Anno del primo book fotografico

Consorzio Interuniversitario
N a z i o n a l e
per la Scienza e Tecnologia
d e i
M a t e r i a l i
Responsabile del
progetto:
Prof. Giuseppe D’Alfonso
CRTT Capofila:
INSTM - Dipartimento di
Chimica, Università degli
Studi di Milano –
Laboratorio di
Optoelettronica e
Bioimaging
A C C O R D O D I C O L L A B O R A Z I O N E P E R
L A " S P E R I M E N T A Z I O N E D ' I N I Z I A T I V E
D I S V I L U P P O , V A L O R I Z Z A Z I O N E D E L
C A P I T A L E U M A N O E T R A S F E R I M E N T O
D E I R I S U L T A T I D E L L A R I C E R C A
C O N R I C A D U T A D I R E T T A S U L
T E R R I T O R I O L O M B A R D O "
Sviluppo di
nano-piattaforme integrate
per il delivery di farmaci
a base di oro contro
il carcinoma prostatico
(SiNFOniA).
Perché il carcinoma della prostata
(CaP)
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M a t e r i a l i
IL PROGETTO E I SUOI
O B I E T T I V I
E’ il tumore maschile più diffuso nei paesi
industrializzati
... soprattutto a partire dai 50 anni di età
situazione in Italia (fonte A.I.O.M 2013)
Numero casi diagnosticati in aumento, per:
• diffusione pratiche diagnostiche
• invecchiamento della popolazione
Milano, 16 giugno 2014
Il carcinoma della prostata (CaP)
Incidenza per 100 mila abitanti maschi/anno:
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Nord
• 109.4
Centro
• 80.1 (-27%)
Sud
• 60.7 (-44%)
Mortalità
IL PROGETTO E I SUOI
O B I E T T I V I
Al terzo posto nella scala di mortalità da tumori:
17-20 decessi per 100.000 abitanti/anno
Quasi tutti maschi con età > 70 anni
... in costante moderata diminuzione da oltre un
ventennio (-1,8% per anno)
Il carcinoma della prostata
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M a t e r i a l i
Opzioni terapeutiche
Chemioterapia
Ormonoterapia
Brachiterapia (deprivazione
androgenica)
Radioterapia
Chirurgia
(prostatectomia
radicale)
IL PROGETTO E I SUOI
O B I E T T I V I
Per classi di rischio elevato: terapia ormonale.
Ma efficacia limitata nel tempo
Per la grande maggioranza dei pazienti
 progressione di malattia
 sviluppo fenotipo androgeno-indipendente, per il
quale
chemioterapia
convenzionale
è
generalmente inefficace
Il carcinoma della prostata (CaP)
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 Necessità di
nuove strategie
terapeutiche:
nuovi farmaci
in grado aggirare
resistenza innata
o acquista
 Necessità
approcci di
veicolazione mirati:
o migliorare la
biodisponibilità a
livello tumorale
o ridurre effetti
collaterali.
IL PROGETTO E I SUOI
O B I E T T I V I
Perché farmaci a base di oro
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• Noti da molti anni per artrite reumatoide
• Alcuni sono potenti inibitori crescita cellulare
Due classi principali:
Neutri
Cationici
Mitocondri bersaglio di entrambe le classi.
Neutri
IL PROGETTO E I SUOI
O B I E T T I V I
Inibizione TrxR
implicato in
proliferazione tumorale
Apoptosi cellulare
Cationici
Uptake e
accumulazione
Tossicità legata
lipofilicità
I farmaci a base di oro
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Problemi:
 neutri: scarsa stabilità già nel mezzo di coltura
 cationici: elevata tossicità a livello fegato e
polmoni.
Nuovo sistema di delivery per
IL PROGETTO E I SUOI
O B I E T T I V I
 contribuire a solubilizzare in acqua il farmaco,
aumentandone la biodisponibilità
 proteggere dalla degradazione durante la
veicolazione sul bersaglio
 favorire l’accumulo sul bersaglio limitandone
la tossicità aspecifica.
Nanomedicina può fornire una soluzione
Targeting passivo
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IL PROGETTO E I SUOI
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Effetto EPR
(Enhanced Permeability and Retention):
 cellule sane: giunzione endoteliale 8 nm,
diffondono solo piccole molecole
 cellule tumorali: giunzione endoteliale 40-80 nm,
diffondono nanoparticelle
Targeting attivo
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IL PROGETTO E I SUOI
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Si sfruttano recettori specifici sovraespressi
dalle cellule tumorali
Nanoparticelle per la teragnostica
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Avidin-biotin
Fluorescent
labeling
Linker
Antibody
PEG
DNA
Fluorophore
Drug A
IL PROGETTO E I SUOI
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Drug B
Magnetic center
Piattaforme multifunzionali che possono trasportare
• agenti per la diagnostica (imaging)
• agenti per la terapia
• agenti per l’indirizzamento sul bersaglio
Nanoparticelle PLURONIC-SILICE
(PLUS)
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PEG
PPG
Guscio PEG
PEG
Pluronic® F127 (BASF)
Polimero anfifilico:
forma micelle che
"templano" la crescita
di un nucleo di SiO2
NP di silice cresce nel
nucleo idrofobico della
micella
Vantaggi metodo
IL PROGETTO E I SUOI
O B I E T T I V I
• Sintesi basso impatto ambientale
• Dimensioni ridotte (10 nm)
e controllate (elevata monodispersione)
• Il guscio di "stealth polymer" aumenta il
tempo di circolazione
• Possibilità di funzionalizzare sulla superficie,
nel core e all’interfaccia
M. Montalti, L. Prodi et al,
Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 4056
Nanoparticelle multifunzionali
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 Funzionalizzare
parte della
superficie con un
peptide per il
targeting.
 Inglobare molecole
luminescenti per il
tracking
IL PROGETTO E I SUOI
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 Inserire la molecola
attiva (farmaco) nel
guscio o nel nucleo
Au
Obiettivo finale
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Il farmaco a base di oro viene trasportato/rilasciato
sul tessuto target
Au
IL PROGETTO E I SUOI
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Vantaggi
 Riduzione della tossicità a livello sistemico
 Tracciabilità (mediante fluorescenza)
 Aumento solubilità in acqua
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INSTM – Dipartimento di
Chimica UniMI
Prof. Giuseppe D’Alfonso
Dr. Monica Panigati
Prof. Emanuela Licandro
Dr. Silvia Cauteruccio
 Competenze del CRTT:
sviluppo di composti molecolari e nano-materiali, per
dispositivi optoelettronici e imaging biomedicale:
I
PA RT E C I PA N T I
•
•
•
•
In particolare:
complessi
di
metalli
di
transizione
altamente
fotoluminescenti in solido, per OLED
complessi molecolari o polimerici idrosolubili o coniugati con
acidi peptido nucleici, per l'imaging di cellule viventi
nanoparticelle superparamagnetiche per l'utilizzo in
teragnostica (imaging multimodale, ipertermia, radioterapia,
drug delivery)
nuovi materiali per applicazioni fotovoltaiche
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INSTM –
Dipartimento di Chimica
G. Ciamician UniBO
Dr. Marco Montalti
Prof. Luca Prodi
Dr. Enrico Rampazzo
 Competenze del CRTT:
I
PA RT E C I PA N T I
• Sintesi di nanoparticelle luminescenti per il
bioimaging e il drug delivery
• Caratterizzazione fotofisica di composti di
coordinazione
• Sviluppo e caratterizzazione di materiali
fluorescenti per applicazione come sensori
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IRCCS Istituto
Nazionale Tumori
Unità Operativa di
Farmacologia Molecolare
Direttore: Dott.ssa Nadia Zaffaroni,
co-responsabile del Programma Prostata,
coordinamento ricerca preclinica su questa patologia
Membri Unità Operativa:
Dr. Marco Folini, Dr. Giovanni Beretta
I
PA RT E C I PA N T I
 Attività di ricerca dell’Unità Operativa:
sviluppo di approcci innovativi per la terapia dei
Tumori. In particolare l’U.O. si occupa di:
• Identificazione nuovi bersagli terapeutici
• Sviluppo razionale di nuove combinazioni
farmacologiche
• Sviluppo preclinico di nuovi agenti terapeutici
• Studio dei meccanismi di farmacoresistenza
rigorosa validazione dell’efficacia dei
materiali preparati nel progetto
Preparazione complessi di oro
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Composti preparati:
Neutro fosfinico
AuSP
Neutro carbenico
AuSC
I RISULTATI SCIENTIFICI
Cationico fosfinico
AuP4
Cationico biscarbenico
AuC2
Preparazione nanoparticelle
PLURONIC-SILICE (PLUS)
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Guscio PEG
1) TEOS
2) Me3SiCl
3) UF/dialysis
Nucleo idrofobico
della micella di Pluronic® F127
I RISULTATI SCIENTIFICI
Guscio (DLS):
22.2 ± 0.14 nm
Nucleo silice
Nucleo (TEM):
10 ± 1 nm
Preparazione NPs con farmaci
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Luminoforo (rodamina B) inserito durante la sintesi
H2O
TEOS Me3SiCl
Farmaco
I RISULTATI SCIENTIFICI
Farmaco di oro inserito dopo la sintesi
Preparazione NPs con farmaci
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Verifica inclusione
del farmaco AuP4
nelle NP
• Sciolto in DMSO (poco solubile in H2O)
• diluito 1:10 in H2O con/senza NP
• filtrato (per eliminare il farmaco indisciolto)
Il farmaco si solubilizza solo in presenza delle NP
I RISULTATI SCIENTIFICI
Spettri di assorbimento in H2O in presenza e in assenza di PLUS NP
Preparazione NPs con farmaci
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Verifica inclusione
nelle NP del
farmaco AuSC
–
–
Sciolto in DMSO (solubile in H2O)
diluito 1:10 in H2O con/senza NP, filtrato
Inclusione cambia le proprietà di fluorescenza:
• resa quantica
• tempo di vita (mono-esponenziale!)
t = 40.8 ns
I RISULTATI SCIENTIFICI
t = 20.5 ns
Spettri di assorbimento e di emissione in H2O
in presenza e in assenza di PLUS NP
Indagini in vitro
dell’interazione NP-cellule
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Modelli sperimentali impiegati
Cellule di carcinoma prostatico
• androgeno-dipendenti LNCaP
• androgeno-indipendenti DU145 e PC-3
Analisi della biocompatibilità
Saggio MTT:
nelle cellule vive l’MTT viene convertito in
Formazan (colore viola)
I RISULTATI SCIENTIFICI
Indagini in vitro
dell’interazione NP-cellule
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Analisi della biocompatibilità
determinazione delle concentrazioni
di NP non citotossiche
2.0
Cell viability
(optical density at 492 nm)
DU145
I RISULTATI SCIENTIFICI
1.5
1.0
0.5
NP
NP+DMSO
0.0
0
0
0.5
0.0015
5
0.015
50
0.15
500
NP[nM]
1.5 % DMSO
 NP biocompatibili con entrambe le linee
cellulari finora testate
Indagini in vitro
dell’interazione NP-cellule
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Studio dell’attività biologica dei complessi di oro
internalizzati nelle NP
Confronto dell’ effetto citotossico di:
• Composti di Au “liberi”
• Composti di Au caricati su NP
0.025
0.25
2.5
25 AuP4[µM]
2.0
I RISULTATI SCIENTIFICI
Cell viability
(optical density at 492 nm)
DU145
1.5
1.0
NP
NP+DMSO
NP+AuP4
AuP4
0.5
0.0
0
0
0.5
0.0015
5
0.015
50
0.15
500
NP[nM]
1.5 % DMSO
 Farmaco AuP4 inglobato in NP mostra citotossicità
statisticamente indistinguibile da farmaco AuP4 da
solo
Indagini in vitro
dell’interazione NP-cellule
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Studi di internalizzazione
Dosi crescenti non tossiche di NP
Monitoraggio nel tempo
Microscopia a fluorescenza
UNT
I RISULTATI SCIENTIFICI
NP (500 nM)
Nuclei (DAPI)
Membrane (CD44/AlexaFluor488)
NPs (Rhodamine)
in corso
Stadio di avanzamento delle azioni
Feedback
Inclusione composti Au
Preparazione NP
Saggi biologici
I RISULTATI SCIENTIFICI
Feedback
Preparazione
composti Au
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Indagini in vitro
dell’interazione NP-cellule
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Acquisizione delle informazioni relative
al meccanismo d’azione
dei composti più promettenti
Analisi della morfologia cellulare
Studi di Biologia cellulare
Studi di Biologia Molecolare
Studi di Biochimica
I RISULTATI SCIENTIFICI
Microscopia
Prospettive future:
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studio dell’attività biologica mediante
riconoscimento molecolare
NP funzionalizzate con
peptidi diretti contro il PMSA
(prostate-specific membrane antigen)
(WQPDTAHHWATL)2K2 o CQKHHNYLC (C1-C9 disulfide)
Vettori con alta selettività per cellule tumorali
NP-Au-PMSA
I RISULTATI SCIENTIFICI
Somministrazione
per via sistemica
Localizzazione
specifica
intratumorale
Ricadute occupazionali
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Oltre il 50% del finanziamento ricevuto è stato
utilizzato per assumere giovani ricercatori.
Borsa di studio per giovani promettenti (6 mesi) a
neolaureato in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
presso UniMI (Dr. Davide Villa)
• Attività di ricerca svolta: sintesi farmaci a base di
oro
• Formazione ricevuta: metodologie avanzate di
sintesi metallorganica e organica
L E R I C A D U T E
O C C U PA Z I O N A L I
Contratto a progetto (4 mesi) a PostDoc con
esperienza in sintesi di nanoparticelle (Dr. Enrico
Rampazzo, UniBo)
• Attività di ricerca svolta: preparazione di
nanoparticelle a struttura core shell a base di
silice per il trasporto di farmaci a base di oro
Le ricadute
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Ricadute attese dall’applicazione degli
strumenti della nanomedicina nella lotta a CaP :
in generale
 sviluppo di nuovi interventi terapeutici con
• riduzione della mortalità (migliore efficacia)
• miglioramento della qualità di vita del paziente
oncologico (riduzione degli effetti collaterali)
• abbattimento dei costi SSN (miglioramento
interventi e riduzione dei pazienti ospedalizzati)
sul territorio lombardo
I RISULTATI TRASFERITI
 accrescimento della capacità di competizione del
capitale umano coinvolto
• sul piano della ricerca, miglioramento risultati
e capacità di attrarre finanziamenti
• sul piano dello sviluppo produttivo (deposito di
brevetti, coinvolgimento industrie
farmaceutiche interessate industrializzazione
risultati).
Concludendo
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