Diffusione anomala = assorbimento Assorbimento Emissione 1.380 Å 1.542 Å http://skuld.bmsc.washington.edu/scatter/AS_periodic.html! 1! Sommario di un esperimento MAD: multiple wavelength anomalous dispersion 1. introduzione del diffusore anomalo (atomo pesante) nel campione (se non gia’ presente) 2. analisi dello spettro di fluorescenza del campione: scelta delle 3(4) λ sperimentali 3. raccolta dati su 1 cristallo (3(4) λ sperimentali) 4. individuazione delle posizioni dei diffusori anomali (atomi pesanti): Patterson delle differenze anomale 5. ottenimento delle fasi usando 2-4 datasets raccolti a diverse lunghezze d’onda 2! 1. introduzione del diffusore anomalo nel campione: - il diffusore anomalo potrebbe essere già presente: ad es. metalloproteine - soaking del cristallo con un atomo pesante - produzione della proteina con seleniometionine f 0 ⇒ f (λ ) = f 0 + Δf (λ ) + if % (λ ) 2. analisi dello spettro di fluorescenza del campione: Sperimentale: misura di λ1 e λ2 € lo spettro di emissione (fluorescenza) genera lo spettro di assorbimento teorico 3! http://www.bmsc.washington.edu/scatter/AS_periodic.html! Scattering anomalo fattore di scattering atomico: f 0 ⇒ f (λ ) = f 0 + Δf (λ ) + if %%(λ ) = f % + if %% ricavato da f’’ misurati (fluorescenza) € 2 Δf (ω ) = π ∞ ∫ 0 ω %f %%(ω ) dω % (ω %2 − ω 2 ) Solitamente la fluorescenza viene usata per misurare λ1 e λ2 € produce uno sfasamento della radiazione diffusa (diverso da π) L’assorbimento f0! f(λ)# Δf ! f0! in assenza di assorbimento if "! f '! in presenza di assorbimento 4! Coppie di Friedel F(h,k,l) = la densità elettronica è una funzione reale ∫ ρ(x, y,z)exp[−2πi(hx + ky + lz)]dV ρ(x, y,z) = ρ * (x, y,z) cell F * (h,k,l) = ∫ ρ(x, y,z)exp[2πi(hx + ky + lz)]dV = F(h ,k ,l ) cell € F * (h,k,l) = F(h,k,l) e −iα ( h,k,l ) = F(h ,k ,l ) = F(h ,k ,l ) e € iα ( h ,k ,l ) € € #% F(h,k,l) = F(h ,k ,l ) $ %&arg[ F(h,k,l)] = −arg[ F(h ,k ,l )] € in presenza di scattering anomalo non vale più la legge di Friedel $& F(h,k,l) ≠ F(h ,k ,l ) % &'arg[ F(h,k,l)] ≠ −arg[ F(h ,k ,l )] 5! € f ( λ ) = f 0 + Δf ( λ ) + if !!( λ ) = f ! + if !! FH = FH" + iFH"" arg( FH (+)) ≠ −arg( FH (−)) i=e i π 2 € sfasamento ! FPH (+) = FP (+) + FH" (+) + iFH""(+) = FP (+) e iα P (+) + FH" (+) e iα H (+) + i FH""(+) e iα H (+) € € $& F(h,k,l) = F(h ,k ,l ) % &'α (h,k,l) = −α (h ,k ,l ) € FPH (−) = FP (+) e −iα P (+) + FH$ (+) e −iα H (+) + FH$$(+) e & π) −i( α H (+)− + ' 2* (+) = h,k,l! FPH (+) ≠ FPH (−) € € (+) = h,k,l! F”H FPH(+) F’H F”H(+) FPH(+) F”H(-) F’H FP(+) (-) = -h,-k,-l! €F (-) FPH(-) FP(+) P FPH(-) F’H F”H riflessione rispetto all’asse R 6! 3. individuazione delle posizioni dei diffusori anomali: Patterson delle differenze anomale Δ F ano ≡ { FPH (+) − FPH (−) } f% 2 f %% F”H(+) da dimostrare: € (Δ F ) ano FPH(+) F’H F”H(-) GPH FPH(-) 2 ≅ 1 2 FH$ + rumore 2 FP FH = FH" + iFH"" € € α "H" (+) GPH % % π( π( i'α #H + * i'α #H + * iα P iα #H iγ PH & & 2) 2) / FPH (+) = FP e + FH# e + FH## e = GPH e + FH## e € . € % % π( π( −i' α #H − * −i' α #H − * / −iα P −iα #H −iγ PH & & 2) 2) + FH# e + FH## e = GPH e + FH## e 0 FPH (−) = FP e α "H" (−) € 7! € 2 2 2 2 FPH (+) = GPH + FH"" (+) = GPH + FH"" + 2 GPH FH"" cos(γ PH − α "H" (+)) = € ' π * 2 2 2 2 = GPH + FH"" + 2 GPH FH"" cos)− + (γ PH − α "H ), = GPH + FH"" + 2 GPH FH"" sin(γ PH − α "H ) ( 2 + € F”H(+) π α "H" (+) = α "H + 2 π α "H" (−) = α "H − 2 FPH(+) α’’H(+) F’H α’H γPH € € 2 2 2 2 FPH (−) = GPH + FH## (−) = GPH + FH## + 2 GPH FH## cos(γ PH − α #H# (−)) = € € 'π * 2 2 2 2 = GPH + FH"" + 2 GPH FH"" cos) + (γ PH − α "H ), = GPH + FH"" − 2 GPH FH"" sin(γ PH − α "H ) (2 + 8! 2 2 FPH (+) − FPH (−) = 4 GPH FH## sin(γ PH − α #H ) vale inoltre € la relazione seguente: 2 2 FPH (+) − FPH (−) = ( FPH (+) − FPH (−) )( FPH (+) + FPH (−) ) ≅ 2 GPH ( FPH (+) − FPH (−) ) approssimazione FPH (+) ≈ FPH (−) ≈ GPH ⇒ FPH (+) + FPH (−) = 2 GPH € ( FPH (+) − FPH (−) ) ≅ 2 FH$$ sin(γ PH − α $H ) € FH"" = f j"" ∑ f ""exp(2πih ⋅ r ) = ∑ f " € j j j j j f "" FH" f" f j" exp(2πih ⋅ r j ) = ( FPH (+) − FPH (−) ) ≅ 2 € € f $$ FH$ sin(γ PH − α $H ) f$ Δ F ano ≡ { FPH (+) − FPH (−) } f% ≅ FH% sin(γ PH − α %H ) 2 f %% 9! € Δ F ano ≡ { FPH (+) − FPH (−) } (Δ F ) € sin 2 x = 2 ano cos2x = cos2 x − sin 2 x = 1− 2sin 2 x € f% ≅ FH% sin(γ PH − α %H ) 2 f %% 2 ≅ FH$ sin 2 (γ PH − α $H ) € 1 1 − cos2x 2 2 (Δ F ) ano 2 ≅ 1 1 2 2 FH$ − FH$ cos2(γ PH − α $H ) 2 2 € γ PH , α #H € (Δ F ) ano 2 indipendenti 1 2 € ≅ FH$ + rumore 2 10! € Mappa di Patterson delle differenze anomale: posizione degli atomi pesanti P(u) = 1 ∑ (Δ Fh V h ano ) 2 cos(2πih ⋅ u) = 2 2( f ' + 1 F (+) − F (−) ) * 2 f ''- cos(2πih ⋅ u) ≈ ∑ ( PH PH V h ) , 2 1 1 ≈ ∑ FH' cos(2πih ⋅ u) + rumore V h 2 deconvoluzione: posizione degli atomi pesanti n FH n FH ( λ) = ∑ f j ( λ)exp[2πi(h ⋅ r j )] = [ f 0 + Δf ( λ) + if ''( λ)]∑ exp[2πi(h ⋅ r j )] = FH' + iFH'' € j=1 j=1 n ( Δf + FH" = [ f 0 + Δf ( λ )]∑ exp[2πi(h ⋅ r j )] = FH 0 *1+ f0 , ) j=1 € F”H(+) n € FH 0 = ∑ f 0 exp[2πi(h ⋅ r j )] FPH(+) j=1 F’H F”H(-) FPH FPH(-) FP deconvoluzione: posizione degli atomi pesanti € 11! SIRAS: single isomorphous replacement anomalous scattering 2 esperimenti: |FP|, 1/2(|FPH(+)| + (|FPH(-)| ), |FPH(+)| e |FPH(-)| differenze isomorfe differenze anomale posizione degli atomi pesanti FH fasi FPH(-) # FPH (+) = FP + FH (+) $ % FPH (−) = FP + FH (−) € FP -FH(-) -FH(+) # FP = FPH ( + ) − FH ( + ) " ! FP = FPH ( − ) − FH ( − ) |FPH(+)| 12! 4. ottenimento delle fasi usando 2-4 dataset raccolti a diverse lunghezze d’onda: MAD n n FH (h, λ ) = ∑ f j ( λ )exp[2πi(h ⋅ r j )] = [ f 0 + Δf ( λ ) + if ''( λ )]∑ exp[2πi(h ⋅ r j )] = FA + a j=1 j=1 f ( λ ) = f 0 + Δf ( λ ) + if !!( λ ) = f ! + if !! € parte anomala! n ) + a = [Δf ( λ ) + if $$( λ )]∑ exp[2πi(h ⋅ r j )] + j=1 * n n F + F = f exp 2 π i(h ⋅ r ) ⇒ (...) = A ∑ ∑ [ ] A 0 j + f0 , j=1 j=1 %Δf ( λ) f $$( λ ) ( a =' +i *FA f0 ) & f0 € € FPH = FP + FH = FP + FA + a = FPA + a 2 2 2 FPH = FPA + a + 2 FPA a cosΔϕ 13! € € 2 % Δf % Δf Δf 2 + ( f $ ) f$( f$( 2 a =' − i *F *A ' + i *FA = FA f0 ) f0 ) f 20 & f0 & f0 2 %Δf ( λ) f $$( λ ) ( a =' +i *FA f0 ) & f0 € angolo tra FPA e a! € FAf’’/f0& Δϕ = ϕ PA − ϕ a = ϕ PA − ϕ A − δ a δ& 180° φa& € φA& FAΔf/f0& FPH FP FPA φa=δ+φA& FA ϕPA FA % a cos δ = ' ' & ' a sin δ = ' ( Δf FA f0 f $$ FA f0 % a cos 2 δ = ' ' & ' a sin 2 δ = ' ( Δf FA cos δ f0 f $$ FA sin δ f0 % Δf ( f $$ a (cos2 δ + sin 2 δ ) = a = ' cos δ + sin δ * FA f0 & f0 ) 14! € € € 2 2 2 FPH = FPA + a + 2 FPA a cosΔϕ cosΔϕ = cos(ϕ PA − ϕ A − δ ) = cos(ϕ PA − ϕ A ) cos(δ ) + sin(ϕ PA − ϕ A ) sin(δ ) € € a cosΔϕ = a (cos(ϕ PA − ϕ A ) cos(δ ) + sin(ϕ PA − ϕ A ) sin(δ )) = = cos(ϕPA − ϕA ) € Δf f% FA + sin(ϕPA − ϕA ) FA f0 f0 € 15! & Δf ) f %% 2 2 2 FPH = FPA + a + 2 FPA FA ( cos(ϕ PA − ϕ A ) + sin(ϕ PA − ϕ A )+ = f0 ' f0 * = FPA € € 2 2 2 & Δf ) Δf 2 + ( f ##) f ## 2 + F + 2 F F cos ϕ − ϕ + sin ϕ − ϕ ( ) ( ) ( + A PA A PA A PA A f 02 f0 ' f0 * 2 2 ( ) FPH = FPA + p( λ) FA + 2 FPA FA q( λ)cos(ϕPA − ϕA ) + r( λ)sin(ϕPA − ϕA ) misura sperimentale € ∀λ ⇒ FPH (+), FPH (−) € FPA , FA , ϕ PA − ϕ A sono sufficienti 2 esperimenti (2 terne di valori p, q, r) con 2 lunghezze d’onda differenti: 4 equazioni in 3 incognite € ϕA € 2 equazioni in 3 incognite: è noto dalle posizioni degli atomi pesanti: mappa di Patterson diff. anomale 16! Scelta delle lunghezze d’onda sperimentali f ( λ) = f 0 + Δf (λ ) + if $$(λ ) = f $ + if $$ peak: f’’ massimo, Δf medio € remote1: f’’ medio, Δf grande remote2: f’’ minimo, Δf grande 17! inflection: f’’ medio, Δf minimo Configurazione assoluta degli atomi pesanti nel MIR: uso del segnale anomalo Δ F ano ≡ { FPH (+) − FPH (−) } f% ≅ FH% sin(α PH − α %H ) 2 f %% € FH" = € k sin(α PH − α "H ) { FPH (+) − FPH (−) } ≥ 0 sperimentale: dai dati isomorfi sperimentale 2 configurazioni degli atomi pesanti (α PH %' FH" ≥ 0 & '( FH" ≤ 0 %'+ α PH − α $H − α $H ) = & '(− α PH − α $H configurazione “giusta” configurazione “sbagliata” 18! € €
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