis. Reactive Polymers 1994; 22:203-212.
18.
Merrifield R. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J.
Am. Chem. Soc. 1963; 85:2149-54.
19.
Bednarek M, Bodanszky M. 9-Fluorenylmethyl esters. Int. J. Pept. Protein Res.1983;
21:196-201.
20.
Fields G, Noble R. Solid phase peptide synthesis utilizing
9-fluorenyl-
methoxycarbonyl amino acids. Int. J. Pept. Protein Res. 1990; 35; 161-214.
21.
Stewart J, Young J (eds), Solid Phase Peptide Synthesis. Rockford I USA: Pierce
Chemical Co, 1984.
22.
Gisin B. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid.
Anal. Chim. Acta 1972; 58:248-9.
23.
Atherton E, Sheppard R. Solid phase peptide synthesis: A
practical approach,
IRLPress, Oxford, England.
24.
Mant C, Hodges R (eds). Reviews in high performance liquid chromatography of
peptides and proteins: separation, analysis and conformation. CRC Press Inc. Boca
Raton, FL 33431 USA.
25.
Tzioufas A, Yiannaki E, Sakarellos-Daitsiotis M, Routsias J, Sakarellos C,
Moutsopoulos H. Fine specificity of autoantibodies to La/SSB:epitope mapping, and
characterization. Clin Exp. Immunol. 1997; 108:191-8.
26.
Tsikaris V, Sakarellos C, Cung MT, Sakarellos-Daitsiotis M. Concept and design of
a new class of sequential oligopeptide carriers (SOC) for covalent attachment of
multiple antigenic peptides. Biopolymers 1996; 38:291-93.
27.
Tsikaris V, Sakarellos C, Sakarellos-Daitsiotis M, Orlewski P, Marraud M, Cung
MT, Vatzaki E, Tzartos S. Construction and application of a new class of sequential
oligopeptide carriers (SOCn) for multiple anchoring of antigenic peptides
application to the acetylcholine receptor (AChR) main immunogenic region. Int.
J.Biol. macromol. I996; I9: 195-205.
28.
Tsikaris V, Sakarellos C, Sakarellos-Daitsiotis M, Cung MT, Marraud M, Konidou
G, Tzinia A, Soteriadou KP. Use of sequential oligopeptide carriers (SOCn) in the
design of potent Leishmania gp63 immunogenic peptides. Peptide Res. 1996; 9:240247.
29.
Brown J, Jardetzky T, Gorga J, Stern L, Urban R, Strominger J, Wiley D. Threedimensional structure of the human class 11 histocompatibility antigen HLA-DR 1.
Nature 1993; 364; 33-9.
30.
Woody R. Studies of theoretical circular dichroism of polypeptides: Contribution of
β turns in "Peptides, Polypeptides and Proteins", Blout E,
Bovey F, Lotan N
Goodman M, Eds, John Wiley & Sons, New York, pp. 338-350, 1974.
31.
Johnson WC Jr, Secondary structure of proteins through
circular dlchroism
spectroscopy. Ann. Rev. Biophys. Chem. 1988; 17:145-66.
32.
Greenfield N, Fasman G. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of
protein conformation. Biochemistry 1969; 8:4108-116.
33.
Takeda K. Kinetics of coil to a-hetix to (3-structure transitions of Poly(L-ornithine)
in low concentrations of sodium dodecylsulfate. Biopolymers 1985; 683-694.
34.
Crisma M, Fasman G, Balaram H, Balaram P. Peptide models for β-turns. Int. J.
Pep. Protein Res. 1984; 23:411-419.
35.
Standard nomenclature for the torsion angles along a polypeptide chain (IUPACIUB Commission on Biochemical Nomenclature, 1970).
36.
Rose G, Gierach L, Smith J. Turns in peptides and proteins. Adv. Prot. Chem.
1985;37:1-109.
37.
Boire G, Lopez-Longo F, Lapointe S, Menard H. Sera from
patients with
autoimmune disease recognize conformational detertninants on the 60-kd Ro/SS-A
protein. Arth. Rheum. 1991; 34:722-730.
38.
Burkhard R, Sander C. Prediction of protein secondary structure at better than 70%
accuracy J. Mol. Biol. 1993; 232: 584-99.
39.
Chiang B-L, Bearer E, Ansari A, Dorshkind K, Gershwin M. The βm12 mutation
and autoantibodies to ds DNA in NZB.H-2βm12 mice. J. Immunol. 1990;145:94-101
40.
Lane P, McConnell, Schieven G, Clark E, Ledbetter J. The role of class II molecules
in human B-cell activation. J. Immunol. 1990; 144:3684-92
41.
Kaye J, Janeway C.J. The Fab fragment of a directly activating monoclonal antibody
that precipitates a disulfide linked heterodimer from a helper T cell clone blocks
activation by either allogenic Ia or antigen and self-Ia. J. Exp. Med. 1984;159:13971412
42.
Koulova L, Clark EA, Shu G, Dupont B. The CD28 ligand B7/BB1 provides
costimulatory signal for alloactivation of CD4+ T cells. J-Exp-Med. 1991;173: 759-62
ΠΕΡΙΛΗΨΗ
Οι
αυτοάνοσες
ρευματικές
παθήσεις
συσχετίζονται
με
μια
ποικιλία
αυτοαντισωμάτων κατά κυτταροπλασματικών ή πυρηνικών συστατικών. Μεταξύ
αυτών βρίσκεται το Ro/RNP, ένα σύμπλοκο πρωτεΐνης-RNA που αποτελείται
από πρωτεΐνες μη ομοιοπολικά συνδεδεμένες με μια οικογένεια μικρών
κυτταροπλασματικών RNAs τα οποία ονομάζονται hY1, hY3, hY4 και hY5
RNAs. Το πρωτεϊνικό μέρος του Ro RNP περιλαμβάνει τουλάχιστον τρεις
ανοσολογικά διακριτές πρωτεΐνες, τις 60kD Ro/SSA, 52-kD Ro/SSA και τη
La/SSB. Πρόσφατα δείχθηκε ότι η καλρετικουλίνη, μια πρωτεΐνη που δεσμεύει
ασβέστιο, αποτελεί μέλος του ίδιου ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου. Το
σύμπλοκο Ro RNP ανευρίσκεται φυσιολογικά σε μια ποικιλία ζωικών ειδών και
τύπων κυττάρων αλλά άγνωστη παραμένει η βιολογική του λειτουργία. Από
κλινική σκοπιά κυκλοφορούντα αντισώματα κατά της Ro60kD ανιχνεύονται
συχνά
σε
ορούς
ασθενών
με
Σύνδρομο
Sjogren
(ΣΣ),
Συστηματικό
Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ) και Ρευματοειδή Αρθρίτιδα (ΡΑ) και η παρουσία
των αυτοαντισωμάτων αντί-Ro60kD συσχετίζονται ισχυρά με την παθογένεση
του νεογνικού λύκου του συγγενούς εμφράγματος του μυοκαρδίου και του
υποξύ
δερματικού
λύκου.
Τα
αντί-Ro60kD
αυτοαντισώματα
επίσης
συσχετίζονται με την παρουσία ορισμένων απλοτύπων HLA και ειδικά με τους
HLA-DR3 και HLA-DRw53.
Τα αντισώματα κατά του Ro RNP κατευθύνονται κυρίως κατά των πρωτεϊνικών
συστατικών του συμπλόκου αλλά οι αντιγονικοί τους καθοριστές (επίτοποι των Β
λεμφοκυττάρων) δεν έχουν επαρκώς κατανοηθεί. Οι Lieu και συν βασίστηκαν σε
μελέτες με συνθετικά πεπτίδια και ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες και πρότειναν ότι ο
στόχος των αυτοαντισωμάτων αντί-Ro60kD είναι ένας επίτοπος στο αμινοτελικό άκρο
του αυτοαντιγόνου καλρετικουλίνη, το οποίο εμφανίστηκε στην SDS/PAGE να κατέχει
μοριακή μάζα 60kD και θεωρήθηκε αρχικά ότι είναι η πρωτεΐνη 60kD Ro/SSA. Ωστόσο
πιο πρόσφατα αποτελέσματα των Rokeash και συν υπέδειξαν ότι τα αυτοαντισώματα
αντί-καλρετικουλίνης αποτελούν ένα διακριτό – από τα αντί-Ro60kD – υποπληθυσμό
αυτοαντισωμάτων. Οι Scofield και συν, χρησιμοποιώντας πρωτεολυτική πέψη και
συνθετικά πεπτιδικά ανάλογα της αυθεντικής Ro60kD πρωτεΐνης προσδιόρισαν τον
κύριο αντιγονικό καθοριστή του αυτοαντιγόνου Ro60kD στη καρβοξυτελική του
αλληλουχία 485-492 (EYRKKMDI). Αυτή η αντιγονική περιοχή κατέχει ομολογία
αλληλουχίας με το τμήμα EYRKKLMD της νουκλεοκαψιδικής (Ν) πρωτεΐνης του ιού
της φυσαλιδώδους στοματίτιδας (VSV) και προτάθηκε ότι η αντί-Ro/SSA απόκριση
σχετίζεται με την ανοσολογική επεξεργασία της Ν πρωτεΐνης του VSV. Οι
παρατηρήσεις αυτές βρίσκονται σε διαφωνία με μελέτες από άλλα εργαστήρια, οι
οποίες έδειξαν ότι τα αντισώματα αντί-Ro60kD κατευθύνονται κυρίως κατά του
κεντρικού μέρους της πρωτεΐνης
Ro60kD. Με σκοπό να ελέγξουμε αυτά τα
αλληλοσυγκρουόμενα αποτελέσματα και να προσδιορίσουμε τη ακριβή εντόπιση των
επιτόπων των αντί-Ro60kD αυτοαντισωμάτων, συνθέσαμε πεπτιδικά ανάλογα του
αμινοτελικού επιτόπου της καλρετικουλίνης, της ομόλογης με το VSV περιοχής της
πρωτεΐνης Ro60kD και πραγματοποιήσαμε λεπτομερή αντιγονική χαρτογράφηση των
επιτόπων
του
αυτοαντιγόνου
Ro60kD
με
αλληλοεπικαλυπτόμενων συνθετικών πεπτιδίων.
τη
χρήση
μεγάλων
(22-μερών)
Τα δύο συνθετικά πεπτίδια που αντιστοιχούν στις αλληλουχίες 1-24 και 7-24 της
καλρετικουλίνης αντέδρασαν με αυτοάνοσους ορούς ασθενών με ΣΕΛ, ΣΣ, ΡΑ και
Μικτή Νόσο του Συνδετικού Ιστού (ΜΝΣΙ) διαφόρων ειδικοτήτων αυτοαντισωμάτων
όπως αντί-Ro/SSA, αντί-Ro/SSA + αντί-La/SSB, αντί-nRNP και αντί-Sm. Τα
αποτελέσματα αυτά δηλώνουν ότι τα αυτοαντισώματα αντί-καλρετικουλίνης αποτελούν
ένα διαφορετικό από τα αντί-Rο60kD υποπληθυσμό αυτοαντισωμάτων ο οποίος δεν
παρουσιάζει ειδικότητα νόσου. Τα αποτελέσματα μας επίσης συμφωνούν με τις
παρατηρήσεις άλλων εργαστηρίων για την παρουσία των αντισωμάτων αντίκαλρετικουλίνης σε αυτοάνοσους ορούς.
Το σχετιζόμενο με τον ιό της φυσαλιδώδους στοματίτιδας πεπτίδιο EYRKKMDI
(8p) του αυτοαντιγόνου Ro60kD (αλληλουχία αμινοξέων 485-492) συντέθηκε σύμφωνα
με την τεχνική του Merrifield και εξετάσθηκε με ορούς ασθενών με ΣΕΛ, ΣΣ και ΡΑ. Η
συμφωνία μεταξύ της ELISA αντί-8p και της ανοσοαποτύπωσης αντί-Ro60kD ήταν
χαμηλή (x2=0,71, p=0,4) σε αντίθεση με την ELISA αντί-Ro60kD και την
ανοσοαποτύπωση αντί-Ro60kD (x2=27,6, p=10-7). Ωστόσο υπήρξε συσχέτιση μεταξύ
της δραστικότητας αντί-8p και αντί-Ro60kD στην περίπτωση ενός ΣΕΛ ορού, ο οποίος
έδωσε ισχυρά θετική αντίδραση τόσο στην αντί-8p όσο και στην αντί-Ro60kD ELISA.
Διαβίβαση κεκαθαρμένης IgG από τον ορό αυτό διαμέσου στήλης 8p-sepharose
οδήγησε σε εξάλειψη της δραστικότητας αντί-8p, ενώ η δραστικότητα αντί-Ro60kD
παρέμεινε. Πειράματα αναστολής έδειξαν ότι η προεπώαση των αντισωμάτων αντί-8p
με το αντιγόνο Ro οδηγεί σε σημαντική αναστολή τόσο της αντί-Ro όσο και της αντί-8p
δραστικότητας τους. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι τα αντισώματα αντί-8p
αποτελούν ένα μικρό μόνο μέρος των αντισωμάτων αντί-Ro60kD και ότι ο VSV δεν
μπορεί να είναι υπεύθυνος για τα αυτοαντισώματα αντί-Ro60kD και τις αυτοάνοσες
παθήσεις.
Τα παραπάνω αποτελέσματα δεν δίνουν σαφή εικόνα για την εντόπιση των
περιοχών που στοχεύουν τα αντί-Ro60kD αντισώματα πάνω στο μόριο Ro60kD.
Κάποιες μελέτες υπέδειξαν ότι η αντί-Ro60kD απόκριση κατευθύνεται ενάντια στο
κεντρικό τμήμα του μορίου χωρίς όμως να προσδιορίζεται η ακριβής θέση των
επιτόπων. Για να προσδιορίσουμε τους επιτόπους του αυτοαντιγόνου Ro60kD
πραγματοποιήσαμε λεπτομερή αντιγονική χαρτογράφηση χρησιμοποιώντας 22-μερή
συνθετικά πεπτίδια, αλληλοεπικαλυπτόμενα κατά οκτώ αμινοξέα, που κάλυπταν την
πλήρη αλληλουχία της πρωτεΐνης Ro60kD. Εκτιμήθηκαν τρεις ομάδες ορών, ανάλογα
με την ειδικότητα των αυτοαντισωμάτων τους. Η πρώτη ομάδα αποτελούνταν από
μονοειδικούς αντί-Ro/SSA ορούς από τέσσερις ασθενείς με ΣΕΛ και ένα με ΣΣ, η
δεύτερη συντέθηκε από αντί-Ro 60kD + αντί-La(SSB) θετικούς ορούς από τέσσερις
ασθενείς με ΣΣ και η τρίτη ομάδα περιλάμβανε τρεις φυσιολογικούς ορούς και ένα
αντί-Ro 52kD ορό. Βρέθηκε ότι οι οροί των ασθενών με ΣΕΛ αλληλεπιδρούν με μια
κοινή αντιγονική περιοχή που κατέχει την αλληλουχία 169-190 της πρωτεΐνης Ro60kD.
Από την άλλη πλευρά, οροί ασθενών με ΣΣ αναγνωρίζουν το τμήμα 211-232 του
αυτοαντιγόνου αυτού. Προσδιορισμός του ελάχιστου απαιτούμενου πεπτιδικού μήκους
για τη βέλτιστη αναγνώριση από τα αντισώματα έδειξε ότι οι καθορισμένοι επίτοποι
μπορούν να περιοριστούν στις αλληλουχίες 175-184 και 216-232 αντίστοιχα. Τα
αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι το αυτοαντιγόνο Ro60kD το οποίο δεν
χαρακτηρίζεται από ειδικότητα για νόσο, περιέχει δύο διακριτούς επιτόπους στο
κεντρικό τμήμα του μορίου οι οποίοι αναγνωρίζονται ειδικά από ορούς ασθενών με
ΣΕΛ και ΣΣ. Επιπλέον, τα αντισώματα αντί-Ro/SSA στον ΣΕΛ (όπου συνήθως δεν
εμφανίζονται αντισώματα αντί-La/SSB) κατευθύνονται σε μια περιοχή, κοντά στο RNP
μοτίβο του Ro/SSA η οποία κατέχει απαραίτητα δομικά χαρακτηριστικά για το
σχηματισμό του συμπλόκου Ro/La RNP. Έτσι η χυμική απόκριση σε διαφορετικές
αυτοάνοσες παθήσεις φαίνεται να στοχεύει διαφορετικές μοριακές μορφές του
αντιγόνου Ro/SSA.
Μελετήθηκαν οι δομικές, μοριακές και αντιγονικές ιδιότητες των δυο κύριων
γραμμικών Β-λεμφοκυτταρικών επιτόπων του αυτοαντιγόνου Ro60kD με τη χρήση
συνθετικών πεπτιδικών αναλόγων και μεγάλου αριθμού ορών ασθενών με ΣΕΛ και ΣΣ.
Βρέθηκε ότι η αντί-Ro60kD δραστικότητα των δύο επιτόπων του Ro60kD είναι μάλλον
περιορισμένη (45% των ασθενών), παρόλο που η αρχική τους ειδικότητα για νόσο
παρέμεινε. Με δεδομένο ότι τα αντισώματα αντί-Ro60kD αναγνωρίζουν συχνότερα
διαμορφωτικούς επιτόπους, είναι πιθανό το υπόλοιπο της αντί-Ro60kD απόκρισης να
αναγνωρίζει μη γραμμικούς επιτόπους οι οποίοι δεν μπορούν να προσδιοριστούν με
την τεχνική
χαρτογράφησης επιτόπων με
συνθετικά
πεπτίδια.
Πειράματα
υποκατάστασης με αλανίνη στους επιτόπους του Ro60kD υπέδειξαν ότι τα αμινοξέα
που είναι κρίσιμα για τη δέσμευση αντισώματος (E223, L226, K227 και Y228) στον επίτοπο
211-232 βρίσκονται εντός του τμήματος 216-232, το οποίο καθορίστηκε σαν το ελάχιστο
απαιτούμενο πεπτιδικό μήκος για τη δέσμευση αντισώματος. Στην περίπτωση του
επιτόπου 169-190 του Ro60kD, τα αμινοξέα που είναι σημαντικά για την αναγνώριση
από το αντίσωμα (W177, S178, H179, K180 και L183) βρίσκονται εντός του περιορισμένου
επιτόπου ενώ τα αμινοξέα L185 και S186, τα οποία φαίνονται να παίζουν κάποιο ρόλο στη
δέσμευση του αντισώματος, δεν περιλαμβάνονται στο περιορισμένο μήκος (175-184).
Ο επίτοπος 175-184 κατέχει ομολογία αλληλουχίας με το τμήμα 60-69 της βαλυσίδας διαφόρων μορίων HLA. Ανάμεσα σε αυτά οι απλότυποι HLA-DR3 και HLADRw53 έχουν συσχετισθεί με την αντί-Ro/SSA απόκριση σε ασθενείς με ΣΕΛ.
Παρασκευάστηκαν και ελέγχθηκαν συνθετικά πεπτιδικά ανάλογα των αλληλουχιών
αυτών. Οι HLA-DR3 και HLA-DRw53 ομόλογες αλληλουχίες έδειξαν αντί-Ro60kD
δραστικότητα παρόμοια με τον επίτοπο 169-190 του Ro60kD, αντιδρώντας κύρια με
ορούς ασθενών με ΣΕΛ. Δομικές μελέτες με κυκλικό διχρωισμό αποκάλυψαν ότι ο
επίτοπος 211-232 του Ro60kD εμφανίζει χαρακτηριστικά έλικας ενώ ο επίτοπος 169190 και το ομόλογο πεπτίδιο του HLA-DR3 κατείχαν μια δομή β-στροφής και
χαμηλότερα ποσοστά α-έλικας. Η μοριακή μίμιση μεταξύ της β-αλυσίδας του HLA-DR
και του Ro60kD που παρουσιάστηκε στη μελέτη μας μπορεί να έχει παθογενετικό
χαρακτήρα, αφού τα ομόλογα τμήματα στα HLA-DR μόρια βρίσκονται σε άκρως
εκτεθειμένες περιοχές της τριτοταγούς δομής των HLA και αντισώματα που στοχεύουν
τέτοιές περιοχές μπορούν να ενεργοποιήσουν Β-λεμφοκύτταρα, μακροφάγα ή Τλεμφοκύτταρα μέσω γεφύρωσης και διμερισμού των μορίων MHC (HLA), δρώντας με
τον ίδιο τρόπο με ορισμένα υπεραντιγόνα.
Παρόλο που η διαγνωστική αξία των συνθετικών πεπτιδικών αναλόγων των
επιτόπων που αναφέρθηκαν φαίνεται να είναι μάλλον περιορισμένη, ο συνδυασμός
τους με άλλους επιτόπους του RoRNP (των La/SSB, Ro52kD) μπορεί να είναι
διαγνωστικά συμπληρωματικός και να αποβεί πολύτιμος στη κλινική πράξη. Τέλος, η
μοριακή ομοιότητα μεταξύ του Ro60kD και των HLA-DR, προσφέρει ένα έναυσμα για
περαιτέρω έρευνα σχετικά με τον ρόλο που διαδραματίζουν οι σχετιζόμενοι με την
αντί-Ro/SSA απόκριση απλότυποι των HLA στη γένεση της αυτοανοσίας.
SUMMARY
Systemic
autoimmune
diseases are
often associated with a
variety
of
autoantibodies directed against cytoplasmic or nuclear components. Among
them the Ro RNP, an RNA-protein complex is composed of proteins noncovalently associated with a family of small cytoplasmic RNAs called hY1, hY3,
hY4 and hY5 RNAs. The protein component of Ro RNP consists of at least
three immunologically distinct proteins, namely: 60-kD Ro/SSA, 52-kD Ro/SSA
and La/SSB protein. Recently, it was shown that calreticulin, a calcium binding
protein, belongs to the same ribonucleoprotein complex. The Ro RNP complex
is present in a variety of vertebrate species and cell types but its biological
function(s) remain unknown. On clinical grounds circulating antibodies directed
against the Ro 60kD are often detected on sera from patients with Sjogren
Syndrome (SS), Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and Rheumatoid Arthritis
(RA) and the presence of anti-Ro 60kD autoantibodies is strongly associated
with the pathogenesis of neonatal lupus, complete congenital heart block and
subacute cutaneous lupus. Anti-Ro 60kD autoantibodies are also associated with
the presence of certain HLA haplotypes, especially with HLA-DR3 and HLADRw53.
Antibodies to Ro RNP are primarily directed against the protein components of
Ro RNP, although the exact antigenic determinants (B cell epitopes) are not
well understood. Lieu et al based on studies with synthetic peptides and
recombinant proteins, proposed that anti-Ro 60kD autoantibodies targets a
major epitope located
in the amino terminal sequence of the autoantigen
calreticulin which was found to migrate in SDS/PAGE with an apparent
molecular mass of 60kD and originally thought to be the 60-kD Ro/SSA protein.
However more recent results of Rokeash et al suggested that anti-calreticulin
autoantibodies consist a distinct – from antiRo 60kD – subpopulation of
autoantibodies. Scofield et al, using proteolytic digestion and synthetic peptide
analogues of the authentic Ro 60kD protein, proposed that the major antigenic
determinant of the Ro60kD autoantigen is
located in its carboxy terminal
sequence 485-492 (EYRKKMDI). This antigenic region possessed sequence
similarity with the EYRKKLMD segment of the nucleocapsid (N) protein of
vesicular stomatitis virus (VSV) and it supported that the response to Ro/SSA is
related to the autoimmune processing of the N protein of VSV. These
observations are in disagreement with studies from other laboratories which
showed that the anti-Ro60kD antibodies are primarily directed against the
central part of the Ro60kD protein. In order to examine these conflicting results
and to identify the exact location of the anti-Ro60kD epitopes we synthesized
peptide analogues corresponding to the amino terminal epitope of calreticulin,
to VSV homologous region of Ro60kD protein and using large (22-mer)
overlapping synthetic peptides an extensive epitope mapping of the Ro60kD
autoantigen, was performed.
The two synthetic peptides which prepared to correspond to the 1-24 and
7-24 amino acid sequence of calreticulin were found to react with autoimmune
sera from patients with SLE, SS, RA and Mixed Connective Tissue Disease
(MCTD) with different autoantibody specificities such as anti-Ro/SSA, antiRo/SSA + anti-La/SSB, anti-nRNP and anti-Sm. These results suggest that anticalreticulin
consist
a
different
from
anti-Ro
60kD
subpopulation
of
autoantibodies which is not restricted to any disease specificity. Our results also
argue in favour with observations of other laboratories for the existence of anticalreticulin antibodies in autoimmune sera.
The EYRKKMDI (8p) vesicular stomatitis virus – related peptide of
Ro60kD autoantigen (amino acid sequence 485-492) was synthesized according
to Merrifield’s method and tested with sera from patients with SLE, SS and RA.
The concordance between anti-8p ELISA and anti-Ro60kD immunoblot was very
poor (x 2 =0.71, p=0.4) in contrast to anti-Ro60kD ELISA and anti-Ro60kD
immunoblot (x 2 =27.6, p=10 -7 ). However correlation between anti-8p and antiRo60kD activity was observed in the case of one SLE serum, which gave strong
positive reaction for both anti-8p anti-Ro60kD ELISA. Purified IgG from the
reported serum, which passed through an 8p-sepharose column, resulted in
depletion of the anti-8p reactivity, while the anti-Ro60kD reactivity was
maintained. Inhibition experiments showed that preincubation of anti-8p
antibodies with Ro antigen resulted in considerable inhibition of both anti-Ro
and anti-8p reactivity. These results indicate that the anti-8p antibodies account
only for a minority of the anti-Ro60kD autoantibodies and that VSV cannot be
itself responsible for anti-Ro60kD autoantibodies and autoimmune diseases.
From the above results and previous studies from others, the location of
anti-Ro60kD antigenic determinants on Ro60kD molecule is not clear. Some
studies suggested that the anti-Ro60kD response is primarily directed against
the central part of the molecule but the exact location of the epitopes was not
identified. In order to identify the linear epitopes on Ro60kD autoantigen, we
performed a detailed epitope mapping using 22-mer synthetic peptides,
overlapping by eight residues, covering the entire sequence of Ro60kD protein.
Three groups of sera were evaluated according to their autoantibody specificites.
The first group consisted of monospecific anti Ro60KD sera from four patients
with SLE and one with SS, the second one was composed of anti-Ro60KD+antiLa(SSB)-positive sera from four patients with SS and the third group included
three normal sera and one anti Ro52KD serum. It was found that sera from SLE
patients interact with a common antigenic site spanning the sequence 169-190 of
the Ro60KD protein. On the other hand, sera from SS patients recognise the
211-232 region of this autoantigen. Determination of the minimal required
peptide length for optimal antibody recognition showed that the defined
epitopes can be shortened to the 175-184 and 216-232 sequences respectively.
These results indicate that the Ro60KD autoantigen, which is not characterized
by disease specificity, contains two discrete epitopes in the central part of the
molecule specifically recognized from SLE and SS patient sera. Furthermore,
anti-Ro/SSA antibodies in SLE (where anti-La/SSB antibodies are not usually
observed) are directed to a region, near the RNP-motif, which possesses
structural characteristics essential for the formation of the Ro/La-RNP particle.
It appears, therefore, that humoral response in different autoimmune diseases
might target different molecular forms of the Ro/SSA 60kD antigen.
The structural, molecular and antigenic properties of the two major
linear B-cell epitopes of the Ro60kD autoantigen were studied using synthetic
peptide analogues and a large panel of SLE and pSS patient sera. It was found
that the anti-Ro60kD reactivity of both Ro60kD epitopes is rather limited
(45%), although they retain their original disease specificity. Given that antiRo60kD antibodies are more frequently directed against conformational
epitopes, it is possible that the remainder of anti-Ro60kD activity is directed
towards discontinuous epitopes which could not be identified by the synthetic
peptide epitope mapping approach. Alanine substitutions experiments of the
Ro60kD epitopes showed that the residues crucial for antibody binding of the
211-232 Ro60kD epitope (E 223 , L226 , K 227 and Y228 ) are within the 216-232 region,
which was identified as the minimal required peptide length for optimal antibody
recognition. In the case of the 169-190 Ro60kD epitope, residues significant for
the antibody recognition (W 177 , S 178 , H 179 , K 180 and L183 ) are within the restricted
epitope while residues L185 and S 186 , which seem to play a role in the binding, are
not included in the restricted length (175-184).
The epitope 175-184 possesed sequence similarity with 60-69 region in bchain of different HLA molecules. Among them the HLA-DR3 and HLADRw53 haplotypes are associated with the anti-Ro/SSA response in patients with
SLE. Synthetic peptide analogues of these sequences were prepared and tested.
The HLA-DR3 and HLA-DRw53 homologous sequences showed anti-Ro60kD
reactivity similar to that of the 169-190 epitope, recognized mainly by SLE sera.
Structural studies with Circular Dichroism (CD) showed that the 211-232
Ro60kD epitope exhibits pronounced helical characteristics while the 169-190
epitope and the HLA-DR3 homologous peptide possess a b-folded structure and
a lower percentage of a-helix. The molecular mimicry between HLA-DR b-Chain
and Ro60kD presented in our study may have pathogenic potential since the
homologous HLA-DR regions are highly exposed in HLA tertiary structure and
antibodies against them can activate B-cells, macrophages or T-cells through
cross-linking and dimerization of the MHC (HLA) molecules, acting in the same
way as some superantigens.
Although the diagnostic value of the reported Ro60kD synthetic peptide
epitope analogues seems to be rather limited, combination with other Ro RNP
epitopes (of La/SSB, Ro52kD) may proved complementary to each other and
valuable in clinical use. Finally, the molecular similarity between Ro60kD and
HLA-DR, may offer an initiative in further investigation of the role of the HLA
haplotypes, associated with the anti-Ro/SSA response, in autoimmune stimulus.

πλήρες βιογραφικό - JG Routsias Laboratory

DEP-Y.pdf 0.6 MB

Τα αντι- κιτρουλλινικά αντισώματα (αντι-CCP) στη

Ερευνητικό Υπόμνημα

Ερωτήσεις με απαντήσεις 8ου Κεφαλαίου

Ανοσοϊστοχηµεία-Ανοσοφθορισµός