Ess. Deriv. Agr., 75, 83-94 (2005).

ESSENZE DERIVATI AGRUMARI
Ess. Deriv. Agr., 75, 83-94 (2005)
Pubblicato dalla Stazione Sperimentale per l’Industria delle Essenze e dei Derivati dagli Agrumi (www.ssea.it)
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Sintesi di limonoidi appartenenti al pathway biosintetico
della limonina e dei 7-acetilati
Castrese Esposito*, Luigi De Masi, Bruna Laratta, Rosa Linda Tridente, Domenico Castaldo
Stazione Sperimentale per le Industrie delle Essenze e dei Derivati dagli Agrumi (SSEA), Via Gen. Tommasini, 2 - 89127 Reggio Calabria, Italy
RIASSUNTO
ABSTRACT
Sono stati sintetizzati sei limonoidi, commercialmente non disponibili,
appartenenti ai pathways biosintetici della limonina e dei 7-acetilati
mediante semplici procedure. In particolare dalla limonina sono stati preparati il limonolo e il limonil acetato e dalla nomilina l'obacunone, il 7obacunolo, il 7-obacunil acetato e la deacetilnomilina. I prodotti ottenuti sono stati purificati e caratterizzati mediante cromatografia su strato
sottile (TLC), cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e spettroscopia di massa con elettrospray (ESI - MS). In questo lavoro abbiamo
dimostrato che i sei limonoidi di sintesi vengono facilmente preparati con
buone rese.
By simple procedures six limonoids, commercially not available, belonging to the biosynthetic pathways of the limonin and of the 7-acetate
were synthetized. In particular limonol and limonyl acetate were prepared from limonin and obacunone, 7-obacunol, 7-obacunyl acetate and
deacetylnomilin were generated from the nomilin we have prepared. The
products were purified and characterized by thin layer chromatography
(TLC), high pressure liquid chromatography (HPLC) and electrospray
mass spectroscopy (ESI - MS). In this work we demonstrated that these
six synthetic limonoids are quickly obtained by simple and fast method
with good yields of reaction.
Parole chiave: limonina, limonolo, limonil acetato, nomilina, obacunone, 7-obacunolo, 7-obacunil acetato, deacetilnomilina, sintesi
keywords: limonin, limonol, limonyl acetate, obacunone, 7-obacunol,
7-obacunyl acetate, deacetylnomilin
INTRODUZIONE
al., 2001, Miller et al., 2004;). Non sorprende, pertanto, che queste sostanze siano oggetto di un forte
interesse applicativo sia dell'industria farmaceutica
che di quella agroalimentare (Ozaki et al., 1995).
I succhi di frutta ed in modo particolare quelli derivati dagli agrumi, sono stati per anni associati da un
punto di vista salutistico, alla discreta presenza di
vitamina C e solo recentemente il consumo di questi
prodotti è stato accomunato alla naturale presenza di
alcuni "phytochemical" quali carotenoidi, flavonoidi
e limonoidi che hanno importanti effetti sulla salute
umana (Nijveldt et al., 2001; Jung et al., 2003;
Balestrieri et al., 2003; Poulose et al., 2005; Berhow
et al., 2000).
In particolare, i glucosidi dei limonoidi (LG) sono
metaboliti secondari presenti in tutti i tessuti degli
agrumi con livelli di concentrazione di circa 500
µg/mL nei succhi e fino ad un massimo di circa 2 g/L
nei sottoprodotti della lavorazione degli agrumi; in
questo modo, è stato stimato che circa 15.000 tonnel-
I limonoidi, da un punto di vista chimico, sono triterpenoidi altamente ossigenati, presenti nelle
Rutaceae e nelle Meliaceae; essi si ritrovano sia in
forma glicosilata (Limonoidi Glucosidi) che privi di
qualsiasi glicosilazione (Limonoidi Agliconi). I limonoidi glucosidici sono tutti solubili in acqua e da un
punto di vista organolettico per lo più privi di sapore,
mentre i limonoidi agliconici sono scarsamente solubili in acqua e generalmente molto amari.
In tabella 1, sono schematicamente riportati i 17
limonoidi glucosidici e i 36 limonoidi agliconici isolati e caratterizzati nelle specie appartenenti al genere Citrus (Hasegawa e Miyake, 1996).
Recenti studi hanno evidenziato che i limonoidi
possiedono un ampio spettro di proprietà con riconosciute attività farmacologiche nel campo degli antivirali, degli antimicetici, degli antibatterici, degli antimalarici ma soprattutto come antineoplastici (Tian et
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C.ESPOSITO ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 75, 83-94 (2005)
Tabella 1- Classificazione biosintetica di limonoidi in Citrus.
LIMONOIDI AGLICONICI
Gruppo della limonina
Limonina, nomilina, obacunone, deacetilnomilina, ichangina, deossilimonina, citrusina, limonolo, 7a-obacunolo, deossilimonolo, acido
nomilinico, acido deacetilnomilinico, acido obacunonico, acido deossilimonico, acido isoobacunonico, acido epi-isoobacunonico, acido
isolimonico, acido 19-idrossideacetilnomilinico, acido isoobacunonico diosfenol e 17-deidrolimonoic A-ring lattone.
Gruppo della calaminaCalamina,
retrocalamina, ciclocalamina, isociclocalamina, metil isoobacunoato diosfenol, 6-cheto-7b-nomilolo, 6-cheto-7b-deacetilnomilolo, metil
deacetilnomilinoato, acido calaminico, acido retrocalaminico e acido ciclocalaminico
Gruppo Ichangensina
Ichangensina
Gruppo dei limonoidi 7-Acetilati
Limonil acetato, 7a-obacunil acetato, 1-(10-19)abeo-obacun-9(11)-en-7a-yl acetato e l'acido 1-(10-19)abeo-7a-acetossi-10b-idrossiisoobacunonico 3,10-lattone
LIMONOIDI GLUCOSIDICI
Acidi Monocarbossilici 17-D-Glucopiranosidi di:
Limonina, nomilina, deacetilnomilina, obacunone, ichangina, ichangensina, calamina, 6-keto-7b-deacetilnomilinolo, metil deacetilnomilinoato
Acidi Dicarbossilici17-D-Glucopiranosidi di:
Acido nomilinico, acido deacetilnomilinico, acido obacunonico, acido trans-obacunonico, acido iso-obacunonico, acodo epi-isoobacunonico, acido isolimonico, acido 19-idrossideacetilnomilinico
late di limonoidi glucosidici sono recuperabili ed utilizzabili come "nutraceuticals" od anche come
sostanze di "fortificazione" per alimenti diretti a
migliorare la salute umana e/o la nutrizione (Manners
et al., 2003); di contro, i limonoidi agliconici, come
riportato da Alford and Murray (2000) e da
Hasegawa et al. (1984), sono pesticidi naturali.
Nell'industria agrumaria è noto che la limonina
dilattone (figura 1) è la principale responsabile del
sapore amaro degli agrumi. Questa sostanza è stata la
prima tra i triterpenoidi ad essere identificata
(Bernay, 1841) e successivamente isolata dalle arance "Navel" (Higby, 1938). Essa naturalmente è presente nell'albedo, nelle pellicole e nei semi dei frutti,
mentre nelle vescicole contenenti il succo è presente
come precursore non amaro, il limonoato A-ring lattone (LARL) che viene convertito gradualmente a
limonina dilattone (dal classico "sapore amaro")
durante il processo di estrazione del succo (figura 2
sez. A) dall'azione dell'enzima limonoid D-ring lattone idrolase (Fong et al., 1992) a valori di pH inferiori a 6,5. Tale fenomeno è noto come "amaro differito", in quanto richiede un certo tempo successivo
all'estrazione del succo per manifestarsi, e sensorialmente la percezione dell'amaro si manifesta quando il
contenuto in limonina dilattone è generalmente superiore ai 6 ppm (Guadagni et al., 1973 e 1974). Nei
succhi di arance italiane, ed in particolare in quelli a
polpa pigmentata, come riportato da Trifirò et al.
(1984), il livello di limonina risulta in media inferiore a 5-6 ppm. Di contro, "inopportune" pratiche di
estrazione e/o anche di miscelazione con succhi di
seconda spremitura, tendono ad incrementare notevolmente questo parametro fino a valori spesso superiori ai 25 ppm (Safina, 1984).
Recentemente, la comprensione del pathway biosintetico dei limonoidi, di estremo interesse per le
Figura 1- Limonina dilattone
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Figura 2- Pathway biosintetico del gruppo Limonina
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applicazioni tecnologiche e/o biotecnologiche, è stata
rivista da Hasegawa et al. (1992, 2000 a). Da queste
ricerche è emerso che le specie vegetali appartenenti
al genere Citrus contengono solo limonoidi facenti
parte del gruppo della limonina e che i principali
componenti sono la limonina, la nomilina, l'obacunone e la deacetilnomilina.
L'acido deacetilnomilinico e l'acido nomilinico
sono i due acidi limonoidici maggiormente presenti
negli agrumi. L'acido deacetilnomilinico, risulta essere con molta probabilità il precursore iniziale di tutti
i limonoidi presenti in Citrus; Hasegawa e Herman
(1986) hanno infatti evidenziato che, nelle foglie di
Citrus limon, l'acido deacetilnomilinico è convertito
a nomilina, probabilmente il precursore iniziale di
tutti i limonoidi conosciuti negli agrumi e che una
volta sintetizzato nelle foglie, viene trasportato nel
frutto e nei semi. Infatti nelle sedi tissutali di foglie e
frutti il contenuto di limonoidi aumenta durante la
maturazione e diminuisce successivamente a questo
stadio. Dato che la concentrazione di limonoidi totali
agliconici rimane invariata nei semi anche dopo lo
stadio di maturazione del frutto, questi agirebbero
come tessuto di stoccaggio per questi composti che
vengono successivamente convertiti a 17 - D glucopiranosidi, derivati non amari, come la limonina 17 
- D- glucopiranoside (LG) durante il processo di
maturazione (Hasegawa et al., 1997). Questo naturale processo di de-amarizzazione è catalizzato, come
riportato in figura 2 sez. b, dall'enzima limonoid glucosil transferasi (LGT) (Herman et al., 1991).
L'estremo interesse che questa classe di composti
suscita da parte delle aziende del settore agrumario ci
ha indotto ad avviare uno studio preliminare su questi promettenti metaboliti secondari.
Vista l'impossibilità di reperirli commercialmente,
lo scopo di questo lavoro è stato quello di mettere a
punto una serie di metodiche rapide per ottenere alcuni limonoidi a partire da limonina e nomilina, unici
due limonoidi disponibili commercialmente. In tal
modo sono stati sintetizzati sei limonoidi appartenenti al gruppo della limonina ed al gruppo dei 7-acetilati: l'obacunone, il limonolo, l'obacunolo, la 7-acetil limonina, il 7-acetil obacunone e la deacetilnomilina.
MATERIALI E METODI
Reagenti
Limonina, nomilina, piridina, anidride acetica, p-Ndimetil-amminobenzaldeide, etanolo e metanolo
sono stati acquistati dalla Sigma-Aldrich.
Acetonitrile, acetato di etile, diclorometano, cicloesano, carbonato di potassio ed acido acetico sono stati
acquistati dalla Carlo Erba reagenti.
Determinazione dei limonoidi: Analisi HPLC
Per l'analisi HPLC dei limonoidi è stato impiegato
un cromatografo liquido Surveyor (ThermoFinnigan)
equipaggiato con un detector UV/VIS regolato a 215
nm.
Per l'analisi, 5 L di campione erano iniettati in una
colonna RP-C18, 5 m, 250x4.6mm della
Phenomenex. L'analisi cromatografica veniva condotta in condizioni isocratiche impiegando una
miscela costituita da MeOH, H2O e Acetonitrile nel
rapporto (41:49:10, v/v/v) per 40 minuti ad un flusso
costante di 1 mL/minuto. Tra una corsa e quella successiva è stato necessario lasciare condizionare la
colonna cromatografica per un tempo non inferiore a
20 minuti.
Identificazione dei limonoidi: Analisi LC-MS
L'analisi LC-MS dei limonoidi è stata eseguita
impiegando uno spettrometro di massa LCQ
Advantage (ThermoQuest) equipaggiato con analizzatore quadrupolare a trappola ionica ed interfacciato
con una sorgente ortogonale ESI (electrospray ionization), operante in positive ion mode con scansione
da 50 a 2000 m/z.
Per l'analisi, un aliquota del campione (1-5 µL) era
disciolto con 20-100 µL di una miscela di acetonitrile contenente lo 0.05% di acido acetico; per l'introduzione diretta dei campioni nella sorgente ESI veniva
impiegato un sistema siringe - pump ad un flusso di 8
L/minuto.
Analisi TLC
Le analisi cromatografiche su strato sottile (TLC)
sono state eseguite impiegando lastrine di gel di silice 60 F256 di 17 cm di lunghezza e 4 cm di larghezza, acquistate dalla Merck.
I campioni, dopo deposizione, venivano eluiti e rilevati impiegando come mezzo di sviluppo il reagente
di Ehrlich (soluzione allo 0.5% p-N-dimetil-amminobenzaldeide in etanolo) in accordo a quanto riportato
da Dreyer (1965) ed esponendo le lastre cromatografiche successivamente in una camera di sviluppo
all'azione di HCl gassoso per 30 minuti, ottenuto
facendo reagire H2SO4 su NH4Cl. In questo modo, i
limonoidi vengono visualizzati selettivamente in
arancione.
Alternativamente, le lastrine possono essere sviluppate spruzzandole con una soluzione di acido solforico al 5% in etanolo e successivamente riscaldando la
lastra a 120°C in stufa in accordo a quanto riportato
da Chandler (1966); in questo modo tutti i composti
organici eventualmente presenti saranno visualizzati
con macchie di colore scuro.
Soluzioni Standard di Nomilina e Limonina
Per la preparazione della soluzione standard (stock)
di nomilina, 11.6 mg di questa sostanza, esattamente
pesati, vengono solubilizzati in acetonitrile fino ad un
volume finale di 2 mL.
Per quanto riguarda la preparazione della soluzione
standard (stock) di limonina dilattone, 5 mg esattamente pesati di questa sostanza vengono solubilizza-
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ti in acetonitrile fino ad un volume finale di 1 mL.
Entrambe le soluzioni stock erano conservate in congelatore a -18°C.
Metanolo anidro
L'anidrificazione del metanolo è stata ottenuta
mediante distillazione. In breve, in un pallone da 500
mL sono stati introdotti 100 mL di metanolo e riscaldati a 80°C su piastra riscaldante. Sono state raccolte
tre frazioni. La frazione di testa, pari a circa 10 mL
viene messa da parte e si raccoglie una seconda frazione utile, pari a circa 60 mL. La terza frazione raccolta è unita alla frazione di testa.
Sintesi dell'Obacunone: conversione della nomilina a obacunone
Conversione mediante anidride acetica e piridina
5 mg esattamente pesati di nomilina sono disciolti
con 500 L di piridina e 500 L di anidride acetica in
un pallone da 5 mL. La soluzione cosi ottenuta è stata
riscaldata a 100°C in un bagno ad olio e lasciata sotto
agitazione per 3 ore. La conversione della nomilina
ad obacunone era monitorata, fino a completezza
della reazione, mediante TLC impiegando come
mezzo di eluizione acetato di etile/diclorometano
(2:3 v/v), come riportato da Hasegawa et al. (2000 b).
Dopo conversione, la miscela di reazione era portata a secco sotto flusso di azoto e il residuo veniva
ripreso con 1 mL di diclorometano e estratto per 3
volte con 1 mL di acqua. La fase organica era recuperata e evaporata fino a secchezza mediante rotavapor e al fine di eliminare le tracce residue di piridina
il campione veniva tenuto sotto pressione ridotta per
circa 3 ore. Infine, l'obacunone cosi ottenuto veniva
ripreso con 500 L di acetonitrile e successivamente
analizzato per HPLC in accordo a quanto descritto
nella sezione Materiali e Metodi.
Conversione mediante carbonato di potassio
A 2,5 mg di nomilina, esattamente pesati, vengono
addizionati 5 mL di una soluzione ottenuta solubilizzando 3 mg di carbonato di potassio (K2CO3) in 4 mL
di metanolo e 1 mL di acqua. La soluzione risultante
era lasciata sotto costante agitazione a temperatura
ambiente per un'ora e la reazione è monitorata
mediante TLC (impiegando come mezzo di eluizione
acetato di etile/diclorometano (2:3 v/v), Hasegawa et
al. (2000 b)) fino a completezza.
Successivamente, la miscela di reazione era portata
a secchezza mediante rotavapor e il residuo veniva
ripreso con 500 µL di diclorometano e estratto per 3
volte con 1 mL di acqua. La fase organica veniva
recuperata e portata a secchezza in rotovapor. Il residuo (obacunone) veniva infine ripreso con 500 L di
acetonitrile, analizzato in HPLC in accordo a quanto
riportato nella sezione Materiali e Metodi e conservato a + 4°C.
Preparazione
del
7-Limonolo
e
del
7-
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Obacunolo
A 60 L di una soluzione standard di limonina (v.
Materiali e Metodi) vengono addizionati 400 L di
diclorometano e 200 L di una soluzione alcolica
(preparata al momento) di boro idruro di sodio, ottenuta sciogliendo 3 mg di NaBH4 in 10 mL di metanolo anidro. La miscela di reazione veniva tenuta a 18°C per 24 ore e occasionalmente agitata. La reazione era monitorata mediante TLC (impiegando
come mezzo di eluizione acetato di etile/cicloesano
(3:2 v/v), Hasegawa et al. (2000 b)) fino a completezza. Successivamente, sulla miscela di reazione,
l'eccesso di boro idruro veniva eliminato addizionando acido acetico glaciale fino a scomparsa dell'effervescenza. La soluzione risultante veniva quindi portata a secchezza sotto flusso di azoto e il residuo
ripreso per tre volte con 1 mL di una miscela MeOH
/ AcOH (9:1 v/v) e successivamente per altre tre volte
con solo metanolo. Il residuo veniva ripreso con 500
µL di diclorometano e estratto per 3 volte con 1 mL
di acqua. Infine, la fase organica veniva recuperata e
portata a secchezza in rotovapor. Il residuo (limonolo) veniva quindi ripreso con 500 L di acetonitrile e
analizzato in HPLC-MS in accordo a quanto riportato nella sezione Materiali e Metodi e conservato a
+4°C.
In modo analogo è stato preparato il 7-obacunolo.
Preparazione dei 7-Acetil limonoidi
Ad 1 mg di limonolo, ottenuto in accordo a quanto
riportato in precedenza, vengono addizionati 250 L
di piridina e successivamente 500 L di anidride acetica. La miscela di reazione veniva lasciata sotto
costante agitazione a temperatura ambiente over
night e monitorata mediante TLC (impiegando come
mezzo di eluizione acetato di etile/cicloesano (3:2
v/v), Hasegawa et al. (2000 b)) fino a completezza
della reazione. Successivamente, la miscela di reazione era portata a secchezza mediante rotavapor e il
residuo veniva ripreso con 500 µL di diclorometano e
estratto per 3 volte con 1 mL di acqua. La fase organica, contenente il 7-acetil limonolo era quindi
recuperata e evaporata in rotavapor e al fine di eliminare le tracce residue di piridina il campione veniva
tenuto sotto pressione ridotta per circa 3 ore. Infine,
il campione veniva ripreso in 500 L di acetonitrile e
analizzato in HPLC in accordo a quanto riportato
nella sezione Materiali e Metodi.
La medesima procedura veniva impiegata per sintetizzare il 7-obacunolo acetato da obacunolo.
Preparazione della Deacetil nomilina
2,5 mg di nomilina, esattamente pesati, erano
miscelati con sodio metallico (circa 20 mg) e metanolo anidro e lasciati sotto agitazione a temperatura
ambiente per 2 ore. La reazione era monitorata
mediante TLC (impiegando come mezzo di eluizione
acetato di etile/diclorometano nel rapporto (2:3 v/v),
Hasegawa et al. (2000 b)). Successivamente, la deacetil nomilina prodottasi era recuperata in diclorome-
C. ESPOSITO ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 75, 83-94 (2005)
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Schema 1- Preparazione dell’Obacunone da nomilina impiegando piridina/anidride acetica e schematizzazione del processo di trans-eliminazione
tano, e dopo evaporazione in rotovapor risospesa in
500 L di acetonitrile e analizzato in HPLC e successivamente in LC-MS in accordo a quanto riportato
nella sezione Materiali e Metodi.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Sintesi dell'Obacunone da nomilina
In natura l'obacunone, come riportato da Herman e
Hasegawa (1985), si forma biosinteticamente a partire dalla nomilina mediante una reazione di trans-eliminazione del gruppo acetato. Da un punto di vista
strutturale, infatti, la nomilina, che è uno dei due
Figura 3- Conversione della nomilina in obacunone impieganndo piridina/anidride acetica: dopo 1 ora di reazione (linea tratteggiata) e dopo 2 ore (linea continua)
limonoidi commercialmente disponibili, differisce
dall'obacunone per la sola presenza in più di una
molecola di acido acetico sull'anello A lattonico (v.
schema 1). Sulla scorta di ciò, per la sintesi dell'obacunone sono possibili almeno due differenti procedure.
La prima (v. schema 1), ha previsto l'impiego di anidride acetica in piridina alla temperatura di 100°C e
per un tempo di reazione di 3 ore in accordo a quanto descritto nella sezione "conversione mediante anidride acetica e piridina" di Materiali e Metodi.
Nelle condizioni adottate, è stato osservato innanzitutto che la reazione procede attraverso un processo
di trans-eliminazione (schema 1), analogo a quello
descritto da Dreyer (1965) studiando la struttura della
deacetilnomilina, e con una totale conversione della
nomilina ad obacunone. Tuttavia la reazione procedeva molto lentamente, come è possibile rilevare dal
cromatogramma di figura 3. E' stato comunque indispensabile monitorare la reazione di conversione
mediante TLC.
La seconda via alternativa per la formazione dell'obacunone prevedeva il trattamento della nomilina
con carbonato di potassio in metanolo/acqua a temperatura ambiente per un'ora, come riportato nella
sezione di Materiali e Metodi (schema 2).
In queste condizioni, in accordo a quanto riportato
da Plattner et al. (1972), avremmo dovuto osservare
una semplice rimozione del gruppo acetilico in posizione 3, con formazione della deacetilnomilina (v.
schema 2), dato che queste condizioni vengono per lo
più impiegate per la rimozione selettiva di gruppi
acetilici da molecole organiche. Inaspettatamente,
invece nel nostro caso abbiamo osservato non una
semplice rimozione del gruppo acetilico ma un vero
e proprio processo di trans-eliminazione con formazione diretta dell'obacunone. Peraltro, la reazione
procede rapidamente e come riportato in figura 4 con
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Schema 2 - Preparazione dell’Obacunone da nomilina impiegando carbonato di potassio in metanolo/acqua.
una totale conversione della nomilina ad obacunone.
Da un rapido confronto delle due procedure di for-
Figura 4 - Conversione della Nomilina in Obacunone, dopo
un’ora di reazione impiegando carbonato di potassio in metanolo/acqua.
mazione dell'obacunone si può facilmente desumere
che tra i due processi è da preferirsi sicuramente quest'ultimo. Con tale procedura, infatti, si hanno notevoli vantaggi sia dal punto di vista operativo sia per
la velocità di esecuzione.
Sintesi della Deacetilnomilina a partire da nomilina
Come riportato in figura 2, la deacetilnomilina è un
derivato biosintetico dell'acido deacetilnomilinico,
quest'ultimo precursore di tutti i limonoidi nel genere
Citrus.
Da un punto di vista strutturale la deacetilnomilina
differisce dalla nomilina solo per l'assenza di un
gruppo acetilico sul carbonio 3 del ciclo A lattonico
(schema 3).
Sulla base di queste considerazioni, abbiamo verificato la possibilità di una conversione diretta della
nomilina in deacetilnomilina impiegando una de-Oacetilazione di tipo Zemplen (Plattner et al., 1972).
Questa reazione è stata effettuata facendo reagire
metilato di sodio in metanolo a temperatura ambiente su nomilina in accordo a quanto riportato nella
sezione Materiali e metodi. Il vantaggio di questa
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C. ESPOSITO ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 75, 83-94 (2005)
Schema 3 - Conversione della Nomilina a Deacetilnomilina.
procedura è quella di risultare veloce e quantitativa. I
risultati ottenuti hanno confermato la formazione
della deacetilnomilina, come evidenziato dal picco a
m/z 473 corrispondente allo ione [MH]+ (figura 5)
dello spettro di massa, e che la reazione adottata procede velocemente e quantitativamente.
Sintesi del 7-Limonolo e del 7-Obacunolo
rispettivamente da limonina e obacunone
Il limonolo è un triterpenoide minore strutturalmente correlato alla limonina. Rispetto a quest'ultima, l'unica differenza è rappresentata dallo stato di ossidazione del carbonio in posizione 7 nell'anello B (sche-
ma 4). Nella limonina tale carbonio risulta essere
ossidato a chetone mentre nel limonolo è ridotto a
gruppo alcolico. Per la sua preparazione è apparso,
pertanto, conveniente partire da limonina e sintetizzare il limonolo attraverso una specifica reazione di
riduzione. La reazione di riduzione ha richiesto una
particolare attenzione nelle condizioni da impiegare,
bisogna infatti considerare che nella limonina sono
presenti due funzioni lattoniche, la prima presente
nell'anello A e la seconda presente nell'anello D v.
schema 4) che potrebbero a loro volta essere ridotte.
Ne deriva, di conseguenza, che la scelta dell'agente
riducente è fondamentale per l'ottimizzazione di que-
Figura 5- Spettro LC-MS Deacetilnomilina.
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Schema 4 - Formazione del 7-Limonolo da limonina
Schema 5 - Stereochimica del processo di riduzione della Limonina a 7-limonolo.
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Schema 6 - Riduzione chimica dell’Obacunone a 7-obacunolo.
Schema 7 - Acetilazione del 7-limonolo a 7-limonil acetato e del 7-obacunolo a 7-obacunolo acetato.
C. ESPOSITO ET AL. / Ess. Deriv. Agr., 75, 83-94 (2005)
sta reazione. Si è pensato quindi di utilizzare boro
idruro di sodio, in quanto questo riducente può consentire di instaurare un controllo cinetico sul processo. Infatti, altri riducenti quali il boro idruro di litio
(LiBH4) o l'alluminio idruro di litio (LiAlH4) risulterebbero molto più energici e pertanto meno selettivi.
Al fine di evitare la riduzione delle due funzioni lattoniche, il processo di riduzione è stato pertanto condotto con l'impiego di una temperatura inferiore allo
zero, in condizioni di elevata anidricità, e impiegando sodio boro idruro come riducente che risulta essere cineticamente meno “energico” in queste condizioni.
Per la preparazione del 7-limonolo si è quindi proceduto con la riduzione della limonina con sodio boro
idruro in diclorometano/metanolo anidro a -18°C in
accordo a quanto riportato nella sezione Materiali e
Metodi.
La reazione era monitorata mediante TLC, ed in
queste condizioni è stato ottenuto solo il 7-limonolo. L'epimero , infatti, non si forma a causa del differente ingombro sterico sulle due facce del gruppo
chetonico come mostrato nello schema 4.
La stereo-selettività di questa reazione si può facilmente spiegare se si considera la stereochimica del
processo di riduzione (schema 5). Bisogna innanzitutto considerare che nel processo di riduzione è
coinvolto tutto lo ione boro idruro e non solo lo ione
idruro. Inoltre, bisogna considerare che, data la planarità del gruppo carbonilico, l'attacco del gruppo
riducente può avvenire solo in direzione ortogonale
al piano contenente la funzione chetonica. Va anche
tenuto in considerazione che la faccia  dell'anello B
della limonina risulta ingombrata stericamente dalla
presenza di sostituenti, il gruppo metilico ed il ciclo
epossidico, rivolti appunto verso l'alto. Ciò fa si che
il gruppo chetonico possa essere attaccato dal boro
idruro solo dalla faccia , quella rivolta in basso.
Infine, per la preparazione del 7-obacunolo, a partire da obacunone, si è utilizzata la medesima strategia impiegata per la riduzione della limonina. Anche
in questo caso l'unico prodotto che si forma è l'epimero , e analogamente a quanto descritto in precedenza, la stereo-selettività del processo è dettata dal
differente ingombro sterico delle due facce dell'anello contenente la funzione chetonica (schema 6).
Entrambe le procedure sono risultate rapide e quantitative.
Sintesi della 7-Acetil limonina e del 7-Acetil
obacunone rispettivamente da 7-limonolo e dal
7-obacunolo
La 7-acetil limonina differisce dalla limonina per
la presenza di un gruppo acetilico sul carbonio 7 dell'anello B. Data la difficoltà di introdurre direttamente un gruppo acetilico su di una funzione chetonica,
abbiamo ritenuto utile utilizzare come substrato il
limonolo, ottenuto come descritto in precedenza, acetilando la funzione alcolica del limonolo (schema 7).
A tal fine abbiamo impiegato anidride acetica in piri-
93
dina a temperatura ambiente per 12 ore come descritto nella sezione Materiali e Metodi. La reazione di
acetilazione è stata monitorata mediante TLC ed è
risultata rapida e quantitativa. Infine, il 7-acetilato
dell'obacunone è stato preparato rapidamente a partire dal 7-obacunolo, con la medesima procedura
impiegata per la 7-acetil limonina.
Analoghi risultati possono essere ottenuti se la reazione di acetilazione viene condotta in un bagno ad
olio a 100°C; in questo caso, il tempo di acetilazione
può essere notevolmente diminuito fino a circa 15
minuti.
CONCLUSIONI
Sulla base di semplici correlazioni strutturali sono
stati sintetizzati sei limonoidi. E' stato possibile convertire la nomilina in deacetilnomilina e obacunone,
la limonina in limonolo, l'obacunone in 7-obacunoBIBLIOGRAFIA
lo. Inoltre, dal limonolo e dall'obacunolo sono stati
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