ELETTROFISIOLOGIA APPLICAZIONI studio delle proprietà elettriche delle cellule eccitabili neuroni, muscolo striato e cardiaco POTENZIALE DI MEMBRANA tutte le cellule hanno un potenziale di membrana il potenziale è mantenuto elettrochimici di equilibrio da gradienti il potenziale di membrana è soggetto a variazioni dovute ai potenziali d’azione e alle attività sinaptiche afferenti equazione di Nernst: equazione di Goldman: EK = potenziale equilibrio K+, R = costante dei gas; T = temperatura Kelvin; z = valenza del potassio, F = costante di Faraday capacitanza: mantenere una carica batteria: forza elettromotorice resisitenza: permeabilità ionica nei neuroni il potenziale di equilibrio è più prossimo a quello del K+ che non a quello del Na+ POTENZIALI SINAPTICI E DI AZIONE i potenziali sinaptici sono eventi voltaggio-indipendenti POTENZIALI SINAPTICI E DI AZIONE EPSP sposta il potenziale di membrana verso valori positivi (in genere aumenta [Na+]i) IPSP sposta il potenziale di membrana verso valori negativi (in genere aumenta [Cl-]i) EPSP genera i potenziali d’azione (nelle cellule eccitabili) Il potenziale d’azione differisce dai potenziali di membrana perché dipende necessariamente dall’apertura di specifici canali ionici voltaggio-sensibili, che data la loro cinetica rapida, consentono di veicolare il segnale mediante treni di potenziali d’azione ELETTRODI PER ELETTROFISIOLOGIA dimensioni e caratteristiche dell’elettrodo variano a seconda della particolare applicazione AMPLIFICAZIONE E FILTARAGGIO DEL SEGNALE amplificare (fattore variabile) il segnale e trasmetterlo per l’archiviazione PREAMPLIFICATORI misurare i piccoli voltaggi di un neurone lasciandoli inalterati FILTRI A BANDA PASSANTE eliminano componenti ad alta frequenza (onde radio) e a bassa frequenza (pulsazioni) SOMMAZIONE DELLE REGISTRAZIONI SCELTA DEL PREPARATO le proprietà delle membrane neuronali sono simili nelle varie specie animali, perciò esiste una ampia varietà di scelta dei preparati su cui effettuare gli studi di elettrofisiologia PREPARATO ACUTO in vivo VANTAGGI - mantenimento rapporti sinaptici - ambiente extracellulare - ossigenazione e nutrimento - chiara identificazione cellulare PUNTI DEBOLI - anestesia - ambiente extracellulare da manipolare - riproducibilità limitata - difficile fare valutazioni intracellulari Aplysia californica PREPARATO CRONICO in vivo VANTAGGI - assenza di anestetici - mantenimento di riflessi e comportamento - possibilità di addestrare l’animale - possibilità di ottenere molti dati da un animale PUNTI DEBOLI - mancanza di individuazione precisa sui neuroni - influenza dello stato comportamentale - spostamento degli elettrodi PREPARATO in vitro fettine di tessuto cerebrale colture cellulari midollo spinale di rana o di ratto VANTAGGI -facilità di registrazione e identificazione dei neuroni -regolazione dell’ambiente extracellulare PUNTI DEBOLI - si possono evidenziare effetti non manifestati da preparati in vivo IDENTIFICAZIONE DI CELLULE localizzazione anatomia connettività potenziali antidromici tipo di attività morfologia tonica vs fasica coloranti IDENTIFICAZIONE DI CELLULE IDENTIFICAZIONE DI CELLULE LIVELLI DI ANALISI -gruppi di neuroni -neuroni singoli -membrana TIPI DI REGISTRAZIONE -intracellulare -extracellulare REGISTRAZIONI EXTRACELLULARI -registrano i campi elettrici intorno alla cellula -possono evidenziare la partecipazione di una cellula a un circuito nervoso -possono evidenziare risposte farmacologiche - non evidenziano meccanismi, e non rilevano eventi che non diano luogo a potenziali di azione REGISTRAZIONI INTRACELLULARI -molto più difficoltose delle registrazioni extracellulari, ma decisamente più accurate -registrano il potenziale di riposo e la resistenza della membrana -registrano tutti gli eventi elettrici, anche quelli non associati a potenziali di azione - registrano solo i corpi, ma non assoni e dendriti PROCEDURA PRATICA PER LE REGISTRAZIONI INTRACELLUALARI Registrazione intracellulare: gli elettrodi sono costituiti da pipette di vetro riempite con una soluzione salina concentrata e poste sui due lati della membrana. Fili metallici inseriti nell’estremità posteriore delle pipette vengono connessi attraverso un oscilloscopio che visualizza direttamente sullo schermo l’ampiezza del potenziale di membrana in volt. Quando entrambi gli elettrodi sono fuori dalla cellula non si registra alcuna differenza di potenziale. Tuttavia, non appena uno degli elettrodi penetra all’interno della cellula, sull’oscilloscopio compare una deflessione stabile che rappresenta il potenziale di membrana di riposo. Nella maggior parte delle cellule nervose a riposo il potenziale di membrana è all’incirca –70 mV. Vm ( mV) +60 Inserzione dell’elettrodo +30 0 -30 -60 Potenziale di riposo -90 Tempo Impulsi depolarizzanti di corrente di debole intensità (ottenuti rendendo positivo l’elettrodo intracellulare) danno origine a semplici potenziali elettrotonici (passivi) nei quali le variazioni dell’ampiezza del potenziale sono sempre proporzionali all’ampiezza degli impulsi della corrente stessa. Tuttavia, le correnti depolarizzanti tendono a sospingere il potenziale di membrana verso un livello critico, detto soglia, al quale si innesca una risposta attiva, che consiste nell’apertura dei canali voltaggio-dipendenti. L’apertura di questi canali dà origine ad un potenziale d’azione che differisce dai potenziali elettrotonici non solo per il modo in cui prende origine ma anche per ampiezza e durata. Se si inverte il senso in cui scorre la corrente, rendendo negativo l’elettrodo intracellulare rispetto a quello extracellulare, il potenziale di membrana diviene più negativo. Questo aumento del numero di cariche viene detto iperpolarizzazione TECNICHE DI VOLTAGE CLAMP E PATCH CLAMP PER VALUTARE GLI EVENTI DI MEMBRANA VOLTAGE CLAMP -permette di studiare le correnti ioniche indotte che si verificano in una membrana mantenuta sotto una differenza di potenziale che viene variata gradualmente dall’operatore -registra le correnti in forma cumulativa PATCH CLAMP -permette di studiare le correnti ioniche per un singolo canale specifico -variando differenza di potenziale della membrana, composizione del liquido nell’elettrodo, concentrazione dei trasmettitori si possono valutare tutti i parametri che regolano lo stato di apertura del canale e le cinetiche del processo -ha sostituito quasi del tutto il voltage clamp vantaggi: permettono studi accurati sulle membrane svantaggi: si perde il contenuto cellulare interno Registrazione della corrente di un singolo canale ionico quando il canale passa dallo stato chiuso a quello aperto Applicazioni umane Analisi del tracciato EEG • Ampiezza • Frequenza (attività delta <4Hz, teta 4-8 Hz, alfa 8-13 Hz, beta>13Hz) • Periodicità (punte e onde) • Distribuzione spaziale (grado di diffusione) Deep brain stimulation
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