l l l l l l - Istituto Superiore di Sanità

l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
ESPERIENZE E RICJ.iRCJIE
l
l
l
Valutazione di alcuni test chimici, colturali e
nell'esame hattet·iologico delle udne
Ltno CAPOCACCI A.
c.. . ,.u.to
UHA l\-DI-'rARTE
t'
citologici
l'tt.RJo'IIAM.E,.I.o (J L\ DHI
l Cfi11ica d •lf f' Malatt ie ln.fett it·t•, Romu
l
l
l
l
l
l
l
Riassunto - Gli AA. hanno stuòiato 433 uriuocolture paragonando il
cla sico metodo della conta s u pias tra con i t est chimici di riduzion e Òt·i uit rati c del t ctrazolio c ron la colorazione di Sternhcimcr c Malbin.
Dai dati ott enuti, sia il tes t di riduzione d ci Jtitrati che qu(•llo di riduzione del t et razolio sembran o as;;ai validi, presentando un a bassissima fal sa
positività (circa l % ) e, al contrario, un alto indice di reale positivi là (s upl'riorc a l 90 % ). Anche ]a ricerca d ci leuéociti blu , se ben condotta , appare
di notevole aiuto n('lla diagnosi di infezione (o Hogosi) delle vie urinaric.
Summary (Eraluation of some tests Jor tlw bactcriologicul analysis of urinl') .
Data obtained on 435 urine sample:-. u sing thc agar pour p late tcchnique,
thc nilrate rcduction tes t , t hc t etrazolium reduction te ~ l and the research
for Lluc stained leucocytes are reportcrl.
l) Thc thrct> teRts present a v ery low iudcx of fa be po ~ itivit) (approximatcly l % );
2) Thf' rcduction of o i lra t c;; te.,t an d te trawlium redurt io n te~ t
rcvcal th(' grcat mHjorit) of infcrtion s by gram 1wgat.ivc bacleria (approximatel y 90% );
3) The micro-organisms which are nol d etcctcd by tlt e;;e two
tests are slaph ylococci and ycasts, Lut s trains o( other spec ics m:l\·
occasionally be missed;
4-) Thc prese n cc of blue s t ain cd lcucocytes appear:; ai' a Yalid clcmrn l
in the diagnosi;; of urinary infcct ion or infiammation.
I l\TRODl'ZlO "E
L e picloncfriti co~ titui sco no un a d elle più frequenti afrczioni dell' albero
urinario. KA SS (1957) ha riportat o che lesioni pieloncfritich e vengono riscontrate nel 10-20% di tutte le autopsie. Stime più rest rittive, che n on
prendono in considerazione le piccole lesioni flogistich e ma solo quelle difAtlll. [ ,, l. Sn1>rr. Srtnilri ( 197 3) 9, lù~ Il i
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
CAPOCACCIA , BRAND IMARTE E QU AD RI
10 3
fu se, hanno dato valori d el 3% (PAWLOWSKI, BLOXDORG & KIMMELSTIEL'
1963). L'importanza d elle pielonefriti n el determinismo di gravi quadri
morbosi, il più importante dei quali è l'insufficienza renale, non ha bisogno
di essere illustrata.
Da t o il frequ ente decorso subdolo d elle pielonefriti, la loro diagnosi
risulta spesso difficile. MAC DONALO et al. (1957), sul materiale autoptico
esaminato, hanno riscontrato che la pielonefrite era stata diagnosticata in
v ita solo n el 20-30 % dei casi.
Ai lavori di Kass e Coli. si deve, inoltre, la definizione di batteriuria
a;;intomatica, che costituisce un importante problema igienico-sanitario nelle
popolazioni socialmente più progredite. Sono noti, infatti, i rapporti tra
batteriuria asintomatica e ipertensione (MrALL et al., 1962), gravida nza
(MAc DONALO et al., 1957), pielonefrite (KAss, 1962), età c strati sociali
(K UNIN, 1966).
La subdolità delle p ielonefriti e la frequenza delle batteriurie asinto·
matiche ba richia mato l' attenzione sull'impo rtanza dell'esame batteriologico
delle urine, quale principale, e spesso unico, segno diagnostico precoce di
tali condizioni. L' abbondanza d ei lavori su tale argomento n egli ultimissimi
anni test imonia la validità di questa ricer ca .
Non ostante ciò, non esiste accordo preciso sul migliore metodo d a im·
piegare ai fini di tale accertamento. Di fo ndamentale importanza, in quest o
settore, è stato il criterio di 100.000 germi per ml quale indice discriminante
tra batteriuria significativa e contaminazione (KASS, 1957). Con poche riserve,
questo criterio b a resistito a d ogni critica ed è oggi universalmente praticato.
Sal vaguardando questo principio generale, numerosissimi son o i metodi
proposti per l' esame batteriologico delle urine, t endenti sostanzialmente
tutti a fornire un inoculum stanùard su un terreno standard senza conservazione delle urine con una m etodica semplice. Ricordiamo il m etodo su
vetrino con t erreno di coltura (ARNEIL, )le ALLISTER & KAY, 1970), il metodo
del tampone (BnADLEY, CnoWLEY & DAttRELL, 1967), il metodo dell' inoculum con carta bibula (LEIGH & WILLIA~t s, 1964), la tecnica d el terreno
di trasp orto con inoculum ad immersione (MACKEY & SA~ DYS, 1965), la
tecnica d ella semina con ansa sostenuta da HAUGEN, STROM & OsTERVOLD
(1968). Non c'è però a ccordo su qu esti diversi m etodi, che non paiono abbastanza diffusi per poter ricevere un giudizio preciso. Più studiati, e quindi
meglio giudicabili, sono i test chimici d ella riduzione dei nitrati e d el tetrazolio, particolarmente utili n ello screening di massa.
Anch e la presenza di piuria, quale indice di fl ogosi urinaria, è stata
oggetto di critica e di rev isione. RESNICK et al. (1969) hanno riportato che
il 33 % dei pazienti con batteriuria asintomatica non presentavan o piuria e
che nel 50% dei piurici n on era p re ·ente battcriuria significativa .
• Lnn.
/.~ /.
S ttpcr. :;an i l à ( l !li :!) 9, 10:!- 111
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
fl '
l
l
Scopo di qucstu la"oro è appunto di ntlutan~ colllJHtrati,·amente i riF>ulta t i oltC'nu ti con il classico wetodo della con la su diluizioni in pia;:; tra ('
«]uclli oltcniùili cou il t C1-i t ai nitrati di Gricss, con il t est al tctrazolio e~egucndo
sulle urine anche la ricerca dei lcucociti vitali sc>eomlo Sn:n NJJ EI.:Il EH &. ~IAL
BTN (1949; 1931).
l
l
l
l
l
l
l
JVI ,\TEfU :\LI E
l
.~tETOJ>I
l
1 f' urine .. vnu ,Late rarcoltc dopo aver scartato la J.H·ima parte del gctt•1
t' dopo la pulizia drlle parti genitali con permanganato di potassio l : 10.000.
'P<·r i malati rirovcrati è stato utilizzato perFonal(' infermicri .. tico istruito.
Quando possibile, le urin e sono st at e raccolte nel pomeriggio p er cvitan•
la permanenza in vescica p er tutta la nott«'. l primi SO carnpioui sono sta t i
studiati in d oppio: suhito dopo il prdicvo e dopo 12 ore di permanenza in
frigorifero a 4,oc. Mentre p er l'esame dei lcueociti tale permanr uza ha cor-tituito m otivo di variazioue, n ess una altcraziot1 c è stata trovata prr Ja ·conta
su piastra, p er il test al t ctrazolio e per il t est di Gric::.s. Ciò è in accordo
con a le une segnalazioni sulla possibilità di mantener(' in frigorifero le uri ne
per l settimana senza che si verifichino alterazioni dci hattcri c delle loro
carattcrif'tich c (R ESNICK et al., 1969). H t est di colorazione dei leucociti
;;econdo STERNHElliiEH & MALBIN (1949; 19.31) è f' tato quindi eseguit o subito
dopo il prelievo, mentre per gli altri t !'!'t l'esecuzione è st ata talora rimandata
di 12 ore l'econdo )e DCCCFI<i t~l.
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
Con tu su piastra.
l
Di ogni campione di unna :;ono st ate preparate tre diluizioui (l: 10.
l : 1000, l : 100.000) c di queste l m l è stato sem in ato in pia ~; tre con 15 ml
di agar triptosio, !'Ciolto prima di essere versato in piastra. Sono state considerate positi\·c quelle piastre con la crescita di ahucuo l colonia alla diluizione l : 100.000. Con sigliamo di c;.;cguirc anche le altre due tliluizioni come
coutrolli. Dopo 24 h a 37c.C sulle colonie i~olatc !'Ono stati compiuti i n ormali procc!'si di identificazione. Sono stati seartati i batteri gram poFi ti,·i.
l
l
l
l
l
l
l
l
l
Test al cloruro di trifcnil tetrazoliu (1'. T . C.).
Si sciolgono mg 750 di T.T.C. in 100 ml di soluzione satura di :Xa 2 HPO~ ,
si fi ltrano per Scitz c si cou,;ervano in b ottiglia sterile c scura a 40C. Questa
;;u)uzionc madre è stahilc per 15 gg. La sol uzion e fi glia, a nrh'cssa da conser vare nelle stesse condizioni, si prepara aggiungendo 4 ml della soluzione
madre a 100 ml di Na 2HP0 .1 saturo cd è stabile per 4 giorni.
La prova vien e eseguita aggiungendo 0,5 ml d ella soluzione figlia a
2 nù di urina e p onen<lo in termostato per 6 ore. Il test è positivo quando
l
l
l
l
l
l
l
l
l
A 1111. ] .ç (. Su 11cr. 8<111 i/tì ( 19 7 3 J 9, JC)2 l l
t
l
l
l
l
l,,
C.APOCACCI.o\, BRANDlMARTE E QUADRl
105
si fo rma un precipitato rosso in fondo alla provetta. Com'è noto, il t est si
basa sulla riduzione del T.T.C. da parte dell'attività deidrogeoasica dei batteri, purchè essi siano in numero significativo e siano dotati di tale attività.
T est di ridu:ione dei nitrati o test di Griess.
Si prepara una soluzione di nitrato di p otassio al 10% e se ne aggiungono
0,5 mi a l ml dell'urina da esaminare. D opo 90 minuti, si aggiunge l ml
del reattivo di Griess composto da parti eguali delle due seguenti soluzioni:
Soluzione A - Acido solfanilico. .
Acido acetico 10%
g 1,5
ml450
Soluzione B - Naftilamina
Acqua distillata
g 0,6
ml60
Prima di essere mescolate, le due soluzioni vanno filtrate per carta
bibula dando la precedenza alla soluzione B. Il test è positivo quando si ottiene una colorazione diffusa variante dal rosa pallido al rosso intenso. Il
t est è basato sulla riduzione dei nitrati in nitriti da parte dei batt eri, purchè
in numero significativo e in condizioni di produrre la reduttasi. La negatività del test riportata da vari AA. può essere dovuta alla mancanza dei nitrati nell'urina: la semplice aggiunta del nitrato, come abbiamo fatto accogliendo il s uggerimento di B uLLEN & KINCAID-SMITII (1967), può facilmente
ovviare a questo inconveniente.
Colorazione di Sternheimer & Malbin.
Il colorante di St ernheimer & Malbin viene così preparato:
Soluzione A - Cristalvioletto
Alcool etilico al 95 %
Ossalato di ammonio
Acqua distillata
g 3
Soluzione B
g 0,25
milO
mllOO
Safranina
Alcool etilico al 95 %
Acqua distillata
ml20
g 0,8
ml 80
Le soluzioni vanno filtrate per carta bibula c possono essere conservate
in bottiglia scura per molto tempo. Il colorante, che è bene preparare al
momento dell'uso, è costituito da 0,3 ml della soluzione A c da 9,7 della
soluzione B. Si aggiungono 0,5 mi di quest a miscela a 0,5 ml di urina da
esaminare. Si prelevano alcune gocce e si mettono in camera di Buerker
per la conta dei leucociti che verranno riportati per mm3. I leucociti appaiono
di 2 tipi: un t ipo con citoplasma pallido c nucleo rosso cupo cd uno con nucleo colorato in blu chiaro. Quando almeno l leucocita di questo tipo era
presente nella camera, il test è stato considerato po itivo.
Artn. Jsl. S UJICr. Stm i là ( 197 3) 9, 102- 111
4
106
Ei' l' E iliE:'IZ E E IH CF: II(: tU:
HI S\ LTATI E CO.m fEì\TO
Son o state esaminate 435 urine provenienti da di\·ersi grupp i d i :-~o~~et t i
(Tah. l ). In un primo gruppo sono state incluse 100 urine di soggetti saui.
senza st oria urinaria p recedente, con urina sterile e priva di piuria . Quest i
100 campioni sono ser viti di controllo p er cal colare, in maniera il più po !-:-~ i
bile precisa, la falsa positiv ità dd test di Gricss, del T .T.C . e della colorazione
di Stcrnheimer e Malbin .
I n un secuudu gruppo sono stati inclusi 113 campioni di urine provenienti
da soggetti afrctti da p iclonefritc in atto o da cistopielitc in a tto, ~enza antibiotici da almeno 48 ore. Questi Ca!'i hanno costituito il gruppo sul quale
valutare la positività dei 2 test chimici e del test leucocilario ri ~p e tto a
quella fornita dal metodo della conta su piastra di agar, considerato comu nemente come il m etodo più efficace. In sostanza, F;u questo grupp o t' stata
v alutata , più ch e la fal sa positività (valutata sul primo gruppo), la falsa n egatività dci 2 test chimici . c del t est leu cocitario.
In un t erzo gruppo sono stati inclusi 216 campioni di urine provenienti
da pazienti affetti d a nefropatic di natura infiammatoria ovvero sosp ett i
di affezioni di tale natura. Si tratta, però, di campioni giunti nel nostro l ab orat orio senza un preventivo accertamento nè clinico n è terapeutico. Il
terzo gruppo, quindi, costituisce un gruppo non omogeneo e non selezionato
sul quale è difficile v alu tare il valore dei singoli test . Costituisce solo un buon
indice di un gruppo di urine, quale quello che probabilmente capita in laboratori di batteriologia clinica.
In un quarto gruppo sono stati inclu;;i 6 r asi di b atteriuria a sintomatica
scoperti durante il raggruppamento dci 100 casi controllo (primo gruppo) .
Come risulta evidente dai dati relativi al primo gruppo, sia il test di
Griess che il test al T.T.C. e la colorazione di Sternheimer e Malbin presentano un basso indice di falsa p ositività (tra l' l e il 2 %). Si tratta, quimli .
di t est ch e vanno considera ti v eritieri ogni qual volta siano p ositivi .
Esaminando i dati relativi al secondo gruppo, ris ulta subito evidentr
che l'urinocoltura s u piastra non è positiva in tutti i casi in cui sarebbe
da aspettarsi questa p ositività. Su 113 casi, infatti, elezionati a ccuratamente
in quanto tutti affetti da n efro patie infettive in a tto, solo in 84 (cioè nel
74% circa) si è av uta un' urinocoltura p ositiva. Si tratta di un dato che può
essere spiegat o con l'ipotesi che, in alcuni di questi casi, esisterebb er o ancora
antibiotici in grado di interferiTe con la crescita batterica, nonostante che
fosse stata in tutti prc critta la ces azione d ella terapia antibiotica per almeno 48 ore prima della r accolta delle urine. Altre ipotesi sono una po ~;s i
bile p ollachiuria (N ORDE N & KAss, 1968) o la presenza di inibitori u rinari
(GuosH, 1970). In 2 casi abbiamo riscontrato un numero inferiore ai 100.000
batteri p er m i : dato lo scopo del nostro lavoro le rispettive urinocolture
n on sono state considerate posi ti ve. Su un piano diverso, p erò, quale può
A 1111. l sl . Suprr. S <m i l ù ( l !l7:J ) 9 . 10~-1 1 1
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l .;i
....
o
!'>
""""
<O
~
";:.
~
:-o
::;
r
~
"...."
.
-.
--
- · ·-
·•
(*)
6
l
- ---
l
l
..
(*)
6
26
(12 %)
84
(74%)
-
Urinoc<Jiture
positive
l
~
-· .
TABELLA
~
l
l
l
l
l
3
%)
(*)
(6
14
76
(67 % )
-
i
l
l
l
l
·-----·----·-
-
l
(0,4 %)
(0,9 %)
l
2
(2 %)
- -·
3
(*)
16
(7 % )
78
(69 % )
-
-
(0,4 % )
l
(0,9 %)
1
(l%)
l
l
-
(2 %)
4
4
(3 % l
(l%)
l
i
1
l
- - · - - - -- - - - -1
(*)
t
(5 % )
12
69
(61 %)
-
Te; t
Test
di Sternbeimer
Test al T .T.C.
di Sternheimer
'T e.; l tli Grie.ss Te; t di Grien Te, t al T.T.C.
(al ~amente
e Malbin
fahumente
..
e Malbin
positivo
po.;iti\'O
pO~lttYO
fal:;amente
positivo
po~iti'\'O
p os itivo
---
(*) Data l'esiguità del numer o non è riportata la percentuale.
-- -
Batteriuria asintomatica con urinoeoltura positiva(*).
216
113
Pielonefriti o cistopieliti in atto.
N efropatia di (liversa natura (gruppo
non omogeneo e non selezionato).
100
Numer()
di osservazioni
Casi controllo (assenza di storia urinaria, non elementi patologici nelle
urine, urinoeoltura sterile).
- - ··-
... !.t
Risultati su 435 urinocolture eseguite tra il gennaio 1970 e il marzo 1972
-
......
o.....,.
::!
>
c:
o
,o
M
>-l
M
~!>l
t;)
7.
>
!>l
C:l
;;:
("J
o("J
>
("J
(">
.,>
lll ll
.E~l 'EIIIE !'\ZE
1-: III CJ·: HCI!E
~'""e re
CJudlo clinico, riteniamo giusto n on applicare il critl'rio in manil'ra
tropp o rigida. Un Luon crit erio sarà, in tali ca si, l a riconferma d ello stc,;so
germe in successive urino eoltur(~ (NonDBN & KASS, 1968). Durante la nostra
indagine, comunque, t' st ata assai rara l'evenien za di urinocolture cou n um eri di ~!ermi a ssai v icini ai 100.000 per ml : o si era molto lontani da t a le
cifra o la si s uperava in mod o co n sis tent~.
Il tes t fii (;rif'>'" ì· ri "u ltato p ositi\·o in 7G Ji. 'iw~:, tc 84 urinoeoiturc con
una percentu ale d el 67 % risp etto ai 113 casi esamina ti , ma del 90 % rispcllo
a l m etodo della conta S \1 piastra . Percentuale ottima, s uperiore a quella ottenuta da altri ricercatori (SMITH et al., 1961; SM ITH & SCIIMlDT, 1962:
Kl;NIN, 1964; STEWAHT, KisEn & NITz, 1968). Hiteniamo che lo scarsissirnn
numero di fal Fc n e~a ti v ità da n oi ottenuto sia legato alraceorgimcnto ùi
aggiungere all'urina il nitrato prima dell'esecuzione del test (B ULLE~ & KI :"CAlD-Sl\nTIJ, 1967) p er fornire sufficiente s uhstrato alla rcduttasi batteri ca .
Uno dei m otivi, infalli, p er cui questo tc~ l è spe~so risultato nega tivo n elle
prove su pazienti ricoverati è stato proprio la scarsit~1 dei nitrati n ella dieta
ospcdaliera (SMITH & ScnMIDT, 1962). Tra i germi che sp esso sono la causa
della ncgati vità del t est di Gricss rientrano le candide e alcuni ceppi di piocianco (TaL. 2) . Di particolare rilievo, lo scarsissimo numero di false positività (meno dell' l o/o).
Per quanto riguarda il t est al T.T.C. , esso ha dato risultati sovrapponibili a quelli del t est al nitrato: 78 positività su 84 urine positive con il m et od o su piastra (rirca il 93%). È verosimile ritenere che i risultati da noi
ottenuti, migliori di quelli avuti da altri ricercatori, siano dovuti all'impiego
di preparazioni fresche del colorante, con conseguente notevole ùiminui ziooe delle false negatività , in accordo con R ESNJCK l't al. (1969). È stata
ri contrala la n egativit:'a del t est p er alcuni ceppi di stafìlococco, p er le candide c p er lo streptocorco fecale (Tab. 2). Anche per questo t est è stato bassissimo il numero d elle false p ositivi t~' (meno dell'l %) .
Anche il test di Stcrnheimcr e Malhin in nostre mani ha dato ris ultati
soddisfa centi: 69 positività sulle 84 evidenziate colturalmente (82 % circa).
Dati non m ollo diversi da quelli ottenuti con i due test precedenti. Un po'
più alto il numero delle false positività (approssimativamente il 4 o/o) . Rit eniamo importan te sottolineare che questo test va considerato p ositiYo con
piì1 di l leucocita blu per roma. Per quanto riguarda il sitgnificato di questa
prova, è ormai scartata la primitiva idea di STEH NHETl\lER & MAI. DIN (19-t9)
che riferiva i leu rociti blu alle pielonefriti solamente. A nch e l' ipotesi ch e
t ali leucociti :::ignifìcasscro uno stato di d anno n on è più acce ttata. l m olti
studi di HAnnrs (1969) hanno dimostrato che la colorazione di questi ]eurociti sta piuttosto a dimostrare un segno di vitalità c ch e la loro presenza in
numero di alm eno l leu cocita per mm 3 in urina n on centrifugata sta ad indicare un segno di flogosi in atto anche se non n ecessa riament e d ' infezione.
An1t. Jsl. Sowr. Sanità ( l!l i:l) 9,
IO~ Ili
109
I d ati relativi al terzo gruppo mal si adattano ad una analisi cnttca,
provenendo da p azienti non omogenei, affetti da nefropatia non accertata
c uon selezionati n ei criteri di base, quale quello dell'assenza di antibiotici
da almeno 48 ore. L'esiguo numero di urinocolture positive (26 casi su 216
rampion i) può essere facilmente spiegato con la natura n on infettiva delle
m.fropatic di questo grup po cfo con la presenza tli antibiotici nelle urine.
\1<'110 facile da spiegare il maggior numero di false ncgatività mostrato 1lal
t t•st di Gricss, dal t est al 'I'.'I' .C. c dalla colorazione di Stcrnheimer e ~I a l b in .
P er quanto riguarda i due test chimici si potreb b e ipotizzare che nelle urine
fossero presenti sostanze non atte a inibire la <:rescita batteril:a, ma su ffi cienti
a modifica m e l' attività metabolica cellulare. Un a causa sicuramente v al ida
ì· rappresentata dalla presenza fo rtuita, in questo gruppo, di cep pi non produllori J cllc rcduttasi. Basti d ire che i 4 ca si in cui f u riscontrata un'a:;soStaphy lococcus arueus, 1--:. coli
Staph.
r iazione batterica (Ps. aerug i noset
uureus) apparten gono proprio a questo gruppo. Lo stesso dicasi per alcuni
l'cppi eli E. coli non produt tori 1li rccluttasi. Più difficile i! s pie~are la nPgat ività della colorazione tli S tcrnhei rncr e Malbin; e 'era in fa t ti <la attender!-li
un aumento delle false posit ività per strumentazion i cffclluate su questo
gruppo di pazienti, che come s'è detto non è stato selezionato. Proprio tale
mancato selezionamento ci impedisce delle conclusion i vali1le.
Durante il selezionamento dci 100 casi controllo (primo g ruppo) sono
~ tatc svelate 6 hattcriuric a sin torna tich e, che hanno costituito il quarto gruppo.
I n 3 di tJUCsti casi fu isolato Staphylococws aurettS in numero significativo.
Data la ncgatività di questo germe n ei confronti d ci test ehim ic i, si cap isce
faci lmente la loro n ega tiv ità. La colorazione di Stcrnhcimcr c .\'1albin (:
+
+
TABELL.,
2
Ceppi i olati dalle ll6 minocolture positive e rispettive posith•ità ai test chimici
e alla colorazione di Sternheimer e Malbin
l
Totale
i .u)umen1i
.•
.
.
1 .
.. ,
1eH ,Ja (. ne-. l l <'• t •l l . r.r.
P'J-4 ,
pn~.
.
1 ,,
....o l uraz1une
t
l
~
h .•.\l a lb'm
11. .:oll'rn
puc
- - - -l
E. l'O li
l'rott· us sp.
1'~. acruginosa.
Staph. aureus .
,\ rrobacter aerogcucs.
\lkaligcnes faecalis .
Candida sp . . . . . .
S t.tJ•IJ. •• p,, at·ru:;inosa
Stuph. + E. coli.
Str. faecalis . .
l'rovidcnria ~p . .
TOTAL.I
:i7
:n
LO
l
~
.io
29
7
l
:l
:; L
:IO
l!
..
•)
.l
2
•)
·)
2
ti
Il
Il
tl
Il
f)
H
o
Il
l)
fJ
l)
l
l
l)
91
'J7
fl3
.,
l lfi
,.
l l lt
risultata I)O~ Jtl v a m 4 ca ~ i . Qu esti 6 casi eran o tuttt> domH' con gravidanza
nel loro reeent c passato. Le pazienti sono s tate trattate fluo a nc~ati vizza
:r.ione del r r iH'rto cd inv itate a sottopors i ad una ~eri e d i test di f unzionalità
renale, n on cl•t· a t ornare p er t'ont rollo.
Xclla TaL. 2 son o riporta ti i m icrorganismi isolat i n elle 11 6 urinocolture p ositive, paragonando i rispettiv i esiti d ei te ·t chimi ci c di colorazione.
Anche nr.ll(' n ostre ri ccrr.hr. il g~>rm~" più frequ entement e i,..vla lv è , LaLu
E. coli. Più fr equente di quant o non risulti d a altn~ casistiche ~~ stato il reperto del piocianeo. Tale d ato fa supporre ch e nei soggetti d a e ui fu isol at o
doveFse e!'screi st at a una qualche procedura l" trumentale. Dci l O ceppi di
piocianeo i ...ola t i 7 appartengon o al t erzo ~ru pp o, che, come g' è più v ol te
detto, n on è st at o selezionato. Gli altri 3 ceppi provengon o d al secon do l!ruppo, in cui n on d ovrebbero esserci state st r um cntazioni.
Per quanto riguarda i rapporti tra germe t~ pos itività dci t es t chimici la
gran parte d ci batteri gram n c~ati v i sembrano Ci'scrc raramente miRconosciuti
d ai t est chimici. Contrariamen lt' a i dati di altri ricercatori la ~ ra nde ma ~
gioranza dci ceppi di piocian eo a ppare svcl ah ile con i t est d elle red uttasi.
Hari i cepp i di s tafilococco riducenti i nit rati c il t C'trazolio. An che la colorazion e di St crnhcimer e Malbin non sembra collegabile in m aniera tlignifi cativa con i di versi microrganis mi. Da n otare ehC', contrariam ente a quantn
presuppouibil e, la presenza di'i lcucociti blu ì:· f' t a t a rara nelk infezioni da
;;ta fll ococcu.
Dai d a t i ottenuti su 4:~S urinocolturc esamin a l e anche con i t c;.t di n duzione dci nitrati e del t ctrazolio c con la ri cerca tlci Jcucociti blu m edianti'
la colorazionf• di St ernheirn er c l\blbin , p os!->ia mu a ffermare:
l ) il t e~ t d i Grie,;fl (riduzione dei nitrati) presenta una fa l·m p ositivi t à aFsai La;;-.a ( 1 ~ 0);
2) il t c,;t al tetrazuli o prc-,;enta la s te-.,a ba:-.sa fa lsa po:-.it ività:
3) an che la colorazion e d t'i leucociti hlu dù raramente reperti falsam ente positi vi (l % circa):
4) s ia il t cst di Griess ehC' il test altctrazolio rivelano la maggior part e
delle infezioni d a b atteri gram negativi;
5) i germ i che non vengono riconosciut i ,;ono rapp re:-:cnta ti d agli
;;tafi lococchi t• dai lie, ; ti . Avendo avuto u n ~ ol o ca;;o di in fez ione d a S tr.
f aecalis n on (: p ossibile pronunciar;;i sulla positi\'ità di quest a ~ p ec ic :
6) an <'he la ricerca dPi. leu cociti blu , ;;<' b<· n eondotta, pu ò essere di
aiuto nella dia gno;;i di infezione (o fl ogosi) delle v ie urinaric.
R icevuto il 27 ~iugno 1972.
Accettato il 2 np:o>to 1972.
·''"' · 1.<1. "'"''"· Sani/11 ( l !li:l) 9, Ili:! Ili
CA I'OC:ACC IA, BRAN DIMARTE E Q l'AD RI
III
llii3LIOGRAFL\
\tt'\Ell .. G.
r..
T . .\ . 'fc \ LLI<,TER
<~
P. K AY, 1970.
Detl'(' t iun o f B acl('riuria at Hoom·
'f,•miH' raLur('. l.ancu, i, 119.
" ··x.
n.
.J.
C nOWLEY & .J.
DAR RELL , 1967. :lft'thocl for D t•tc<'tinn Hf lhctuiuria
:'uit ablr for U-c i n Gcn l.'ral Prncticr. Brit . ,U ed. J., 4, 6!9.
1111 \lli.EY,
J1 1 1 1 F'-:. \l. ,1{· P. 'K t :""'C \I O·SmT H. 1 967.
P rove D iagno-tic h e in Ca-o di I nfezioni l riua r il'.
TriunJ!.olo, 8 . 9 1.
1,uo-u. li . K .. 1970. 1to 1c nf H ac t l.'r ial G r ow lh I nhih i tor • in l'rinc in Uiaj:nu,.tic Cu1tn r l'.
.l. Cli11. l 'u thol .. 23, 6!.!7 .
I l \11 111,;, D. \T.. 1969. Stui u inp: of l 'ri n ary l. eu cocy tcs :h a n A id Lo Lhl' D iagno;.i- o f l u fl a rn ·
ma t iun in tiH~ lfr inary Trac t . .f. Clin. Prrth ol., 22, ·~92 .
11 \ 1 oa: :'i . .T., O. T 11 0 M & B. Q,.,TF.IRVO t n,
.\f i croll io /. .'icun d. , 7•l , 39 1.
1'\ \ ""• 1·:. H ., '1957.
fllt••rll lli.
h. \ ~".
1'\1
!t-t" l 'utlw / .
Bac t e rial \.n unt " in (' ri n r.
Bac tc riuria :111cllht> Dia g noo<i" of Jnft•t•ti o rh of tlw l ri nn r y Trao· l .
!a h.
Mt•d ., 100, 709.
E. H .. 19(,:!.
'\l 'l,
196!l.
l' yt· lum•phriti:- a uol Bae tniuria . . ln11 . lllll'l'ttttl . J' l11l .• 56. 1(1.
C. \L. l 1)nll. •h ) m p lomaiÌI' Ba ett•r inri a . ..!1111. Ro•r·. JT..d .• 17, :1!\:1.
1-.1 " ' · C. \[ .. lt. lh:t Tsun:n & \. J . I'AQ l' I;oo;. l !Jo l. Lri uary T r a !'t f u ft•rtitm Ì1t Sdwo 1
( .hil ol rPn: a n E p i <lr·mio lo~ir·a l, Clinka1 a u d La l •ora l ury S t udy . .\ l ••tliri 11 f', 43, () l.
. ~11; 11.
1>. \. ,'\; .1 . 1). \\' ll .LI \\1 ~. 196 1. \l t'lho <l l'o r t h r Dr•t rrtion uf :O:i:,:nifir·:ll lll1nt• l rriuria
in l.aq~r l ;roup~ of P a l it•n l - . . ] . Clin. Pa tito/ .. 17, · ~9!l.
R. \ .. I L l. EnT I;>., G. K. 'f ALI,O RY & E. H . K A,..,.. 195 i. ltdation ltt• l i\C' t'll
l'yrlonrph riti, nnd Barlrrinl lnunt- Ì11 l hl' Crinr . .\',,.. F.nJ!.Iond .1. Mrtl.. 256.915.
\f.\ r. J)O.., .\I.. Il,
\ l \ CKEY, J . P. & (;. IL . ;\ 'IDY". l 965. Laboratory D ia !!nn,i.; of l ll fl'l'linn.; of thr Llrinary
Tra<· t i11 Gt•f1t•ra1 P ractin· hy :\[ can< uf a Dip·ÌIInrulu m Tr;an•pnrt \ fctlium. /Jrit. J l i'CI .
. /., 2, 12116.
\ l 1 \1.1.. \\'.E .. 1:. I l. K,\"'· .I. L L'\G & K . L. Sn · \ltT. 19(>2. Fari or l ltfiul'nt·in!(
l'n·--u ro• in lh r G··rwral P opulatiun Ì11 J amail'a . Urit. \[,,/ . .1 .. 2. ~9i.
\ rtl'ria l
\ ·nuuF:"'. C.\\'. & E. IL KA""· 1968. 11al' l r•riuria n f P r t>!(n:m o·y. \ Crilic·a l ·\ pprai-al.
u,.,.. " ''"··
!1111.
l9. ~ 31.
l' \ \\' LOW;.K I. .1 . \f. , .1 . \\ . BLOXDU HF & P. K Dt.lt EL,-TI Et.. 1 96~. Clu·n 1ti r· l'~c· l unt·vhri ti -:
a \[or pho luj.!Ìt' aml Ba r· tt- ri o log ir· S lurly. NPw F.n~;lu11d .) . " r• tl .. 268, 96S.
H ~-:,--: tr. K. IL
R. B. CE LI.A, K. Soc~ I U Kf.\ N, ·\.H. l.tE BT, nltA N & E. \\'..:1r•• 1969.
1·io n of S il{ ni fi t'a u t Bac t l'riuria . ..lrrh. l ntn rral. ,lTt•tl., 124. l li:l.
\fa" l h· l•·r··
:-tlti TI! , 1.. (; , & .J. Sc nMIIIT, 1%2. Evalu atio n o f Th re e Se rr·t•ttÌII ).: T ,•, l ,. l'or P nlÌ<'11l :- 11ilh
Si~ u ì fi l'a n t ll uct<•riuri n . .} . • l m. Jletl . ..Lssoc .. 181, 159.
or th l'
S lttTII. L. c .. \X' . Il. TI!A Y E fl . E. \·f . M A LT A & J. 1'>. U TZ, 196 1. H.rlu l ion,: h i p
11 Ìt r ite lt'•t I O llac l.o· ri a l Cul tur\' inLIH· D ia!! II O"i' u f l. r iu;~r y Tr·af't l11 fN ti on.
11111.
(; .. ;,.,.~
l uu. l u tcr·
\lt•tl. , 5-l , 66.
r. ..t n. JT. \fAl. lH ." , l \l j.~. ·\ j\ ('w Sta in for Frillar\ S,•, Limt•n l . i t- \ '.due itt
t l w )) jffo·n•ul i.1 l Dia!!no,i,: of H y pt' r l t'u"ion. A m . flt•art .] .. 37, 6711.
""T !1'\IIt:III C I~.
Sn:n'\ 11 ~. l 11F:tl. l t. & B. H. \fALB I "· 1951. Ui u iea\ R<'CO!!uil i un uf P yrlonl'phril j, "il h a "{1·w
:'tain fnr l ' riuary Srdinwnt. . f m .. / . .\lt•d .. 11. 312.
STt-:1\ \llT. Il. Il . & \\ .S. KI-F lt & (~. \ tTZ. 196!l. E nluatimr nf lhr :'lut -To·-1 iu l' rin.t r~
rral'l l ufo•t·liuu . ./. ( rol .. 99. 109.
. 111 11.
1:<1. .'i lt/ftr. S m 1i l a IIH~ :11 9.
1112 Jll
Purificazione della timidilil-3', 5' -timidina
mediante cromatografia di scambio ionico
J)i\'di>:I, E
GOZZ I (*)
tubnratori di l"isir11
Uiassuuto. - La piridin a ì: ~cneralmcntP. presente, come impurez:la.
negli oligonucleo tidi di sintc:;i.
Viene descritto un metodo di purifi cazionc mediante cromato~rafìa di
scambio ionico su colonna di D EAE-cellulosa (dictilammin oetilccllulosa).
L'oligonueleoti de trattato è il dinuelcotidc della timina (timi<lilil- 3' , 5'timidina).
Sunuuary (Purification of thy mid_yly l- 3', 5'-thy midine by ion exchanw ·
chromatography). - P yridin c is usually prescnt, as impurity, in synth etic
oligonuclcotides.
A purification m cthoù by ion exchange ch r o mat ograplt~· on DEAE
cell ulose (diethylaminoethyl cellulose) column is shown. Thc treated oligonucleotiò c i;; th vm irH' dinucl<'otidc ( thymid yl~·l - 3', 5'-thymidin<').
Molte esperienze che si conclucono sugli oligonucleotidi richiedono <li
lavorare su p rodotti di elevata purezza, ma sfortunatam ente la maggior parte
di quelli ot tenu t i per sinte,:i, attualm ent e disponibili in commercio, n on
pos~:>i ed e questo requisito.
La sintc::i m ediante la quale \Cngono prodotti (G ILII A\r & KHORA !\'A.
1958) avviene in piridi na anidra, che costituisce la piì1 frequ ente impurezza
presente n ei prodotti commerciali (ca. 1 0 °~). Alcune esperienze di fotochimic a degli oligonucleot idi, ad esempio, sono rese non quantitative dalla presen za di impurC7.:f.C U.V. attive comi! la piridina, cl1 c irraggiata forma un
fotoprodotto con un massimo di assorbimento a 3.650 A.
..
GOZZI
113
È quindi necessario operare una purifìcazione con un m etodo ch e p ossieda le seguenti caratteristiche:
l) possibilità di op erare su quantità di oligonucleotidc dell'ordine
del mg;
2) non alterabilità d el prodotto (gli oligonuclcotidi sono gen eralmente
instabili in ambiente a cido);
3) possib ilità di recuperare quantitativamente c allo stato cristallino
il prodotto purificato.
La cromatografia di scambio ionico su colonna di DEAE-HCOa (dietilammino etilcellulosa in forma bicarbonato) soddisfa sia l'esigenza di una
completa purificazion e che le caratteristich e sopra citate: inoltre, come già
d imostrato da STAEHELIN (1963), offre la possibilità di effet tuare contemporanea mente la separazione di una miscela di oligonu cleotid i.
Il presente lavoro tratta l a purificazione di un dinucleotide particolarmente studiato p er le sue caratteristiche foto chimich e: il TpT (timidilil-3',
5' -timidin a) m a, ovviamente, il metodo descritto è applicabile a ()Ualsiasi
altro ol igonucleo tidc o miscela di essi.
MATERIALI E \lETODI
Timidilil-3' , 5' -timidirra
È il dinucleo tide della timina (Fig. l) prodotto dalla Sigma Chemical
Company, St. louis - Missouri - USA, ch e contiene 1'8% di piridina.
Il P.M. del sale anidro di formul a bruta C20 H 260 12N4P.NH1 è pari a 563,5
e il suo coefficiente di estinzione molare in soluzione acquosa a p H = 7,
alla lungh ezza d 'onda del m assimo d i assorbimento (2.650 A) è 1,85 · 10'1
litro· m ole - 1 • cm - 1 (JouNs Pt al., 1964) . È stabile in ambiente neutro e
alcalino (Jon NS et al. , 1964).
P retrattamento della reswa
P er separazioni t ra oligonucleotidi è consigl iabile un'eluizione in gradiente
c una granulometria compresa t ra 230 -:-- 325 mesh (STAEHELIN, 1963),
con dizioni che, come è n oto, favoriscono le separazioni tra sostanze con
coefficienti di selettività m olto simili tra loro: nel n ostro caso una granulometria compresa tra 100 :-- 200fL ris ulta ugu almente soddisfacen te ed inoltre
Hun crea uu'ecce:o::.iva ce:oi:olcnza al passaggio Jdla fase m ubile, cousculcnùu
un flusso oper ativam ente accet tabile, senza ricorrere a lla p ressostatazione
della colon na. P rima dell' infroduzionc in colonna la resina v iene ~< otto posta
a d un ciclo di lavaggi secondo quanto raccomandato d a PETERSON & SOBER
(1956).
11 1
F~I'ElCIEt'>ZE
~.
lll <..t ; R (;I II ·:
La DEAE usa ta c:~ prodotta dalla Ser va cità di scambio f. d i 0,85 mC4J/g.
OH
Fi)!. l. -
Hci d el bcr~
-
c la sua capa-
H
T p'l ( Lirniililil- 3'. j ' -Li midiua ).
Apparecchiatura
Le dimensioni d ell a colon na son o 2 '/ 20 cm. E ssa {: provvista di ca micia
esterna per la circolazione di acq ua t ermostat ata. L'cluenlc è i mmesso nella
colonna median te p ompa a siringhe, m entre l' u scit a è- collep:ata ad un collett ore di frazioni.
1His u re spettrofotometrichl'
Le m isure di D .O. ven gon o eseguite, sull e frazioni raccolte, median te
lo spcltrofotometro Cary 15, usando va:-ch ettc di qu arzo d a l c 0,1 cm eli
cammino ottico .
E lu en tfJ
P repara.:. ione
L'eluente è costit uito da una soluzione 0,1 ) l di trietilammonio hicarh ona lo (TEAll). Un litro l M vien e preparato aggiungeudo goccia a goccia
An11. / , 1. ::iu}ll r. Sa11 i là ( 19i:l} 9, Il:! 1:!0
115
COZZI
NEt3 (140,5 ml) in u na soluzione satura di C02, ottenuta facendo gorgogliare
il gas in 500 ml di H 20 distillata mantenuta a 0 °C.
Si regola il flusso della NE~ e della C0 2 in m odo che il pH rimanga t ra
7,5 -7- 8,0. Si diluisce poi ad un litro.
Caratteristiche
La condizione protonica per u na soluzione 0,1 M di TEAB è
ed (•, r on buona approssimazione, verificata quando
quest o avviene a pH = 8,2 come si può vedere in Fig. 2, dove sono rappresentati i diagrammi di distribuzione d ell'Hl:Oa e della trietilammina per
una concentrazione 0,1 M.
o
lgc
[H 2 C0 3]
~~--~~--=-----~·
-2
- 4
- 6
Fig. 2. -
Oioj!ranuna !li d i,tr ihuzione per il sistema
H~C03 -'t\Et3 •
Si può inoltre osservare che il campo di esistenza per una tale soluzione
è compreso approssimativamente tra p H 7,5 c 9,5. Se si calcolano gli i ndici
tampone {3 = dCb/dpH come somma degli indici tampone di tutte le coppie
a cido-base presenti nei sist emi H 2C03•NEt3 e H 2 C03 -NH3 e si graficano in
funzione del pH si otten gono le c nrve di Fig. 3.
Queste sono state graficat e dal cal colatore IBM 7040 mediante le seguenti relazioni
(Ju,co,- XE•, = f3u,o _:_ fJn,co,
+ f3NEt,
(JH,co, - .'!H, = fJu,o + f3u,co,
+ fJN H,
. 11111. f.oll . .S"IJN. Snnilcl ( 19i3) 9, 112- 120
ll6
ESl'ERH: NZE E 'RICE RCH"
dove
singoli t ermini della somma valgono
fln,o = 2,303 · (lQ - pH
fJn,co,
=
2,303 · C · lO - P11
fJNEt, = 2,303
1 0 - pKa, 2
[ (lO-vK•,2+ lO - vll)2
'c'
pKw)
10 - pKa, 3
+ -(JO-- -vK•,3+
-- --lO - PH)2
) 0-
(pKa, 4 + pii)
10 -
(pKa. 5 + pii)
]
10 - 1'11 . - - -- - -- -(10 - pKo, 4 + 10 - p11)2
{3.,..11, = 2,303 . C . IO - rH .
Fig. 3. -
+ lQI'H -
(lO - pKa, s + 10
Variazione d ell'indice tampone {1 per i sistemi NEt 3 •
H 2C03 , N H3-H 2 C0 3 , iu funzione del pii.
m cui C = 0,1 . M, pKw = 14, pKa, 2 = 6,35, pKa, 3 = 10,25, pKa,
4 = ll,Ol, pKa, 5 = 9,24 a 25°C (KOLTHOFF & ELVINC, 1959).
Poichè il pH di lavoro della colonna è intorno a 8 si vede che converrebbe
usare una soluzione 0,1 .M di NH 4 HC0 3, che presenta una migliore capacità
t amponante, ma d'altra parte è scarsamente volatile e, perciò, difficilmente
eliminabile per liofìlizzazione, cosa invece, facilmente attuabile per il TEAB.
Ann. l st.
S~tpu.
.Sanil<i (1073) t, 11 2-120
117
COZZI
In Fig. 4 è riportata la variazione della conducibilità specifica e del pH
del TEAB in funzione della concentrazione. Tali curve possono essere utili
nel caso si voglia fare l'eluizione in gradiente di concentrazione.
3,~
,25
2,5
o.t::
E
E
~
2,0
><
1,15
1,~
1,10
c (moti/t )xlO -!
Fig. 4. -
Variazione del pH e della conducibilità specifica " del
TEAB in funzione della concentrazione.
RISULTATI SPERIMENTALI
Cromatogramma
Riportando l'assorbimento di ogni frazione in funzione del suo numero
si ottiene il cromatogramma di Fig. 5.
Le misure di D.O. sono fatte alle lunghezze d'onda dei massimi di assor·
bimento del TpT (2.650 A) e della piridina (2.560 A).
Si può osservare come i due componenti siano b en separati in un numero
abbastanza contenuto di frazioni.
Le frazioni relative al picco del TpT sono state successivamente riunite
e liofilizzate. Il residuo è costituito da TpT esente da piridina e da altre
impurezze che assorbono all'U.V. come si può vedere dallo spettro di assorbimento di una sua soluzione acquosa (Fig. 6, curva b) rispetto ad una di non
trattato (Fig. 6, curva a). La curva c corrisp onde allo spettro della piridina.
Si noti come le deformazioni dello spettro del TpT impuro corrispondano
alle bande di assorbimento della piridina.
.&nn. lat. Super. Sanila (1973)
t, 112- 120
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
11 3
t:S P E IUF. ~Z F.
l
t: RI C t:R CII E
l
l
l
D. O.
8,0
Ca mpion e _ mg : 4,84
l:luente
6,0
_T( AB
5,0
4,0
l
• 2560 A
0,1 M
rtusso _ 0 ,4 3 ml / min
l
o
o
l
o 2650 A
Temperatura _ IO °C
l
pft eluente _ 8, 2 4
l
l
Dime nsioni colonna _ ~=2 cm; h= 2 0 cm
Veloc iti linea re _ 0,14 cmjmin
3,0
l
Dimensioni particelle _ 100+20 0 il
l
2,0
l
l
1,0
0,0
o
8
4
1--- - -
12
44
16
N!! truioni Imi 3)
V:S7m l ---~
Fig. 5. -
Cromatogramma della oeparazionc di TpT-piridina.
l
l
l
l
l
l
l
D. O
l
Spettri in toluz• ont •cquou
V61Chtth 41 l CM
a ) TpT '"" puritic ah
\ ) Tpf puriricato
c) Piridina
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
Fig. 6. -
Spettr i di assorbimento di : c•) Tp1' non purificato;
b) TpT purifi ca to; c) piridiuo.
A llll. l sl. S"JUr . .Sa11iftì (1 0 i3 ) t , 11 2-120
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
119
COZZI
l
l
l
_'\t!isura del volume intersti::iale
Per il calcolo dei coefficienti di selettività è necessa rio conoscere il volume
interstizialc V della colonna ed una misura di questa grandezza può essere
effettuata conduttomctricamente nel modo seguente:
l) un certo volume di soluzione 0,1 .M di TEAB viene fatto passare
in colonna fin o a quando la conducibilità specifica misurata in uscita non
rimane costante;
2) si fa poi passare in colonna dcll' H 20 di:;tillata, iniziando contemporaneamente la r egistrazione della conducibilità. Quando è fluito un volume
di H 2 0 pari al volume interstiziale V si osserva una rapida variazione della
conducibilità specifica in u scita alla colonna.
In Fig. 7 è riportata la registrazione conduttometrica in funzi one del
numero di inch di carta svolta dal registratore.
-;;'s
V • J:f._ : 57 mi
E
E
l
.c.
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
v,
l
l
F • 0,43m l / mon
l • 26,9
ve:-
l
l
o n c~
0,2 •ne h/ -n1n
l
l
l
'X." 0
< 3 f1"':"ihO
'l
l
l
l
l
l
Fig. 7. -
Heg i.traziu ne co mlut tom<'lricn pN la mi. ura d("l volume iulc-r-tizialc J'.
Conoscendo il Busso della colonna, F, in mlfmin, la velocità di ::lcorrimento della carta, Ve, in inchf rrlin c il numero di i 11ch, l , corrispondenti al
punto di flesso, si può ricavare il valore di V.
Nel cromatogramma di Fig. 5, V corrisponde alle prime 19 frazion i,
nella 20esima è già presente della piridina.
A -~
l
l
l
l
l
DEA E-A r II C03
A1111. l dl . SIIJII'r. S11nii<l ( 107:!) 9,
l
l
Se si scrive la reazione di scambio per un generico anione A- come
..J..
l
l
Calcolo dei coefficienti di selettività
DEAE-HC03
l
l
l
l
11 2- 1~0
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
120
ES PEIUE~ZE
E R ICERCHE
si può scrivere il relativo coefficient e di selcttivit à
1959) come
[DEAE-A] [HC03]
E -
[DEAE-HCOJ
ed il coefficiente di distribuzione, C
(RIEMAN & SARGENT, 1959) a
=
( KOLTDOF F
&
ELVING,
[A ]
[A-]m:.~ e/[A-], risulta uguale
_w
,.....Q
~E----=v [HC03]
c=
dove W è il peso di resina asciutta in g, Q la cap acità di scambio in m eqfg,
V il volume interstiziale e [HC03] la concentrazione dcll'cluente.
È noto ch e si può scrivere il volume di ritenzione Vn (MARTIN & SYNCE,
1941) come
Vn = CV + V
e sostituendo il valore di C si ottiene E, noti gli altri parametri
E . (VR
-
V)
[H;~3]
Poichè HC03 = 0,1 M , W = 13 g, Q = 0,85 meqfg, V = 57 mi, not1 1
Vn dal cromatogramma si calcola il valore di E per la piridina ed il TpT. Si
ottiene rispettivamente EJ.'Ir = 0,65 e E l'pT = 1,20.
Si ringraziano vivamente i Sigg. A. MarLinangeli c C. Rnnglli nsc i per la loro collahorazione t e crùca.
Ricevuto il 5 luglio 1972.
.Accettato il 12 &et tembre 19 72.
BIBLIOGRAFI A
G ILRAM, P .
T. & H. G.
H. E., M. L.
9, 503.
JonN s ,
KuonANA,
PEARSON,
1958. J, A. Chem. Soc., 80, 62 12.
X . G. C. LE
BLANC
& C. W.
H ELLE I NEn ,
1964. ] . Mol. Bio/.,
KOLTUOFF,
l. M. & P. J . E LV I NC, 1959. Trcatise on .Analy tical Chemistry part I, l .
Kor,TUOFF,
l.l\I. & P .
J.IARTIN,
J.
ELV I NC,
A. J . P. & R. L. J\l.
P ETERS0:-1,
E. A. & H. E.
1959. Treatise on Analytical Chtmistry
1941. Biochem. J. , 35, 1385.
part
l, 3.
SYNCE ,
S OBER ,
1956. ] . Am. Chrm. Soc., 78, 751.
RIE~lAN, W. & R. SARCENT, 1959. « l on Exch ange» In: W. G. Derliu, Physical 1\!ethods of
Chemical Analysis, Academic Pres~. New York, vol. IV.
STAERELIN, M., 1963. Progrcss in Nucleic Acid R esearch, 2, 170.
Ann.. 1st. S u1Jcr. Sanità (1973) 9, 112- 120

Download Report