La tecnologia del DNA ricombinante Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 rDNA is NOT Whole Animal Cloning Recombinant DNA is a tool in understanding the structure, function, and regulation of genes and their products Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 • The objectives of Recombinant DNA technology include: – Identifying genes – Isolating genes – Modifying genes – Re-expressing genes in other hosts or organisms Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 • These steps permit scientists and clinicians to: – Identify new genes and the proteins they encode – To correct endogenous genetic defects – To manufacture large quantities of specific gene products such as hormones, vaccines, and other biological agents of medical interest Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 restriction animation.exe Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Sebbene esistano enzimi di restrizione con siti di riconoscimento degenerati (per es. BsiEI riconosce la sequenza 5'-CGPuPyCG-3' dove Pu e Py rappresentano "qualunque purina" e "qualunque pirimidina“), la maggior parte degli enzimi di restrizione utilizzati nell'ingegneria genetica riconoscono sequenze specifiche che tagliano in tre modi diversi: • Generando estremità piatte (blunt) Es. SmaI ↓ 5'-CCC-3' 5'-CCCGGG-3' 3'-GGG-5' 3'-GGGCCC-5' ↑ • Generando estremità coesive (sticky) sporgenti al 5' (5' protuding) 5'-GGG-3' 3'-CCC-5' Es. EcoRI ↓ 5'-G-3' 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAA-5' 3'-CTTAAG-5' ↑ • Generando estremità coesive (sticky) sporgenti al 3' (3' protuding) Es. PstI ↓ 5'-CTGCAG-3' 3'-GACGTC-5' ↑ 5'-CTGCA-3' 3'-G-5' 5'-AATTC-3' 3'-G-5' 5'-G-3' 3'-ACGTC-5' Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Estrazione di frammenti di DNA da gel Dopo aver digerito un DNA con enzimi di restrizione ed averne separato i frammenti risultanti su gel di agarosio, il passo seguente di solito consiste nell’excidere dal gel, con un bisturi, specifiche bande corrispondenti a geni o porzioni di DNA di nostro interesse e purificarle da gel. Esistono molti sistemi per purificare bande da gel, tra cui: • • • • • • elettroeluizione colonne a scambio ionico gel-filtration ultrafiltrazioni agarosio a basso punto di fusione ecc. ecc. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 VETTORI DI CLONAGGIO Dai plasmidi batterici naturali sono derivati i vettori di clonaggio, le cui caratteristiche essenziali sono • Origine di replicazione • Marcatore selezionabile • Siti di restrizione unici Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Sottoponendo il vettore e l’inserto a trattamento con terminal transferasi con due deossiribonucleotidi diversi le due molecole diventano complementari tra loro e possono essere ligate. vettore inserto Terminal transferasi + dGTP 5'-P HO-3'GGGGGG vettore Terminal transferasi + dCTP GGGGGG3'OH 5'-P 5'-P HO-3'CCCCCCCC inserto CCCCCC3'OH 5'-P Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Filling in Nel corso dei clonaggi può capitare di dover trasformare estremità coesive sporgenti al 5' o al 3‘ in estremità piatte, sintetizzando le basi mancanti nel filamento incompleto al 5' (filling in), oppure eliminando quelle sporgenti al 3' (trimming) Esempio 1: estremità “sticky” 5' protuding (es.EcoRI) In questo caso la tecnica d’elezione consiste nel cosiddetto “ filling in” che consiste nel “riempire” una estremità sporgente al 5' con la Klenow 5'P 3'OH G 3'OH C AATTC dTTP dATP dGTP 5'P 5'P 3'OH G TTAAG C AATTC 3'OH 5'P Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 T/A cloning di prodotti di PCR La maggior parte delle polimerasi termostabili utilizzate nella PCR, possiedono una debole attività di tipo terminal trasferasico e aggiungono un residuo di adenosina alla estremità 3' dei propri prodotti di amplificazione 5'-P HO-3 A A-3'OH 5'-P Sebbene questa caratteristica ostacoli il clonaggio dei prodotti di amplificazione, è stata vantaggiosamente sfruttata in una serie di vettori commerciali, i cosiddetti vettori T/A, che vengono forniti già linearizzati e che possiedono un residuo di timidina alle loro estremità 3'. I residui 3' terminali di T del vettore si appaiano con le A dei prodotti di amplificazione rendendo così possibile il clonaggio dei prodotti di PCR. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 - Inserto fino 500 Kb Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Vettori di clonaggio. Gran parte degli straordinari progressi ottenuti dalla biotecnologia e dalla biologia molecolare, dipendono dall'acquisizione della capacità di amplificare e propagare indefinitivamente i geni. Clonare un gene significa isolarlo da un genoma ed inserirlo in un vettore capace di replicarsi in un certo ospite (di solito E.coli o lievito). Esistono diversi tipi di vettori di clonaggio, ciascuno con vantaggi e svantaggi. La principale considerazione da fare é relativa alle dimensioni dell'inserto di DNA che ogni vettore può accettare. PLASMIDI da 0,1 a 10 Kb FAGI da 8 a 22 kb COSMIDI da 32 a 45 kb BAC da 75 a 300 kb YAC da 100 a 2000 kb Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Tavola riassuntiva dei principali metodi di trasferimento genico Protoplasti Batteri Elettroporazione trasformazione chimica con CaCl2 Elettroporazione fusione di protoplasti coniugazione batterica Piante elettroporazione trasferimento mediato da Agrobacterium cannoncino balistico fusione di protoplasti Celule animali Lieviti PEG Elettroporazione DEAE-destrano PEG Elettroporazione DEAE-destrano CaPO4 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Libreria genomica e di cDNA Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Progenitor cells Endoderm ES cell Pancreatic cell Hepatocyte Myoblast Mesoderm B cell Totipotent cell Ectoderm Neuron Epithelial cell Pluristratified
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