CDT aspetti biochimici e analiticii

Transferrina Carboidrato Carente
( CDT)
Aspetti biochimici e analitici
Aronne Pastoris
La Transferrina
La Transferrina (Tf) è una glicoproteina con peso molecolare che varia
da 75,37 a 79,61 kD, ed è la principale deputata al trasporto di ferro
nell’organismo.
E’ sintetizzata principalmente negli epatociti e in piccola parte dal
sistema reticolo-endoteliale e da ghiandole endocrine,
La Tf apoproteina consiste di una singola catena polipeptidica di 679
aminoacidi, suddivisa in due domini omologhi, denominati N e C, ognuno in
grado di legare uno ione Fe3+ (es.: nel dominio N, lo ione è coordinato da
diversi residui aminoacidici, Asp63, due Tyr, 95 e 188, e la His249). Il legame
del Fe3+ richiede il contemporaneo legame di una molecola di bicarbonato.
Struttura terziaria della
Transferrina:
domini N e C
Ione Fe3+
Ione bicarbonato
Eterogeneità: 1 livello
E’ dovuto al carico di Ferro.
Possono essere identificate 4 forme di Tf:
- Apotransferrina ( pI Fe 0 = 6,1 )
-Transferrine monoferriche con Fe legato nel dominio N-terminale
(pI Fe 1N = 5,8 )
-Transferrine monoferriche con Fe legato nel dominio C-terminale
( pI Fe 1C = 5,7 )
-Transferrina diferrica ( pI Fe 2 = 5,4 )
Nei soggetti normali il livello di saturazione del ferro è circa il 30%.
Per ogni ione ferrico si osserva una variazione del pI di circa 0.3 unità.
Eterogeneità: 2° livello
•La Tf è una glicoproteina: è legata a due catene complesse di glicani. I siti
di legame sono due residui di asparagina (Asn 413 e 611).
• Queste strutture eterogenee e ramificate di glucidi mostrano una notevole
variabilità anche in condizioni non patologiche e determinano il 2° livello di
Eterogeneità della Transferrina.
•Dal punto di vista biochimico, dunque, la Tf esiste in diverse isoforme,
definite dalla natura delle catene di N-glicani ad essa legate (glicoforme).
Le isoforme della transferrina
Acido Sialico
Catena glicanica
Catena peptidica
Esasialo Transferrina
Pentasialo Transferrina
Tetrasialo Transferrina
pI = 5.2
pI = 5.4
Trisialo Transferrina
Disialo Transferrina
Monosialo Transferrina
Asialo Transferrina
pI = 5.6
pI = 5.7
pI = 5.8
pI = 5.9
Eterogeneità: 2 livello
Le catene glicaniche possono essere bi,tri e tetrantennate.
Ciascuna antenna termina con una molecola di acido sialico che crea una
carica negativa. In linea teorica sono possibili Tf con residui di acido sialico
da 0 a 8. La Spettrometria di Massa evidenzia che possono coesistere due
forme di Disialo-Tf : la prima lega i 2 residui di acido sialico alla stessa catena
glucidica,l’altra possiede 2 catene glucidiche che legano un residuo di acido
sialico ciascuna.
Le forme asialo, monosialo e ottasialo non sono normalmente rilevabili nel
siero.
Per ogni residuo di acido sialico si osserva una variazione del pI di circa
0.1 unità.
Glicoforme di Transferrina
Sono rilevabili glicoforme della Tf con numero di molecole di acido
sialico legate che varia da 0 a 8:
•
•
•
•
•
•
asialo, monosialo e octasialo-Tf
epta e esasialo-Tf
pentasialo-Tf
tetrasialo-Tf
trisialo-Tf
disialo-Tf
<1%
~2%, complessivamente
12–18%
(pI 5.2)
70–80%
(pI 5.4)
4.5–9%
(pI 5.6)
<2%
(pI 5.7)
Microeterogeneità: 3 livello
Varianti genetiche
Sono dovute alla sostituzione di diversi AA nella catena polipeptidica.Sono
state caratterizzate almeno 38 varianti genetiche della Tf, ma solo 4 di queste
mostrano una prevalenza nella popolazione maggiore del 1%. La Tf di tipo C,
prevalente nella popolazione caucasica, presenta ben 16 sottotipi ma il
sottotipo C1 è il più rappresentato (>95%).
Le varianti più comuni sono le Tf di tipo B e di tipo D: presentano una
diminuzione (5.2) e un incremento (5.7) di pI rispetto al comune tipo C1
(considerando la tetrasialo-Tf). Le frequenze degli eterozigoti nella popolazione
sono di circa il 0.7% per l’eterozigote BC e di 0.2% per l’eterozigote CD (più
frequenti in popolazioni di origine asiatica, africana e sudamericana).
Un altro sottotipo di Tf C, denominata C2C3, è stata osservata con una
frequenza attorno a 0.6%. Altri varianti possono, ad esempio, aumentare livelli
di trisialo-Tf (>8%).
Queste varianti genetiche non comportano alterazioni clinicamente
significative nella funzione fisiologica della Tf.
CDT, definizione e origine
La transferrina carboidrato-carente (Carbohydrate-Deficient Transferrin, CDT) fu scoperta
da Stibler e collaboratori negli anni ’70: fu definita come la somma percentuale delle
frazioni di asialo-, monosialo- e disialo-Tf rispetto alla Tf totale.
Le glicoforme CDT aumentano in percentuale quando la corretta
glicosilazione delle proteine è in qualche modo ridotta.
La principale causa non genetica di riduzione della glicosilazione è il consumo
eccessivo e continuato di alcool etilico (>50-60g di etanolo/giorno, per 1-2
settimane), tramite:
1) l’inibizione delle glicotransferasi epatiche da parte dell’acetaldeide,
prodotta dal catabolismo dell’etanolo
2) l’aumento etanolo-dipendente dell’attività delle sialidasi
3) l’interferenza dell’etanolo sul trasporto delle proteine a livello dell’apparato
del Golgi.
La mancanza dei residui di acido sialico rallenta la degradazione, pertanto la
CDT ha emivita di ca.14 gg. mentre le Tf normali 7 gg.
CDG, definizione
I disordini congeniti della glicosilazione (CDG, Congenital Disorders of
Glycosylation, sono patologie ereditarie che colpiscono gli enzimi
coinvolti nella biosintesi delle glicoproteine e della glicosilazione.
Le caratteristiche cliniche associate a tali patologie sono variabili ma
spesso includono ritardi psicomotori, mentali e di crescita sin dalla prima
infanzia.
CDG-I: difetti nella sintesi e trasferimento di gruppi glucidici (catene di
carboidrati completamente assenti o fortemente ridotte)
CDG-II: difetti di processamento di gruppi glucidici (strutture anormali) La
forma CDG-Ia è la più frequente (1/20000) mentre altre forme sono più
rare (1/50000 – 1/70000, CDG-Ib – Ik e CDG-IIa – IId)).
A livello della transferrina, quindi, i CDG-I impediscono la corretta
glicosilazione della proteina dando origine ad un notevole incremento
della CDT, mentre i CDG-II producono glicoforme della Tf legate con
catene di glicani anomale.
CDT: glicoforme significative
L’associazione fra Tf desialata ed abuso alcolico è relativa solo ad alcune delle
glicoforme sinora prese in considerazione.
Diversi studi hanno dimostrato che le glicoforme associate all’abuso alcolico
sono esclusivamente la DISIALO-Tf e la ASIALO-Tf, mentre per la
MONOSIALO non vi sono evidenze sicure.
L. Dibbelt, “Does Trisialo-Transferrin Provide Valuable Information for the Laboratory Diagnosis of Chronically Increased
Alcohol Consumption by Determination of Carbohydrate-deficient Transferrin?”, Clin Chem 46, No. 8, 2000, pp. 12031205
Helander A, Eriksson G, Stibler H, Jeppsson J-O. Interference of transferrin isoform types with carbohydrate-deficient
transferrin quantification in the identification of alcohol abuse. Clin Chem 2001;47:1225–33.
In una recente pubblicazione, il gruppo di studio IFCC sulla standardizzazione
della Transferrina Carboidrato-Carente ha evidenziato che il parametro più
importante associato all’abuso alcolico e scelto per la standardizzazione è da
considerarsi la DISIALO-Tf, sia per sensibilità, sia per specificità.
J-O. Jeppsson, T. Arndt, F. Schellenberg, J. P.M. Wielders, R. F. Anton, J. B. Whitfield and A. Helander, Toward
standardization of carbohydrate-deficient transferrin (CDT) measurements: I. Analyte definition and proposal of a
candidate reference method) Clin Chem Lab Med 2007;45(4):558–562
Aspetti preanalitici
Prelievo ematico
1) Uso di anticoagulanti
2) Durata di conservazione del campione
3) Temperatura di conservazione del campione
Anticoagulanti
L’uso di provette con gel separatore non influenza la
misura della CDT, mentre EDTA , Eparina e Citrato
Possono:
1) alterare la saturazione in vitro degli ioni ferrici
della Tf., agendo come complessanti antagonisti.
2) interferire nella separazione elettroforetica
Pertanto si raccomanda di usare il siero come campione
biologico.
Temperatura e durata di
conservazione
• La CDT è stabile a t.a. fino a 30 h., a 4°C per alcune
settimane e a -20°C per diversi mesi.
• Se lasciata a t.a., dopo 3 gg. la CDT aumenta anche del
25% per la presenza di batteri ad attività neuraminidasica che
staccano i residui di Ac. Sialico dalle catene glicaniche.
A questo scopo si raccomanda l’uso di provette sterili.
• Ripetuti cicli di congelamento e scongelamento non alterano la
determinazione della CDT.
• Il prelievo deve essere fatto a digiuno, mancando dati relativi in
letteratura.
Aspetti analitici generali
La separazione delle glicoforme della Tf è legata alla
loro eterogeneità e quindi al pI risultante da:
• Differenza di carica dovuta al contenuto di Ac. Sialico
• Differente grado di saturazione ferrica
• Differente struttura primaria della Varianti Genetiche
Per evitare la presenza di glicoforme CDT e non-CDT
con diverso pI, è necessario saturare la Tf con una
soluzione di ioni Fe3+
Analisi della CDT
Dalle prime analisi effettuate tramite
isoelettrofocalizzione delle proteine, con
staining, immunoblotting, immunofissazione…
… attraverso le analisi tramite separazione CDT RIA, CDT EIA, CDT TIA…
cromatografica su minicolonne a scambio
ionico e reazioni immunochimiche…
… attraverso altre tecniche che fanno uso di N Latex CDT
reazioni immunochimiche con anticorpi
monoclonali…
Elettroforesi capillare (CE/CZE)
… fino alle analisi tramite tecniche
separative.
Cromatografia liquida ad alte
prestazioni (HPLC)
IEF
Prima tecnica separativa utilizzata per la separazione delle
isoforme della transferrina
Tecnica scarsamente automatizzabile e non semplice
Per la rivelazione, è necessario un passaggio successivo di
staining
Separativamente efficiente ma la quantificazione pone seri
problemi di inaccuratezza ed imprecisione (densitometria).
Esistono kit commerciali disponibili?
In un gradiente di pH creato da anfoliti e applicando un campo elettrico, ogni
proteina migra fino a raggiungere il punto in cui ha carica netta neutra (pI)
formando bande strette e ben definite.
%CDT TIA
Tecnica semplice ed automatizzabile (screening)
Esistono rilevanti problemi sulla corretta separazione delle
isoforme e sul riconoscimento dell’anticorpo (contaminazione da
Mono- e Tri-sialo Tf)
Spesso la quantificazione è soggetta ad elevata inaccuratezza ed
imprecisione (turbidimetria).
Esistono numerosi kit commerciali disponibili
Tf desialata
Anticorpo policlonale anti Tf
Microcolonna a
scambio ionico
Campione di siero
saturato con Fe3+
Tf totale
Misura turbidimetrica a 405nm e rapporto fra Tf desialata e Tf
totale con curva di calibrazione %CDT
N Latex CDT
Tecnica che utilizza anticorpi monoclonali ricombinanti contro la
porzione peptidica desialata della transferrina + anticorpo contro
Tf umana per la determinazione della Tf totale.
Elevata specificità per A-, Mono- e Di-sialo Tf
Quantificazione
adeguatamente
sensibile
e
precisa
(nefelometria). Accuratezza e Commutabilità?
Metodo
completamente
automatizzato
e
rapido
su
strumentazione di chimica clinica
Misura anche la CDT delle Varianti Genetiche
Buona correlazione con metodo HPLC di riferimento
Helander A, Husa A, Jeppsson JO. Improved HPLC method for carbohydrate-deficient transferrin in serum. Clin Chem
2003;49: 1881–90.
J.R. Delanghe, A. Helander, J.P.M. Wielders, J. M. Pekelharing, H.J. Roth, F. Schellenberg, C. Born, E. Yagmur. W.
Gentzer, H. Althaus, Development and Multicenter Evaluation of the N Latex CDT Direct Immunonephelometric Assay
for Serum Carbohydrate-Deficient Transferrin, Clin. Chem. 2007 - 53:6 1115–1121
Elettroforesi Capillare (CE/CZE)
Tecnica separativa, evoluzione delle tecniche elettroforetiche: la separazione
delle molecole avviene lungo capillari in silice fusa del diametro di 20 -50 μm
Flusso elettroosmotico
Anodo
+
z
Z
Z
Rivelazione a 200-215nm
detector
Catodo
30 min.
Siero
Saturazione con ferro
Alto voltaggio
Valori di CDT
I risultati sono espressi in % della transferina totale e non in g/L in modo
da eliminare variazioni fisiologiche della concentrazione della transferrina
totale.
Il calcolo:
% CDT
= (2 sialo ) + (0-sialo)
=
Tutte le isoforme
15
15+85+1446+199
*100
Variant: normal sample
Variant: positive sample
Fattori da considerare per
una validazione accurata
Effetti della conservazione del
siero sul pattern di Capillarys CDT
degradatedC3
degradated C3
Campione conservato a -20 °C
Campione conservato a +20 °C
Emoglobina (Hb)
1.44 g/dL: nessuna interferenza
1.73 g/dL: interferenza
Anticoagulanti EDTA o Citrato
Rimozione del picco monoclonale con
CDT/IS
Prima del
trattamento
Dopo il trattamento
con la « soluzione
CDT/IS »
%CDT in HPLC
Tecnica separativa, candidata metodica di riferimento messa a
punto per la separazione delle glicoforme della Tf e la
determinazione della CDT
Jeppsson J-O, Kristensson H, Fimiani C. Carbohydrate-deficient transferrin quantified by HPLC to determine heavy
consumption of alcohol. Clin Chem 1993;39:2115–20
Helander A, Husa A, Jeppsson J-O: Improved high-performance liquid chromatography method for carbohydratedeficient transferrin in serum. Clin Chem 49:1881-1890, 2003.
z
Z
Z
30 min.
Siero
Saturazione con ferro e
precipitazione lipoproteine
10 min centrifuga
Fase mobile (gradiente)
Colonna a scambio anionico
Iniezione del sovranatante in un
sistema HPLC che usa un gradiente
salino con colonna a scambio
anionico: il pI delle diverse isoforme
della Tf è il discriminante per la
separazione
Rivelazione della Tf tramite misura
in assorbimento a 460-470nm
altamente specifica (Fe coordinato)
Specificità del metodo HPLC
•L’immunosottrazione applicata a campioni normali, patologici, con
Trisialo elevate, con Transferrine Varianti, con C.M., con PCR elevate
ha evidenziato la purezza dei picchi cromatografici, utilizzando
anticorpi monoclonali da siero di coniglio ( Bianchi et. Al.)
Nei campioni immunosottratti solo il picco della Tf di coniglio rimane
evidente.
•L’anticoagulante EDTA produce un picco cromatografico (t.r. 1,9 min.
Fe- EDTA) che non interferisce con i picchi delle isoforme di
Transferrina.
Confronto CZE-HPLC
• Imprecisione (al cut-off)
• Sensibilità (LOD)
• Tempo di analisi
CZE
< 3.0 %
HPLC
CZE
HPLC
CZE
HPLC
< 2.9 “
= 0.4 U.%
= 0.3 U. “
= 10 min.
= 37 “
Correlazione CZE-HPLC
 La pendenza = 0.989 (molto vicina ad 1) indica che la differenza, tra
i valori di % CDT in HPLC ed i valori di Capillarys CDT, rimane
approssimativamente costante; la correlazione è lineare.
 L’intercetta = 0.460 invece è significativamente diversa da 0 ed infatti
i due metodi hanno un diverso valore di cut-off (dati Sebia)
Valori di Riferimento
Latex < 2.5 %
CZE
< 1.6 “
HPLC < 2.0 “
Cause probabili:
•
•
•
I metodi immunologici indiretti (estrazione su resina ion exc.),risentono
dell’interferenza di glicoforme CDT coeluenti , non controllabili.
I metodi immunologici diretti risentono dell’interferenza di altre frazioni
“non-CDT” (epitopi differenti).
Il metodo CZE è lievemente meno sensibile dell’HPLC “classico” (~ 0,1
U.%), è lievemente meno risolutivo (Rs disialo-trisialo ~0.1 U.%), è
meno specifico (lettura a 200 nm) e presenta una linea di base più
disturbata da altre sostanze proteiche comigranti).
Risultati analitici
• Per un referto comprensibile della CDT è necessario
specificare il Metodo utilizzato e quali Glicoforme
vengono utilizzate per il calcolo.
• La CDT deve essere espressa come % sulla Tf totale
e non sulla Tetrasialo Tf.
• Il Laboratorio dovrebbe indicare sul referto anche
l’Errore Analitico.
• I campioni positivi o dubbi analizzati con metodi “non
separativi” devono essere confermati con metodi
HPLC o CZE.
CDT: conclusioni
• La glicoforma DISIALO-Tf è l’analita target.
• La metodica HPLC, accoppiata alla Spettrometria di
Massa, è candidata ad essere il Riferimento per l’analisi
della CDT.
• La differenza dei Valori di Riferimento CZE-HPLC non è
significativa, per cui i due metodi sono confrontabili.
• Il Laboratorio dispone, ad oggi, di Biomarcatori in grado di
coprire la finestra temporale di rivelazione, da pochi istanti
fino a mesi di distanza dall’assunzione di alcol in quantità
significativa.
Biomarcatori: criteri di utilizzo
Nelle applicazioni Amministrative e Forensi, le
determinazioni di tali Parametri devono rispettare il
“consolidato criterio di correttezza analitica della
Tossicologia Forense” secondo cui i risultati analitici
devono essere confermati dalla concordanza di
almeno due tecniche basate su principi chimico-fisici
differenti. ( Tagliaro et al. 2010)

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