La diffusione dell’inattivazione dipende dalla continuità fisica del
cromosoma e anche da caratteristiche del cromosoma X.
In traslocazioni con autosomi e in inserzioni di un transgene Xist in
autosomi l’inattivazione si propaga per breve distanza sull’autosoma.
1)  Appaiamento (pairing) transitorio delle due sequenze Xic
(counting: conteggio alterato se sequenze delete).
2)  Xist recluta fattori proteici e crea un compartimento nucleare
silente >>> conformazione chiusa alla cromatina, trascrizionalmente
inattiva, fattori della trascrizione esclusi.
3)  Cromatina della X inattiva: H3K9 di- o trimetilata, H3K4 non
metilato, H3K27 trimetilato (PRC1 ePCR2 in uomo), H4
deacetilato. Molti nucleosomi contengono la variante macroH2A.
CC Xist è fondamentale per le prime fasi dell’inattivazione della X, non
per il mantenimento: in cellule in cui è già avvenuta l’inattivazione, la
perdita di Xist non ne causa la riattivazione (il mantenimento avviene
per opera di meccanismi epigenetici).
CC Replicazione tardiva di Xi
Durante la fase S sappiamo che il DNA può essere replicato in diverse
fasi, early o late (temporal segregation euchromatin/eterocromatina).
Probabilmente dipende dal trasferimento delle modificazioni
epigenetiche da un filamento al quello di nuova sintesi. Affinchè ci sia
ereditabilità di tali modifiche bisogna assicurarne il trasferimento.
I complessi epigenetici di rimodellamento della cromatina entrano in
contatto con la forca replicativa durante le fasi tardive della sintesi e
possono quindi provvedere al trasferimento dei marker di repressione
della trascrizione quale metilazione delle isole CpG dei promotori e e
deacetilazione degli istoni.
CC Come mai Xist si localizza su Xi e agisce in cis?
Cosa gli impedisce di diffondersi ed agire in trans?
Nel 2011 hanno dimostrato che l’RNA di Xist può in realtà diffondere nel nucleo.
Per esempio un transgene Xist espresso da un autosoma può migrare e raggiungere
la Xi, può quindi agire in trans.
YY1 (Yin Yang 1) è un fattore di
trascrizione che mette in contatto
l’RNA Xist con il gene Xist su Xi (non
Xa).
CC L’XIC è un’entità funzionale, composta da
geni, fiancheggianti Xist/Tsix, che svolgono
un ruolo importante nell’attivazione di
entrambi i geni:
- fattori che agistono in cis
- fattori che agistono in trans
Attivatori che agistono in trans (geni Xlinked)
↑  Xist
↓  Tsix
controbilanciati da inibitori che agiscono in
trans (autosomici)
Quando la random XCI (rXCI) ha iniziato a silenziare una delle due X, si ha una
downregolazione dei geni attivatori della XCI in cis sulla seconda X.
Gli inibitori della XCI più importanti identificati fino ad ora sono i fattori di pluripotenza e
riprogrammazione cellulare: OCT4, SOX2, NANOG, REX1, KLF4 e MYC. Questi fattori
vengono reclutati per reprimere Xist o attivare Tsix o Xite (Xite modula la probabilità di scelta
tra le due X). CC Silent nuclear compartment
Counting by RNA expression and Xist activation
Active histon marks
Xist RNA stabilization on Xi
CC CC Counting
In individui con aneuploidie dei cromosomi sessuali (45,X0; 47,XXX; 47,
XXY) resta attivo un solo cromosoma X a prescindere dal numero di partenza.
Tuttavia, in embrioni triploidi o tetraploidi si ritrovano sia uno che due
cromosomi X attivi ad indicare la presenza di un “meccanismo di conta” che
consenta la presenza di un cromosoma X attivo ogni due set di autosomi.
“Fattore bloccante” autosomico (BF), che protegge un cromosoma X per genoma
diploide dall’inattivazione. Candidato: DXPas34, 1.2kb
Delezione di DXPas34:
XCI ectopica in cellule maschili.
CC Vengono inattivati tutti i geni della X?
No, inizialmente si riteneva che l’inattivazione coinvolgesse tutto il
cromosoma, oggi sappiamo che non vengono inattivati i geni della
regione pseudoautosomica (PAR): i geni di questa regione hanno un
omologo sul cromosoma Y; non vengono inattivati geni che hanno
pseudogeni sul cromosoma Y, e altri geni per i quali non si conosce la
ragione. C’é un numero crescente di geni X-linked (15%) che sfuggono
all’inattivazione, sia nel topo che nell’uomo. Un ulteriore 10% mostra
pattern variabili
- 35% dei geni Xp sfuggono all’inattivazione
- domini di geni che restano attivi (gene clustering)
CC CC I geni che sfuggono al silenziamento si
posizionano all’esterno del territorio del
trascritto di Xist e non vengono quindi
inglobati nel corpo di Barr, altamente
condensato (modello B), o in alternativa,
fanno parte del corpo di Barr, ma
controllati più localmente (modello A).
Il corpo di Barr ha le caratteristiche
dell’eterocromatina ed è
trascrizionalmente inattivo. Per questo
motivo si pensava che contenesse i
geni inattivati della Xi.
Sorprendentemente invece, all’esterno
del corpo di Barr si localizzano non
solo i geni che sfuggono
all’inattivazione, ma anche quelli
inattivati. Tutti i geni si localizzano al
bordo del territorio dell’RNA di Xist,
e all’esterno del corpo di Barr.
CC Compartimentalizzazione Il DNA ripetuto viene compattato nel corpo di Barr, che contiene
consistenti quatità di DNA C0t-1.
Studi recenti hanno dimostrato
che nel nucleo in interfase la X
inattivata (Xi) è organizzata in
un bordo esterno di geni e un
core ricco di sequenze
ripetute, nel quale si localizza
Xist.
CC Alcune informazioni dalla sindrome di Turner (X0)
In uomo X0, sesso femminile, mostra alterazioni fenotipiche (anche
particolarmente gravi)
In topo, sesso femminile, fenotipicamente normali e assente mortalitá
embrionale
PERCHE’?
CC Inattivazione della X in uomo e topo
Nel topo l’inattivazione é globale, coinvolge quasi tutti il 2000 geni
del cromosoma X.
 La maggior parte dei geni di topo sono inattivati potrebbe essere in
relazione alla quantità di LINE:
MOLTE NEL GENOMA DI TOPO
CC The human Xi is comprised of a heterogeneous chromatin landscape
Quando Xist viene introdotto in un autosoma, i geni che facilmente
vengono inattivati sono quelli in regioni arricchite di LINE; la densità
locale di LINE può influire sull’abilità dei geni di una regione di essere
inclusi nel comprtimento silente di Xist.
Sebbene gli elementi L1
non siano esclusivi del
cromosoma X, possono far
parte delle caratteristiche
della X che facilitano la
d i f f u s i o n e
dell’inattivazione.
CC Nei marsupiali è stato recentemente scoperto un altro RNA non
codificante (Rsx): ha proprietà molto simili a Xist (no similarità di
sequenza)
Nel topo Xist è necessario sia per iXCI che per rXCI.
CC Inattivazione della X ed ereditarietà
Ereditarietà X-linked:
i maschi portatori della mutazione
mostrano sempre il fenotipo
Tessuto specificità: le donne portatrici presentano aree della pelle con
tesuto sano e aree con tessuno anormale (es, daltonismo; displasia
ectodermica ipoidrotica, mancanza di ghiandole sudoripare).
Donne eterozigoti: se il fenotipo dipende da un prodotto diffusibile, si
avrà un effetto medio tra i cloni che esprimono l’allele normale e quelli
che esprimono l’allele mutato: le donne portatrici possono essere
anormali da un punto di vista biochimico, ma sono di solito sane da un
punto di vista clinico (emofilia).
CC L’ inattivazione le traslocazioni X/Autosoma
 Xic agisce in cis:
il frammento fisicamente
separato non puó inattivarsi
due copie Xp attive
parte autosoma inattiva
morte della cellula
Inattivazione
casuale dell’X
un cromosoma X attivo
due autosomi attivi
X X/A A/X A
questo clone é
l’unico che si ritrova
NB La casualitá viene meno in presenza di X riarrangiate
CC Inattivazione della X ed ereditarietà
skewed X-inactivation
L’inattivazione della X in femmine eterozigoti si
discosta molto dall’atteso 50% se una mutazione
X-linked compromette la proliferazione
cellulare (es . Rett syndrome, 75:25, mutations
in the MECP2 gene)
CC Compensazione del dosaggio:
Upregulazione di Xa
Sbilanciamento dell’espressione dei geni X-linked rispetto ai
geni presenti sugli autosomi.
Considerando che la maggior parte dei geni X-linked sono
tessuto-specifici, il confronto dei livelli di espressione deve
riguardare solo i geni attivamente espressi in un determinato
tessuto.
Nel 2010, mediante analisi di microarray e RNA-seq è stato
dimostrato che la Xa è upregolata nei mammiferi.
CC XCI e cancro
Diversi studi hanno dimostrato che il corpo di Barr
è spesso perso in individui con cancro al seno.
Probabilmente si ha instabilità epigenetica della Xi,
che causa decondensazione dell’eterocromatina del
corpo di Barr e porta alla riattivazione dei geni Xlinked sulla Xi.
CC Perché studiare l’inattivazione della X 1. Modello della regolazione epigenetica (eterocromatizzazione)
2. Metodi per intervenire nella riattivazione della X inattivata in casi
di malattie ad ereditarietà X-linked.
CC Cellular resolution maps of X chromosome inactivation Femmine di topo in cui proteine reporte fluorescenti diverse (GFP e
tdTomato) “colorano” la Xm e la Xp.
Si riesce ad osservare il mosaicismo in cellule del SNC, o in patologie
della retina.
CC CC CC Translating dosage compensation to trisomy 21
2013: transgene di Xist inserito nel cromosoma 21 in cellule staminali
pluripotenti di individui con sindrome di Down.
L’RNA di Xist ricopre il cromosoma 21 e induce modificazioni stabili
della cromatina, silenziamento dell’intero cromosoma e metilazione del
DNA, formando un “corpo di Barr del cromosoma 21”.
CC Translating dosage compensation to trisomy 21
I deficit di proliferazione e altri difetti sono immediatamente risolti con
il silenziamento del cromosoma 21.
•  Modello per studiare l’XCI.
•  Modello per studiare i cambiamenti di espressione nella trisomia 21.
•  Primi passi verso lo sviluppo di una “chromosome therapy”.
CC Cellular resolution maps of X chromosome inactivation: implications for neural development,
function, and disease.
Wu H, Luo J, Yu H, Rattner A, Mo A, Wang Y, Smallwood PM, Erlanger B, Wheelan SJ, Nathans J.
Neuron. 2014
Translating dosage compensation to trisomy 21
Jun Jiang, Yuanchun Jing, Gregory J. Cost, Jen-Chieh Chiang, Heather J. Kolpa, et al.; Nature. 2013
Different flavors of X-chromosome inactivation in mammals
Cathe´ rine Dupont and Joost Gribnau; Curr Opin in Cell Biology. 2013
Species-specific differences in X chromosome inactivation in mammals
Takashi Sado and Takehisa Sakaguchi; Reproduction. 2013
XIST RNA and Architecture of the Inactive X chromosome: Implications for the Repeat Genome
Hall LL, Lawrence JB.; Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2010
X inactivation Xplained.
Wutz A, Gribnau J.; Curr Opin Genet Dev. 2007
XIST RNA and architecture of the inactive X chromosome: implications for the repeat genome.
Hall LL, Lawrence JB.; Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2010
New and Xisting regulatory mechanisms of X chromosome inactivation.
Jeon Y, Sarma K, Lee JT.; Curr Opin Genet Dev. 2012
CC 

Variazioni delle modalità di trasmissione rispetto alle leggi di Mendel

Lezione genomi vegetali - e

"Dna e fattori ambientali hanno un ruolo cruciale"

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