MODULO 2: infiammazione e immunità innata •  •  •  •  •  Lezione 2-12: Rinnovamento e riparazione tissutale regolazione della proliferazione cellulare e della crescita tissutale rigenerazione epatica matrice extracellulare guarigione: angiogenesi, cicatrizzazione fibrosi Dott.ssa Chiara Porta: [email protected] Tel 0321-375883 Riparazione del danno 1ssutale rigenerazione: ripris'no delle componen' tessutali in maniera iden'ca rispe2o a quelle rimosse o eliminate (cellule staminali integre, ECM integra) guarigione: rigenerazione + deposizione di tessuto fibroso (cicatrizzazione). risposta a una ferita, a processi infiamm. degli organi interni, a necrosi di tessu' incapaci di rigenerazione. Stem cells regenera1on and fibrosis ECM: fornisce un’impalcatura essenziale per la migrazione, e la polarità cellulare e per la ricostruzione delle stru2ure pluristra'ficate Deposizione di tessuto fibroso ferita: epitelio rigenerazione ma derma cicatrice di collagene cirrosi epa1ca Pneumoconiosi (silicosi, asbestosi) pericardite costri>va (cicatrice densa e fibrosa del pericardio) Esiti dell’infiammazione L'essudato è un liquido infiammatorio extravascolare con elevata concentrazione proteica (peso specifico >1,02) che si raccoglie nei tessu' del corpo so2opos' a un processo d'infiammazione. Se l’essudato non viene riassorbito o demolito avviene formazione di tessuto conneNvo e generazione di aderenze (es. la fibrina che si accumula in un essudato fibrinoso s'mola la proliferazione dei fibroblas' e la deposizione di tessuto cicatriziale: aderenze fra foglieN parietali e viscerali delle cavità sierose) il 'po di riparazione dipende 1)  en'tà del danno (ECM, cellule staminali danneggiate?) 2)  dalla capacità prolifera'va del tessuto danneggiato. Cell-‐cycle landmarks premito1ca Sintesi di DNA mito1ca presinte1ca Cellule quiescen1 The figure shows the cell-‐cycle phases (G0, G1,G2, S, and M), the loca'on of the G1 restric'on point, and the G1/S and G2/ M cell-‐cycle checkpoints. Cells from labile 1ssues such as the epidermis and the gastrointes'nal tract may cycle con'nuously; stable cells such as hepatocytes are quiescent but can enter the cell cycle; permanent cells such as neurons and cardiac myocytes have lost the capacity to proliferate. A>vità prolifera1va dei tessu1 • Tessu' labili: in con'nua proliferazione (epiteli della cute e delle mucose (gastrointes'nale, genitale urinario); mucose di rives'mento dei do> escretori ghiandole salivari, pancreas, tra2o biliare; midollo osseo e tessu1 ematopoie1ci) le cellule mature derivano da cellule staminali con capacità prolifera'va illimitata. • Tessu' quiescen' o stabili: bassa aNvità prolifera'va, ma possono andare incontro ad alta proliferazione (cellule parenchimali del fegato, reni, pancreas; cellule mesenchimali come fibroblas', muscolari lisce, endoteliali, leucoci' inaNvi). le cellule sono normalmente quiescien' (G0) ma in risposta a opportuni s'moli entrano in G1. • Tessu' perenni: non proliferan' (neuroni, muscolo cardiaco) le cellule hanno abbandonato il ciclo cellulare dopo lo sviluppo fetale e non possono più intraprendere divisioni mito'che Meccanismi che regolano il numero di cellule in un tessuto mioci1 e neuroni sono cell. completamente differenziate incapaci di dividersi. cell. del fegato e del rene invece sono normalmente quiescien' ma se necessario possono proliferare nei tessu' prolifera'vi (midollo osseo, epiteli) le cellule differenziate son incapaci di replicarsi tu2avia sono con'nuamente sos'tuite a par're dalle cellule staminali tessutali la proliferazione cellulare è controllata da segnali microambientali solubili e conta2o dipenden' •  accorciamento del ciclo cellulare •  reclutamento delle cellule quiescen' la dimensione della popolazione cellulare di un tessuto/organo dipende dall’equilibrio tra proliferazione, differenziamento e morte apopto1ca Cellule staminali: capacità autorigenera1va e replicazione asimmetrica STEM CELLS (proliferazione asimmetrica) Three possible outcomes of stem cell ac'va'on and cell division are illustrated: an “α” division represents the classic asymmetric cell division with renewal of the mother cell and genera'on of a daughter that enters a downstream transit popula'on. A “2α” cell division generates two iden'cal stem cells, increasing the number of total stem cells by one. Finally, a “μ” division generates two cells that enter a downstream transit popula'on, deple'ng the number of stem cells by one. The balance between “2α” and “μ” events determines whether a given stem cell pool will increase or decrease in number. •  cellule staminali embrionali •  cellule staminali dell’adulto CELLULE STAMINALI EMBRIONALI le cellule ES furono le prime staminali iden'ficate CELLULE PLURIPOTENTI isolabili da blastocis' (32 cellule) •  Embrionic Stem cells (ES): studio dei meccanismi molecolari che guidano lo sviluppo di mol' tessu' •  sviluppo di topi gene'camente modifica' per studiare malaNe umane e il ruolo di geni •  clonaggio terapeu'co per ripopolare organi danneggia' (fegato, cuore (infarto), cellule che producono insulina (diabe'ci) cellule nervose (patologie neurologiche) usando le cellule dello stesso paziente come donatore per evitare il rige2o immunologico Steps involved in therapeu1c cloning, using embryonic stem cells (ES cells) for cell therapy. The diploid nucleus of an adult cell from a pa'ent is introduced into an enucleated oocyte. The oocyte is ac'vated, and the zygote divides to become a blastocyst that contains the donor DNA. The blastocyst is dissociated to obtain ES. These cells are capable of differen'a'ng into various 'ssues, either in culture or ager transplanta'on into the donor. CELLULE STAMINALI DELL’ADULTO •  si trovano in par'colari sedi anatomiche de2e nicchie specifiche per i diversi tessu' A, Epidermal stem cells located in the bulge area of the hair follicle serve as a stem cells for the hair follicle and the epidermis. B, Intes'nal stem cells are located at the base of a colon crypt, above Paneth cells. C, Liver stem cells commonly known as oval cells) are located in the canals of Hering (thick arrow), structures that connect bile ductules (thin arrow) with parenchymal hepatocytes (bile duct and Hering canals are stained for cytokera'n 7. D, Corneal stem cells are located in the limbus region, between the conjunc'va and the cornea. •  la maggior parte delle cellule staminali 'ssutali hanno una capacità di differenziamento limitata a una sola linea cellulare (fanno eccezione quelle del midollo osseo che hanno un grande plas'cità di sviluppo) CELLULE STAMINALI DEL MIDOLLO OSSEO •  cellule staminali ematopoie'che (HSC) •  cellule pluripoten' stromali del midollo osseo Ac1va1on of key regulatory proteins by growth factors, cytokines, or matrix components leads to commitment of stem cells to differen1ate into specific cellular lineages. Differen'a'on of myotubes requires the combined ac'on of several factors (e.g., myoD, myogenin); fat cells require PPARγ, the osteogenic lineage requires CBFA1 (also known as RUNX2), car'lage forma'on requires Sox9, and endothelial cells require VEGF and FGF-‐2. le HSC hanno un notevole potenziale di differenziamento durante lo sviluppo embrionale si formano i tre foglieN germinali endoderma, mesoderma, ectoderma da cui derivano tuN tuN i tessu' dell’organismo. le cellule staminali adulte che risiedono nei vari organi possono solo generare cellule degli organi in cui risiedono. tu2avia, alcune cellule staminali del midollo osseo oltre a produrre le cellule del sangue (mesoderma) possono dare origine anche a cellule di orgine endodermica o ectodermica cellule progenitrici mul1poten1 dell’adulto (MAPC) isolate da neona' e dal midollo di roditori sono una popolazione di cellule staminali stre2amente correlate alle cellule ES; infaN pur trovandosi in tessu' diversi (muscolo, cervello, pelle, midollo osseo) sono molto simili tra loro , proliferano in coltura senza sviluppare senescenza e possono differenziarsi in cellule mesodermiche, endodermiche e neuroectodermiche MECCANISMI DI SEGNALAZIONE NELLA CRESCITA CELLULARE la rigenerazione e la riparazione 'ssutale è guidata da fa2ori di crescita molecole che oltre a s'molare la proliferazione cellulare possono regolare altri processi biologici importan' per il riparo come la mo'lità cellulare, la contraNlità, il differenziamento e l’angiogenesi le cellule rispondono alle molecole che esse stesse producono (rigenerazione del fegato, proliferazione dei linfoci', crescita dei tumori) le cellule che producono i fa2ori di crescita agiscono su 'pi cellulari diversi e vicini (es macrofagi-‐fibroblas') Segnalazione iuxtacrina:ligando è ancorato a membrana e promuove adesione cellula-‐cellula come gli ormoni anche fa2ori di crescita e citochine possono essere trasporta' dal sangue e agire a distanza rispe2a al sito di produzione Schema1c illustra1on of the role of cyclins Pro-apoptosis: Bax p21: inibitore delle chinasi ciclina-‐dipenden1 (CKI) TGFβ Cyclin B/CDK1 Cyclin A/CDK2 CDKs, and cyclin-dependent kinase inhibitors in regulating the G1/S cell-cycle transition. External signals activate multiple signal transduction pathways, including those involving the MYC and RAS genes, which lead to synthesis and stabilization of cyclin D (there are several D cyclins, but, for simplification, we refer to them as "cyclin D"). Cyclin D binds to CDK4, forming a complex with enzymatic activity (cyclin D can also bind to CDK6, which appears to have a similar role as CDK4). The cyclin D-CDK4 complex phosphorylates RB, located in the E2F/ DP1/RB complex in the nucleus, activating the transcriptional activity of E2F (E2F is a family of transcription factors, which we refer to as "E2F"), which leads to transcription of cyclin E, cyclin A and other proteins needed for the cell to go through the late G1 restriction point. The cell cycle can be blocked by the Cip/Kip inhibitors p21 and p27 (red boxes) and the INK4A/ARF inhibitors p16INK4A and p14ARF (green boxes). Cell-cycle arrest in response to DNA damage and other cellular stresses is mediated through p53. The levels of p53 are under negative regulation by MDM2, through a feedback loop that is inhibited by p14ARF. ERB B2 (HER-‐2/Neu c-‐MET 1) formazione di nuovi vasi (angiogenesi) 2) riparazione delle ferite (chemiotaNco per macrof. fibroblas', EC) 3) sviluppo del muscolo scheletrico e maturazione del polmone 4) emopoiesi e sviluppo dello stroma del midollo osseo TGFβ 1 svolge numerose funzioni: 1)inibisce proliferazione di cell epiteliali e leucoci' 2)s'mola la proliferazione di fibroblas' e cell muscolari lisce 3) è un potente fibrogene'co (s'mola chemiotassi dei fibroblas' e produzione di collagene, fibronec'na proteoglicani) 4) è an'-‐infiammatorio rigenerazione epa1ca come esempio di rigenerazione 1ssutale la capacità rigenera'va dipende dalla capacità delle cellule quiescen' di entrare nel ciclo cellulare e dall’efficienza del differenziamento delle cellule staminali più che rigenerazione nei mammiferi avviene CRESCITA COMPENSATORIA ovvero iperplasia e ipetrofia per ripris'nare la capacità funzionale di un organo ma non la sua originale anatomia roditore: epatectomia parziale Liver regenera'on ager par'al hepatectomy. The lobes of the liver of a rat are shown (M, median; RL and LL, right and leg lateral lobes; C, caudate lobe). Par'al hepatectomy removes two thirds of the liver A\er 3 weeks, the right lateral and caudate lobes enlarge to reach a mass equivalent to that of the original liver. Note that there is no regrowth of the median and leg lateral lobes removed ager par'al hepatectomy.. UOMO: epatectomia parziale per rimuovere un tumore o per il trapianto epa'co da donatore vivente Computed tomography (CT) scans of the donor liver in living-‐donor hepa'c transplanta'on. Upper panel, The liver of the donor before the opera'on. The right lobe, which will be used as a transplant, is outlined. Lower panel, A scan of the liver 1 week ager performance of par'al hepatectomy to remove the right lobe. Note the great enlargement of the leg lobe (outlined in the panel) without regrowth of the right lobe Timing of hepatocyte DNA replica1on, hepatocyte mitosis, and expression of messenger RNAs during liver regenera1on. DNA replica'on is shown as the incorpora'on of tri'ated thymidine × 10-‐4 (right-‐side scale). Mitosis presented as the percentage of hepatocytes undergoing mitosis (right-‐side scale). The expression of some of the many mRNAs in the regenera'ng rat liver is presented as fold eleva'on above normal (le<-‐side scale). Expression of the proto-‐oncogenes c-‐ fos, c-‐jun, and c-‐myc corresponds to the immediate early gene phase of gene expression during liver regenera'on. l’ondata replica'va degli epatoci' è poi seguita dalla replicazione sincrona delle cellule di kupffer, cellule endoteliali e le cellule stellate sono necessarie diverse ore prime che gli epatoci' quiescen' entrino nel ciclo cellulare procedano nella fase G1 ed entrino nella fase S la transizione G0-‐G1 è guidata dall’espressione dei proto-‐oncogeni c-‐fos, c-‐jun (AP-‐1) c-‐Myc; aNvazione di fa2ori di trascrizione NFkB, STAT-‐3, C/EBP durante la progressione di G1 vengono espressi altri geni (es Bcl-‐X) quindi la ciclina D con formazione del complesso ciclina D-‐CDK4 citochine e fa2ori di crescita regolano la proliferazione degli epatoci' di un fegato in rigenerazione Priming and cell-‐cycle progression in hepatocyte replica1on during liver regenera1on. Quiescent hepatocytes become competent to enter the cell cycle through a priming phase mostly mediated by the cytokines TNF and IL-‐6 (upper panel). Growth factors, mainly HGF and TGF-‐α, act on primed hepatocytes to make them progress through the cell cycle and undergo DNA replica'on (lower panel). Norepinephrine, insulin, thyroid hormone, and growth hormone act as adjuvants for liver regenera'on. The factors that determine the termina'on of cell replica'on are not known but are likely to involve cell cycle inhibitors, shut-‐off of growth factor produc'on, and decreased metabolic demand on the liver. LA MATRICE EXTRACELLULARE e presente negli spazi tra cell epiteliali, endoteliali, muscolari lisce e conneNvo prodo2a dalle cell epiteliali e mesenchimali è stre2amente connessa con la superficie cellulare •  secreta localmente si organizza a formare una rete negli spazi che circondano le cellule. •  sequestra acqua (turgore per i tessu' molli) o minerali (rigidità per i tessu' duri), agisce da serbatoio per i fa2ori di crescita, regola le interazioni cellula-‐cellula, adesione, migrazione e proliferazione cellulare •  sintesi e degradazione dell’ECM accompagnano la morfogenesi, la guarigione, i processi fibro'ci cronici e l’invasione/metasta'zzazione tumorale. composta da 1) proteine fibrose stru2urali (collagene elas'na) 2) glicoproteine di adesione 3) proteoglicani e acido ialuronico. sia le cellule epiteliali che mesenchimali (es fibroblas') interagiscono con la ECM a2raverso le integrine Main Types of Collagens, Tissue Distribution, and Genetic Disorders Collagen Type Tissue Distribution Genetic Disorders I Ubiquitous in hard and soft tissues Osteogenesis Imperfecta Ehlers-Danlos syndrome-tipo artrocalasia (lassità dei legamenti e iperelasticità della cute) II Cartilage, intervertebral disk, vitreous Acondrogenesi tipo II, sindrome della displasia spondiloepifisaria III Hollow organs, soft tissues Vascular Ehlers-Danlos syndrome V Soft tissues, blood vessels Classical Ehlers-Danlos syndrome IX Cartilage, vitreous Stickler syndrome (facial abnormalities, ocular problems, hearing loss, and joint problems) Fibrillar Collagens Basement Membrane Collagens IV Basement membranes Alport syndrome (perdita di funzione renale e uditiva) VI Ubiquitous in microfibrils Bethlem myopathy VII fibrille di ancoraggio alle giunzioni tra derma e epidermide epidermolisi distrofica bullosa (comparsa di bolle, sia a livello della pelle che nella mucosa) IX Cartilage, intervertebral disks displasia epifisaria multipla XVII Transmembrane collagen in epidermal cells epidermolisi bullosa generalizzata atrofica benigna XV and XVIII Endostatin-forming collagens, endothelial cells Knobloch syndrome (type XVIII collagen) Other Collagens fibre elas1che conferiscono elas'cità: nucleo centrale di elas'na circondato da una rete periferica di miofibrille (fibrillina). Sindrome di Marfan (fibrillina) alterazioni del sistema cardiovascolare (dissezione aor'ca) e dello scheletro Le componen1 della ECM (fibronec1na, laminina) e i fabori di crescita influenzano la mo1lità la proliferazione il differenziamento e la sintesi proteica cellulare (sia interazione tra le due classi di molecole che a>vazione delle stesse vie di trasduzione del segnale) Integrins bind ECM components and interact with the cytoskeleton at focal adhesion complexes (protein aggregates that include vinculin, α-‐ac'n, and talin). This can ini'ate the produc'on of intracellular messengers or can directly mediate nuclear signals. Cell-‐surface receptors for growth factors may ac'vate signal transduc'on pathways that overlap with those ac'vated by integrins. Collec'vely, these are integrated by the cell to yield various responses, including changes in cell growth, locomo'on, and differen'a'on. Guarigione è una risposta fibroprolifera'va che volge a riparare le componen' tessutali danneggiate consiste in un insieme ordinato di processi: • Induc'on of an inflammatory process in response to the ini'al injury, with removal of damaged and dead 'ssue • Prolifera'on and migra'on of parenchymal and connec've 'ssue cells • Forma'on of new blood vessels (angiogenesis) and granula'on 'ssue • Synthesis of ECM proteins and collagen deposi'on (scar forma'on) • Tissue remodeling • Wound contrac'on • Acquisi'on of wound strength ANGIOGENESI è cruciale durante l’infiammazione cronica, nella crescita tumorale e nella vascolarizzazione dei tessu' ischemici. Può avvenire per 1)  mobilizzazione di precursori delle cellule endoteliali (EPC) dal midollo osseo 2)  crescita dei vasi preesisten' Angiogenesis by mobiliza'on of endothelial precursor cells (EPCs) from the bone marrow EPCs are mobilized from the bone marrow and may migrate to a site of injury or tumor growth. The homing mechanisms have not yet been defined. At these sites, EPCs differen'ate and form a mature network by linking with exis'ng vessels. Regardless of the ini1a1ng mechanism, vessel matura1on (stabiliza1on) involves the recruitment of pericytes and smooth muscle cells to form the periendothelial layer. 1.  aumento della permeabilità vascolare 2.  retrazione dei perici' 3.  degradazione della membrana basale 4.  migrazione delle EC 5.  proliferazione delle EC 6.  maturazione delle EC (inibizione della crescita e rimodellamento dei capillari) 7.  reclutamento delle cellule periendoteliali (stabilizzazione) Meccanismo dell’angiogenesi 4 1 5 2 1  2  3  4  5  6  3 6 Retrazione dei periciti Rilascio di proteasi da cellule endoteliali stimolate Migrazione e proliferazione di cellule endoteliali Aumento della permeabilità Formazione del lume e maturazione del vaso (tubuli) Differenziazione e stabilizzazione di nuovi vasi Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Proteins Family members: VEGF (VEGF-A), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D Dimeric glycoprotein with multiple isoforms Targeted mutations in VEGF result in defective vasculogenesis and angiogenesis Production Expressed at low levels in a variety of adult tissues and at higher levels in a few sites, such as podocytes in the glomerulus and cardiac myocytes Inducing Agents Hypoxia TGF-β PDGF TGF-α Receptors VEGFR-1 VEGFR-2 (restricted to endothelial cells) VEGFR-3 (lymphatic endothelial cells) Targeted mutations in the receptors result in lack of vasculogenesis Functions Promotes angiogenesis Increases vascular permeability Stimulates endothelial cell migration Stimulates endothelial cell proliferation VEGF-C selectively induces hyperplasia of lymphatic vasculature Up-regulates endothelial expression of plasminogen activator, plasminogen activator inhibitor-1, tissue factor, and interstitial collagenase VEGF di neosintesi e ancorato a ECM (rilasciato via metalloprotease ac'va'on ) stabilizzazione dei nuovi vasi (perici', cellule muscolari lisce, proteine della ECM): Ang1 legando Tie2 s'mola il reclutamento delle cellule periendoteliali PDGF: partecipa al reclutamento delle cellue muscolari lisce TGF-‐beta s'mola la produzione di ECM Matrix metalloproteinase regulation. SINTESI COME PRECURSORI LATENTI eg. ROI Zinco-‐dipenden' Four mechanisms are shown: (1) regula'on of synthesis by growth factors or cytokines, (2) inhibi'on of synthesis by cor'costeroids or TGF-‐β, (3) regula'on of the ac'va'on of the secreted but inac've precursors, and (4) blockage of the enzymes by specific 'ssue inhibitors of metalloproteinase (TIMPs). Phases of wound healing scar mastoci' eosinifili linfoci' Growth Factors and Cytokines Affec1ng Various Steps in Wound Healing Monocyte chemotaxis PDGF, FGF, TGF-β Fibroblast migration PDGF, EGF, FGF, TGF-β, TNF, IL-1 Fibroblast proliferation PDGF, EGF, FGF, TNF Angiogenesis VEGF, Ang, FGF Collagen synthesis TGF-β, PDGF Collagenase secretion PDGF, FGF, EGF, TNF, TGF-β inhibits Steps in wound healing by first intention (left) and second intention (right). Note large amounts of granulation tissue and wound contraction in healing by second intention Basal membrane Contrazione: fibroblas' and miofibroblas' per prima intenzione È il caso delle ferite da taglio, delle quali rappresenta un esempio quella chirurgica, lineari o a grande curvatura, a margini neN e sopra2u2o suturate. Tale procedimento, infaN, riducendo al minimo la perdita di sostanza per accostamento dei lembi, ne favorisce il riempimento da parte del tessuto di granulazione con tempi di cicatrizzazione veloci e risulta' este'ci buoni. per seconda intenzione Riguarda le ferite non suturate e quindi lasciate aperte, per scelta o per necessità. In ques' casi il tessuto di granulazione, che si forma sul fondo della lesione, per riempirla deve procedere dal basso in superficie con un processo che richiede tempi più lunghi e che può determinare ineste'smi anche gravi. Appartengono a questo gruppo le: ferite lacero-‐contuse, inquinate o infe2e, perdita di sostanza per terza intenzione Questo 'po di guarigione riguarda le ferite chirurgiche andate incontro, nel decorso post-‐ operatorio, a una deiscenza parziale o totale. Healing of skin ulcers A, Pressure ulcer of the skin, commonly found in diabe'c pa'ents. The histology slides show B, a skin ulcer with a large gap between the edges of the lesion; C, a thin layer of epidermal reepithelializa'on and extensive granula'on 'ssue forma'on in the dermis; and D, con'nuing reepithelializa'on of the epidermis and wound contrac'on. Factors That Retard Wound Healing Local Factors Blood supply Mechanical stress Denervation Necrotic tissue Local infection Protection (dressings) Foreign body Surgical techniques Hematoma Type of tissue Systemic Factors Age Malnutrition Anemia Obesity Drugs (steroids, cytotoxic medications, intensive antibiotic therapy) Systemic infection Temperature Trauma, hypovolemia, and hypoxia Genetic disorders (osteogenesis imperfecta, Ehlers-Danlos syndromes, Marfan syndrome) Uremia Vitamin deficiency (vitamin C) Hormones Trace metal deficiency (zinc, copper) Diabetes Malignant disease A, Keloid. Excess collagen deposi'on in the skin forming a raised scar known as keloid. Keloid B, Note the thick connec've 'ssue deposi'on in the dermis. The persistent s'mulus of chronic inflamma'on ac'vates macrophages and lymphocytes, leading to the produc'on of growth factors and cytokines, which increase the synthesis of collagen. Deposi'on of collagen is enhanced by decreased ac'vity of metalloproteinases.