Journal club 11 marzo 2014 Federica Lanza La corrente di Na+ nella cellula miocardica (I Na+) ha ruolo fondamentale nella depolarizzazione iniziale, nella durata del potenziale d’azione e nella propagazione dell’impulso elettrico da una cellula all’altra Nav1.5 SCN5A •canale del Na+ voltaggio dipendente maggiormente espresso nelle cellule cardiache •composto da una proteina formante il poro di 220 kDa, subunità alfa, e piccole proteine transmembrana (30‐40 kDa), subunità beta, multifunzionali, modulano l’apertura del canale, la dipendenza da voltaggio e la cinetica • • • gene che codifica per Nav1.5 Localizzato in 3p2.1 coinvolto in molti disordini elettrici cardiaci; la sindrome del QT lungo congenita e acquisita, la sindrome di Brugada, conduzione rallentata, fibrillazione atriale, sindrome del nodo del seno (SSS Sick Sinus Syndrome) e la cardiomiopatia dilatativa ruolo di Nav1.5 nella normale fisiologia e nella malattia Topologia di Nav1.5 e interazione con proteine regolatorie 4 domini omologhi, connessi da anse intracellulari e extracellulari. Ciascun dominio contiene segmenti che contribuiscono all’allineamento del poro (S5 e S6), S4 è il segmento sensore del voltaggio Molte proteine interagiscono a livello delle anse intracellulari e a livello del C‐terminale, per molte i siti di interazione sono sconosciuti. Interazione con proteine regolatorie Nav1.5 • Regolato da molte proteine • alcune si legano al medesimo dominio • Possibile presenza di diversi pool di canali che coesistono nella cellula cardiaca? Mutazioni nei geni di queste proteine sono state ritrovate in pazienti con aritmie ereditarie, come la sindrome congenita del QT lungo, la sindrome di Brugada Le proteine interagenti con Nav1.5 possono agire da: •proteine coinvolte nel traffico, trasporto e ancoraggio del canale a specifici compartimenti membranosi •enzimi interagenti col canale e modificatori post traduzionali, come proteine chinasi o ligasi •proteine modulanti le proprietà biofisiche di Nav1.5 Proteine interagenti con Nav1.5 Interazione con proteine regolatorie Suddivisione delle Proteine in base al sito di legame: 1.Interagenti col C‐terminale 2.Interagenti con le anse intra‐extracellulari 3.Interagenti con l’N‐terminale 1. Il C‐terminale, contiene 3 siti di interazione principali: ¾ PDZ domain‐binding motif ¾ PY motif ¾ Calmodulin‐binding IQ motif Interazione con proteine regolatorie Dominio PDZ I domini PDZ sono domini conservati, interagiscono con i carbossi terminali di proteine target Spesso ritrovati in proteine presenti nella membrana plasmatica e coinvolte in pathway di trasduzione di segnale SIV‐motif sono gli ultimi 3 residui del C‐ter di Nav1.5 (Ser‐Ile‐Val) che interagiscono con proteine contenenti dominio PDZ (es. Sintrofine, PTPH1 e SAP97) • Sintrofina e distrofina Legame di sintrofine a canali del Na+: peptidi corrispondenti agli ultimi 10 amminoacidi del C‐ terminale di Nav1.5, inibiscono questo legame legandosi al dominio PDZ di queste proteine. Si è visto che Nav1.5 interagisce con distrofina mediante sintrofina Æ in cuori di topi deficitari di distrofina il livello di Nav1.5 è basso , ciò risulta in una ridotta I Na+ e conduzione difettosa. Æ Distrofina regola i livelli di espressione di Nav1.5 • PTPH1 protein tyrosine phosphatase Coespressione di PTPH1 e Nav1.5 modifica l’accessibilità del canale del Na+ a potenziali iperpolarizzanti, questo effetto è eliminato in caso di mutazioni nel dominio SIV Più proteine possono interagire con un unico dominio (SIV) Nav1.5 potrebbe essere parte di diversi complessi multiproteici, a seconda del compartimento membranoso in cui è localizzato Interazione con proteine regolatorie Dominio PDZ Dimostrato nell’atrio cardiaco umano e in ventricolo di topo l’interazione tra il PDZ binding‐ motif di Nav1.5 e SAP97 (proteina di membrana guanilato chinasi MAGUK), entrambe localizzate a livello dei dischi intercalari. I Na+ ridotta in cellule HEK293 con espressione di SAP97 inibita; stessa riduzione di corrente in cellule trasfettate con canali Nav1.5 mancanti del dominio SIV Esistono almeno 3 proteine con dominio PDZ che legano il PDZ binding motif di Nav1.5: sintrofine, SAP97 e PTPH1 Gli autori suggeriscono la coesistenza di due pool di canali Nav1.5 nei cardiomiociti, uno localizzato nella membrana laterale con il complesso multiproteico distrofina e l’altro localizzato con la proteina SAP97 nei dischi intercalari Interazione con proteine regolatorie PY‐motif Molti canali ionici vengono regolati mediante ubiquitilazione. Proteine con il dominio PY ([L/P]PxY si legano a membri della famiglia NEDD4 proteine ubiquitin‐ligasi. La proteina NEDD4‐2 si lega al sito PY di Nav1.5 e ubiquitina il canale nelle cellule di mammifero IQ‐motif Sequenza consenso IQxxxRxxxxR costituisce un calmodulin (CaM) binding motif CaM è una proteina ubiquitaria legante Ca2+, coinvolta in molti processi cellulari. E’ stata provata una diretta interazione tra la proteina CaM e l’IQ motif di Nav1.5, ma le spiegazioni di tale interazione sono inconsistenti; molti risultati suggeriscono comunque il Ca2+ intracellulare come importante regolatore di Nav1.5 Interazione con proteine regolatorie 2. Proteine che interagiscono con le anse intra‐extra cellulari di Nav1.5 Ansa DI‐DII Si tratta di un locus che contiene vari siti di fosforilazione Oltre a siti fosforilati dalle PKA e PKC, Nav1.5 è regolato anche da CaMKII (Ser/Thr chinasi) che traduce un aumento di Ca2+ intracellulare in fosforilazione di proteine. Espressa nel tessuto cardiaco, immuno precipita con Nav1.5 Inibizione di CaMKII causa una riduzione drastica della velocità del potenziale d’azione, invece l’over espressione aumenta in maniera persistente la corrente di Na+ e prolunga il QRS Immunomarcatura di cardiomiociti di coniglio adulto ha mostrato presenza di Nav1.5 e 14‐3‐3η (proteina adattatrice citosolica dimerica) a livello dei dischi intercalari. 14‐3‐3η in grado di modificare le proprietà biofisiche del canale, se coespressa in cellule COS. Interazione con proteine regolatorie ansa DII‐DIII Sequenza di 9 aa presente in tutti i canali del Na+ interagisce con ankirina‐G Æ organizza, trasporta, ancora trasportatori ionici al citoscheletro di actina e spectrina Nel cuore espressione di ankirina‐G e B, ma non c’è evidenza di interazione tra ankirina B e Nav1.5 MOG‐1 è una piccola proteina trovata nel nucleo e nel citosol delle cellule cardiache. Co espressione di MOG‐1 e Nav1.5 in cellule HEK293 porta ad un incremento di I Na+ così come ad un’aumentata espressione di Nav1.5 sulla membrana. MOG‐1Æco fattore per l’espressione ottimale del canale sulla membrana In miociti ventricolari di topo le due proteine sono state evidenziate a livello dei dischi intercalari Interazione con proteine regolatorie Ansa DIII‐DIV α‐actinin‐2 presente con Nav1.5 a livello delle linee Z e nella membrana plasmatica. Questa interazione aumenta la densità dei canali del Na+ senza interferire sulle proprietà di apertura. Presenza di un dominio che interagisce con CaM, sequenza ancora non completamente mappata, gli aa 1520‐FIF‐1522 E 1494‐YY‐1495 sono coinvolti Le subunità β interagiscono con le anse extracellulari Sembra che la subunità β1 interagisca con l’ansa che collega S5 e S6 di DI e DIV Interazione con proteine regolatorie 1.3 Proteine che interagiscono con il dominio N‐terminale • Non sono state riportate sino ad ora proteine interagenti con l’N‐terminale • O’Brien et al identificarono la proteina Map1b interagente con il canale Nav1.6, la sequenza amminoacidica VAVP coinvolta in questo legame non è stata ritrovata in Nav1.5 Clatot et al dimostrano il ruolo importante dell’N‐ter in uno studio in cui vengono esaminate due mutazioni in pazienti affetti da Sindrome di Brugada (R104W e R121W residui conservati a livello dell’N‐ter) Studi di Patch‐clamp evidenziano assenza di corrente del Na+ in cellule HEK293 mutate Esperimenti immunoistochimici rivelano che i canali mutati vengono trattenuti nel reticolo endoplasmatico e la loro co‐espressione con i canali WT provoca ritenzione anche di questi ultimi. • Æle subunità α interagiscono tra di loro, anche se mutate Æeffetto dominante negativo della mutazione Mutazioni in SCN5A così come nei geni codificanti tutte queste proteine sono state collegate a diverse sindromi aritmiche The Nav1.5 “two pools”model Inizialmente si pensava ad una localizzazione esclusiva a livello dei dischi intercalari Dati più recenti mostrano espressione sia a livello dei dischi sia nella membrana laterale dei cardiomiociti Si pensa ad un’organizzazione in complessi regolatori multiproteici Distrofina e sintrofina Petitprez et al. descrivono co‐localizzazione di distrofina/sintrofina con Nav1.5 solo a livello della membrana laterale The Nav1.5 “two pools”model Distrofina e sintrofina Perdita di marcatura nella membrana laterale in cardiomiociti di topo deficitari di distrofina The Nav1.5 “two pools”model Distrofina e sintrofina Distrofina e sintrofina interagiscono con Nav1.5 per ancorare il canale alla membrana. Rottura di questo complesso in topi deficitari di distrofina porta a: • riduzione del 50% dell’espressione di Nav1.5 • corrispondente calo della corrente di Na+ • difetti di conduzione Æ prolungato intervallo QRS nell’ECG. Corretta espressione e funzione di Nav1.5 nella membrana laterale dipende dall’associazione con distrofina e sintrofina Esiste meccanismo compensatorio a livello della membrana laterale: utrofina UtrofinaÆomologo di distrofina, lega il motivo SIV mediante l’adattatore sintrofina Osservata up‐regolazione di utrofina in topi distrofina deficitari Topi KO per entrambe le proteine: Ædecremento dei livelli proteici di Nav1.5, dell’espressione a livello della superficie cellulare, della corrente di Na+ e della velocità di depolarizzazione del potenziale d’azione Æanomalie ancora più marcate che nei topi deficitari solo di distrofina The Nav1.5 “two pools”model SAP97 Petitprez et al. rivelano come SAP97 sia un potenziale partner regolatorio di Nav1.5 a livello dei dischi intercalari L’importanza funzionale dell’interazione tra Nav1.5 e SAP97 viene studiata mediante silenziamento di SAP97 con shRNA ÆCalo di corrente del Na+ sia in cellule HEK esprimenti Nav1.5 sia in cardiomiociti di topo in coltura Attribuito alla perdita di interazione e conseguente perdita di stabilità ed espressione sulla membrana cellulare, resa visibile da esperimenti di biotinilazione di Nav1.5 Patofisiologia cardiaca e pool della membrana laterale Topi, omozigoti per D1275N in SCN5A •perdita di espressione di Nav1.5 nella membrana laterale e conservazione dell’espressione a livello dei dischi •decremento del livello proteico e della corrente del Na+ •fenotipo di cardiomiopatia dilatativa, aritmia, difetti di conduzione Correlazione tra perdita di espressione di Nav1.5 nella membrana laterale e fenotipo funzionale cellulare e clinico Regolazione di Nav1.5 nei dischi intercalari Il pool di Nav1.5 nei dischi intercalari dipende da interazioni con proteine chiave coinvolte nella comunicazione tra cellule e trasmissione elettrica: Cx43 Jensen et al. esaminano l’impatto tra espressione funzionale di Nav1.5 e la suscettibilità a aritmie quando i livelli di Cx43 sono ridotti a meno del 5% in miociti di ventricolo di topo Down‐regolazione dell’espressione di Cx43 e Nav1.5 portano a modifiche nella conduzione che aumentano la vulnerabilità del cuore alla aritmie Kleber et al. studiano l’effetto dell’assenza di Cx43 sulle proprietà elettriche delle gap junctions e del canale del Na+ in miociti atriali in coltura Ædecremento della conduttanza elettrica e della corrente del Na+ Importanza del rimodellamento delle giunzioni nella modulazione della corrente del Na+ Plakophilin2 (pkp2) Sato et al. rivelano che la funzione di Nav1.5 nei dischi intercalari dipende anche da associazioni con plakophilin2, proteina dei desmosomi Abolita questa interazione, modifiche nella cinetica della corrente del Na+, decremento della corrente e della velocità di conduzione Ankirin‐G (AnkG) Interazione tra le gap junctions, i desmosomi e il complesso di Nav1.5, mediante interazioni tra Cx43, pkp2 e ankirin‐G Viene dimostrato che silenziando AnkG si influenza la distribuzione di pkp2 e l’espressione di Cx43, interruzione del contatto cellulare e riduzione della trasmissione elettrica Esiste un terzo pool? Nav1.5 espresso anche a livello dei tubuli T •Esperimenti rivelano un contributo del 22% di corrente del Na+ cardiaca a livello dei tubuli T •Milstein et al mostrano co‐localizzazione di SAP97 con Nav1.5 sia a livello dei dischi sia dei tubuli T •Gli autori credono che questo terzo pool non dipenda da sintrofina/distrofina, in quanto presente anche in topi deficitari di distrofina Potrebbe essere un altro unico e separato complesso proteico che monitora e regola la corretta emissione della corrente di Na+ nell’attività elettrica nel normale funzionamento cardiaco Conclusioni • Nav1.5 è parte di complessi multiproteici importanti per la sua corretta localizzazione e funzione nelle cellule cardiache • Si trova in diversi compartimenti cellulari, formando distinti pool di canali • Si sa ancora poco sui ruoli specifici che hanno questi pool distinti nella fisiologia dei cardiomiociti Necessario approfondire per capire i multipli fenotipi patologici associati a mutazioni nel gene SCN5A riscontrate in pazienti con disordini cardiaci
© Copyright 2024 Paperzz
